caracterización funcional de las principales fracciones
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
Caracterización funcional de las principales
fracciones proteínicas de reserva en semillas no
tóxicas de Jatropha curcas L.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN
RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
IBT. EYMER ALONSO CASTILLO MORENO
GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE DE 2012
El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Biotecnología agrícola, en el
Laboratorio de Alimentos Funcionales del Centro Interdisciplinario de Investigación
para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico
Nacional (IPN). El presente trabajo fue apoyado económicamente a través del
Proyecto: Caracterización estructural y funcional de las proteínas de reserva en
semillas no tóxicas de Jatropha curcas L. SEP-CONACYT (CB-2008-01 #103601),
así como al Proyecto financiado por la Secretaria de Investigación y Posgrado con
número de registro: SIP20110936.
Agradecimiento especial:
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca de maestría
CVU 367338, perteneciente al alumno Eymer Alonso Castillo Moreno.
Al Instituto Politécnico Nacional por la beca institucional de posgrado: BECA TESIS
MAESTRÍA, otorgada en el periodo de Agosto-Diciembre del 2012.
AGRADECIMIENTOS
A mis padres Pascual, Micaela y ma Bertha por todo su apoyo a lo largo de
mi vida, estando presentes en buenos y malos momentos, siempre aconsejándome y
guiándome para salir adelante, muchas gracias, los amo.
Un especial agradecimiento al Dr. Sergio Medina Godoy por aceptarme
como alumno de maestría, gracias doc he aprendido mucho de usted. De igual
manera Dra. Laura Gabriela Espinosa Alonso le agradezco por su colaboración
como directora de esta tesis, por su amistad, por sus consejos. A mi comité tutorial le
agradezco por su aportación, a la Dra. Norma Karina Hernández Ibarra, Dr. Carlos
Ligne Calderón Vázquez y a la Dra. Maribel Valdez Morales en especial, no solo
formó parte de mi comité sino que estuvo siempre al pendiente de mi tesis, Señorita
muchas gracias por su amistad, por su apoyo, por sus consejos, por sus regaños que
también sirvieron, por todo, mil gracias.
También agradecer al LAF, ya que el ambiente estuvo siempre al cien, Libia,
Paola, Caro, Divet, Xio, Jaqui, Gastón muchas gracias por su amistad, por su
apoyo que mostraron, por hacerme reír tanto con sus locuras jeje, y a ti en especial
M.C Andrés León por la disponibilidad mostrada, por soportar a la Jatropha junto
conmigo, por tus consejos, por tus enseñanzas, por tu amistad, gracias Andrew. Jefa
muchas gracias, siempre estuvo al pendiente de mi, enseñándome, aconsejándome,
regañándome, gracias M.C Claudia Moreno.
Aquí apareces tú Eda, no podías faltar, muchas gracias negrita, desde que
llegué al CIIDIR siempre he podido contar contigo, me ayudaste mucho, aunque no lo
creas he aprendido de ti, eres a todo dar, ponle muchas ganas al estudio eh, todo
has superado y así seguirás. ¡Éxito!.
Hablando de… Cindy muchas gracias por todo, te la rifaste. Desde que estuve
dando lata en la estancia estuviste ayudándome, claro querías tratarme como negro
y ve, saliste negra! Éxito en todo.
Gracias familia, todos han mostrado aprecio y sobre todo amistad a mi
persona, directa o indirectamente me han apoyado mucho, te mando un saludo
especial tio Gerardo, vaya que me has ayudado y he aprendido mucho de ti, en la
universidad te di mucha lata, también tú pero así es esto.
A mis hermanos Sergio y Eder, gracias por todo morros, hemos pasado
tantos momentos como buenos hermanos y me han apoyado en todo, los amo!
Por último agradecerte a ti amor: Albina eres muy linda, has estado conmigo
en las buenas y malas, tantas cosas que hemos vivido juntos y lo que falta, siempre
me has demostrado tu cariño, tus consejos han sido únicos, he aprendido tanto de ti,
gracias por todo y solo me resta decir: te amo!
ÍNDICE
GLOSARIO……………………………………………………………………………... I
ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………. III
ÍNDICE DE CUADROS………………………………………………………………... IV
RESUMEN……………………………………………………………………………… V
ABSTRACT…………………………………………………………………………….. VI
I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………….. 1
II. ANTECEDENTES…………………………………………………………………... 3
2.1 Jatropha curcas L………………………………………………………………. 3
2.1.1 Clasificación taxonómica y distribución del género…………………….. 3
2.1.2 Nombres comunes…………………………………………………………. 4
2.1.3 Centro de origen y diversidad…………………………………………….. 4
2.1.4 Descripción botánica………………………………………………………. 5
2.1.5 Rendimientos……………………………………………………………….. 6
2.1.6 Usos…………………………………………………………………………. 7
2.2 Proteínas vegetales……………………………………………………………. 9
2.3 Proteínas de reserva…………………………………………………………… 10
2.3.1 Clasificación………………………………………………………………… 11
2.3.1.1 Albúminas………………………………………………………………. 12
2.3.1.2 Globulinas………………………………………………………………. 12
2.3.1.3 Prolaminas……………………………………………………………… 13
2.3.1.4 Glutelinas……………………………………………………………….. 13
2.3.2 Proteínas vegetales de mayor importancia: Soya………………………… 14
2.4 Electroforesis……………………………………………………………………. 15
2.4.1 Patrón proteínico de semillas de soya…………………………………... 16
2.4.2 Análisis electroforético de las proteínas de reserva de semilla de
Jatropha curcas……………………………………………………………………
17
2.5 Caracterización funcional……………………………………………………… 18
2.5.1 Propiedad funcional………………………………………………………... 18
III. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………… 21
IV. HIPÓTESIS…………………………………………………………………………. 22
V. OBJETIVOS…………………………………………………………………………. 22
5.1 Objetivo general………………………………………………………………… 22
5.2 Objetivos específicos…………………………………………………………… 22
VI. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………………. 23
6.1 Obtención de harina de J. curcas…………………………………………….. 23
6.2 Extracción de proteínas de reserva…………………………………………... 23
6.3 Composición proximal de la harina………………………………………….. 25
6.4 Determinación de proteína……………………………………………………. 25
6.5 Electroforesis en gel de poliacrilamida……………………………………… 25
6.6 Evaluación funcional………………………………………………………….. 26
6.6.1 Solubilidad…………………………………………………………………. 26
6.6.2 Capacidad de absorción de agua………………………………………… 26
6.6.3 Capacidad de absorción de aceite……………………………………….. 27
6.6.4 Superficie de hidrofobicidad………………………………………………. 27
VII. RESULTADOS……………………………………………………………………. 28
7.1 Composición proximal de la harina…………………………………………… 28
7.2 Extracción y determinación de las proteínas de reserva…………………… 29
7.3 Electroforesis……………………………………………………………………. 31
7.4 Caracterización funcional……………………………………………………… 34
7.4.1 Solubilidad………………………………………………………………….. 34
7.4.2 Absorción de agua…………………………………………………………. 36
7.4.3 Absorción de aceite………………………………………………………… 37
7.4.4 Superficie de hidrofobicidad………………………………………………. 38
VIII. DISCUSIÓN……………………………………………………………………….. 40
8.1 Composición proximal de la harina…………………………………………… 40
8.2 Extracción y determinación de las proteínas de reserva…………………… 42
8.3 Electroforesis……………………………………………………………………. 44
8.4 Caracterización funcional……………………………………………………… 46
8.4.1 Solubilidad………………………………………………………………….. 46
8.4.2 Absorción de agua…………………………………………………………. 47
8.4.3 Absorción de aceite………………………………………………………… 47
8.4.4 Superficie de hidrofobicidad………………………………………………. 48
IX. CONCLUSIONES………………………………………………………………….. 49
X. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………….. 50
GLOSARIO
Coeficiente de sedimentación. Se define como la razón entre la velocidad a la que
sedimenta la molécula y la aceleración centrifuga aplicada, son expresados en
unidades de Svedberg (S). Cuanto menor sea el valor de S, la molécula se moverá
más lentamente por la fuerza centrífuga.
Desnaturalizante. Es un agente capaz de desnaturalizar a la proteína, es decir,
cambia su estructura y por ende pierde su estructura nativa, modificando así sus
propiedades.
Diálisis. Es el proceso mediante el cual las proteínas en solución pueden separarse
de moléculas pequeñas a través de una membrana semipermeable. Las moléculas
mayores al diámetro del poro se retienen dentro de la bolsa de diálisis, mientras que
las moléculas más pequeñas y los iones atraviesan los poros de esta membrana.
Esta técnica es útil para retirar las sales u otras moléculas pequeñas presentes en la
solución, de tal manera que la proteína se obtiene más pura.
Hidrofílico. Es el comportamiento de toda molécula que tiene afinidad por el agua,
esta característica la presenta las moléculas polares.
Hidrófobo. Es el comportamiento de toda molécula que tiene afinidad por los lípidos
o grasas, es decir, característica presentada por moléculas no polares.
Leguminas. Son proteínas del tipo globulinas, denominadas 11 S por su coeficiente
de sedimentación, se caracterizan por ser oligómeros hexaméricos y estar unidas
mediante puentes disulfuro.
Liofilización. Es el proceso mediante el cual se extrae el agua de la muestra
congelada por sublimación bajo condiciones de vacío, es decir, pasa del estado
sólido al gaseoso sin pasar por el estado líquido.
I
Oligómeros. Son proteínas que están compuestas de más de una cadena
polipeptídica, por lo que poseen estructura cuaternaria.
Propiedad funcional. Se denomina propiedad funcional a toda propiedad no
nutritiva que afecta al uso de un ingrediente en un alimento.
Proteínas de reserva. Son depositadas en cuerpos proteínicos durante el desarrollo
del endospermo, éstas a su vez, dan un aporte significativo a la alimentación
humana.
Punto isoeléctrico. Es el pH al que una sustancia anfótera tiene carga neta cero, a
este valor la solubilidad de la sustancia es casi nula.
Vicilinas. Son proteínas del tipo globulinas, denominadas 7 S por su coeficiente de
sedimentación, se caracterizan por ser proteínas triméricas y carecer de enlaces
disulfuro, generalmente sus subunidades se encuentran glicosiladas.
II
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Patrón SDS-PAGE de proteínas de soya cultivada, soya salvaje y sus
variantes. α’, α y β indican subunidades de β-conglicinina. A y B indican
polipéptidos ácidos y básicos de glicinina respectivamente. Bandas con
movilidad única están marcadas con asterisco. Carril 1, soya cultivada;
2, soya salvaje; 3, β.β*; 4, β*; 5, α’ pequeña; 6, A3 pequeña; 7, A4
grande…………………………………………………………………………..
16
Figura 2 Patrón SDS-PAGE de la harina desgrasada de semillas de J. curcas.
Carriles (M) marcadores, (a) Albuminas, (b) Globulinas, (c) Glutelinas,
(d) Prolaminas………………………………………………………………….
