CARACTERIZACIÓN DE CIANOBACTERIAS AISLADAS DE CUERPOS DE AGUA EUTROFICADOS Y EVALUACIÓN DE SU TOXICIDAD EMPLEANDO

DIFERENTES ENSAYOS BIOLÓGICOS RESUMEN

Las cianobacterias son un componente común e importante del fitoplancton en ambientes acuáticos, sin embargo bajo ciertas condiciones puede verse favorecida la acumulación masiva de ciertas cianobacterias formando lo que se conoce como florecimientos algales o “blooms” Varias especies de cianobacterias, pueden producir potentes endotoxinas conocidas como cianotoxinas, sin embargo, se sabe que dentro de la misma especie, pueden existir cepas productoras y no productoras de estos compuestos, así mismo algunas especies pueden ser genéticamente capaces de producirlas pero no bajo todas las condiciones ambientales En México son escasos los trabajos en cuanto a la presencia de cianobacterias en cuerpos de agua que presentan florecimientos y se han enfocado principalmente en la taxonomía morfológica y sólo pocos han determinado la presencia de estas toxinas. Sin embargo no existen trabajos que hayan informado sobre su efecto en otros organismos (pruebas biológicas). En el presente trabajo se realizó su caracterización morfológica (identificación), su aislamiento, la extracción de posibles toxinas o metabolitos con actividad biológica y la realización de pruebas biológicas con invertebrados y con bacterias que nos permitan afirmar que los florecimientos presentes en los reservorios estudiados presentan especies tóxicas o no, de tal manera de alertar sobre el uso de esta agua en diferentes actividades humanas. También se evaluó el efecto anticancerígeno de alguno de estos metabolitos.

INTRODUCCIÓN Las cianobacterias, son un grupo amplio de microorganismos procariontes, aeróbicos y fotoautotrofos (Roset et al., 2001), los cuales cuentan con una larga historia evolutiva (Whitton, 2000)). Recientemente el análisis de secuencias de DNA, ha sugerido que las primeras cianobacterias pudieron ser organismos termofílicos, lo que les permitió sobrevivir en los océanos primitivos (Chorus et al., 1999), en ese tiempo, probablemente las cianobacterias fueron las principales productoras de materia orgánica y los primeros organismos en liberar oxígeno molecular a la atmósfera primitiva, condición que permitió el desarrollo del metabolismo aeróbico y el subsecuente surgimiento de formas derivadas de plantas y animales (Fay, 1983; Carmichael, 1994). I. 2. Importancia Ecológica Las cianobacterias muestran una considerable plasticidad genotípica y fenotípica, lo que les permite desarrollar una amplia variedad de nichos ecológicos (Whitton, 2000). Estos microorganismos son comunes en todos los tipos de ambientes naturales y muchas especies son semicosmopolitas; algunas son con frecuencia componentes dominantes del plancton en lagos y océanos, otras son características de arroyos, ríos, estuarios, aguas termales o costas rocosas, algunas otras están bien adaptadas al ambiente terrestre y son

particularmente abundantes en suelos tropicales y en campos inundados (Fay, 1983). Por otra parte, poseen una gran importancia en el ambiente, como colonizadores primarios tienen una impresionante capacidad para colonizar sustratos infértiles tales como ceniza volcánica, desiertos y rocas, otro carácter remarcable es su habilidad para sobrevivir en temperaturas extremas (Chorus et al., 1999), así como ser importantes productores primarios. Otro papel trascendente que desempeñan en el ambiente, se debe a la gran variedad de interacciones ecológicas que desarrollan, ya que establecen relaciones simbióticas con una gran variedad de organismos entre los que se encuentran hongos, briofitas, pteridofitas, gimnospermas, angiospermas (Chapman et al., 1998) así como con animales marinos (esponjas y tunicados) (Burja et al., 2001). Sin embargo, tal vez su mayor importancia resida en el papel que desempeñan en el proceso fundamental de la fijación biológica del nitrógeno ya que muchas de las cianobacterias de vida libre y aquellas que forman asociaciones simbióticas contribuyen significativamente con la disponibilidad del nitrógeno tanto en ambientes acuáticos como terrestres (Fay, 1983). Cianobacterias en sistemas acuáticos.

Las cianobacterias son un componente común e importante del fitoplancton en ambientes acuáticos (Vasconcelos et al., 2001), sin embargo bajo ciertas condiciones puede verse favorecida la acumulación masiva de ciertas cianobacterias formando lo que se conoce como florecimientos algales o “blooms” (Roset et al., 2001), algunos de los géneros que comúnmente presentan este comportamiento son Microcystis, Oscillatoria, Anabaena Nostoc y Nodularia (Datta et al., 1998; Nandini, 2000). Estos florecimientos masivos pueden aparecer rápidamente, inclusive en horas y sin haber sido advertida la presencia de estos organismos en el agua, esta pronta aparición se debe a la migración hacia la superficie de una población dispersa existente, y no al crecimiento celular. Su aparición esta también asociada con condiciones de calma y disminución de la turbulencia en la columna de agua, condiciones que permiten a estos microorganismos flotar hacia la superficie, en consecuencia, un bloom de superficie ocurre solo si existe una población de cianobacterias, y esto depende en parte del tamaño de la población preexistente (Whitton, 2000). A pesar de que el crecimiento masivo de estos organismos es un fenómeno natural, sobre todo en grandes lagos y estanques (Nandini, 2000), la creciente eutroficación de los ambientes acuáticos como producto de la actividad humana ha elevado el riesgo de formación de florecimientos (Peinador, 1995), por lo que su incidencia se ha convertido en un problema sanitario y ecotoxicológico a nivel mundial que afecta a todo tipo de cuerpos de agua (Tsujimura, 2003), debido a las diversas consecuencias que traen consigo como lo son alteraciones en la calidad del agua (especialmente en el pH y oxígeno disuelto) y sobretodo por los efectos tóxicos agudos y crónicos (Gleick, 1993) en plantas, animales acuáticos e incluso en el hombre, resultado de la liberación de productos tóxicos por parte de estos microorganismos (Tsujimura, 2003), de hecho se estima que más del 50% de estos florecimientos son tóxicos (Roset et al., 2001).

