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CARACTERIZACIÓN DE ISOTERMAS DE PRESIÓN SUPERFICIAL EN
FUNCIÓN DEL ÁREA, PARA PELICULAS INTERFACIALES DEL
SISTEMA TENSIOACTIVO PULMONAR.
Informe de pasantía presentado por:
Yenny Carolina Velazco Rojas
Angélica Giovanna Barragán Rojas
Director Externo:
Olga Lucia Ospina Ramírez, Ph.D.
Director Interno:
José Manuel Flórez Pérez, Ph.D.
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
LICENCIATURA EN FÍSICA
BOGOTÁ D.C
2017
ÍNDICE
I. Introducción ...................................................................................................................... 1
I.1. Surfactante Pulmonar (SP) ............................................................................................... 2
I.1.1. Historia. ............................................................................................................................ 2
I.1.2. Composición. .................................................................................................................... 3
I.1.2.1. Fracción Lipídica. ............................................................................................................ 4
I.1.2.2. Fracción Proteica. ............................................................................................................ 4
I.2. Estudios Biofísicos del Surfactante Pulmonar: “Fenómenos de Superficie” ................... 5
I.2.1. Interfase Aire-Líquido. ..................................................................................................... 5
I.2.2. Intercambio Gaseoso de O2 por CO2. ............................................................................... 6
I.2.2.1. Proceso Termodinámico: Difusión Alveolo-Capilar. ....................................................... 6
I.2.3. Tensión Superficial. .......................................................................................................... 7
I.2.3.1. Ley de Laplace. ................................................................................................................. 9
I.2.4. Adsorción ........................................................................................................................ 12
I.3. Balanzas de Compresión ................................................................................................. 13
I.4. Isotermas de Compresión ............................................................................................... 14
I.5. Presión superficial .......................................................................................................... 16
I.6. Trabajo mecánico durante la espiración ......................................................................... 16
II. Objetivos ......................................................................................................................... 18
II.1. General ............................................................................................................................ 18
II.2. Específicos ...................................................................................................................... 18
III. Justificación .................................................................................................................... 19
IV. Materiales y Métodos ..................................................................................................... 20
IV.1. Surfactante Pulmonar de Origen Animal ........................................................................ 20
IV.1.1. Obtención del Lavado Broncoalveolar. .......................................................................... 20
IV.1.1.1. Primer Proceso: Centrifugación del Lavado Bronco-alveolar. ..................................... 21
IV.1.1.2. Segundo Proceso: Ultracentrifugación del Lavado Bronco-alveolar. ........................... 21
IV.1.1.3. Tercer Proceso: Gradiente de Densidad. ....................................................................... 22
IV.1.1.4. Cuarto Proceso: Cuantificación de Fosfolípidos. .......................................................... 23
V. Análisis y Resultados ...................................................................................................... 27
V.1. El trabajo calculado en el proceso de compresión lateral de películas interfaciales ...... 31
VI. Discusión ........................................................................................................................ 38
VII. Conclusiones ................................................................................................................... 40
Perspectivas................................................................................................................................... 41
Anexos .................................................................................................................................... 42
VIII. Referencias ..................................................................................................................... 44
1
Introducción
I. Introducción
La terapia clínica con preparaciones de surfactante pulmonar (SP), se ha
establecido como un avance importante en el manejo médico de recién nacidos prematuros con
síndrome de dificultad respiratoria, o también conocida como enfermedad de membrana hialina
(Pérez-Gil, 2008). Este síndrome consiste en la carencia de un surfactante pulmonar óptimo que
estabilice la interfase aire-líquido alveolar durante la fisiología respiratoria, principalmente,
mediante la reducción de la tensión superficial al final de la espiración.
Los estudios estructurales y de caracterización bioquímica de surfactante pulmonar, se
desarrollan a partir de material obtenido de lavado broncoalveolar de origen animal (Serna,
2006), dado que es en el pulmón donde se realiza el intercambio gaseoso aportando el oxígeno
necesario para la respiración y por consiguiente de donde se extrae el surfactante pulmonar.