17
Figura 3 Extracción secuencial de las fracciones proteínicas de reserva en
semillas de J. curcas no tóxica, mediante el método
Combinado……………..……………………………………………..……….
24
Figura 4 Patrón electroforético de las proteínas de reserva de semillas de J.
curcas no tóxica en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE)
extraídas por diversos métodos. M, marcador de peso molecular; 1,
albúminas; 2, globulinas; 3, prolaminas; 4, glutelinas……………………..
31
Figura 5 Patrón electroforético de las proteínas de reserva de semillas de J.
curcas no tóxica en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE)
extraídas por el método Combinado. M, marcador de peso molecular;
1,2 albúminas; 3,4 globulinas; 5,6 prolaminas; 7,8 glutelinas; 9,10
harina; 11,12 residuos. En condiciones: no desnaturalizantes (-) y
desnaturalizantes (+)………………………………………………………….
33
Figura 6 Efecto del pH en la solubilidad de las fracciones glutelinas y globulinas
en semillas de J. curcas no tóxica ecotipo Puebla………………………...
35
Figura 7 Superficie de hidrofobicidad presente en las fracciones mayoritarias
correspondientes a Glutelinas (A) y Globulinas (B) a distintas
concentraciones……………………………………………………………….
39
III
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1 Clasificación de las proteínas de acuerdo a su solubilidad……….……. 11
Cuadro 2 Características de las principales globulinas de soya (Tomado de
Arrese et al., 1991)……………………………………………………………
14
Cuadro 3 Composición proximal de la harina sin desgrasar y desgrasada de las
semillas de J. curcas no tóxica ecotipo Puebla……………………………
28
Cuadro 4 Composición de las proteínas de reserva presentes en semilla de J.
curcas no tóxica ecotipo Puebla…………………………………………….
29
Cuadro 5 Distribución en porcentaje de las fracciones proteínicas obtenidas por
el método Combinado con diálisis a partir de la semilla de J. curcas no
tóxica ecotipo Puebla………………………………………………..……….
30
Cuadro 6 Capacidad de absorción de agua de las principales fracciones
proteínicas correspondientes a glutelinas y globulinas en semillas de J.
curcas no tóxica ecotipo Puebla……………………………………….……
36
Cuadro 7 Capacidad de absorción de aceite para las principales fracciones
proteínicas correspondientes a glutelinas y globulinas en semillas de J.
curcas no tóxica ecotipo Puebla…………………………………….………
37
IV
RESUMEN
Las semillas de Jatropha curcas representan actualmente uno de los recursos
más viables para la obtención de aceite para la producción de biodiesel; una
característica sobresaliente es que los genotipos encontrados en México tienen la
particularidad de ser no-tóxicos a diferencia de los empleados en otras regiones del
mundo. De la obtención de aceite resulta una pasta rica en proteína (hasta en un
60%), cuya aplicación en la industria alimentaria no ha sido totalmente explotada. Por
otro lado, las proteínas de reserva representan un aporte significativo a la
alimentación humana. Debido a las razones antes mencionadas, es importante el
estudio de las principales fracciones proteínicas de la pasta rica en proteína
generadas durante la producción de biodiesel a partir de semillas de Jatropha; su
caracterización funcional podría elucidar su posible uso en la industria alimentaria.
Además, este estudio contribuirá a dar un plus a la cadena de producción de
biodiesel a partir de esta semilla. Para ello se evaluaron tres métodos de extracción
distintos, siendo el método Combinado el que obtuvo mejores resultados con un
42.02% para la fracción mayoritaria glutelinas, 20.2, 12.35 y 6.2% para globulinas,
albúminas y prolaminas respectivamente. El análisis electroforético reveló cinco
bandas principales <35 kDa, nueve <73 kDa, y tres <44 kDa para albúminas,
globulinas y glutelinas respectivamente. Los resultados de electroforesis y solubilidad
sugieren que la fracción mayoritaria presenta puentes disulfuro debido a su baja
solubilidad encontrada, característico de ellas. Aunado a esto, la fracción mayoritaria
presentó muy buena capacidad de absorción de aceite (posiblemente por su
composición elevada de aminoácidos no polares), lo cual les otorga un gran potencial
o bien las convierte en un buen ingrediente para la industria alimentaria,
principalmente en la elaboración de embutidos, donde generalmente se usan
proteínas que liguen grasa y agua con la finalidad de obtener un buen producto.
V
ABSTRACT
Jatropha curcas seeds currently represent one of the most viable resources to obtain
oil for biodiesel production; a striking feature is that the genotypes found in Mexico
have the characteristic of being non-toxic unlike employees in other regions in the
world. In the process of oil extraction from Jatropha’s seed, a paste rich in protein (up
to 60%) is generated as by-product, whose application in feed industry has not been
fully exploited. Moreover, the storage proteins represent a significant contribution to
the human diet. Due to the reasons mentioned above, is important the study of the
major protein fractions from the paste rich in protein generated during biodiesel
production from J. curcas seed; it´s functional characterization could be elucidate
their possible use in food industry. This study will contribute to give a plus to the
production chain of biodiesel from this seed. We evaluated three different protein
extraction methods; the combined method shown the best results: glutelin fraction
represented the 42.02% of the total extracted proteins; globulins, albumins and
prolamins accounted the 20.2, 12.35 and 6.2% respectively. Electrophoretic protein
profile analysis revealed five major bands <35 kDa, nine <73 kDa, and three <44 kDa
for albumins, globulins and glutelins respectively. The solubility results and
electrophoresis profile suggest the major fraction contains disulphide bonds due to its
low solubility found characteristic of them. Along these facts, the majority fraction
showed very good oil absorption capacity (possibly by its high composition of non
polar amino acids), which gives it great potential or makes a good ingredient in food
industry, especially in the preparation of sausages, where proteins are typically used
that link fat and water in order to obtain a good product.
VI
1
I. INTRODUCCIÓN
Actualmente las semillas de Jatropha curcas representan uno de los recursos
más viables para la obtención de aceite para la producción de biodiesel; asimismo, la
planta puede ser una excelente alternativa en la reforestación de zonas erosionadas,
sobre todo para los agricultores que se encuentran en regiones en donde sus cultivos
han perdido su valor comercial y para aquellas tierras que no son aptas para cultivo o
inclusive como cultivo alternativo (Martínez, 2005).
El rendimiento de semilla reportado para J. curcas varía de 0.5 a 12
ton/año/Ha, dependiendo del tipo de suelo, fertilización y condiciones de riego. El
arbusto de J. curcas tiene un periodo productivo de más de 40 años. Se puede
esperar un promedio anual de producción de semilla alrededor de 5 ton/ha, en
excelentes tierras y precipitaciones de 900 a 1200 mm (Francis et al., 2005).
El aceite extraído de esta semilla se ha utilizado como lubricante y
combustible, también en la elaboración de jabones, velas, barnices y cosméticos. En
cuanto al consumo de la semilla, se han reportado algunos efectos tóxicos, debido
principalmente al efecto purgante del aceite causado por un éster diterpeno (12-
desoxi-16-hidroforbol); sin embargo es menor o bien no se ha encontrado en plantas
originarias de México (Aderibigbe et al., 1997).
Una característica sobresaliente para nuestro país es que los genotipos
encontrados en México tienen la particularidad de ser no-tóxicos, lo cual ha sido
demostrado por su consumo humano en Quintana Roo (Makkar et al., 1998).
Adicionalmente la harina proveniente de las semillas posee un alto contenido de
proteína (60%). Por lo que las variedades no tóxicas de J. curcas ó piñón mexicano
pueden ser una fuente potencial de proteína para consumo humano y animal
(Makkar et al., 1998).
2
Por otro lado, en mamíferos, las proteínas forman parte de la estructura básica
de los tejidos (músculos, tendones, piel, uñas, etc.) y además, desempeñan
funciones metabólicas y reguladoras (asimilación de nutrientes, transporte de
oxígeno y de grasas en la sangre, inactivación de materiales tóxicos o peligrosos,
etc. Además, constituyen un aporte nutricional importante, representando una fuente
de energía, nitrógeno y aminoácidos esenciales (Cheftel et al., 1989).
Por otra parte, las proteínas determinan las propiedades físicas y
organolépticas de muchos alimentos; así, la consistencia y textura de la carne, leche,
queso o pan, dependen en gran medida de la naturaleza de las proteínas que lo
constituyen. Pero, también en alimentos elaborados con una presencia menor de
proteínas pueden jugar un papel muy importante influyendo en características
funcionales, tales como la absorción de agua o aceite o la formación de emulsiones,
geles y espumas (Zayas, 1997).
En la actualidad existen pocos reportes donde se describa la composición de
las proteínas de reserva de J. curcas y aquellos que se encuentran son
contradictorios con respecto a la proteína mayoritaria: Martínez-Ayala et al. (2003)
reporta a las proteínas tipo Globulinas como mayoritaria con un 44.4%; mientras que
Selje-Assmann et al. (2007) reportan a la fracción de Glutelinas como la de mayor
significancia representando un 56.9%; sin embargo no existen reportes donde se
describan las propiedades funcionales de las mismas, siendo éstas de gran
importancia debido a que de ellas dependen las características que se le pueden dar
a este como insumo para la industria alimentaria.
Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo extraer y caracterizar
funcionalmente las principales fracciones proteínicas de reserva de semillas no
tóxicas de J. curcas, y elucidar su posible uso en la industria alimentaria.
3
II. ANTECEDENTES
2.1 Jatropha curcas L
2.1.1 Clasificación taxonómica y distribución del género
El género Jatropha L. (Griego: Iatros: medicinal; trophe: alimento) pertenece al
reino Plantae, subreino Tracheobionta, división Magnoliophyta, clase Magnoliopsida,
subclase Rosidae, orden Geraniales, familia Euphorbiaceae, subfamilia
Crotonoideae, y fue determinado por Linneo (1753-1754) incluyendo en él siete
especies, dos de ellas hoy incluidas en Cnidoscolus, una especie posteriormente
segregada como tipo del género Manihot y otra especie hoy referida al género
Aleurites; mientras que las tres especies linneanas restantes aún forman parte del
género: J. gossypifolia, J. multifida y J. curcas (Font, 2003).
J. curcas se encuentra distribuida naturalmente desde el sur de Florida y
México hasta Argentina, en las Antillas y, los trópicos del Viejo Mundo. Su
distribución altitudinal varía de 0 a 1500 msnm, con precipitaciones anuales de 300 a
1000 mm y temperaturas promedio de 30 a 34 °C. Se encuentra generalmente en
áreas abiertas. Es resistente a la sequía y se adapta a una gran variedad de climas y
suelos. Crece tanto en suelos bien drenados con buena aireación como en suelos
pesados, aunque en los últimos la formación de raíces se ve limitada; se adapta a
suelos con bajos contenidos de nutrientes.
En México se encuentra distribuida en Chiapas, Guerrero, Hidalgo, Morelos,
Oaxaca, Puebla, Quintana Roo, Sonora, Sinaloa, Tamaulipas, Veracruz y Yucatán
(Salas et al., 1994; Heller, 1996).