Cianotoxinas Varias especies de cianobacterias, pueden producir potentes endotoxinas conocidas como cianotoxinas, sin embargo, se sabe que dentro de la misma especie, pueden existir cepas productoras y no productoras de estos compuestos, así mismo algunas especies pueden ser genéticamente capaces de producirlas pero no bajo todas las condiciones ambientales (Roset et al., 2001; Ouellette et al., 2003). Las cianotoxinas son metabolitos secundarios que se acumulan en el citoplasma en determinadas situaciones, la producción de estas endotoxinas es máxima cuando las condiciones de crecimiento son óptimas, por este motivo, se observa una producción directamente proporcional al aumento de la biomasa, así mismo, cuando las condiciones ambientales son desfavorables, las cianobacterias mueren produciéndose la lisis celular y la liberación de las cianotoxinas al medio acuático (Roset et al., 2001). Existen tres ordenes dentro del grupo de las cianobacterias que producen la mayor parte de los compuestos tóxicos, el orden Chroococcales, Oscillatoriales, y el orden Nostocales (Burja et al., 2001), así mismo, especies y cepas de todos los géneros planctónicos comunes incluyendo Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Microcystis, Pseudanabaena, Nodularia, Nostoc, Oscillatoria, Lyngbya, Scytonema, Schizothrix y Tolypothrix producen toxinas biológicas conocidas (Tabla 1) (Burja et al., 2001), pero otros géneros incluyendo Coelosphaerium, Fischerella, Gloeotrichia, Gomphosphaeria, Hapalosiphon, Spirulina, Symploca y Trichodesmium también son tóxicos, pero todavía ninguna toxina ha sido aislada y caracterizada para estos géneros (Carmichael, 199; Burja et al., 2001). La biosíntesis de cianotoxinas es un procesos energéticamente demandante, y la función de estas es toda vía incierta aunque existen diversas hipótesis que tratan de dar una explicación a la síntesis de estos compuestos (Ouellette et al., 2003). Algunos autores, plantean que estas toxinas tienen una acción aleloquímica, que contribuye a que ciertas especies sean dominantes en el sistema acuático y por lo tanto pueden formar los florecimientos algales, por lo que la mayoría de los efectos de las cianotoxinas en otros organismos acuáticos, llevan a la conclusión de que estas toxinas tienen un poder alelopático en los sistemas acuáticos (Pflugmacher, 2000; Burja et al., 2001). Por otra parte, se ha sugerido que las cianotoxinas actúan como una defensa contra la presión de depredación de organismos componentes del zooplancton (Datta et al., 1998; Hojang et al., 2003), facilitando el mantenimiento y sobrevivencia de florecimientos algales en ambientes con gran cantidad de organismos herbívoros (Mallik, 2003). Sin embargo, se ha encontrado que las especies planctónicas generalmente no se alimentan de cianobacterias tóxicas a menos de que no haya otra fuente de alimento, no obstante estos organismos intentan modular la cantidad que toman, asegurándose de evitar dosis letales (Burja et al., 2001). Por lo que el ataque de depredación más intenso, no se debe al ataque del zooplancton, sino que las cianobacterias son atacadas por virus, bacterias y hongos (Chorus et al., 1999).

Otros compuestos bioactivos sintetizados por cianobacterias Además del conocimiento que se tiene de la producción de cianotoxinas, las cianobacterias han sido identificadas como uno de los grupos más prometedores en la producción de nuevos compuestos bioactivos (Burja et al., 2001), por lo que recientemente gran cantidad y variedad de metabolitos han sido encontrados en este grupo, presentando diferente actividad biológica y estructuras químicas, entre los que se encuentran compuestos con actividad citotóxica, antineoplásica, antimalaria, anti VIH, antimicrobiana así como compuestos con actividad antifúngica (Al-Jassabi et al., 2004). Con respecto a esta última, las cianobacterias son una fuente importante de novedosos compuestos antifúngicos, de hecho algunas moléculas con tales propiedades derivadas de estos microorganismos han sido patentadas para el uso agrícola, pero desafortunadamente las investigaciones en ese tópico no se han seguido desarrollando (Biondi et al., 2004). MATERIAL Y MÉTODOS • FORMACIÓN DE UN CEPARIO Colecta de muestras. Se colectaron muestras de diferentes cuerpos de agua del Valle de México, donde se han informado previamente florecimientos de cianobacterias: Lago de Chapultepec primera sección, Alameda Oriente, Pista Olímpica de Remo y Canotaje “Virgilio Uribe” y Lago del Bosque de Aragón; además de la Laguna de Villa Victoria y en Valle de Bravo, Durante la colecta se realizaron anotaciones de las condiciones ambientales al momento de tomar la muestra como temperatura, nublado o despejado, hora del día, presencia de viento o lluvia, y se tomó nota de las actividades realizadas en el sitio. Se colectaron dos muestras de agua de 500 mL previamente filtradas con un tamiz con malla de 25 µm, esta agua se empleó para medir parámetros fisicoquímicos como oxígeno disuelto (OD), pH, salinidad, conductividad, concentración de nitratos y fósforo de ortofosfatos y dureza, el agua colectada se empleó también para los ensayos toxicológicos con Daphnia magna. En el mismo sitio se colectó biomasa del florecimiento con el fin de utilizarla para ensayos toxicológicos y para el aislamiento de las cianobacterias. Aislamiento de cianobacterias. Se inocularon cajas de Petri con medio mineral BG-11 semisólido por estría cruzada y por espatulado (0.1 mL de agua en cada placa) y se incubaron bajo las siguientes condiciones: temperatura de 25 ± 2 oC, con un fotoperiodo de 16 horas luz/8 horas de oscuridad, el tiempo de incubación fue de aproximadamente 30 días. Otro método empleado fue el aislamiento por micromanipulación, seleccionando las colonias de Microcystis con una micropipeta capilar y un microscopio estereoscópico, hasta tener una sola colonia por campo que era transferida a un vial con 1 mL de medio mineral Z8 e incubándose como se mencionó anteriormente. Propagación de las cianobacterias. Las colonias de cianobacterias obtenidas mediante este proceso se inocularon en matraces con 150 mL de medio mineral BG-11, Z8 o ASM1 (Rippka, 1998)