Para llevar a cabo este estudio biofísico de las películas interfaciales de surfactante
pulmonar, se realizaron isotermas de compresión de origen porcino, a partir de lavados
broncoalveolares; teniendo señalada la cantidad de fosfolípidos que contiene el material (Bligh,
1959) se evalúan las isotermas, mediante la medición de la presión superficial en función del área
de la interfase aire-líquido, a dos temperaturas de referencia 25°C y 37°C. En estas mediciones
se tiene en cuenta la variación de factores como: la masa del surfactante (10μg, 25μg y 50μg)
que se aplica en la interfase, y la velocidad de compresión de la película (37mm/min,
70mm/min y 100mm/min), utilizando una balanza de tensión superficial o balanza de superficie
KSV Nima, que consta básicamente de un recipiente de teflón en el que se dispone una
subfase acuosa de buffer monocapas, sobre la cual se deposita el material surfactante que forma
la película interfacial a analizar.
A continuación, se describirá con más detalle los conceptos y procedimientos que se
mencionaron anteriormente y que fueron necesarios para la elaboración de este estudio biofísico.
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Introducción
I.1. Surfactante Pulmonar (SP)
El surfactante pulmonar es un complejo lipoproteico sintetizado y secretado hacia la
interfase alveolar por unas células alveolares llamadas neumocitos de tipo II; este
compuesto facilita los procesos de respiración y cumple dos funciones básicas: reduce la
tensión superficial en la interfase, contrarrestando las fuerzas físicas que tienden hacia el
colapso y funciona como un mecanismo de defensa ante agentes infecciosos que superan
las vías aéreas superiores (Pérez-Gil, 2010).
I.1.1. Historia.
El estudio del surfactante pulmonar comenzó con la necesidad de conocer la razón
por la cual, los neonatos prematuros nacían con problemas respiratorios. Según las
investigaciones del Doctor alemán Kurt von Neergaard en 1929, se comenzó a creer
en la existencia de una sustancia dentro de los pulmones que evitaba el colapso
alveolar, debido a que tenía algún efecto en la tensión superficial de la interfase aire-
líquido de los alveolos. Con estos estudios se empezó a suponer que los bebés que
nacían con atelectasia, era debido a la ausencia de dicha sustancia en los pulmones, y
gracias a las investigaciones que se iniciaron a raíz de esa hipótesis, se pudo
descubrir la existencia del SP y su importancia en los procesos de respiración
(Jiménez & Castellanos, 2009).
Aproximadamente en la época de los cincuenta, el físico Richard Pattle y el fisiólogo
John Clements estudian paralelamente los daños que causan ciertas armas químicas
llamadas gases nerviosos en el sistema respiratorio de algunos animales, llegando
juntos a la misma observación sobre la existencia de una sustancia en la superficie de
los alveolos, la cual llamaron surfactante pulmonar (Halliday, 2008). Para la misma
época de Pattle y Clements, Mary Avery y Jeremiah Mead descubrieron que los
bebés prematuros que fallecían por el síndrome de dificultad respiratoria (SDR) o
enfermedad de membrana hialina (HDM), era a causa de una deficiencia de
surfactante pulmonar (Chattás, 2013).
En los estudios que se le realizaron posteriormente a las características del SP, se
observó que el dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) era su principal componente
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Introducción
fosfolípidico y el más abundante, por lo que investigadores como Robillard y Chu en
la época de los sesenta, llegaron a una conclusión bastante apresurada, de que dicho
componente lipídico por si solo podía sustituir al SP, si era suministrado como
medicamento en forma de aerosol a los bebés prematuros que lo necesitaran, lo cual
no les resulto con éxito (Chu & et al., 1967).