4
2.1.2 Nombres comunes
Los nombres comunes más usados en las diferentes regiones donde se cultiva
esta planta son: Piñón mexicano en México; piñol en Perú; tempate en Costa Rica;
physic nut en países angloparlantes; coquillo en España; cotoncillo en Honduras;
piñón en Guatemala y Nicaragua, así como tempate en este último país. En Cuba:
piñón botija, piñón de cercas, piñón purgante (Bisse, 1988). Otros nombres son:
coquito, capate, higo del duende, barbasco, higo de infierno, purga de fraile, tua tua,
pinhao manso, etc. (Torres, 2007).
2.1.3 Centro de origen y diversidad
Un gran número de científicos han intentado definir el centro de origen de J.
curcas, pero han surgido controversias al respecto, y aún no se sabe con exactitud
su ubicación. Por tal motivo, desde el 2007 la Universidad de Wageningen en
Holanda, lleva adelante un proyecto para estudiar el genoma de muestras de J.
curcas de diversas procedencias del mundo y así dilucidar dicha cuestión
(Jongschaap, 2007). No obstante, es muy probable que el lugar de origen sea
México y otros países de América Central (Heller, 1996).
Según Schmook, Serralta y Ku Vera (1997) esta especie era conocida y
utilizada por los mayas y sugieren que, desde el Caribe, fue probablemente
distribuida por los navegantes portugueses a países de África, a través de Cabo
Verde y Guinea Bissau, y también a países del sudeste de Asia tales como
Indonesia, Malasia y Filipinas.
5
2.1.4 Descripción botánica
Según Bisse (1988), Heller (1996) y Joker y Jepsen (2003) esta especie se
caracteriza por presentar:
Porte. Arbusto o árbol pequeño, caducifolio, de hasta 8 m de altura.
Copa. Ancha e irregular.
Tallo. Los tallos crecen con una discontinuidad morfológica en cada
incremento. Es un cilindro verde, robusto, que produce ramas con savia láctea
o rojiza viscosa.
Raíz. Normalmente se forman cinco raíces en los arbolillos, una central y
cuatro periféricas.
Corteza. La corteza es verde amarillenta, pálida y casi lisa, delgada como el
papel, con desprendimientos en tiras horizontales. Corteza interna blanca con
rayas rojas.
Hojas. Simples, alternas, con pecíolos largos, con una longitud de 10 a 15 cm
y anchura de 9 a 15 cm, ovadas, con una filotaxis espiral y se caen durante la
época seca. La haz es verde; el envés verde claro, glabro o con pelillos finos.
Flores. Están ubicadas en inflorescencias que se forman en las axilas de las
hojas. Ambas flores, masculinas y femeninas, son pequeñas (6- 8 mm),
verdoso-amarillas y pubescentes. Los pétalos son de 6-7 mm de largo. La
longitud del pecíolo fluctúa entre 6-23 mm. Las flores femeninas presentan
brácteas acuminadas y las masculinas, brácteas aovadas y pedicelos
pubescentes.
Frutos. Son cápsulas drupáceas y ovoides. Después de la polinización, se
forma una fruta trilocular de forma elipsoidal. Las frutas son cápsulas
inicialmente verdes, pero cambian a café oscuro o negro con posterioridad.
Las cápsulas de los frutos son de 2,5 a 4,0 cm de largo por 2,0 cm de ancho,
elipsoidales y lisas, que cuando maduran van cambiando a amarillas. Al inicio
son carnosas, pero dehiscentes cuando secas. Los frutos se producen en
invierno cuando el arbusto bota sus hojas. El desarrollo del fruto necesita
alrededor de 90 días desde la floración hasta que madura la semilla.
6
Semillas. Dos a tres por fruto, oblongo elipsoides, de aproximadamente 2 cm
de largo y 1 cm de ancho, pálidas, con líneas negras conspicuas. El volumen
de aceite es 35-40% en las semillas y 50-60% en el grano.
2.1.5 Rendimientos
Según Rijssenbeek (2006), el rendimiento varía entre 100 y 5 000 kg/ha. En la
literatura, los datos al respecto varían ampliamente.
La planta comienza a producir de manera rentable desde el primer año, su
rendimiento se incrementa durante los primeros cinco años y a partir de ahí se
estabiliza. El rendimiento por hectárea es de 5 ton de semilla, de las cuales 2 ton son
de aceite y 1 ton es de pasta residual, rica en proteína (60%) (Martínez, 2005;
Parsons, 2005); aunque según Jones y Miller (1992) y Hooda y Rawat (2005), los
rangos de producción de semillas varían desde 0.4 ton hasta 12 ton/ha/año, después
de cinco años de cultivo. Estos últimos autores señalan que una plantación adecuada
rinde alrededor de 2.0 kg de semilla por planta, y en suelos relativamente más
pobres de 0.75 a 1.0 kg por planta; una hectárea de plantación en un suelo de
mediana calidad produce como promedio 1.6 ton de aceite.
De acuerdo con lo informado por Parsons (2005), J. curcas puede tener un
mayor reembolso energético que cualquier otro biocombustible. El rendimiento por
hectárea por año puede alcanzar hasta 8 ton de semilla, las que contienen un 30%
de aceite; a $320 USD por tonelada, representaría $728 por hectárea por año.
Potencialmente, de igual o mayor valor es el rendimiento de las semillas de Jatropha
en glicerina, que a $2 000 por tonelada sumaría unos $1120 por hectárea por año, y
el ingreso total sería de $1 888 por hectárea por año.
7
2.1.6 Usos
En muchos países tropicales de América y África se usa ampliamente como
cerca viva, apoyo de otros cultivos, control de la erosión y como árbol de sombra y
ornato (Heller, 1996). Además, es una excelente alternativa para la recuperación de
zonas erosionadas, principalmente para los cultivos establecidos en regiones donde
han perdido el valor comercial y de igual manera para aquellas tierras que no son
óptimas para cultivo (Martínez, 2005).
Se ha reportado que el contenido de fibra, proteína y minerales (P, Ca, Mg, Na
y K) de sus frutos es de importancia como fertilizante y para un uso eventual en la
nutrición animal. La pasta obtenida después de prensar la semilla de genotipos
tóxicos para obtención de aceite no puede ofrecerse directamente como alimento a
los animales, pues es sumamente tóxica; sin embargo, si se pasa por un proceso de
detoxificación puede usarse sin problema para alimentar vacunos, cerdos y aves, ya
que contiene altos niveles de proteína (55-58%). Sin detoxificar, puede emplearse
como abono orgánico, debido a su alto contenido de Nitrógeno, similar al del estiércol
de gallina. Las ramas y hojas tiernas se usan también como abono verde para
árboles de coco (Cocus nucifera).
También se usa para preparar barnices después de ser quemadas las semillas
con óxido de hierro, o como un excelente sustituto para aceites industriales. En
Europa se emplea en el hilado de lana y en manufacturas textiles. Se usa junto con
cenizas de quemar plátano para hacer un duro jabón casero (Heller, 1996; Añón,
2001).
Todas las partes de la planta tienen usos medicinales. Según Heller (1996) las
semillas se exportaban de Cabo Verde a Portugal para emplear el aceite como
purgante, aunque es un método muy drástico. La ingestión de dos a tres semillas
actúa como un purgante fuerte y se dice que la ingestión de cuatro a cinco semillas
puede causar la muerte. El aceite de las semillas se usa ampliamente para
enfermedades de la piel y aliviar dolores, como los causados por el reumatismo. El
8
látex tiene propiedades antibióticas contra algunas bacterias, además de efectos
coagulantes, y se aplica directamente en heridas y cortes como antiséptico, así
como para salpullidos, quemaduras e infecciones de la piel. Diversos preparados de
la planta, incluyendo las semillas, las hojas y la corteza, frescas o en decocción, se
usan en la medicina tradicional y como medicamentos veterinarios, por sus efectos
diuréticos, contra edemas, estreñimiento, fiebre y dolores reumáticos (Thomas, 1989;
Heller, 1996).
El aceite de la semilla es una fuente de energía renovable no convencional, de
bajo costo y amigable con el ambiente, además de ser un sustituto para el diesel,
keroseno y otros combustibles (Heller, 1996; Martínez, 2005).
En el Caribe, en la isla de Cuba e Isla de la Juventud, además de las
provincias orientales, se usa para la producción de jabones artesanales y glicerina
(Montes de Oca et al., 2007).
9
2.2 Proteínas vegetales
Las proteínas son parte esencial de la alimentación humana y animal, las de
origen vegetal presentan ciertas ventajas debido al relativo bajo costo de
producción; a que se pueden almacenar por largos períodos y a que son
relativamente fáciles de manejar y transportar en comparación con las proteínas
de origen animal (Segura-Nieto y Jiménez-Flores, 1999).
El rápido crecimiento demográfico de la población mundial determina la
necesidad de encontrar nuevas fuentes proteicas, que complementen a las ya
existentes, para satisfacer la demanda de este nutrimento; en especial en países
en vías de desarrollo, donde la escasez de proteínas de origen animal y su
elevado costo conllevan a serios problemas de desnutrición. En este sentido se
ha dirigido el interés hacia el aprovechamiento de las proteínas vegetales,
procedentes tanto de fuentes convencionales como de no tradicionales en la
alimentación humana, con la finalidad de incorporarlas en la elaboración de
productos alimenticios (Yildirim et al., 1996; Britten y Lavoie, 1992).
Las proteínas vegetales, a diferencia de las de origen animal, son de bajo nivel
biológico (con excepción de la soya, que tiene un valor biológico mayor que la
carne y/o el pescado), esto significa que no contienen todos los aminoácidos
esenciales. Las legumbres y los frutos secos carecen de metionina, mientras que
los cereales si la contienen, pero son deficientes en lisina, a diferencia de las
leguminosas.
Las proteínas de semilla se pueden clasificar en dos categorías: proteínas de
mantenimiento, esenciales para el metabolismo celular, y proteínas de reserva,
las cuales son metabolizadas durante la germinación para proveer una fuente de
Nitrógeno reducido, así como de Carbono y Azufre para las etapas iniciales del
desarrollo de la nueva plántula.
10
2.3 Proteínas de reserva
Las proteínas de reserva se encuentran en mayor proporción, y son
depositadas en cuerpos proteínicos durante el desarrollo del endospermo
(Fukushima, 1991)
El endospermo de los cereales es el principal componente de la semilla ya que
representa aproximadamente el 80-90% de su peso seco. Almidón y proteínas son
las dos macromoléculas más importantes que la conforman. El contenido de proteína
varía según la especie y el manejo de cultivo en campo. Los valores más altos se
dan en trigo y avena (10-17%) y los más bajos en maíz y arroz (6%). La
concentración de proteínas en los cereales es apreciablemente menor que en las
leguminosas ya que en éstas los órganos de reserva o cotiledones son capaces de
almacenar hasta un 40% de su peso seco en proteínas.
La función biológica que presentan es la de proveer esqueletos carbonados y
nitrogenados, siendo estos utilizados durante el desarrollo, se hidrolizan durante la
germinación y el crecimiento de la semilla (Casey y Domoney, 1984).