líquido adicionados con bicarbonato de sodio. Las condiciones de incubación fueron con aireación continua, temperatura de 25 ± 2oC. Todos los cultivos se escalaron con el fin de tener biomasa suficiente para la extracción de DNA y para los ensayos toxicológicos. Conservación de las cianobacterias. Las cepas aisladas se conservan en tubos de medio sólido BG-11 y en medio líquido. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD TOXIGÉNICA MEDIANTE PRUEBAS CON CLADOCEROS. Ensayos de toxicidad aguda con Daphnia magna. Se realizaron según la Norma Oficial Mexicana NMX-AA-087-1995, los organismos de prueba fueron neonatos de D. magna cuya edad era menor de 24 hs. Los ensayos agudos se realizaron con la biomasa concentrada de las muestras de campo, esta biomasa se secó y se utilizaron 500mg/mL, el contenido celular se liberó mediante periodos de congelación y descongelación, el extracto crudo se centrifugó a 4000 rpm durante 20 minutos para eliminar restos celulares y posteriormente se filtró con papel filtro Whatman No 1 y con membrana Millipore® de 3 µm para eliminar la mayor cantidad de materia orgánica, se hicieron diluciones con el extracto crudo, y se realizaron las pruebas de toxicidad. Para los ensayos crónicos se emplearon cultivos de la cianobacteria. Las condiciones de prueba se resumen en el siguiente cuadro:

Tabla 1. Condiciones de la prueba de toxicidad aguda con Daphnia magna.

La respuesta evaluada al final de la exposición fue la mortalidad de los organismos de prueba y con estos datos se calcula la concentración letal media, se emplearon el método logarítmico y el método Probit.

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS DE CIANOBACTERIAS Propagación de Bacterias Fitopatógenas Las bacterias fitopatógenas fueron obtenidas del Departamento de Microbiología, del Laboratorio de Fitopatología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, estas se mantuvieron viables en agua destilada estéril y sembradas en medio Agar Papa Dextrosa a las bacterias del género Xanthomonas y en B de King a Pseudomonas phaseolus, Erwinia carotovora y Agrobacterium tumefaciens, para mantener los cultivos viables. Para la evaluación de la actividad antibacteriana de los extractos de cianobacterias los 5 géneros de bacterias fitopatógenas fueron sembradas por la técnica por espatulado en placa en medio B de King.

Obtención de extractos acuosos de cianobacterias Se toman 40 mL de cultivo de cianobacterias con 15 días de crecimiento y se centrifuga a 3500 rpm durante 15 minutos a 25º C, el paquete celular obtenido se le adiciona 10 mL de regulador de fosfatos pH 7, procurando condiciones de esterilidad en todo el proceso de obtención de los extractos acuosos. Realizar ciclos de congelación a -20º C y descongelación inmediata hasta observar un cambio en la coloración en el medio, se centrifuga a 3500 rpm durante 15 minutos y se obtiene el sobrenadante. Obtención de extractos metanólicos de cianobacterias Se obtienen 40 mL del cultivo de cianobacterias con 15 días de crecimiento y se filtran a través de un papel filtro Whatman No. 1. La biomasa retenida en el papel filtro se obtiene raspando la superficie con una espátula y recolectada en vasos de precipitados de 25 mL. Se adiciona por cada gramo de biomasa recolectada 60 mL de metanol y 2 mL de ácido acético, se deja reposar durante 24 horas. Se evapora el metanol y el ácido acético a sequedad por calentamiento, este concentrado se resuspende en 3 mL de metanol.

Evaluación de la actividad antibacteriana Los discos de papel filtro estériles se impregnan con los extractos acuosos y metánolicos de cada una de las cianobacterias, se colocan sobre una siembra por técnica de espatulado en placa de bacterias fitopatógenas en medio de cultivo B de King. Posteriormente se incuba a 28º C durante 24-48 horas. Todo el proceso se llevó a cabo en condiciones de esterilidad. EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTICANCERIGENA DE LOS METABOLITOS AISLADOS DE LAS CIANOBACTERIAS Extracción de Ficobiliproteínas Se cosechó la biomasa obtenida de Pseudoanabaena. tenuis, por medio de centrifugación a 548 g a 5˚C por 45 min. Posteriormente se pesó 1 gr del paquete celular obtenido y se resuspendió en 20mL de regulador de fosfatos

0.1M pH 7. La lisis celular se realizó por periodos recurrentes de congelación y descongelación. Posteriormente se agregó 1g de sulfato de estreptomicina, para precipitar los restos de membrana. Se dejó el extracto en refrigeración y protegido de la exposición a la luz, durante 24 horas. Transcurrido ese tiempo se centrifugaron a 548 g a 5˚C durante 1 hora, para eliminar los restos celulares y recuperar el sobrenadante, el cual contiene las ficobiliproteínas. Cuantificación de la concentración de ficobiliproteínas del extracto. Para conocer la concentración de PBPs en el extracto crudo se determinó su absorbancia a 565, 620 y 650 nm por medio de un espectrofotómetro, utilizando como blanco el regulador de fosfatos y posteriormente calculando la cantidad de cada PBP por medio de las siguientes ecuaciones 1, 2 y 3