Después de este intento fallido, en los setenta otros investigadores como Enhorning y
sus colegas, se dieron cuenta que el surfactante obtenido de conejos adultos podía
beneficiar la respiración de conejos prematuros cuando se les suministraba por la
tráquea; además tiempo después, en los ochenta, Fujiwara informó que realizó
instilaciones de SP de origen bovino en humanos recién nacidos y observó una
respuesta positiva por parte de ellos, concluyendo así que aunque el DPPC es el
fosfolípido que tiene mayor presencia en el agente tensioactivo, no es el único
compuesto que realiza el trabajo de la disminución de la tensión superficial en los
alveolos, debido a que requiere de algunas proteínas y otros lípidos que le ayuden a
facilitar la adsorción en la interfase (Rimensberger, 2015).
I.1.2. Composición.
En los estudios realizados a la composición del surfactante pulmonar (Figura 1), se
ha podido observar en su estructura molecular que esta sustancia está conformada
aproximadamente por un 92% de lípidos y un 8% de proteínas; de la parte lipídica
cerca del 90% del peso lo componen los fosfolípidos y el porcentaje restante lo
conforman los lípidos neutros (Pérez-Gil, 2010).
Figura 1: Composición del Surfactante Pulmonar. Esquema tomado de (Picardi, 2014)
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Introducción
I.1.2.1. Fracción Lipídica.
En esta fracción del SP se encuentran los lípidos neutros y los fosfolípidos
(Figura 2). Los lípidos neutros conforman cerca del 8% y están compuestos
principalmente por colesterol y una fracción mínima de triglicéridos y ácidos
grasos libres (Ospina, 2011); por otra parte, los fosfolípidos son moléculas que
tienen un grupo fosfato que les da la característica de ser anfipáticas, esto
quiere decir que poseen una parte hidrofílica y otra parte hidrofóbica. Estas
moléculas conforman aproximadamente el 85% del peso total del SP y se
clasifican en: fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina
(PS), fosfatidiletanolamina (PE) y fosfatidilcolina (PC) (Notter, 2000). La PC
es el fosfolípido más abundante, y se encuentra presente en su mayoría con dos
cadenas palmíticas saturadas (cadenas grasas sin dobles enlaces) al que se le
conoce como (DPPC), que es el principal constituyente del agente tensioactivo
y conforma aproximadamente el 41% de su peso total (Ospina, 2011).
Figura 2: Fosfolípidos y lípidos neutros representados por medio de un esquema, en dónde se puede
observar la estructura química e identificar las regiones hidrofílicas e hidrofóbicas de cada uno.
Esquema tomado de (Ospina, 2011)
I.1.2.2. Fracción Proteica.
Las proteínas son moléculas formadas por aminoácidos y cumplen con diversas
funciones en el organismo. En el SP existen cuatro proteínas: SP-A, SP-B, SP-
C y SP-D (Figura 3), que en parejas cumplen con unas funciones específicas; la
SP-A y la SP-D son glicoproteínas hidrofílicas encargadas principalmente de
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Introducción
regular el sistema inmune para defender los pulmones de la entrada de
cualquier agente patógeno, y la SP-B y SP-C son proteínas hidrofóbicas que
cumplen fundamentalmente con la reducción de la tensión superficial ya que
permiten la adsorción de los fosfolípidos en la película que se forma en la
interfase aire-líquido de los alveolos (Sánchez & Torres, 2004).
Figura 3: Representación gráfica de las cuatro proteínas (SP-A, SP-B, SP-C y SP-D) existentes en el
surfactante pulmonar ubicado en la hipofase acuosa del alveolo. (Pérez-Gil, 2008)
I.2. Estudios Biofísicos del Surfactante Pulmonar: “Fenómenos de Superficie”
I.2.1. Interfase Aire-Líquido.