Por otro lado, las proteínas de reserva representan un aporte significativo a la
alimentación humana porque se acumulan en grandes cantidades en la semilla
(Higgins, 1984; Herman y Larkins, 1999; Gruis et al., 2004).
11
2.3.1 Clasificación de las proteínas de reserva
La clasificación tradicional de las proteínas de reserva fue establecida en 1924
por Osborne de acuerdo a su solubilidad (Cuadro 1).
Cuadro 1. Clasificación de las proteínas de acuerdo a su solubilidad.
PROTEÍNAS SOLUBILIDAD
Albúminas Solubles en soluciones salinas diluidas y en agua
Globulinas Solubles en soluciones salinas
Prolaminas Solubles en etanol 50-80%
Glutelinas Solubles en pH ácidos o básicos
En 1991 Fukushima propuso una nueva clasificación para este tipo de
proteínas, teniendo como criterios la presencia o ausencia de intrones en el gen, la
homología en estructura primaria, la presencia de estructuras repetitivas que tienen
influencia en la estructura secundaria y su ruta biosintética. En vista de esto, ahora
es posible estudiar las proteínas de reserva dividiéndolas solamente en dos
grandes grupos: prolaminas, que engloba a las albúminas y globulinas, y glutelinas.
Aunque las glutelinas y las globulinas tienen patrones distintos de solubilidad, sus
secuencias primarias presentan una identidad del 32 al 37%, ambas se sintetizan a
partir de un precursor grande y se procesan proteolíticamente en un polipéptido ácido
y otro básico; además, se acumulan y almacenan en vacuolas (Katsube et al., 1999).
Sin embargo, en este estudio se optó por utilizar la clasificación de acuerdo a
Osborne (1924) debido a la búsqueda de la caracterización de las fracciones
proteínicas mayoritarias de acuerdo al orden en que se encuentran en la semilla de
Jatropha curcas, no tanto por la presencia o ausencia de intrones en el gen tal como
lo propuesto por Fukushima (1991).
12
2.3.1.1 Albúminas
Las albúminas incluyen moléculas que poseen propiedades funcionales y
muchas son enzimas que metabolizan las sustancias almacenadas en la semilla,
como por ejemplo las proteasas. Estas juegan un papel importante en la degradación
proteínica durante la germinación, otras proteínas juegan un papel muy importante
en la defensa de la planta como son los inhibidores de tripsina y las lectinas. A las
albúminas de tipo 2S se les ha atribuido un papel como proteína de reserva y de
proveer azufre durante la germinación. En la mayoría de las semillas de las
leguminosas las albúminas son buena fuente de lisina y de aminoácidos azufrados
principalmente la metionina (Guëguen y Cerletti, 1994).
2.3.1.2 Globulinas
La fracción de globulinas conforma la mayor parte de las proteínas en ciertos
granos, por lo que han sido ampliamente estudiadas a detalle, principalmente en
leguminosas como chícharo, soya y frijol (Shewry, 1995).
Contienen grandes cantidades de ácido glutámico, ácido aspártico, leucina,
aminoácidos básicos y amidas lo que concuerda plenamente con su función, ya que
la mayoría de estos tienen un alto porcentaje de nitrógeno (Cubero, 1983).
Son clasificadas por sus coeficientes de sedimentación en dos grupos: las
globulinas 7S o también llamadas vicilinas, y las globulinas 11S también llamadas
leguminas (Danielsson, 1949).
Las globulinas 7S (vicilinas) son proteínas triméricas deficientes en
aminoácidos azufrados con pesos moleculares que oscilan entre los 150-190 kDa;
carecen de residuos de cisteína, por lo que las subunidades no presentan enlaces
disulfuro (Shewry, 1995). Generalmente sus subunidades se encuentran glicosiladas;
la primera estructura tridimensional reportada de una proteína de reserva del tipo 7S
fue la faseolina (Lawrence et al., 1990), actualmente las subunidades de la 7S de la
soya y el frijol son las más estudiadas (Coates et al., 1985).
13
Las globulinas 11S (leguminas) son proteínas complejas que consisten de seis
subunidades, cada subunidad está compuesta por dos polipéptidos, uno de punto
isoeléctrico ácido y otro alcalino, los cuales se encuentran unidos mediante un enlace
disulfuro. Por lo general son oligómeros hexaméricos, con enlaces no covalentes, su
peso molecular oscila entre los 50-60 kDa dependiendo de la fuente vegetal (Plietz et
al., 1987), contienen puentes disulfuro (Gueguen y Azanza 1985; Fukushima 1991),
son deficientes en aminoácidos azufrados y no están glicosiladas, excepto las de
Lupinus (Duranti et al., 1996). Entre las globulinas 11S, la legumina del chícharo y la
glicinina de soya son las más conocidas.
2.3.1.3 Prolaminas
Constituyen la fracción proteica principal en cereales como maíz y trigo, son
conocidas por su solubilidad en mezclas alcohol-agua y por sus altos niveles de
prolina y glutamina; sin embargo, la comparación de sus secuencias de aminoácidos
han mostrado que ésta definición debe ser ampliada para incluir a las proteínas que
son insolubles en soluciones alcohólicas en el estado nativo debido a la presencia de
enlaces disulfuro ínter cadena. Por otra parte, se ha conocido que las prolaminas,
aún las que son insolubles en soluciones alcohólicas, están relacionadas por su
estructura y constituyen una superfamilia de la cual está excluida la alfa del maíz
(Shewry, 1995).
2.3.1.4 Glutelinas
Las glutelinas más estudiadas son las aisladas del trigo, las cuales tienen un
intervalo de peso molecular de unos cientos de miles de kDa (Huang y Khan, 1997).
Estas glutelinas son agregados insolubles en alcohol, en las que muchas
subunidades con pesos moleculares de 95 a 145 kDa, son estabilizadas por enlaces
disulfuro; sin embargo son esencialmente un grupo de prolaminas, ya que cuando
son disociadas, las unidades se vuelven solubles en alcohol (Fukushima, 1991).
14
2.3.2 Proteínas vegetales de mayor importancia: Soya
Las proteínas de soya están constituidas principalmente por las del tipo
Globulinas (Cuadro 2). A pH ácido, las globulinas de soya precipitan quedando en el
sobrenadante las denominadas proteínas del suero (Zarcadas et al., 1994).
Cuadro 2. Características de las principales globulinas de soya (Tomado de
Arrese et al., 1991).
Hay dos proteínas de almacenamiento principales en la semilla de soya, la
glicinina y β-conglicinina, las que en conjunto representan hasta el 70% de las
proteínas de reserva en base al peso seco. La glicinina está constituida por seis
subunidades no idénticas y cada subunidad posee una cadena ácida de pesos
moleculares (PM) entre 37 y 42 kDa y subunidades básicas de PM entre 17 y 20 kDa
ligadas a un único puente disulfuro. La β-conglicinina es una glicoproteína compuesta
Proteínas
Masa
molecular
(kDa)
Componentes de
cada proteína
PM (kDa) de los
componentes y
composición
% proteína
respecto a
globulinas
totales
Globulina 11 S
o glicinina
350-380 Tres subunidades ácidas 31-38 (40-50%) 40%
Tres subunidades básicas 18-20 (50-60%)
Globulina 7 S
(β-conglicinina)
180 Combinaciones de tres
subunidades α, α’, β
α: 57-76 (40-45%)
α’: 57-83 (25-32%)
β: 42-53 (29-33%)
30%
Globulinas 7 S
(γ-conglicinina)
170 Tres subunidades - 3%
Globulina 15 S 600 - - Componente
minoritario
Globulinas 2 S 21 α-conglicinina
Inhibidor de la
Tripsina
21 Componente
minoritario
15
por tres subunidades, α´, α y β, con PM de 76, 66 y 47 kDa, respectivamente.
Durante los primeros estadios de la germinación las proteínas de almacenamiento
son degradadas por proteólisis a polipéptidos de menor PM o a aminoácidos. Fukuda
et al. (2005) reportan en cultivares de soya veintiún líneas con presencia de banda
de β* de movilidad más rápida que β, además tres líneas presentan A3* mientras
soya silvestre carece de éstas (Figura 1).
2.4 Electroforesis
La electroforesis en gel de poliacrilamida es un método de separación de
moléculas de acuerdo a su carga eléctrica y su peso molecular, es una técnica
sensible, fácil, económica, que presenta alta resolución y la capacidad de analizar
gran número de muestras de proteínas en un período de tiempo corto (Sathe et al.,
1987). La técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970), es muy utilizada para el estudio de
proteínas en soya (Hu & Esen, 1981; Hughes & Murphy, 1983).
16
2.4.1 Patrón proteínico de semillas de soya
Figura 1. Patrón SDS-PAGE de proteínas de soya cultivada, soya salvaje y
sus variantes. α’, α y β indican subunidades de β-conglicinina. A y B indican
polipéptidos ácidos y básicos de glicinina respectivamente. Bandas con movilidad
única están marcadas con asterisco. Carril 1, soya cultivada; 2, soya salvaje; 3, β.β*;
4, β*; 5, α’ pequeña; 6, A3 pequeña; 7, A4 grande.
17
2.4.2 Análisis electroforético de las proteínas de reserva de semilla de
Jatropha curcas.
En los pocos reportes que se han generado de la caracterización de las
proteínas de reserva de J. curcas, se ha reportado que los pesos moleculares de las
fracciones tienen diferentes subunidades en un rango de peso molecular de 76 hasta
por debajo de 19kDa en condiciones desnaturalizantes (Figura 2). Sin embargo, a
pesar de estos reportes solamente han sido de un solo material, por lo que es posible
que estos patrones electroforéticos varíen debido a factores genéticos y ambientales.
Figura 2. Patrón SDS-PAGE de la harina desgrasada de semillas de J.
curcas. Carriles (M) marcadores, (a) Albúminas, (b) Globulinas, (c) Glutelinas, (d)
Prolaminas.
18
2.5 Caracterización funcional
2.5.1 Propiedad funcional
La mayoría de las propiedades funcionales afectan al carácter sensorial del
alimento y al comportamiento físico del alimento durante su preparación,
transformación o almacenamiento (Endres, 2001). Es también una propiedad
fisicoquímica de los polímeros que afecta y modifica algunas características de un
alimento y que contribuye a la calidad final del producto.
Las propiedades funcionales de las proteínas de uso alimenticio pueden
clasificarse en tres grupos (Endres, 2001; Katsaras y Peetz, 1994):
1. Propiedades de hidratación, que dependen de las interacciones proteína-
agua (absorción y retención de agua, hinchamiento, adhesión, solubilidad y
viscosidad).
2. Propiedades basadas en las interacciones proteína-proteína (precipitación,
gelificación y formación de diferentes estructuras).
3. Propiedades basadas en interacciones superficiales (propiedades
emulsionantes y espumantes).