38.7)(7.0)/( 650620 AAmLmgPC −

= (1)

AC (mg/mL) = 65.15

)(19.0 620650 AA − (2)

APC (mg/ml) = 7.12

)(34.1)(8.2565 APPCA −− (3)

Identificación de ficobiliproteínas por electroforesis PAGE-SDS El extracto de PBPs fue analizado por electroforesis continua en un gel de poliacrilamida PAGE-SDS. Se prepararon 2 minigeles de 0.75 mm, con un gel concentrador de 5% y un gel separador de 13% de acrilamida en Tris-HCl/ SDS pH 8.8. La separación se llevó acabo en placa vertical y se corrió a 15 mA de manera continua. Al concluir la separación, las bandas proteicas fueron detectadas por tinción de plata en un gel y el otro gel por tinción con azul de Comassie. Se concentró 1 mL del extracto usando una membrana de diálisis de celulosa de 3.5 mm de diámetro marca Spectrum; empleando como agente dializante azúcar glass, mientras que 1mL del extracto se dejó sin concentrar. Tanto en el extracto concentrado como en el no concentrado se cuantificó la cantidad de PBPs depositadas en cada pozo, por método de Bradford. Previo a depositar las muestras del extracto en los pozos, estas se calentaron durante 5 min en baño maría e inmediatamente se depositaron en hielo durante 1 min, favoreciendo la desnaturalización de proteínas. El diseño de las muestras a cargar en cada carril fue el siguiente:

• Carril # 1 : Marcador de peso molecular Bench Mark® de Invitrogen (cuenta con 10 proteínas con pesos moleculares que van desde los 10 a los 190 KDa, diseñado para geles Tris-Glicina).

• Carril # 2: Estandar de R-Ficoeritrina Sigma® (Obtenida de Porphyridium cruentum, considerando que el peso molecular (PM) de ficoeritrina reportado es de 24KDa).

• Carril # 3: Estandar de Ficocianina Sigma® (Obtenida de Spirulina sp. Considerando que el PM de ficocianina reportado es de 18.3 KDa).

• Carril del 4 al 6: Se depositarón 3, 6 y 9 µl del extracto sin concentrar, respectivamente, más de regulador Magie Mix (desnaturalizante para proteínas) agregando vol:vol a cada muestra.

• Carril del 7 al 9: Se depositarón 3, 6 y 9 µl del extracto concentrado, respectivamente, mas regulador Magie Mix agregando vol: vol para cada muestra.

Al concluir el corrimiento electroforético se procedió a realizar las tinciones de plata y Comassie para cada gel. Preparación del regulador Magie Mix. Se agregaron las siguientes soluciones en este orden: 2.5 mL de solución Tris 2.5M pH 6.8, 4.0 mLSDS al 10%, 2mL de Glicerol, 1.0mL de β- Mercaptoetanol y 0.25mg de Azul de Bromofenol. Tinción con azul de Comassie: Se calentó por 12 seg. en microondas en colorante al 0.1% de azul de Coomassie. Se enjuagó el gel con agua corriente 2-3 veces hasta quitar el excedente de color. Calentando por 24 seg en microondas con solución para desteñir 1:1:8 (acético:metanol:agua), agitando 5 min, luego se retiró la solución y se cambió por nueva solución para desteñir, agitando, hasta aparecieron las bandas y se destiñó bien el gel. Tinción con Plata69: Se fijó el gel 10 min el etanol al 10% y ácido acético 0.5%, 50 mL y agitación Se incubo en solución de tinción de nitrato de plata al 0.2% por 5 min con agitación, disuelto en la misma solución de fijación. Se revelaron las bandas en hidroxido de sodio al 3%, con 300 µL de formaldehído, por cada 100 mL de solución, con agitación hasta que aparecieron las bandas, sobre un fondo café. Se dejó en solución ácido acético al 5% hasta el día siguiente. Posteriormente se lavó con agua. Ambos geles se conservaron en refrigeración y sumergidos en agua destilada, para posteriormente obtener imágenes por transiluminación. La misma técnica será utilizada para identificar las fracciones obtenidas de cada PBP, posterior a su separación por cromatografía de intercambio iónico. Separación de las diferentes ficobiliproteínas por cromatografia de intercambio ionico. Se utilizó el método de cromatografía de intercambio iónico, debido a la necesidad de colectar cantidades suficientes de cada PBP separada, para posteriormente realizar con ellas pruebas biológicas. Se realizó de inicio una separación parcial del extracto de PBPs realizando el siguiente procedimiento: Primeramente se agregaron 8.6 gr de sulfato de amonio (saturación al 65%) a 20 mL de extracto de PBPs, dejándolo a 4˚C durante 24 hrs. Posteriormente se centrifugó a 548 g por 30 min, se recuperó el precipitado y se resuspendendió