Todas las sustancias tienen características químicas y propiedades intensivas
variables que hacen que podamos diferenciar unas de otras; debido a que estas
sustancias tienen estados fundamentales que ocupan de distintas formas un lugar en
el espacio, se puede decir que se encuentran en alguna fase en especial. Cuando dos
sustancias se colocan en contacto y macroscópicamente se puede observar la
separación entre ellas (interfase), se habla de que son fases incompatibles que no se
pueden mezclar debido a la gran diferencia que existe entre sus compuestos
químicos.
Los alveolos pulmonares son el lugar en donde se realiza el intercambio gaseoso del
oxígeno O2 por el dióxido de carbono CO2, y este proceso se da en dos interfases: la
primera se forma entre el aire que respiramos y la capa de agua que rodea al alveolo,
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Introducción
y la segunda se forma entre la capa de agua que rodea al alveolo, con la sangre que
circula por los capilares de las paredes alveolares.
I.2.2. Intercambio Gaseoso de O2 por CO2.
Con lo mencionado anteriormente, se puede evidenciar que, en el proceso de
ventilación pulmonar, el aire juega un papel importante, debido a que se purifica la
sangre realizando un intercambio gaseoso de O2 por CO2, mediante un proceso físico
llamado difusión pasiva, que se da necesariamente por las características anatómicas
y fisiológicas del sistema circulatorio y respiratorio (Koeppen & Stanton, 2009).
I.2.2.1. Proceso Termodinámico: Difusión Alveolo-Capilar.
La difusión pasiva es un proceso termodinámico irreversible en donde no se
utiliza energía diferente a la cinética de las moléculas para transportar el O2 y
el CO2, pero para que se dé dicho transporte o flujo de materia, se necesita que
exista unas fuerzas conductoras como lo son: el gradiente de presión que
depende del gradiente de concentración de soluto y la temperatura. Como el
proceso biológico de la respiración se desarrolla en un sistema a temperatura
constante, entonces el intercambio gaseoso de O2 por CO2, no depende de
dicha fuerza conductora; pero como hay un intercambio entre dos soluciones,
la fuerza existente es aquella en donde interviene el gradiente de concentración
del soluto, con esto el estado final del sistema es un equilibrio de difusión, en
donde se iguala la concentración a cada lado de la membrana alveolo-capilar
(Vázquez, 2002).
En el intercambio gaseoso, la velocidad de difusión a través de la membrana
alveolo-capilar depende de varios factores, uno de ellos es el gradiente de
presión, dado que entre mayor sea la diferencia de presión parcial de la
sustancia, más rápida será la difusión (Patiño, 2005), y otro factor importante
es la superficie de contacto, ya que cuanto mayor es la superficie expuesta al
contacto con el aire, mayor es la velocidad de difusión; en el caso de los
pulmones, ellos exponen al intercambio gaseoso una superficie de
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Introducción
aproximadamente 70m2 que pertenece a los alveolos cuando el pulmón se
encuentra con un volumen en reposo (Koeppen & Stanton, 2009).
I.2.3. Tensión Superficial.
En los líquidos se pueden observar fuerzas internas provocadas por la atracción entre
las moléculas, a esta atracción se le conoce normalmente como cohesión y a las
fuerzas internas que se producen entre las moléculas que interactúan, se les conoce
como fuerzas de Van der Waals. Estas fuerzas que disminuyen al aumentar la
distancia entre las moléculas, ayudan a que exista entre ellas una mayor estabilidad
que, aunque son fuerzas débiles en comparación con las fuerzas internas de las
moléculas, se dan en grandes cantidades, generando importantes contribuciones a las
propiedades físicas de los líquidos (Castellan, 1987).