Las características fisicoquímicas y las interacciones con otros componentes en el
alimento, determinan el valor de una proteína dentro de un sistema alimenticio. Por
consiguiente, para ser utilizadas en aplicaciones alimentarias las proteínas deben
tener, en adición a su valor nutricional, ciertas propiedades funcionales que le
confieran capacidad para suministrar textura, estabilidad física y otras condiciones
deseables en el producto donde se incorporen (Yildirim et al., 1996; Britten y Lavoie,
1992).
Varios estudios se han realizado sobre la obtención de concentrado y aislados
proteínicos de fuentes vegetales; así como también acerca de la propiedades
funcionales de los mismos; lo cual ha conducido un incremento sin precedentes en la
19
producción y uso de materiales como ingredientes y en la fortificación de alimentos.
Aunque la soya ha sido la materia prima más utilizada al respecto, oleaginosas como
el cacahuate, el girasol y otras leguminosas como los frijoles comunes (Phaseolus
vulgaris), chícharos (Pisum sativum), habas (Vicia faba), también se han empleado
con este propósito en muchas preparaciones alimenticias (King et al., 1985; Sathe et
al., 1982; Induraine et al., 1991).
Algunas de las propiedades funcionales que imparten las proteínas son:
a) Solubilidad
Las proteínas son solubles en agua cuando adoptan una conformación
globular. La solubilidad es debida a los radicales (-R) libres de los
aminoácidos que, al ionizarse, establecen enlaces débiles (puentes de
hidrógeno) con las moléculas de agua. Así, cuando una proteína se
solubiliza queda recubierta de una capa de moléculas de agua (capa de
solvatación) que impide que se pueda unir a otras proteínas lo cual
provocaría su precipitación (insolubilización). Las propiedades funcionales
de las proteínas a menudo se ven afectadas por la solubilidad de la
proteína, especialmente en el caso del hinchamiento, espumado,
emulsificación y gelificación. Las proteínas insolubles tienen un uso muy
limitado en alimentos. La solubilidad de una proteína es la manifestación
termodinámica del equilibrio entre las interacciones proteína - proteína y
solvente - proteína, que a su vez dependen de la hidrofobicidad (Badui,
2006).
20
b) Capacidad de absorción de agua
Las proteínas en estado seco se hidratan mediante sus aminoácidos
hidrófilos y retienen una cantidad de agua que está en equilibrio con la
humedad relativa del medio ambiente; y ésta depende de la naturaleza de
los grupos polares que la constituyen. Este es un parámetro importante
desde el punto de vista tecnológico. En productos horneados, una alta
capacidad de absorción de agua contribuye a reducir la pérdida de
humedad de los productos envasados, lo que permite que se mantengan
frescos (Chandi y Sogi, 2007).
c) Capacidad de absorción de aceite
A veces resulta conveniente que los ingredientes proteínicos
deshidratados adsorban cierta cantidad de aceite y la retengan (Cheftel et
al., 1993). Esta propiedad es esencial en la formulación de sistemas
alimentarios como salchichas, batidos, mayonesas o aderezos salados. La
materia grasa en un alimento es fundamental para aumentar la
palatabilidad del mismo.
d) Hidrofobicidad
Consiste en determinar la composición de aminoácidos no polares
presentes en la proteína, a mayor hidrofobicidad la composición de grupos
hidrófobos aumenta, de igual manera la absorción de aceite aumenta
(Cheftel et al., 1993).
21
III. JUSTIFICACIÓN
Las semillas de Jatropha curcas son muy ricas en composición de aceites, lo que,
entre otras características de la planta, ha despertado el interés de grupos científicos
alrededor del mundo en el estudio de J. curcas para la producción de
biocombustibles, específicamente biodiesel. De dicha actividad se desprenden
subproductos, entre estos una pasta con alto contenido de proteína (hasta un 60%)
que actualmente no es aprovechada al máximo con fines de alimentación.
Tal contenido de proteína es elevado en comparación a otras fuentes vegetales
que actualmente son utilizadas en la industria alimentaria, dando pauta a la
caracterización de las proteínas vegetales de fuentes alternas como lo es J. curcas,
que permitan conocer el potencial de su utilización en alimentación, por lo tanto es
necesario conocer las características funcionales de las fracciones mayoritarias de
las proteínas de J. curcas para establecer su potencial en la industria alimenticia.
22
IV. HIPÓTESIS
Las proteínas de reserva de Jatropha curcas están compuestas principalmente
por las fracciones de tipo globulinas y glutelinas, y estas presentan propiedades
funcionales requeridas por la industria alimentaria.
V. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general
Obtener las principales fracciones proteicas de reserva de semillas no
tóxicas de Jatropha curcas y determinar sus propiedades funcionales.
5.2 Objetivos específicos
1. Seleccionar un método adecuado para la extracción de las proteínas de
reserva de semilla de J. curcas no tóxica.
2. Caracterizar electroforéticamente las principales fracciones proteínicas de
semilla de J. curcas no tóxica.
3. Caracterizar funcionalmente las principales fracciones proteínicas de
semilla de J. curcas no tóxica.
23
VI. MATERIAL Y MÉTODOS
6.1 Obtención de harina de J. curcas
Las semillas de J. curcas fueron molidas en un molino pulverizador Retsch
modelo MM301 y la harina resultante se pasó a través de un tamiz de 0.5 mm. La
extracción de aceite se realizó mezclando la harina con hexano en una relación
1:10 harina:solvente, se mantuvo en agitación a 4 °C durante 12 h,
posteriormente se recuperó la harina filtrando la mezcla a través de papel filtro
Whatman No.1. El proceso se realizó dos veces para disminuir al máximo el
contenido de aceite. La harina desgrasada se almacenó a 4 °C hasta su empleo.
6.2 Extracción de proteínas de reserva
Las fracciones proteínicas de J. curcas fueron extraídas secuencialmente
empleando tres métodos distintos, dos de estos reportados previamente, Osborne
(1924) y Ferreira (2000), empleando soluciones de extracción apropiadas para
cada una de ellas, el tercer método resulta de la combinación de los pasos 1 y 2
del método Osborne, seguido de los pasos 3 y 4 del método Ferreira (Figura 3).
En el método Combinado las albúminas fueron extraídas a partir de harina
desgrasada agitándose por 2 horas a 4 °C en agua (g de harina/10 ml). Las
proteínas insolubles se removieron de la solución mediante centrifugación a
10,000 g durante 30 min a 4 °C. La extracción de globulinas se realizó a partir de
la pastilla resultante de la extracción anterior, resuspendiendo la pastilla en
solución NaCl al 10% pH 7 y agitándose durante 2 h a 4 °C, las globulinas
solubilizadas se obtuvieron centrifugando como se describió anteriormente. Las
prolaminas se obtuvieron resuspendiendo la pastilla obtenida de la fracción de
globulinas en etanol al 75% (1 g/5 mL), se agitó durante una noche a 4 °C,
posteriormente esta fracción se obtuvo centrifugando a 20,000 g a 4 °C por 80
min. El sobrenadante contiene las prolaminas, mientras que de la pastilla
24
resultante se obtendrán las glutelinas, resuspendiendo (1 g/5 ml) ésta en buffer de
borato de sodio 50 mM, pH 10, conteniendo 2-mercaptoetanol 1% (v/v), SDS 1%.
La suspensión se agitó por 4 h a temperatura ambiente y posterior centrifugación a
20,000 g por 80 min a 20 °C. Todas las fracciones solubles se almacenaron a -70
°C hasta su uso.
Figura 3.- Extracción secuencial de las fracciones proteínicas de reserva en
semillas de J. curcas no tóxica, mediante el método Combinado.
a) b)
1
2
3
4
1
2
3
4
25
6.3 Composición proximal de la harina
El análisis proximal de la harina de J. curcas fue realizado mediante servicio
externo en el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR), La Paz.
6.4 Determinación de proteína
La determinación de proteína se realizó usando el reactivo de Bradford
(SIGMA), ajustado a sistemas de placa de 96 pozos, empleando un sistema
Beckman Coulter DTX 880 y como estándar Albúmina de suero bovino (BSA) de la
compañía Sigma-Aldrich.
6.5 Electroforesis en gel de poliacrilamida
La electroforesis en gel de poliacrilamida es un método sensible, fácil,
económico, que presenta alta resolución y la capacidad de analizar gran número de
muestras de proteínas en un período de tiempo corto (Sathe et al., 1987).
Mediante electroforesis en geles de poliacrilamida se determinaron los
componentes de las proteínas presentes en cada una de las fracciones de las
proteínas de reserva de J. curcas. Se realizaron geles desnaturalizantes (SDS-
PAGE) con y sin condiciones reductoras (2-mercaptoetanol). Las proteínas se tiñeron
con azul de Coomassie y se fotodocumentaron en un sistema Gel-Doc y fueron
analizados empleando el software Quantity-One (Bio-Rad). Los marcadores de peso
molecular se adquirieron de la casa comercial Bio-Rad, adecuados para cada uno de
las electroforesis. Los resultados de la electroforesis brindaron información acerca de
cómo se encuentran las proteínas almacenadas en semilla, así como que tipo de
interacción las mantiene unidas: covalentes o puente disulfuro.
26
6.6 Evaluación funcional
Una vez obtenidas las proteínas de reserva a evaluar, se determinaron
algunas propiedades funcionales, lo que permitirá establecer potenciales
aplicaciones de estas. Las principales proteínas de reservas se evaluaron como se
menciona a continuación:
6.6.1 Solubilidad
La determinación del perfil de solubilidad de las principales fracciones proteínicas
de J. curcas fue realizado mediante los métodos descritos por Paredes-López (1988)
y Maruyama (1999).
Brevemente se prepararon suspensiones con las proteínas al 10 % (p/v) y se les
ajustó el pH en el rango de 2-12 usando ya sea HCl 0.1 M ó NaOH 0.1 M, las
suspensiones se agitaron durante 30 min a temperatura ambiente (25°C) y
posteriormente se tomó 1 ml de la suspensión y se centrifugó a 12,000 g por 5 min a
25°C y se mantuvo en reposo por 18 h a 4°C. El contenido de proteína se determinó
mediante el método de Bradford (1976), tal como se describió en la sección 6.4.
La solubilidad fue expresada en porcentaje de solubilidad: del contenido de
proteína en el sobrenadante con respecto al contenido de proteína total.
6.6.2 Capacidad de absorción de agua
La capacidad de absorción de agua se determinó de acuerdo a los métodos
reportados por Wang y Kinsella (1976) y Kabirullah y Wills (1982).
Se pesaron 0.5 g proteína y se colocaron en un tubo graduado para centrífuga, se
les agregó 5 mL de agua destilada, se agitaron en un vortex por 1 min y se dejaron
en reposo por 30 min. Posteriormente se centrifugaron a 1600 g durante 25 min.
Se midió el volumen del agua inicial y el volumen de agua libre después de la
centrifugación y se expresó en g de agua absorbida/g de proteína.
27
6.6.3 Capacidad de absorción de aceite
La capacidad de absorción de aceite se determinó de acuerdo a los métodos
propuestos por Lin (1974) y Ordorica-Falomir (1988).
