caracterización funcional y genómica de bacteriófagos con
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Caracterización funcional y genómica de
bacteriófagos con potencial para el control de
la presencia de aminas biógenas en quesos
Microbiología
MolecularVictor Ladero
Compuestos nitrogenados, originados por descarboxilación, presentes en muchos alimentos capaces de provocar intoxicaciones alimentarias
Aminas biógenas
HISTIDINA HISTAMINA
CO2
Descarboxilasa (DC)H+
TIROSINA TIRAMINA
CO2
H+
Alimentos no fermentadosFamilia Scombridae (caballa, atún, …)Microbiota contaminanteBacterias Gram negativas
Alimentos y bebidas fermentadosQueso, vino, embutidos, cerveza, sidraBacterias Gram positivas (BAL)Cultivo iniciador o microbiota secundaria
Sistema circulatorioHipertensión (tiramina)Hipotensión (histamina, putrescina)Cefaleas, Bradicardia, fallo cardíacoAparato respiratorioSofocosAparato digestivoNauseas, vómitos
Aminas biógenas
Scientific Opinion (BIOHAZ)Risk Based Control of BA in Foods Reducir la presencia de AB en los alimentos
Compuestos nitrogenados, originados por descarboxilación, presentes en muchos alimentos capaces de provocar intoxicaciones alimentarias
Tiramina en alimentosValores máximos detectados
(mg/kg o mg/l) Alimento Histamina Tiramina Putrescina Cadaverina
Pescado yproductos derivados
Atún 20.000 2.000 4.470Anchoas 2.860
Productos fermentados 163 627 244 356Otros 8.910 634 337 1.690
Bebidas alcohólicasfermentadas
Cerveza 21,6 46,8 17,8 31,4Vinos fortificados 2,9 22,5 4,3 0,4
Vino tinto 34,3 18,5 21,6 5Vino blanco 55 10 10 10
Vino espumoso 9,8 47,3 46,4 0,5
SalsasSalsa de pescado 758 741 1.220 1.150
Otras salsas 16 21 27,4 82,1
Productos cárnicosEmbutidos 400 1.740 1.550 1.250
Otras carnes curadas 150 387 406 305Otros productos cárnicos 212 292 305 64
Productos lácteos
Queso fresco 119 457 348 389Queso curado 1.240 1.450 1.560 3.170
Queso de corteza lavada 392 1.900 816 2.460Queso azul 1.850 2.130 701 3.120
Quesos de cuajada ácida 102 480 648 980Total en quesos 1.850 2.130 1.560 3.170
Yogur 1 5,2 1,1 10,3Otros 0,6 0,4 0,9 3
VerdurasVerduras fermentadas 92 91 549 94
Otras verduras 75,7 25,4 310 85
Presencia de microorganismoscon actividad Aminogénica
Disponibilidad de sustratoProteolisisPeriodo de maduración
SUSTRATO
BACTERIAS
DC+
AMBIENTE
ABαα
Factores reducen ABPasteurización, HPs[Sal]
Factores aumentan ABpH ácido, TªProcesado post-maduración
Iniciadores AB -
Factores presencia Tiramina
Productores tiramina en quesos
Productores
Tiramina
E. duransE. faecium
E. faecalisL. curvatus
L. brevisS. thermophilus
E. hirae
E. faecalis
Eliminación de tiramina en quesos
Reducción
Autoreplicación
Fago-remediación
Resistencia
E. faecalisProductores
Tiramina
Especificidad Inocuidad
Aminas Biógenas
Viables
Fagos
Biocontrol en miniquesosBiocontrol
MOI: 0,1 104 cfu ml-1
Reducción tiramina84,8 %
0
1
2
3
4
t0 tf
Tyra
min
e (m
M)
*
430 mg kg-1
63 mg kg-1
Enriquecimiento
Aislamiento
Bacteriófagos frente a E. faecalisFago-remediación
Aislamiento bacteriófagos