En una interfase aire-líquido, las fuerzas de Van der Waals difieren de acuerdo a las
fases en las que se encuentran las sustancias que están en contacto, y como la
separación entre las moléculas es mucho mayor en una fase gaseosa que en una fase
condensada, entonces las fuerzas de Van der Waals son menores en los gases que en
los líquidos. Si se analiza el líquido en la interfase, se puede observar que las
interacciones de las moléculas de la superficie, no se encuentran en equilibrio debido
a que no hay fuerzas lo suficientemente intensas que actúen hacia arriba para que la
fuerza neta sobre ellas sea cero; este desequilibrio en la interfase hace que las
moléculas experimenten fuerzas hacia el centro del líquido, provocadas por las que
están justo debajo de las que se encuentran en la superficie, causando así que el
líquido tienda a minimizar su superficie resistiéndose a fuerzas de expansión (Wilson
& Buffa, 2003).
Cuando la interfase aire-líquido se encuentra en equilibrio hidrostático y se somete a
un proceso reversible e isotérmico de expansión, el trabajo mecánico realizado en el
sistema se describe por medio de dos situaciones: la primera situación, define el
trabajo que realiza la presión para incrementar el volumen del sistema de la siguiente
manera , pdV; y la segunda situación, especifica que, el trabajo que incrementa el
área de la interfase lo realiza la tensión superficial γ, en donde el signo negativo
indica que γ se opone a dicho proceso de expansión, –γdA (Ono & Kondo, 1960).
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Introducción
Teniendo en cuenta estas dos situaciones, el trabajo total que se ejerce sobre la
superficie cuando hay cambios en su área y volumen es:
𝛿𝑊 = 𝑝𝑑𝑉 − 𝛾𝑑𝐴. (1)
Debido al proceso que se está ejerciendo sobre el sistema, a medida que cambia el
área de la interfase, la energía interna U del sistema también cambia y por
consiguiente se genera un incremento en la cantidad de calor. Esto se describe por
medio de la primera ley de la termodinámica como:
𝛿𝑄 = 𝑑𝑈 + 𝛿𝑊, (2)
Y teniendo en cuenta la relación de la ecuación (1) con la primera ley, tenemos:
𝛿𝑄 = 𝑑𝑈 + 𝑝𝑑𝑉 − 𝛾𝑑𝐴. (3)
Dicho calor absorbido 𝛿𝑄 , es energía que no es útil para el proceso isotérmico
descrito anteriormente, por consiguiente, se puede escribir a través de la entropía por
medio de la segunda ley de la termodinámica
𝛿𝑄 = 𝑇𝑑𝑆, (4)
Se puede observar que, tanto en el trabajo como en el calor, se utiliza δ en vez de d,
esto es porque estas dos propiedades no son funciones de estado, ya que dependen
del proceso que se ejerza sobre el sistema. Reemplazando la segunda ley de la
termodinámica en la ecuación (3) tenemos:
𝑑𝑈 = 𝑇𝑑𝑆 − 𝑝𝑑𝑉 + 𝛾𝑑𝐴. (5)
Como el sistema está realizando el trabajo máximo, se puede escribir en términos de
la energía libre de Helmholtz en su forma diferencial de la siguiente forma:
𝑑𝐹 = 𝑑𝑈 − 𝑇𝑑𝑆 − 𝑆𝑑𝑇, (6)
Debido a que la energía libre de Helmholtz depende en parte, de la energía interna,
entonces se puede relacionar la ecuación (5) con la ecuación (6), quedando:
𝑑𝐹 = −𝑝𝑑𝑉 + 𝛾𝑑𝐴 − 𝑆𝑑𝑇. (7)
Las ecuaciones escritas anteriormente describen un sistema cerrado (aislado); pero en
el caso en que el sistema se encuentra abierto, existe un intercambio de materia con
el entorno y por consiguiente se debe tener en cuenta un término adicional que
depende del número de moléculas que se intercambian con el exterior, quedando:
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Introducción
𝑑𝐹 = −𝑝𝑑𝑉 + 𝛾𝑑𝐴 − 𝑆𝑑𝑇 + ∑ 𝜇𝑖𝑑𝑁𝑖
𝑥
𝑖=1
, (8)
Esta expresión es conocida como la ecuación fundamental de Gibbs y se representa
con la letra (G), en donde 𝜇 es el potencial químico asociado a la cantidad de materia
del sistema y 𝑁𝑖 es el número de moléculas contenidas en la sustancia i. Escribiendo
la ecuación (8) en términos de la energía libre de Gibbs, queda como:
𝑑𝐺 = −𝑝𝑑𝑉 + 𝛾𝑑𝐴 − 𝑆𝑑𝑇 + ∑ 𝜇𝑖𝑑𝑁𝑖
𝑥
𝑖=1
. (9)
Si se realiza un análisis a la ecuación (9), la energía libre de Gibbs depende del
volumen, la temperatura y el número de moléculas, por consiguiente, se puede
definir la tensión superficial como la variación que se produce en la energía libre
interfacial del sistema debido a la variación en el área de la superficie (Ono &
Kondo, 1960).