Se pesaron 0.5 g de proteína y se le adicionaron 3 mL de aceite de oliva en un
tubo graduado para centrífuga, se agitaron durante 1 min en un vortex, se dejaron
reposar durante 30 min y finalmente se centrifugó a 1600 g durante 25 min.
Se midió el volumen de aceite libre. La capacidad de absorción de aceite se
expresó como ml de aceite absorbido/g de proteína.
6.6.4 Superficie de hidrofobicidad
La superficie de hidrofobicidad de la proteína se determinó mediante el
método reportado por Hayakawa y Nakai, 1985. Utilizando como sonda 1-anilino-8-
naftaleno sulfonato (ANS). La proteína se preparó en cinco concentraciones distintas
(0.05, 0.1, 0.2, 0.3 y 0.5 mg/ml) disueltas en buffer de fosfatos 0.01 M pH 7.
Posteriormente se mezcló la proteína y la ANS a 8 mM en una relación 1:5. La
intensidad de fluorescencia se registró a 390 nm de excitación y 470 nm de emisión
utilizando un sistema multimodal Beckman Coulter DTX 880. Se usaron como control
Albúmina de suero bovino (BSA) y Ovoalbúminas, preparadas a las mismas
concentraciones y tratamientos que la proteína.
28
VII. RESULTADOS
7.1 Composición proximal de la harina de J. curcas
Se realizó el análisis proximal de la harina sin desgrasar y desgrasada de las
semillas de J. curcas (Cuadro 3), encontrándose en la harina sin desgrasar un
contenido de proteína de 25 ± 0.05% y un alto contenido de grasa de 52.9 ± 0.01%,
mientras que en la harina desgrasada se encontró un incremento en el contenido de
proteína de 25 ± 0.05% a 57.13 ± 0.14% y lógicamente una disminución en el
contenido de grasa, hasta a 5.30 ± 0.22% en comparación a los 52.9 ± 0.01%
presentes en la harina sin desgrasar.
Cuadro 3. Composición proximal de la harina sin desgrasar y desgrasada de
las semillas de Jatropha curcas no tóxica ecotipo Puebla.
Componente Porcentaje 1,2
Harina
sin desgrasar
Harina
desgrasada
Proteína 25 ± 0.05 57.13 ± 0.14
Grasa 52.9 ± 0.01 5.30 ± 0.22
Cenizas 4.48 ± 0.05 9.89 ± 0.15
Fibra 0.93 ± 0.05 4.42 ± 0.19
Carbohidratos* 16.7 23.27
1% en base seca 2Promedio de tres repeticiones ± desviación estándar *Por diferencia
29
El contenido de cenizas presentes en la harina de J. curcas no tóxica fue de 4.48
± 0.05% para la harina sin desgrasar mientras que para la harina desgrasada fue
mayor con un 9.89 ± 0.19%; de fibra se encontró en la harina sin desgrasar un 0.93 ±
0.05% el cual fue menor que el presente en la harina desgrasada con un valor de
4.42 ± 0.19%. En cuanto a carbohidratos presentes en las harinas, se obtuvieron
16.7% y 23.27% en la harina sin desgrasar y desgrasada respectivamente.
7.2 Extracción y determinación de las proteínas de reserva
Como resultado de la extracción y cuantificación de proteína de las tres
fracciones por los tres métodos empleados se obtuvo como fracción mayoritaria a la
fracción tipo glutelinas, seguida por globulinas, albúminas y en menor cantidad
prolaminas (Cuadro 4).
Cuadro 4. Composición de las proteínas de reserva presentes en semilla de J.
curcas no tóxica ecotipo Puebla.
Fracción Osborne Ferreira Combinado
Albúminas 9.69 ± 0.04 9.65 ± 0.01 11.84 ± 0.02
Globulinas 17.12 ± 0.01 15.19 ± 0.02 18.73 ± 0.04
Prolaminas 6.63 ± 0.01 6.05 ± 0.01 5.79 ± 0.01
Glutelinas 36.77 ± 0.02 37.18 ± 0.01 39.78 ± 0.02
Residuos 29.79 ± 0.03 31.93 ± 0.03 23.86 ± 0.04
% de cada fracción obtenida por los tres métodos distintos de extracción Promedio de tres repeticiones
30
Se decidió emplear un paso de diálisis para todas las fracciones con la intención
de minimizar el efecto adverso que pudieran presentar las sales usadas durante la
purificación, como resultado se observó un ajuste en los resultados de distribución de
proteínas (Cuadro 5).
Cuadro 5. Distribución en porcentaje de las fracciones proteínicas obtenidas por
el método Combinado con diálisis a partir de la semilla de J. curcas no tóxica ecotipo
Puebla.
Fracción Combinado
Albúminas 12.35 ± 0.02
Globulinas 20.2 ± 0.01
Prolaminas 6.2 ± 0.01
Glutelinas 42.02 ± 0.03
Residuos 19.25 ± 0.01
% de cada fracción obtenida por el método Combinado Promedio de tres repeticiones
31
7.3 Electroforesis
Se obtuvo el patrón electroforético mediante la electroforesis en gel de
poliacrilamida de las cuatro fracciones obtenidas de cada uno de los métodos
evaluados: Osborne, Modificado por Ferreira y Combinado (Figura 4). La fracción de
albúminas representó la tercera fracción mayoritaria con un 12.35 ± 0.02% respecto
al total de proteína de la semilla, para esta fracción se observó un patrón
electroforético que oscila desde los 15 kDa – 35 kDa; específicamente con el método
de Osborne se obtuvieron cinco bandas principales de 15, 17, 20, 25 y 28 kDa, el
método Modificado por Ferreira mostró cuatro bandas principales de 15, 17, 20 y 28
kDa, mientras que el método Combinado presentó cinco bandas principales de 15,
17, 20, 25 y 35 kDa.
Figura 4. Patrón electroforético de las proteínas de reserva de semillas de J.
curcas no tóxica en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) extraídas por
diversos métodos. M, marcador de peso molecular; 1, albúminas; 2, globulinas; 3,
prolaminas; 4, glutelinas.
32
Por su parte la fracción globulinas representó la segunda fracción mayoritaria de
las proteínas de reserva de J. curcas con un 20.2 ± 0.01% respecto a la proteína
total, para esta fracción se obtuvieron en general pesos moleculares que van desde
los 12 hasta los 73 kDa; se obtuvieron mediante el método de Osborne nueve
bandas principales de 12, 17, 27, 30, 33, 45, 58, 61 y 73 kDa, el método Modificado
por Ferreira mostró tan solo cinco bandas principales de 13, 17, 30, 37 y 48 kDa,
mientras que el método propuesto (Combinado) presentó nueve bandas principales
de 14, 18, 29, 32, 36, 45, 58, 60 y 73 kDa, el cual mostró una mayor definición de
bandeo con respecto a los otros métodos analizados.
Como fracción mayoritaria se encontró a la fracción tipo glutelinas, las cuales
representan el 42.02 ± 0.03% de la proteína respecto a la proteína total presente en
la semilla de J. curcas, para esta fracción se obtuvieron pesos moleculares de 12 -
44 kDa por los tres métodos, siendo para el método de Osborne pesos moleculares
encontrados en tres bandas principales de 14, 24 y 44 kDa, el método Modificado por
Ferreira presentó de igual manera tres bandas principales, correspondiendo sus
pesos moleculares a 12, 17 y 34 kDa, mientras que el método Combinado presentó
una mejor definición en su patrón electroforético con tres bandas principales de 15,
20 y 35 kDa.
De igual manera se realizó una electroforesis a partir del método Combinado, en
el cual se observa además de las fracciones proteicas obtenidas el patrón
electroforético de la harina total de J. curcas y el residuo obtenido de la extracción
con el método ya mencionado, cabe mencionar que la corrida electroforética se
realizó en condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes (Figura 5).
En resumen, se observó un patrón electroforético mejor en las proteínas
correspondientes al método Combinado al compararlos con los otros dos métodos.
Principalmente lo que refiere a los patrones de proteínas en globulinas, donde se
resuelven de mejor manera por el método de Osborne y el Combinado, pero no así
por el método propuesto por Ferreira, en cambio las glutelinas se comportan de
manera contraria, siendo bien resueltas de manera más adecuada en el método de
33
Ferreira y el Combinado, y no así en el de Osborne. Por lo anterior, las proteínas del
método Combinado fueron empleadas para los siguientes análisis.
Figura 5. Patrón electroforético de las proteínas de reserva de semillas de J.
curcas no tóxica en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) extraídas por el
método combinado. M, marcador de peso molecular; 1,2 albúminas; 3,4 globulinas;
5,6 prolaminas; 7,8 glutelinas; 9,10 harina; 11,12 residuos. En condiciones: no
desnaturalizantes (-) y desnaturalizantes (+).
kDa
160
80
50
35
20
15
M 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 M
- + - + - + - + - + - +
34
7.4 Caracterización funcional
Se determinaron distintas propiedades funcionales a las fracciones mayoritarias
obtenidas empleando el método Combinado a partir de semillas de Jatropha curcas
no tóxica ecotipo Puebla, tanto a glutelinas como a globulinas; encontrando como
resultado los siguientes valores:
7.4.1 Solubilidad
En este estudio se realizó la prueba de solubilidad para las fracciones
mayoritarias, siendo éstas de mayor interés por encontrarse más abundantes dentro
de las proteínas de reserva de la semilla de J. curcas no tóxica. Se realizó en función
del pH de 2-12, observándose un aumento directamente proporcional al pH alcalino
en ambas fracciones; para la fracción mayoritaria (glutelinas) se encontró que la
mayor solubilidad fue a pH 12 con un 80.1 ± 0.01%, mientras que a pH 2 la
solubilidad fue menor con tan solo un 3.3 ± 0.01%, mientras que para la fracción
globulinas se encontró que la mayor solubilidad fue a pH 12 con un 70.01 ± 0.02%,
mientras que a pH 2 la solubilidad fue prácticamente nula con tan solo un 0.04 ±
0.01% (Figura 6).
35
Figura 6. Efecto del pH en la solubilidad de las fracciones glutelinas y globulinas
en semillas de J. curcas no tóxica ecotipo Puebla.
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
90.0
2 4 6 8 10 12
% s
olu
bili
dad
pH
Solubilidad
Glutelinas
Globulinas
36
7.4.2 Absorción de agua
Se determinó la propiedad funcional de absorción de agua para ambas fracciones
proteínicas de acuerdo al método descrito por Wang y Kinsella (1976); Kabirullah y
Wills (1982), obteniendo como resultado para glutelinas y globulinas 1.54 ± 0.004 y
1.06 ± 0.005 g de agua/g de proteína respectivamente (Cuadro 6).
Cuadro 6. Capacidad de absorción de agua de las principales fracciones
proteínicas correspondientes a glutelinas y globulinas en semillas de J. curcas no
tóxica ecotipo Puebla.
