caracterização de genes de resistência a insetos marcelo menossi laboratório de genoma funcional...
TRANSCRIPT
Caracterização de genes de resistência a insetos
Marcelo MenossiLaboratório de Genoma Funcional
Centro de Biologia Mol. Engenharia Genéticahttp://cafe.cbmeg.unicamp.br
Coffea arabica (75%) e Coffea canephora (25%)
13 estados produtores
9 milhões de empregos diretos e indiretos
2 bilhões de dólares em receita
2 milhões de hectares
150 cooperativas e empresas exportadoras registradas
1.500 indústrias de torrefação e moagem
Segundo país maior consumidor do produto
Café no Brasil
Nematódeos
Meloidogyne sp.
Fungos
Ferrugem do café (Hemileia vastatrix)
Insetos
Broca do Café (Hypothenemus hampei)
Bicho mineiro (Leucoptera coffeella)
Estresse Biótico e o Café
Ciclo de vida do bicho mineiro
Incubação dos ovos à eclosãoDas lagartas - 4 a 6 dias
Desenvolvimento da lagarta - 7 a 11 dias (dano)
Mariposa
Oviposição
Formação da crisálida
Eclosão da lagarta
Duração da fase pupal – 5 a 8 dias
Duração da fase adulta - 5 a 20 dias (fêmeas)
Instituto Agronômico de Campinas
- Hibridações entre C. arabica e C. racemosa (resistente)
- Avaliação da quinta geração de retrocruzamentos
Indivíduos resistentes e suscetíveis
Cultivares resistentes
Defesa Constitutiva- Barreiras Físico-químicas
Defesa Induzida - Expressão gênica
Transdução de sinal
Reparação do tecido
Ajuste metabólico
Inibição do crescimento do predador
Defesas contra herbivoria
Identificar e caracterizar a expressão de genes que possam estar relacionados com a expressão da resistência do cafeeiro ao bicho-mineiro
Avaliar esses genes como possíveis marcadores moleculares de resistência ao bicho-mineiro
Objetivos
Arranjos de DNAArranjos em lâmina - MicroarraysArranjos em membrana - Macroarrays
Arranjos de DNA
**
*
**
***
****
******** ****
********
****
Sonda células controle Sonda células tratadas
**
**
**
****
Hibridação
Macroarray A1 Macroarray A2
Detecção do sinale análises
**
768 ESTs duplicata12 x 8,5 cm
Bibliotecas de subtração
Enriquecidas em cDNAs diferencialmente expressos
Driver Tester
Sem amplificação
Amplificação Exponencial
Amplificação Linear
EliminadoEliminado
Driver Driver e Tester
Tester
Tester Enriquecido
genes seminteresse
genes deinteresse
Resultados
Avaliação do nível de resistências das plantas
11 22
3344
Resistentes
Suscetíveis
Experimento de infestação
R S
Resistentes e Suscetíveis
3 dias pós infestação (oviposição)
7 dias pós infestação (eclosão)Ro e So
Re e Se
Rc e ScControle (sem infestação)
C O E C O E
Estratégia - Biblioteca de Subtração
Tester(genes de interesse)
Driver(genes descartáveis)
Genes induzidos preferencialmente nas resistentes pós infestação
Resistente após oviposição +
Resistente após eclosão
Resistente controle
Suscetível controle
Suscetível após oviposição
Suscetível após eclosão
Resultados subtração
DP1 DP2 DP3
•Vários ciclos de subtração
•Não normalizada
•Único ciclo de subtração
•Efeito de normalização
Representational Diference Analysis (RDA)
Supressive Subtraction Hybridization(SSH)