𝛾 = (𝜕𝐺
𝜕𝐴)
𝑇,𝑉,𝑵. (10)
I.2.3.1. Ley de Laplace.
Los fenómenos de superficie tienen un papel protagónico en la ventilación
pulmonar, por lo cual es de suma importancia realizar un análisis físico a la
relación que existe entre la tensión superficial en la que se encuentra la
membrana alveolar, y las presiones que son necesarias para que los alveolos no
colapsen.
La ley de Laplace, para el caso del proceso de respiración, relaciona la
diferencia de presiones que existe a ambos lados de una membrana elástica; por
esta razón, es el modelo adecuado para realizar dicho análisis físico al
funcionamiento de los alveolos (Kane & Sternheim, 2007) y se puede deducir
de la siguiente manera: Suponiendo que los alveolos son totalmente esféricos,
la diferencia de presiones tanto en el interior de la cavidad pulmonar (𝑝𝑖) como
en el exterior (𝑝𝑒) producida por la presión de la sangre en los capilares,
originan fuerzas perpendiculares a la superficie de la membrana. La presión en
el interior del alveolo es mayor que en el exterior (Figura 4-a), debido a que los
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Introducción
gases que se encuentran en el interior, están sometidos a la presión de los
capilares sanguíneos y a la presión que ejerce la tensión de la superficie de la
membrana alveolo-capilar (Villar, López, & Cussó, 2013).
Figura 4: a) presiones ejercidas tanto en el interior como en el exterior de una membrana elástica. b)
Fuerzas generadas por las diferencias de presiones y la tensión superficial de la superficie de la
membrana, y a la derecha se observa una proyección de la superficie de la semiesfera sobre un plano
imaginario. Esquema modificado de (Kane & Sternheim, 2007)
Si se toma solo la mitad de un alveolo (Figura 4-b), las fuerzas que lo
mantienen en equilibrio, son las generadas por la diferencia de presiones y las
producidas por la tensión de la superficie de la membrana. La proyección de la
mitad del alveolo sobre un plano imaginario, muestra que todas las
componentes de las fuerzas provocadas por las presiones, que son tangenciales
al plano se cancelan y que solo quedan las que son perpendiculares, generando
así una fuerza total igual a:
𝐹1 = (𝑝𝑖 − 𝑝𝑒)𝐴𝑝 (11)
El término 𝐴𝑝 es el área del círculo de la proyección del alveolo sobre el plano,
quedando:
𝐹1 = (𝑝𝑖 − 𝑝𝑒)(𝜋𝑟2) (12)
En el caso de las fuerzas ejercidas por la tensión superficial 𝛾 de la membrana
del alveolo, se puede observar que, en la parte en donde se cortó el alveolo por
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Introducción
la mitad, la tensión superficial es perpendicular a cada punto del perímetro, por
lo que la fuerza total es:
𝐹2 = −(2𝜋𝑟) 𝛾 (13)
El signo negativo hace referencia a la oposición en la dirección de esta fuerza
con la provocada por la diferencia de presiones y 𝛾 es el coeficiente de tensión
superficial; la diferencia de presiones tienden a incrementar el volumen del
alveolo, en cambio la tensión superficial de la membrana tiende a minimizar el