en 15ml de regulador de fosfato de potasio (KPO4) 5 mM pH 7, se procedió a dializarlo. El dializado se aplicó a la columna de cromatografía. Se utilizó una columna (3.1 x 33 cm) de DEAE – Celulosa preequilibrada con regulador KPO4 5 mM pH 7. Inicialmente se aplicaron 250 mL de regulador KPO4 5mM pH 7 para lavar la muestra y después se mantuvo a un gradiente lineal de regulador KPO4 5-200 mM pH 7 (hasta pasar 1000 mL finales de regulador). Se obtuvieron 89 fracciones durante la elusión las cuales fueron colectadas y leídas a 650, 620 y 565 nm por espectrofotometría, se obtuvieron los perfiles de elusión de las 89 fracciones y se seleccionaron 2 (correspondientes a las fracciones 48 y 49), en las cuales se observaron 3 bandas de absorción mejor definidas que las que muestran los estándares comerciales de PE y PC , a demás los máximos de cada banda correspondieron con los de PE, PC y APC El procedimiento será repetido nuevamente hasta obtener fracciones con el mayor grado de pureza posible de cada una de las PBPs. Cultivo de células. Con las fracciones purificadas, se realizarán pruebas biológicas en tres líneas celulares de carcinoma epidermoide: Caski, CaLo, C33A, así como en células epiteliales sin cáncer. Cada línea celular será descongelada, se proliferará haciendo subcultivos y al tener aproximadamente 4 botellas al 100% de confluencia se congelarán para tener una reserva a utilizar durante el proyecto. Se descongelarán las líneas celulares colocando cada criotubo en baño de agua a 37ºC, agitando suavemente hasta que el contenido se descongele.Posteriormente se trabajará en la campana de flujo laminar con material estéril. Se transferirán 2 mL de las células a una botella de cultivo que contendrá 4 mL de medio Dulbecco Modificado Eagle (DMEM) complementado con suero fetal bovino (SFB) al 7% y se agitará suavemente durante 30 segundos y se agregará DMEM hasta alcanzar un volumen final de 16 ml, el cual se incubará a 36.5ºC durante 4 hrs, para luego cambiar por medio fresco y continuar incubando a la misma temperatura hasta obtener 100% confluencia. Al obtener 100% de confluencia se tripsinizaran las células con 2 mL de solución Tripsina-Verseno a 37˚C durante 5-10 minutos posteriormente se neutralizara la tripsina con 3ml de DMEM-SFB 7%. Finalmente, la suspensión célular se centrifugará a 548 g durante 5 minutos, para luego decantar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 3 mL de medio fresco. A partir de este paso se realizará una cuenta viable, tomando10 µl de suspensión celular con 90 µl de azul de tripano, colocando dos gotas de la suspensión en la cámara de Neubauer realizando el conteo de células bajo el objetivo 40X del microscopio óptico. Para así determinar el número de células viable en cada cuadrante y poder deducir un promedio se usará la siguiente fórmula: Células/ml = Promedio x 10 x 104. A partir de dicha cuenta se realizarán diluciones en función del número de pozos a preparar. El resto de las células del subcultivo serán congeladas y conservadas.

Preparación de microplacas de 96 pozos. Al determinar la cuenta viable de los cultivos celulares, se utilizarán microplacas de 96 pozos, por duplicado para cada línea celular (Caski, CaLo, C33A y células sin cáncer). Se sembrarán 50,000 células en cada pozo, la placa será diseñada con pozos por cuadriplicado para: el blanco, el testigo de viabilidad, el testigo de irradiación y las fracciones de las PBPs obtenidas (figura 5). Habiendo preparado las placas en una de ellas solamente se expondrá a las células a distintas concentraciones de cada fracción de PBPs, sin irradiar, durante 24 horas, para poder determinar CL50 y dosis seguras. Mientras que en otra placa se seleccionará una de las dosis seguras y se evaluará si desarrolla fototoxicidad al aplicar la PDT.

Aplicación de la PDT. Previa exposición de tres horas a las fracciones de PBPs, cada pozo será irradiado durante 20 minutos con un láser de argón a 127J/cm2. Posterior a la irradiación se incubará cada placa durante 24 horas. Determinación de viabilidad por las técnicas de rojo neutro y MTT. La viabilidad celular será estimada por el método espectrofotométrico de rojo neutro y por el método 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio bromidio ó MTT69. Pasadas las 24 horas de incubación con el extracto se eliminará el medio y se sustituirá con medio fresco con una concentración de 50 µg /mL de rojo neutro (previamente filtrado). Las placas se incubarán a 37ºC durante 3 horas. Sólo a los pozos que sirven de blanco no se les adicionará rojo neutro. Pasadas las 3 horas se elimina el medio y se lava rápidamente con una mezcla formol – calcio (formaldehído 40% y CaCl2 10% ,v/v 4:1). Se eliminará esta solución y se agregará a cada pozo 100µl de la mezcla ácido acético-etanol (ácido acético 1% y etanol 50% v/v 1:1) agitando la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente. Con una pipeta se pasará el contenido de cada pozo a un tubo de eppendorf previamente etiquetado y se leerá a 540 nm, por espectrofotometría.

En el caso del MTT se empleará a una concentración de 25µg /ml. Las placas se incubarán a 37ºC durante 4 horas y a los pozos que sirven de blanco no se les adicionará MTT. Pasadas las 4 horas se eliminará el medio y a cada pozo se agregará 100 µl de isopropanol a pH 4, luego se agitará la placa unos segundos y se pasará el sobrenadante de cada pozo a un tubo eppendorf y se leerá a 570 nm por espectrofotómetro. Los cálculos se realizan refiriendo la absorbancia del testigo al 100% de sobrevivencia, para determinar que porcentaje le corresponde al problema. Los resultados de expresan como porcentaje de células viables.

RESULTADOS

1. FORMACIÓN DE UN CEPARIO.

Actualmente se mantienen las siguientes especies de cianobacterias aisladas de diferentes reservorios. En la siguiente tabla se resumen el número de aislados de Microcystis spp de diferentes sitios de colecta y el medio de cultivo en el que se mantiene. Tabla 2. Lagos a partir de los cuales se ha aislado Microcystis spp.