Fracción g de agua/g de proteína
Glutelinas 1.54 ± 0.004
Globulinas 1.06 ± 0.005
37
7.4.3 Absorción de aceite
Se determinó la propiedad funcional de absorción de aceite mediante el método
descrito por Lin (1974); Ordorica-Falomir (1988) tanto en la fracción mayoritaria, las
glutelinas como en la segunda fracción mayoritaria, las globulinas y se obtuvo como
resultado una capacidad de absorción de aceite por parte de la proteína del 5.96 ±
0.04 y 1.01 ± 0.02 ml de aceite/g de proteína respectivamente (Cuadro 7).
Cuadro 7. Capacidad de absorción de aceite de las principales fracciones
proteínicas correspondientes a glutelinas y globulinas en semillas de J. curcas no
tóxica ecotipo Puebla.
Fracción ml de aceite/g de proteína
Glutelinas 5.96 ± 0.04
Globulinas 1.01 ± 0.02
38
7.4.4 Superficie de hidrofobicidad
La superficie de hidrofobicidad de las principales fracciones proteínicas se
determinó mediante el método reportado por Hayakawa y Nakai, 1985.
Obteniendo a la fracción glutelinas y globulinas con una hidrofobicidad distinta
(Figura 7). En este caso se emplearon dos proteínas de referencia: Albúmina de
suero bovino (BSA) y proteínas obtenidas de clara de huevo: Ovoalbúminas.
El valor de la pendiente presente en la fracción glutelinas (Figura 7 A) es
mayor a la encontrada en la proteína de referencia de Ovoalbúminas, sin
embargo fue menor a la Albúmina de suero bovino:
BSA: 496, 009, 8.51 > Glutelinas: 62, 939, 2.18 > Ovoalbúminas: 5, 843, 2.60
Por su parte, la fracción globulinas (Figura 7 B) mostró un valor bajo, al
compararla con la proteína de referencia de Ovoalbúminas:
Ovoalbúminas: 3, 432, 3.64 > Globulinas 1, 342, 8.39
39
A)
B)
Figura 7. Superficie de Hidrofobicidad presente en las fracciones mayoritarias
correspondientes a Glutelinas (A) y Globulinas (B) a distintas concentraciones.
y = 5E+08x - 2E+06 y = 6E+07x + 1E+07 y = 6E+06x - 412550
0.00E+00
5.00E+07
1.00E+08
1.50E+08
2.00E+08
2.50E+08
3.00E+08
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Un
idad
es
de
flo
ure
sce
nci
a
mg/ml
Albúmina de suero bovino Glutelinas Ovoalbúminas
y = 1E+06x + 96566 y = 3E+06x + 58213
0.00E+00
2.00E+05
4.00E+05
6.00E+05
8.00E+05
1.00E+06
1.20E+06
1.40E+06
1.60E+06
1.80E+06
2.00E+06
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Un
idad
es
de
flo
ure
sce
nci
a
mg/ml
Globulinas Ovoalbúminas
40
VIII. DISCUSIÓN
8.1 Composición proximal de la harina
El análisis proximal en la harina sin desgrasar reveló un contenido de proteína
de 25 ± 0.05%, lo cual se encuentra dentro de lo reportado para la composición de
proteína en semillas de leguminosas, que es de 19 a 30% y ésta a su vez es mayor a
la composición de cereales que va de 7 a 17% (Bernardino et al., 2006); valores
similares han sido reportados para harina sin desgrasar de J. curcas por otros
autores con un contenido de 24.3 ± 0.5% (Peralta-Flores et al., 2012). Se han
reportado porcentajes relativos de proteína en un intervalo de 23 a 27% en distintos
ecotipos de J. curcas originarios de Cabo Verde, India, Nicaragua y Nigeria (Makkar,
1997; Castil, 1991). Mientras que en la harina desgrasada se registró un aumento
considerable en el porcentaje de proteína de 25 ± 0.05 a 57.13 ± 0.14, que coincide
con lo encontrado en harina de J. curcas proveniente de Cabo Verde, Nicaragua y
Nigeria, en la cual se cuantificaron, porcentajes de 57.3, 61.9 y 56.1%
respectivamente (Makkar, 1998). Por su parte Peralta-Flores et al., 2012 reportan un
menor contenido de proteína de 45.3 ± 1.0% con respecto a lo encontrado en este
estudio, esto puede ser debido al tratamiento sometido de la harina al momento de
desgrasar, ya que en este estudio se realizó una relación mayor de harina:solvente,
además de haber realizado el proceso de extracción de aceite en dos ocasiones.
El contenido de grasa en la harina sin desgrasar fue de 52.9 ± 0.01%, un
porcentaje igual reportan Peralta-Flores et al., 2012, sin embargo en la harina
desgrasada hubo una alta disminución en el contenido de grasa a 5.30 ± 0.22% en
comparación a los 29 ± 0.5% reportados por Peralta-Flores et al., 2012, como se
mencionó anteriormente se sugiere que el tratamiento dado en este estudio es más
adecuado en la extracción de grasas para esta semilla. Por otro lado, el contenido de
grasa de J. curcas es mayor al reportado para otras semillas, para soya (18-20%),
lupino (15-20%), cacahuate y girasol con un 50 y 40 % respectivamente, lo que
41
confirma de nuevo que esta semilla desde el punto de vista de contenido de lípidos,
tiene un potencial alto para la producción de biocombustibles.
El contenido de cenizas presentes en la harina de J. curcas no tóxica
analizada en este proyecto fue de 4.5 ± 0.05% para la harina sin desgrasar,
porcentaje muy similar a lo reportado por Peralta-Flores et al. (2012), quienes
determinaron un 4.7 ± 0.5%, también en harina sin desgrasar. Mientras que para la
harina desgrasada fue mayor con un 9.9 ± 0.19% en comparación a lo reportado por
dichos autores (8.6 ± 0.4%), además, en este estudio se obtuvo un valor de cenizas
muy similar a lo reportado por Makkar (1998), donde se encontraron porcentajes de
cenizas de 9.6, 10.4 y 9.6 en las variedades Cabo Verde, Nicaragua y Nigeria
respectivamente.
Con respecto al contenido de fibra total, se determinaron porcentajes del 0.9 ±
0.05% en harina sin desgrasar, contenido que fue menor al 4.4 ± 0.19% encontrado
en harina desgrasada; en ambos casos el contenido de fibra total determinado en
este trabajo fue notablemente menor a lo descrito por Peralta-Flores et al. (2012) en
J. curcas, quienes reportaron un 8.1 ± 0.7% y por Makkar (1998) en cuyo trabajo se
reporta un promedio de 15.4% en las tres variedades de J. curcas analizadas.
En cuanto a carbohidratos para la harina sin desgrasar se obtuvo un total de
16.7%, valor similar a la reportado por Peralta-Flores et al. (2012) con un 13.3%, por
su parte Makkar (1998) reporta un promedio de 12.5%; mientras que en este trabajo
en la harina desgrasada se obtuvo un valor mayor (23.27%) a lo reportado por
Makkar (1998) (15.1%) y menor a lo reportado por Peralta-Flores et al. (2012)
(35.0%).
42
8.2 Extracción y determinación de las proteínas de reserva
Las proteínas de reserva presentes en las semillas de J. curcas fueron extraídas
de manera secuencial por los tres métodos de extracción diferentes, descritos en la
sección de materiales y métodos; en base a su solubilidad: albúminas solubles en
soluciones acuosas, globulinas en soluciones salinas, prolaminas en soluciones
alcohólicas y por último glutelinas en soluciones básicas.
El método de extracción que permitió el mejor rendimiento y un patrón
electroforético más definido fue el método Combinado, el cual fue estandarizado en
nuestro grupo de trabajo. Debido a esto se optó realizar la extracción de las
proteínas con éste método; y se obtuvo un aumento en porcentaje de la fracción
mayoritaria del 36.77 ± 0.02 al 39.78 ± 0.02% y un decremento en los residuos de la
extracción del 29.79 ± 0.03 al 23.86 ± 0.04%, por lo tanto se observó que al disminuir
los residuos favorece al aumento de la fracción tipo glutelinas, ya que estas se
encuentran en el último paso de la extracción y al no solubilizarse completamente
pasan a los residuos, para cerciorarse de ello se realizó una corrida electroforética de
los residuos, se observó el patrón de bandeo presente y al compararlo con las
glutelinas presentaron un perfil electroforético idéntico.
La fracción mayoritaria glutelinas presentó un 39.78 ± 0.02% de la proteína
extraída, datos obtenidos por Selje-Assmann et al. (2007) presentan de igual manera
como fracción mayoritaria a glutelinas; sin embargo el valor encontrado por estos
autores es mayor al reportado en este trabajo, con un 56.9%, esto probablemente se
deba al bajo contenido de residuos que ellos obtuvieron en comparación al nuestro,
aunado a esto, las variaciones que pueda presentar por ser el promedio mostrado de
tres variedades distintas. Por su parte Peralta-Flores et al. (2012) obtuvieron de igual
manera a glutelinas como la fracción proteínica mayoritaria con un 37.8% y un
residuo de 20.6%, valor cercano al obtenido en este estudio siendo el residuo de
23.86 ± 0.04%, lo que sugiere que el contenido de glutelinas es directamente
proporcional al contenido de residuo generado en la actividad.
43
La segunda fracción mayoritaria fue globulinas, se obtuvo un valor muy cercano
al 20.1% reportado por Peralta-Flores et al. (2012), por su parte Selje-Assmann et al.
(2007) reporta a globulinas en un porcentaje de 27.4% que resultó un poco mayor a
lo determinado en este proyecto y a lo reportado por Peralta-Flores en el 2012.
En menor cantidad se encontraron albúminas y prolaminas (11.84 y 5.79%
respectivamente) tal como han sido reportadas por Selje-Assmann et al. (2007) y
Peralta-Flores et al. (2012) con un 10.8, 0.6% y 15.1, 6.4% respectivamente.
Al agregar la técnica de diálisis al proceso en la extracción mediante el método
Combinado se obtuvo una mejora en la eficiencia de extracción, debido a que las
moléculas más pequeñas y los iones atraviesan los poros de la membrana
semipermeable, pudiendo de esta manera retirar las sales o detergentes presentes
en la muestra y así al disminuir su concentración la proteína se obtiene más pura, lo
cual permitió un aumento en las fracciones globulinas y glutelinas del 18.73 ± 0.04 y
39.78 ± 0.02 al 20.2 ± 0.01 y 42.02 ± 0.03% respectivamente.
44
8.3 Electroforesis
Se obtuvo el patrón electroforético mediante SDS-PAGE de las distintas
fracciones obtenidas por los tres métodos de extracción utilizados: Osborne, Ferreira
y Combinado, encontrando como mejor método de extracción al método Combinado,
ya que nos permitió visualizar las bandas de tres de las cuatro proteínas de reserva
presentes en la semilla de J. curcas, siendo albúminas, globulinas y glutelinas las
principales. Aunado a esto presentó mayor definición en las bandas correspondientes
a cada fracción, permitiendo determinar el peso molecular de cada una de ellas. De
aquí en adelante la discusión de resultados se enfocará a los obtenidos con el
método Combinado.