área de la superficie, por lo tanto, cuando estas dos fuerzas se compensan, se
puede decir que el sistema se encuentra en equilibrio, y por consiguiente la
suma de las fuerzas debe ser igual a cero:
𝐹1 + 𝐹2 = 0 (14)
(𝑝 − 𝑝𝑒)(𝜋𝑟2) − (2𝜋𝑟)𝛾 = 0 (15)
Despejando la diferencia de presiones se tiene que:
(𝑝𝑖 − 𝑝𝑒)(𝜋𝑟2) = (2𝜋𝑟)𝛾 (16)
(𝑝𝑖 − 𝑝𝑒) =2𝛾
𝑟 (17)
A esta última expresión se le conoce como la Ley de Laplace, y nos explica
que un alveolo de menor tamaño que otro, necesita mayor diferencia de presión
para mantenerse hinchado (con la condición de que la presión sanguínea sea la
misma), y que la diferencia de presiones es proporcional al coeficiente de
tensión superficial (Kane & Sternheim, 2007), ya que entre mayor sea la
tensión superficial de la membrana alveolo-capilar, mayor debe ser la
diferencia de presiones (𝑝𝑖 − 𝑝𝑒) para que el sistema se mantenga en equilibrio
mecánico.
Figura 5: Ley de Laplace representada por dos alveolos de diferentes tamaños que se encuentran
interconectados. Esquema modificado de (Ospina, 2011)
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Introducción
Realizando el análisis para el caso de dos alveolos que se encuentran
comunicados por un conducto (Figura 5), la Ley de Laplace relaciona la
diferencia de presiones de ambos alveolos y sus tamaños de la siguiente
manera:
(𝑝𝑖1 − 𝑝𝑒) =2𝛾
𝑅1, (18)
(𝑝𝑖2 − 𝑝𝑒) =2𝛾
𝑅2, (19)
Sustrayendo las ecuaciones (18) y (19) y teniendo en cuenta que la presión
externa de ambos alveolos es la misma, se obtiene:
(𝑝𝑖1 − 𝑝𝑖2) = 2𝛾 (1
𝑅1−
1
𝑅2). (20)
Esta expresión nos manifiesta lo que se mencionó con anterioridad. El aire que
se encuentra dentro de los alveolos ejerciendo diferentes presiones, fluye de
donde hay mayor presión (alveolos pequeños) a donde hay menor presión
(alveolos grandes), esto genera que los alveolos de menor tamaño tiendan a
colapsar; por esta razón es importante la existencia del surfactante pulmonar,
ya que evita dicho colapso, equilibrando las presiones internas de cada uno de
los alveolos (Villar, López, & Cussó, 2013).
I.2.4. Adsorción
Cuando el interior del alveolo está recubierto por una fina capa de agua,
instantáneamente se genera fuerzas intermoleculares que hacen que el alveolo tienda
a minimizar su superficie y por consiguiente tienda al colapso; está tensión en la
superficie del líquido, se puede contrarrestar fácilmente con una sustancia que sea
capaz de acumularse en la superficie (Figura 6) y disminuya la energía total
interfacial del sistema (Villar, López, & Cussó, 2013), y como ya se ha mencionado
anteriormente, esta sustancia la secreta las células neumocitos tipo II y se le conoce
como surfactante pulmonar.
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Introducción
Figura 6: Adsorción de una película de surfactante pulmonar que se ubica en la interfase aire-líquido
Las cantidades adsorbidas en una superficie, se definen como la densidad superficial
de moléculas con referencia a la zona interfacial (Ono & Kondo, 1960).