Lugar Aislamiento de Microcystis spp. No. de cepas

Calidad del aislado Medio Mineral

Villa Victoria 3 NA, C Z8α Valle de Bravo 0 - - Chapultepec 1a Sección 10 NA,C Z8* Alameda Oriente 1 NA, C Z8 α PORC 12 NA, C Z8 α Bosque de Aragón 3 NA, C Z8 α

NA, No axénico; C, Clonal. * Ajustado a pH 10. α Modificado en este trabajo. En la siguiente tabla se resumen las especies aisladas de los reservorios colectados: Tabla 3. Relación de las especies identificadas, en cada uno de los sitios de colecta.

Localidad Cepas identificadas Lago de Chapultepec 1ª Sección Microcystis sp., Planktothrix agardhii,

Pseudanabaena mucicola, Anabaena helicoidal y A. fallax.

Pista Olímpica de remo y canotaje “Virgilio Uribe” Cuemanco

Planktothrix agardhii y Pseudanabaena mucicola

Alameda Oriente Anabaena helicoidal y Arthrospira sp. Valle de Bravo Pseudanabaena tenuis

2. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD TOXIGÉNICA MEDIANTE PRUEBAS CON CLADÓCEROS. En la siguiente tabla se concentran los resultados de las pruebas tóxicas agudas realizadas con neonatos de Daphnia magna y donde se probó el gua de los sitios de colecta. Como se observa en los resultados la mortalidad fue cero en todos los casos lo que puede indicar que no existen toxinas en el agua colectada o la concentración es muy baja y no es detectada por esta prueba.

Tabla 4. Resultado del bioensayo de toxicidad con neonatos de Daphnia magna empleando muestras de agua de las diferentes colectas.

Lugar Mortalidad, % PORC Cero Villa Victoria Cero Chapultepec 1a Sección Cero AO 2 exclusa Cero AO 3 exclusa Cero AO 4 exclusa Cero AO 5 exclusa Cero Bosque de Aragón Cero

PORC: Pista Olímpica de Remo y Canotaje Virgilio Uribe; AO: Alameda Oriente.

En las siguientes figuras se muestran los resultados de los ensayos tóxicos agudos realizados con biomasa húmeda y seca de Microcystis sp.

Figura 1. Bioensayo realizado con un extracto crudo de Microcystis, proveniente de la PORC ‘Virgilio Uribe’. Representa la mortalidad promedio obtenida en cada concentración. El 100% es con referencia a la concentración de 5 cm3 biomasa / 500 mL de agua dura. Factor de dilución exponencial (2).

Figura 2. Bioensayo realizado con el extracto crudo de Microcystis, proveniente del lago de Chapultepec Primera Sección. La concentración al 100% hace referencia al extracto crudo resultado de la lisis de 5 cm3 de biomasa. Representa la mortalidad promedio obtenida en cada concentración.

Figura 3. Bioensayo realizado con el extracto crudo de Microcystis, proveniente del lago de Chapultepec Primera Sección (Réplica). La concentración al 100% hace referencia al extracto crudo resultado de la lisis de 5 cm3 de biomasa. Factor de dilución exponencial (2). Representa la mortalidad promedio obtenida en cada concentración.

Los ensayos realizados con el extracto de biomasa de Microcystis proveniente del Lago de Chapultepec 1ª. Sección, mostraron una mortalidad proporcional al aumento en la concentración del extracto crudo, generando un gráfico de tendencia sigmoidea (Figura 4).

Figura 4. Bioensayo realizado con el extracto crudo de Microcystis, proveniente

del Lago de Chapultepec 1ª Sección. Se calculó la CL50 para estos bioensayos, mediante el método semilog, con el cual se obtuvieron los siguientes resultados: Alameda Oriente 2: 131.9 mg de biomasa seca / mL Alameda Oriente 4: 180-5 mg de biomasa seca / mL Los valores relativamente bajos de CL50 obtenidos para la Alameda Oriente, son comparables con los obtenidos en Barra Bonita, Brasil (Sotero-Santos et al., 2006). De acuerdo a estos resultados se deduce que las cepas de Microcystis spp. aisladas de diferentes reservorios son potencialmente toxigénicas y que la toxicidad aumenta de manera proporcional a la biomasa empleada. 3. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS DE CIANOBACTERIAS En un primer experimento se tomó una alícuota de 25 µL de cada uno de los extractos acuosos obtenidos de Pseudanabaena tenuis y Microcystis sp. para poner de manifiesto su actividad antimicrobiana contra bacterias fitopatógenas. Los extractos acuosos no presentaron actividad sobre las bacterias fitopatogenas, debido a que no se observó inhibición en el crecimiento de las bacterias (tabla 1)

Tabla 5. Efecto antibacteriano de extractos acuosos de cianobacterias sobre

bacterias fitopatógenas

+: Efecto antibacteriano que se pone de manifiesto por un halo de inhibición. -: No hay efecto antibacteriano, ausencia de halo de inhibición. El primer experimento se realizó por segunda vez con un aumento en la concentración del extracto acuoso se utilizó una alícuota de 50 µL, las bacterias fitopatógenas no mostraron una inhibición en su crecimiento (resultados no mostrados).

Evaluación de la actividad antibacteriana de extractos metanólicos de cianobacterias. Se realizó una extracción orgánica con metanol/acético de las cianobacterias, de tal forma que se obtiene una condición ácida para la liberación de metabolitos secundarios de las cianobacterias, se utilizaron de 1.2 g de biomasa de Microcystis sp y 0.5 g de biomasa de Pseudanabaena tenuis. Figura 5. a) Extracto metanólico de Microcystis sp., b) Extracto metanólico de

Pseudanabaena tenuis.

De los extractos metanólicos obtenidos se tomó una alícuota de 25µL de cada uno para poner de manifiesto la actividad antibacteriana contra bacterias fitopatógenas. El extracto metanólico de Pseudanabaena tenuis no mostró actividad antibacteriana sobre las bacterias fitopatógenas probadas, el efecto se pone de manifiesto por la presencia de un halo de inhibición que no fue revelado (tabla 2).