Caracterización
Rango hospedador Morfología Ciclo vida
Fago-remediaciónAislamiento bacteriófagos
Quesos Screenings BacteriófagosCabrales 14 141, 152, 158, 159, 153, 155, 160, 161
Emmental 11 143, 146
Boffard 7 142, 144, 145, 150, 151, 153
Gamoneu 4 140
Oveja 4 156, 157
Zamorano 3 147, 149, 148
Cabra 1 162
Otras variedades 18 -
Enriquecimiento
Aislamiento
Bacteriófagos frente a productores AB
62 screenings – 23 bacteriófagos
Fago Lácteo Carne Humano Clínico Tipo Total14 2 8 2 1 27
140 11 1 5 1 1 19
141 6 0 2 0 1 9
142 0 0 1 0 0 1
143 1 0 3 2 0 6
144 2 0 4 1 0 7
145 2 0 3 1 0 6
146 1 0 1 2 0 4
147 1 0 3 2 0 6
148 12 1 2 1 1 17
149 12 1 2 1 1 17
150 6 0 2 1 1 10
151 2 0 0 1 1 4
152 4 0 0 0 1 5
153 4 0 2 0 1 7
155 0 0 0 0 1 1
156 13 1 3 2 1 20
157 13 1 3 2 1 20
158 7 0 2 0 1 10
159 6 0 2 0 1 9
160 7 0 2 0 1 10
161 6 0 0 0 1 7
162 6 0 3 0 1 10
Rango de hospedador
85,454 bp
Terminasa Lisis Estructural Replicación Desconocido
Secuenciación
Bacteriófago: 140
Origen: Queso Gamoneu
Hospedador: E. faecalis 52c
Ciclo vida: Lítico
DNA Resistente a la restricción
Identificación de genes implicados en modificación
de nucleótidos
RESULTS Bacteriophages of E. faecalis
142,215 bpTerminasa Lisis Estructural Replicación Desconocido
Secuenciación
Bacteriófago: 149
Origen: Queso Zamorano
Hospedador: E. faecalis 63c
Ciclo vida: Atemperado?
Placas pequeñas y turbias
Ciclo de vida Lítico
RESULTS Bacteriophages of E. faecalisSecuenciación
Bacteriófago: 159
Origen: Queso Cabrales
Hospedador: E. faecalis CECT481T
Ciclo vida: Lítico
Placas grandes y claras
Sin secuencia tras dos intentos
Φ159 MWΦ159HindIII
141,133 bpTerminasa Lisis Estructural Replicación Desconocido
Bacteriófago: 156
Origen: Queso Oveja
Hospedador: E. faecalis HFS59
Ciclo vida: Lítico
Placas pequeñas y con doble halo
RESULTS Bacteriophages of E. faecalisSecuenciación
Ningún gen asociado al
fenotipo “doble halo”
Bacteriófago: Q69 (162)
Origen: Queso Monterrubio (Cabra)
Hospedador: E. faecalis CECT481T
Ciclo vida: Lítico
Placas con doble haloDoble secuencia
42,241bp
42,822bp
Terminasa Lisis Estructural Replicación Desconocido
Profago de la cepa CECT481TNingún gen asociado al
fenotipo “doble halo”
Secuenciación
Comparación de secuencias
MAFFT v.6
Identificación de endolisinasIdentificación de secuencias con potencial antimicrobiano
MW E1 E2 E3 E4
p1367
815
1824
5772
42
31 34,9
pIPLA1367x6218 bps
HindIII
NcoI
pBR322 ori
Lys
lacI
Kan
f1 origen
Conclusiones
Hemos aislado 23 bacteriofagos frente a E. faecalis, productor de tiramina y putrescina.
La secuencia genómica nos permite caracterizarlos y conocer peculiaridades de los mismos
La combinación de caracterización funcional y genómica permite realizar una mejor selección de los mismos con vistas a futuras aplicaciones
La secuenciación nos permite la identificación y utilización de genes con potencial antimicrobiano.
Agradecimientos
GRUPO MICROBIOLOGIA MOLECULAR
Carolina Gómez SordoNoelia MartínezEsther Sánchez Llana
GRUPIN14-137
AGL2013-45431-R
AGL2016-78708-R