Hibridação com sondas de cDNA
Membranas de náilon contendo 768 clones da biblioteca de
subtração, hibridadas com sondas de cDNA
Resistente - controle Resistente - pós eclosão
SOM- Self Organizing Maps
260 ESTs selecionados.
C O E C O E
Res Sus
Clones Funções hipotéticas e-value Ro/Rc Re/Rc Sc/Rc So/Rc Se/Rc So/Sc Se/ScSSH203F09 O-sialoglicoprotease Arabidopsis thaliana 1,00E-12 4,3 0,6 0,8 1,1 0,1 1,4 0,2SSH103H03 Proteína hipotética domínio metaloprotease Arabidopsis thaliana 5,00E-31 3,1 0,4 0,7 0,8 0,1 1,1 0,1SSH103F12 Proteína RD22 Domínio BURP Prunus persica 3,00E-13 2,7 0,4 0,6 0,9 0,2 1,4 0,2SSH203E09 GST T3 Lycopersicon esculentum 2,00E-57 3,6 0,9 0,6 1,4 0,7 2,2 1,1SSH104C02 Albumina Domínio Kunitz STI Theobroma cacao 5,00E-13 3,5 0,6 0,9 1,9 0,2 2,1 0,2SSH101B04 Miraculina Domínio Kunitz STI Youngia japonica 6,00E-09 3,6 0,7 0,7 1,5 0,3 2,2 0,4SSH202E06 Proteína relacionada a tumor Domínio Kunitz STI Nicotiana tabacum 3,00E-11 3,4 0,6 0,3 1,2 0,2 3,6 0,6SSH203H02 4-Difosfocitidil-2C-metil-D-erithritol sintase Arabidopsis thaliana 8,00E-38 3,2 0,7 0,8 1,3 0,4 1,6 0,6SSH202G05 Acetil COA sintetase Arabidopsis thaliana 8,00E-49 3,4 0,6 0,4 1,1 0,2 3,1 0,6SSH101B03 Glutamato decarboxilase Lycopersicon esculentum 1,00E-44 2,8 0,7 0,7 1,3 1,0 1,9 1,4SSH203G02 Proteína Domínio SET Nicotiana tabacum 2,00E-27 2,6 0,8 0,8 1,2 0,6 1,7 0,8SSH201D09 Peptidase sinal microsomal 25 kDa Arabidopsis thaliana 4,00E-13 3,6 0,5 0,8 1,2 0,1 1,5 0,2SSH104G04 Proteína de membrana de troca Na/Ca dependente de potássio 6,00E-11 3,1 0,6 0,5 1,3 0,3 2,9 0,6
DP302B11 Endoquitinase Ácida Lupinus albus 2853142|emb|CAA76203.1| (Y16415) class III chitinase [Lupinus albus]4,00E-31 3,9 1,4 0,3 1,1 4,7 3,5 14,6
Genes Induzidos (exemplos)
16,5% de clones de RDA (143) – alta redundância
17 % dos clones do SSH (117) – baixa redundância
Confirmação por northern blot
SSH104G04 Na/Ca trocador
0
10
20
30
40
Rc Ro Re Sc So Se
Tratamentos
Sin
al
DP3 102 B11 Quitinase
0
5
10
15
20
25
30
Rc Ro Re Sc So Se
Tratamentos
Sin
al
Miraculin SSH101B04
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Rc Ro Re Sc So Se
Treatments
Sig
nal
(arb
itra
ry u
nit
)
SPC25 SSH201D09
0
20
40
60
80
100
120
140
Rc Ro Re Sc So Se
Treatments
Sig
nal (arb
itra
ry u
nit
)
CAX9-like SSH104G04
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Rc Ro Re Sc So Se
Treatments
Sig
nal (arb
itra
ry u
nit
)
Chitinase class I I I DP3102B11
0
5
10
15
20
25
Rc Ro Re Sc So Se
Treatments
Sig
na
l (a
rbit
rary
un
it)
psaH SSH202H06
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Rc Ro Re Sc So Se
Treatments
Sig
nal (a
rbit
rary
unit
)
BEL1 SSH202C10
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Rc Ro Re Sc So Se
Treatments
Sig
nal (arb
itra
ry u
nit
)
Rc Ro Re Sc SeSo
SSH 101B04SSH 201D09SSH 104G04
SSH 202H06SSH 202C10
DP3 102B11
RDA- Ideal para amostras com diferença de indução de 10x
SSH- Ideal para amostras contendo muitos transcritos diferencialmente expressos
Análise da estratégia Subtração + Macroarray
? Tente conhecer seu modelo experimental
Falso positivos
260 genes diferencialmente expressos
Epiderme Mesofilo TRÁFICO INTRACELULAR
Peptidase sinal SECY
METABOLISMODE AMINOÁCIDOS,
AÇÚCARES E VITAMINAS
METABOLISMO
SECUNDÁRIO
ESTRESSE OXIDATIVO
PROTEÓLISE
PROTEÍNAS
EFETORAS
Glutamato decarboxilaseTiamina sintaseAcetil COA sintase
GSTCatalasepsaH
Fosfocitidil sintaseFlavonol transferase
QuitinasesInibidor de protease
Metaloprotease
FUNÇÃODESCONHECID
ANo hitsUnknown protein
TRANSDUÇÃO DE SINAL
GTPase, Quinases, Trocador Na/Ca
FATORES DE TRANSCRIÇÃO
MYB, Homeoproteína BELL
Proteína associada à senescênciaRD22 – Proteína anti-seca
ESTRESSE ABIÓTICO
Oviposição
Eclosão
?
Modelo inicial das defesas da planta
Próximas etapas
Análise da expressão dos genes diferencialmente expressos
Análise de segregação em Southern blot de plantas resistentes e suscetíveis
Equipe
CBMEG - Unicamphttp://cafe.cbmeg.unicamp.br
Jorge Mondego (Dr.)Juliana de Maria Felix (Dr.)Rodrigo Drummond (Dr.) Renato Vicentini (IC)Cristiane Rocha (IC)Melina P. Duarte (IC)
Dr. Marcelo Menossi
IACDr. Oliveiro Guerreiro FilhoDra. Míriam MalufDaniel Ramiro (MSc.)Silvia Chebabi (M.Sc.)
IMECC – UnicampDr. Aluisio S. Pinheiro
IQ-USP Prof. Dra. Mari Cleide SogayarDr. Mario Henrique BengtsonChristian Colin (Dr.)
União Européia
CNC CNC PNP&DPNP&D