Bacterias fitopatogenas

cianobacteria

Agrobaterium tumefaciens

Erwinia carotovora

Pseudomonas phaseolus

Xanthomonas campestris

Xanthomonas translucens

Microcystis sp. - - - - -

Pseudanabaena tenuis

- - - - -

Sin embargo extractos metanólicos de Microcystis sp mostraron actividad antibacteriana que se pone de manifiesto por la presencia de un halo de inhibición de crecimiento de Xanthomonas campestris (figura 2), pero no sobre Erwinia carotovora, X. translucens, Pseudomonas phaseolus y Agrobacterium tumefaciens (tabla 2).

Tabla 6. Efecto antibacteriano de extractos metanólicos de cianobacterias sobre bacterias fitopatógenas

+: Efecto antibacteriano que se pone de manifiesto por un halo de inhibición.

-: No hay efecto antibacteriano, ausencia de halo de inhibición

Los extractos acuosos de cianobacterias no mostraron actividad antibacteriana sobre las 5 bacterias fitopatógenas Erwinia carotovora, Xanthomonas campestris, Xanthomonas transluscens, Agrobacterium tumefaciens y Pseudomonas phaseolus, partiendo de una cantidad de 25 y 50 µL

Bacterias fitopatogenas

cianobacteria

Agrobateium tumefaciens

Erwinia carotovora

Pseudomonas phaseolus

Xanthomonas campestris

Xanthomonas translucens

Microcystis sp. - - - - -

Pseudanabaena tenius

- - - + -

X. campestris X. translucens E. carotovora

A. tumefaciens P. phaseolicola

Figura 6. Demostración del efecto antibacteriano de extractos acuosos de

Pseudanabaena tenuis en 5 cepas de bacterias fitopatógenas diferentes. No se observa efecto antibacterial visible en las 5 cepas de bacterias fit tó b d

Extractos metanólicos de cianobacterias mostraron actividad antibacteriana sobre Xanthomonas campestris pero no sobre Erwinia carotovora, Xanthomonas transluscens, Agrobacterium tumefaciens y Pseudomonas phaseolus.

Prueba de sensibilidad de bacterias fitopatogenas a la estreptomicina.

De manera adicional a este trabajo se realizó una prueba de sensibilidad a estreptomicina para observar el efecto de inhibición de las 5 bacterias fitopatógenas utilizadas. Se colocaron concentraciones de estreptomicina de 0, 10, 30, 50 y 100 µg/mL en discos de papel filtro que fueron colocados sobre una siembra masiva en agar B de King de cada una de las 5 bacterias fitopatógenas, después de 24 horas se observó el crecimiento de Pseudomonas phaseolus, Erwinia carotovora, y Agrobacterium tumefaciens debido a que son bacterias que tienen un crecimiento rápido. Hasta este momento solo Erwinia carotovora fue sensible a la estreptomicina a partir concentración de 30 µg/mL hasta la concentración de 100µg/mL, Psdeudomonas phaseolus y Agrobacterium tumefaciens no fueron sensibles a la estreptomicina. El efecto de sensibilidad se pone de manifiesto por la presencia de un halo de inhibición de crecimiento ( figura 4) Después de 48 horas se observa el crecimiento de Xanthomonas campestris y Xanthomonas translucens (bacterias de crecimiento lento), ninguna de estas bacterias mostró sensibilidad a la estreptomicina (tabla 6)

Figura 7. Efecto de inhibición de diferentes concentraciones de estreptomicina sobre Erwinia carotovora

4. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTICANCERÍGENA DE LOS METABOLITOS AISLADOS. Identificacion de las ficobiliproteinas por electroforesis PAGE- SDS. El extracto de PBPs fue analizado por electroforesis continua en 2 geles de poliacrilamida PAGE-SDS. Ambos geles fueron diseñados de igual manera,

pero al revelarlos se utilizaron tinciones diferentes, la cuales fueron: Tinción con plata y tinción con azul de Comassie. Al revelar ambos geles se obtuvo mejor resolución con la tinción de Comassie (figura 8). En esta fotografía tomada por transiluminación podemos observar en los carriles 1 y 10 el corrimiento del marcador de peso molecular (Bench Mark® de Invitrogen) el cual contiene 10 proteínas de peso molecular que van de los 190 a los 10 KDa (de arriba hacia abajo). En el carril 2 y 3 se corrieron los estándares comerciales de PE y PC respectivamente. Mientras que en los carriles del 4 al 5 se corrió el extracto de PBPs sin concentrar y en los carriles del 7 al 9 se corrió el extracto dializado. En el carril correspondiente a el estándar de PE se observa una banda mas marcada de aproximadamente 14 KDa y por arriba de ella una banda sin separar de 20 kDa. Sin embargo el estándar de PC describió una banda muy marcada entre los 20 y 15 KDa. Las bandas correspondientes al extracto sin concentrar se muestran mas tenues a comparación del concentrado, sin embargo en los carriles que corresponden a los extractos se aprecian dos bandas muy marcadas de 20 y 25 KDa que coinciden con los pesos moleculares de PE y PC respectivamente, reportados en la bibliografía. Entre los 120 a los 25 KDa se describe un patrón de múltiples bandas de baja intensidad que pudieran corresponder a subunidades proteicas agregadas.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 8: Identificación de ficobiliproteínas por electroforesis.