La fracción de albúminas representó la tercera fracción mayoritaria con un 12.35
± 0.02% respecto al total de proteína de la semilla, en este proyecto se encontraron
cinco bandas principales < 35 kDa; por su parte Peralta-Flores et al. (2012)
encontraron cuatro bandas principales < 30 kDa y Juliano en 1980 reportó para arroz
tres polipéptidos principales de 8.5, 11 y 16 kDa.
La fracción globulinas conforma la mayor parte de las proteínas en ciertos granos,
por lo que han sido ampliamente estudiadas a detalle, principalmente en
leguminosas como chícharo, soya y frijol (Shewry, 1995), estas a su vez son
clasificadas por sus coeficientes de sedimentación en dos grupos: las globulinas 7S y
las globulinas 11 S (Danielsson, 1949). El patrón electroforético encontrado en este
estudio reveló nueve bandas principales < 73 kDa, datos similares fueron reportados
por Peralta-Flores et al. (2012) quienes encontraron de igual manera nueve bandas
principales < 70 kDa, por otro lado, Pinciroli reportó en 2010 bandas principales < 67
kDa en arroz y Chang et al. (2009) reportan seis bandas principales < 70 kDa en
globulinas 7 S de garbanzo. Cabe mencionar que en este estudio tanto en
condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes el patrón electroforético fue
similar, lo cual sugiere que las globulinas presentes en la semilla de J. curcas son del
tipo vicilinas, es decir, globulinas 7 S, ya que éstas no presentan puentes disulfuro y
al entrar en contacto con algún agente reductor su estructura no es afectada debido
45
a la carencia ya mencionada, a diferencia de las leguminas (globulinas 11 S) que son
oligómeros hexaméricos, los cuales contienen puentes disulfuro (Gueguen y Azanza,
1985), cada subunidad está compuesta por dos polipéptidos, uno de punto
isoeléctrico ácido y otro alcalino que al entrar en contacto con algún agente reductor
éstos se disocian dando como resultado subunidades de bajo peso molecular de 50
– 60 kDa aproximadamente (Plietz et al., 1987).
Como fracción mayoritaria se encontró a la fracción tipo glutelinas, las cuales
representaron el 42.02 ± 0.03% de la proteína respecto a la proteína total presente
en la semilla de J. curcas, para esta fracción se obtuvieron tres bandas principales <
35 kDa, éstas se caracterizan por su gran insolubilidad que se debe
fundamentalmente a la abundancia de puentes disulfuro, formando agregados de alto
peso molecular (Juliano, 1985), al igual que las leguminas, la fracción glutelina está
constituida por dos polipéptidos alfa y beta, ambos unidos por puentes disulfuro
(Utsumi, 1992), básicamente la fracción glutelinas de la semilla de J. curcas presenta
dos subunidades: subunidad ácida de 20 kDa y la subunidad básica de 15 kDa.
Peralta-Flores et al. (2012) reportan dos cadenas principales de 33 y 27 kDa para J.
curcas; Yamagata et al. (1982) reportan como subunidad ácida de 37 – 39 kDa y
subunidad básica de 20 – 22 kDa a las glutelinas del arroz, siendo estas la fracción
mayoritaria.
46
8.4 Caracterización funcional
8.4.1 Solubilidad
La solubilidad de las proteínas está influenciada por el equilibrio
hidrofílico/hidrofóbico, el cual depende de la composición de aminoácidos,
particularmente en la superficie de la proteína (Moure et al., 2006). Esta se ve
afectada por distintos factores, tales como la composición de aminoácidos, el estado
de la proteínas y factores ambientales (Vojdani, 1996). El pH es un factor ambiental
muy importante que tiene un efecto muy significativo en la solubilidad de las
proteínas.
En este estudio se realizó la prueba de solubilidad para la fracción de
globulinas y glutelinas a distintos valores de pH, siendo éstas de mayor interés por
encontrarse más abundantes dentro de las proteínas de reserva de la semilla de J.
curcas no tóxica. La fracción globulinas presentó una alta solubilidad a pH alcalino,
siendo muy baja a pH ácido, por su parte Mei-Li et al. (2009) reportan una solubilidad
baja a pH 5-6 en globulinas 7 S de Caupí (Vigna unguiculata) y una alta solubilidad a
pH extremos.
Las glutelinas se caracterizan por su gran insolubilidad que se debe
fundamentalmente a la abundancia de puentes disulfuro, formando agregados de alto
peso molecular (Juliano, 1985; Agboola et al., 2005), éstas a su vez son solubles en
ácidos o álcalis diluidos tal como lo reporta Bernardino-Nicanor et al. (2005) para
glutelinas de guayaba encontrando el mayor porcentaje de solubilidad a pH alcalino y
a pH ácido la más baja solubilidad, misma tendencia se encontró en este estudio, lo
que sugiere que la presencia de un agente desnaturalizante (en este caso SDS)
durante la extracción podría provocar un cambio en la estructura de la proteína, de
tal manera que facilita su solubilización. A pH ácido la extracción en presencia de 2-
mercaptoetanol fue baja, probablemente este agente provocó rompimiento de los
puentes disulfuro de la proteína, y luego una reordenación de dichos enlaces podría
haber ocurrido durante el secado por liofilización de la fracción, de tal manera que la
solubilidad disminuyó, tal como lo menciona Bernardino-Nicanor et al. (2005). Cabe
mencionar que los resultados del perfil de solubilidad de los aislados proteínicos de
47
J. curcas pueden estar estrechamente relacionados a la fracción mayoritaria de las
proteínas de reserva (glutelinas) de esta oleaginosa, (Selje-Assmann et al., 2007), ya
que podrían tener el mayor efecto en la baja solubilidad de los aislados proteínicos
de J. curcas a pH neutro debido que las glutelinas son proteínas bastante hidrófobas
y, los grupos hidrofóbicos promueven las interacciones proteína-proteína que inciden
en una disminución de la solubilidad (Fennema y Tannenbaum, 1993).
8.4.2 Absorción de agua
La capacidad de absorción de agua de las fracciones mayoritarias resultó ser
baja tanto para globulinas como glutelinas con un 1.06 g ± 0.005 y 1.54 g ± 0.004 g
de agua/g de proteína respectivamente en comparación a los 2.8 g de agua/g de
proteína obtenidos en glutelinas de guayaba (Bernardino-Nicanor et al., 2005), cabe
mencionar que esta propiedad depende de la naturaleza de los grupos polares que la
constituyen (Chou y Morr, 1979), por lo tanto esta propiedad está inversamente
relacionada con la solubilidad, es decir, una alta solubilidad corresponde a que la
proteína presenta una baja absorción de agua (Petruccelli y Añón, 1994).
8.4.3 Absorción de aceite
La capacidad de absorción de aceite es otra de las características importantes en
la industria alimentaria. Las cadenas laterales de los aminoácidos no polares forman
interacciones hidrofóbicas con las cadenas hidrocarbonadas de los lípidos (Saetae et
al., 2011). En este estudio se obtuvieron valores muy distintos en las fracciones
mayoritarias, siendo la fracción glutelinas la que presenta mejores resultados con
respecto a esta propiedad, con un valor de capacidad de absorción de aceite de 5.96
± 0.04 ml de aceite/g de proteína; la fracción globulinas mostró una capacidad de
absorción de 1.01 ± 0.02 ml de aceite/g de proteína. El valor obtenido en el estudio
es alto, ya que se han encontrado valores de 1.86 y 1.07 ml de aceite absorbido/g de
proteína en aislados proteínicos de J. curcas tóxica y detoxificada (Saetae et al.,
48
2011), mientras que en soya se reporta un 3.29 mL de aceite/g de proteína (Mwasaru
et al., 1999).
Por lo tanto la propiedad que presentan las proteínas de J. curcas (glutelinas) de
absorber aceite le otorga un gran potencial o bien las convierte en un buen
ingrediente para la industria de embutidos, principalmente en la producción de
salchichas, donde generalmente se usan proteínas que liguen grasa y agua con la
finalidad de obtener un buen producto (Mao y Hua, 2012).
8.4.4 Superficie de hidrofobicidad
La superficie de hidrofobicidad brinda una idea clara de las propiedades
funcionales de una proteína, por ejemplo: las proteínas insolubles son las que mayor
cantidad de aceite fijan y son altamente hidrofóbicas, y tanto más solubles sean
menos hidrófobas serán (Cheftel et al., 1993), tal como se observó en este estudio.
Las globulinas presentaron baja superficie de hidrofobicidad, tal como se esperaba
ya que su solubilidad fue alta. Por otro lado, se obtuvo una alta capacidad de
absorción de aceite por parte de la fracción mayoritaria (glutelinas) dada por una alta
hidrofobicidad, contrastando con la baja solubilidad presentada por esta fracción.
Dicha propiedad aumentó considerablemente con la presencia de agentes
desnaturalizantes tales como SDS y 2-mercaptoetanol, que actúan directamente en
la ruptura de enlaces disulfuro; Bernardino-Nicanor et al. (2005) sugieren un
comportamiento similar en glutelinas de guayaba debido a que dichos agentes
desnaturalizantes provocan una exposición parcial irreversible de los grupos
hidrófobos ocultos en la estructura plegada de la proteína, reflejando un aumento en
la superficie de hidrofobicidad.
49
IX. CONCLUSIONES
I. La composición proximal de la harina sin desgrasar fue de proteína 25 ±
0.05% la cual aumentó considerablemente al desgrasarla a un 57.13 ± 0.14%,
contenido similar al de un concentrado proteínico, lo que la hace factible para
ser usada en la extracción de proteínas para diversos fines.
II. Las proteínas de reserva en semilla de Jatropha curcas no tóxica ecotipo
Puebla fueron fraccionadas de acuerdo a su criterio de solubilidad, para lo
cual se estableció en nuestro grupo de trabajo un método de extracción que
combina metodologías ya reportadas (Osborne, 1924 y Ferreira, 2000).
III. Se extrajo como fracción mayoritaria a glutelinas seguidas por globulinas,
albúminas y prolaminas con un 42.02 ± 0.03, 20.2 ± 0.01, 12.35 ± 0.02 y 6.2 ±
0.01 % respectivamente.
IV. El análisis del perfil electroforético mostró cinco bandas principales < 35 kDa
para la fracción albúminas, mientras que para globulinas se encontraron
nueve < 73 kDa y para glutelinas tres bandas principales < 44 kDa.
V. Glutelinas, la fracción mayoritaria, presentó una mayor solubilidad a pH
alcalino (pH 12) y una menor solubilidad a pH ácido (pH 2).
VI. La capacidad de absorción de agua determinada en globulinas y glutelinas
permite que puedan ser consideradas para su uso especialmente en masas
horneadas.
VII. La capacidad de absorción de aceite para glutelinas fue muy alta respecto a lo
reportado para otras proteínas vegetales, indicando su posible uso en la
elaboración de salchichas, mayonesas, aderezos.
VIII. El resultado de la alta hidrofobicidad le otorga un gran potencial como
ingrediente para la industria de embutidos, principalmente en la producción de
salchichas, donde generalmente se usan proteínas que liguen grasa y agua
con la finalidad de obtener un buen producto.
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