Posteriormente se realizo una curva tipo por método de Bradford para conocer la cantidad de PBPs cargada en cada carril. Obteniendo que en los carriles 4, 5 y 6 la concentración de PBPs cargada fue de 2.5, 5, 7.5 µg respectivamete, mientras que en los carriles 7, 8 y 9 µL la concentración de PBPs fue de: 6.7, 13.5 y 20.2 µg. Lo cual pudiera explicar el suceso observado en los carriles del 7 al 9, donde se observa una mancha barrida al final que debido a la alta

190 120 85 60 50 40 25 20 15

concentración de proteína cargada y el exceso de sales en el concentrado ocasionaron este fenómeno. Separación de las diferentes ficobiliproteínas por cromatografia de intercambio ionico Se inició la estandarización de la separación de PBPs por cromatografía de intercambio iónico en una columna de cristal de 3.1 x 33 cm empleando una resina de DEAE- Celulosa como fase estacionaria. Se mantuvo un gradiente lineal de regulador KPO4 5 a 200 mM pH 7. Se colectaron 89 fracciones de 3 mL durante la elusión, de estas se seleccionaron 2 fracciones en las cuales se observaron 3 bandas parcialmente separadas, con máximos correspondientes a PE, PC, APC, (figura 9).

Figura 9: Fracción seleccionada de la purificación parcial del extracto de PBPs por cromatografía de intercambio iónico.

Posteriormente se decidió realizar barridos de 200 a 700 nm a los estándares comerciales para comparar los picos de pureza del estándar con las fracciones seleccionadas de la cromatografía realizada. Encontrando francas impurezas en el estándar (figura10).

400.0 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 7000.000

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

0.24

0.26

0.28

0.30

0.323

nm

A

48

651.94

620.97

560.93

Figura 10 : Barrido de el estándar comercial de Ficoeritrina Determinacion de la efectividad de la PDT utilizando estandares comerciales de ficoeritrina y ficocianina. Se determinó la efectividad de la PDT utilizando los estándares comerciales de PE y PC de laboratorios Sigma. El primero extraído de un alga roja Porphyridium cruentum y el segundo de la cianobacteria Spirulina sp. (referido en catálogo). Se decidió sembrar en microplacas de 96 pozos, 50000 células HeLa por pozo, por cuadruplicado y se expusieron a dosis altas de los estándares de PE y PC. Se emplearon las mismas dosis estudiadas por Vargas y Cols.64en un estudio previo en donde se utilizó un extracto el PBPs de Pseudanabaena tenuis sin purificar, como agente fotosensibilizante.Una placa se sometió a irradiación con un láser de Argón a 127 J/ cm2.

Tabla 7: Dosis más altas reportadas por Vargas y Cols en el 2005, con las cuales se obtuvo muerte celular significativa, empleando el extracto de PBPs.

Ficobiliproteínas (mg/mL)

% de mortalidad de células HeLa

PE PC APC Sin PDT Con PDT

0.0** 0.0** 0.0** 0.0±0.01 0.0±0.01

2,1e-3 1,46.e-3 9,61e-3 0,0±0.01 45,69±9.6 e-3*

4,3e-3 2,92.e-3 1,92e-3 6,47±0.037 46,51±0.013*

8,7e-3 5,84e-3 3,84e-3 17,4±0.008 48,18±0.012*

0,0174

2,34e-2 1.54e-2 6,47±0.022 46,51±3.8 e-3*

0,0696

4,68e-2 3.08e-2 23,38±0.01 57,1±0.0132*

*Diferencia significativa (p<0.05), **Grupos controles.

200.0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700.00.06

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.56.74

nm

A

569.98

563.00554.95

542.95525.05

520.07

230.77

221.12

Posteriormente se realizó una prueba de viabilidad con método de Rojo Neutro a ambas placas. Al obtener los resultados no se observó muerte significativa de las células cancerosas.

Tabla 8: Mortalidad de células HeLa con y sin PDT, empleando los estándares comerciales.

% de mortalidad de células HeLa

Estándar de PB

Concentración

Sin PDT Con PDT PE 0.0696 14.54 13.62 PC 4.68 x 10-2 13.37 0

Esto probablemente se deba a que la PE y PC de los estándares provienen de un tipo de organismo diferente a la cianobacteria de nuestro interés y probablemente estas PBPs tengan algunas diferencias en su estructura que no favorezcan la formación de estados tripletes. Se probaron células HeLa, CaLo (Infectadas con VPH) y C33 una línea celular no infectada con VPH, fueron expuestas a concentraciones desde 1.69 x 10 -5 hasta 2.17 x 10 -3 mg/mL de la C-PE que se purificó de P. tenuis, las células se irradiaron con un laser de argón (127 J/cm2). Se determinó la viabilidad celular y se encontró que las mayores concentraciones fueron efectivas con las líneas HeLa y CaLo con un 92 % y un 74% de mortalidad mientras que con la línea celular C33 la terapia fotodinámica no fue efectiva. Se concluye que la ficoeritrina puede ser usada como un fotosensibilizador en algunos tipos de cáncer. IMPACTO

De acuerdo a los resultados del proyecto se encontró que algunas cianobacterias que se encuentran en florecimientos de cuerpos de agua de la ciudad de México y zonas cercanas son potencialmente toxigénicas, lo que es de relevancia ya que son sitios empleados intensamente por la pobladores de la zona metropolitana para actividades recreativas y deportivas. En este proyecto se establecieron protocolos para el aislamiento de las cianobacterias, y también para la evaluación de su toxicidad empleando organismos como cladóceros o bacterias. También se ha demostrado que algunas de estas cianobacterias no son toxigénicas y que sus metabolitos pueden emplearse su como anticancerígenos. Lo que abre una línea de investigación de gran importancia en el sector salud. Así mismo, este proyecto ha permitido la vinculación con diferentes laboratorios de la Escuela con el fin de realizar un trabajo interdisciplinario, y con este proyecto se ha podido titular a estudiantes de licenciatura y de maestría, algunas tesis ya han culminado y otras están por concluirse, parte de este rabjao se ha presentado en foros nacionales e internacionales.