I.3. Balanzas de Compresión
Si se deposita una sustancia con propiedades anfipáticas en una superficie acuosa y se deja
reposar por un tiempo determinado, esta se adsorbe en la interfase, formando una
monocapa a la que se le conoce como película de Langmuir, que produce cambios en las
propiedades físicas del sistema; para poder observar algunos de los cambios físicos que se
dan en la interfase, se realizan isotermas de presión superficial utilizando instrumentos que
permiten medir las fuerzas intermoleculares, producidas en la superficie de un líquido en
particular. En el caso del surfactante pulmonar, al cual se le realiza un análisis de los
efectos que produce en la tensión superficial de sustancias acuosas, uno de los
instrumentos que se utiliza es la balanza Langmuir KSV Nima.
Figura 7: Balanza de Langmuir de tensión superficial en donde se puede observar algunas de las partes que la
componen: (sensor de presión superficial, cubeta de teflón, barrera de compresión y canales de termalización).
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Introducción
Esta balanza (Figura 7) contiene una cubeta hecha de teflón, controlada térmicamente por
medio de unos canales por los cuales circula agua a la temperatura que lo requiera el
experimento a realizar; esta cubeta tiene la propiedad de ser resistente ante la adhesión de
sustancias como el agua o algunos disolventes orgánicos, y tiene una cinta de material
hidrofóbico (Ribbon Barrier) que evita que la película de surfactante se salga del área de
trabajo, funcionando así, como una barrera que ayuda a tener un mayor control sobre el
material. Con esta balanza se pueden realizar diferentes observaciones de la tensión
superficial a través de un software que controla un sensor de presión superficial y las
barreras que varían la superficie de trabajo, ya sea disminuyendo o aumentando el área a
una velocidad constante (Biolin Scientific, 2016).
El sensor de presión superficial se encuentra en la parte superior de la balanza (Figura 7), y
está compuesto por un dinamómetro que está unido a un soporte en el cual se suspende una
placa rectangular (placa de Wilhelmy); esta placa es sumergida en la sustancia acuosa que
se va a analizar y luego se procede a medir, por medio del sensor, la fuerza que ejerce el
fluido sobre la placa (Figura 8) (Salager & Anton, 2005).
Figura 8: La placa de Wilhelmy es un método con el cual se puede medir la fuerza que ejerce la tensión superficial de la
película adsorbida, sobre la placa sumergida en el líquido. Esquema modificado de (Salager & Anton, 2005) & (Biolin
Scientific, 2016).
I.4. Isotermas de Compresión
Las isotermas se realizan cuando se necesita información acerca de las interacciones
moleculares, estructura, fases de transición, histéresis o compresibilidad de sustancias en
equilibrio termodinámico, que se encuentran sobre una interfaz aire-líquido y que son
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Introducción
sometidas a procesos de compresión y/o expansión (Biolin Scientific, 2016). Cuando se
deposita la sustancia que se va a analizar (como en nuestro caso el SP), esta se adsorbe en
la superficie del líquido formando una película, que se comprime de manera cuidadosa con
el fin de ir aumentando la concentración mientras disminuye el área superficial y así
generar una reducción en la tensión superficial del líquido (Maldonado, 2006).
Figura 9: Isoterma de compresión de una película de surfactante adsorbida en una interfase: Presión superficial en
función del área con indicación de las fases asociadas a la concentración según el área en la compresión. Esquema
modificado de (Ospina, 2011) & (Biolin Scientific, 2016)
Cuando se va comprimiendo la película en la balanza Langmuir KSV Nima, ella va
cambiando de fase de acuerdo con las interacciones que se van generando, por cercanía
entre las moléculas del surfactante. Durante la primera parte, cuando se inyecta el
surfactante en la interfase y se deja estabilizar, la película que se forma se encuentra en una
fase similar a la de los gases (G), debido a que sus moléculas tienen un amplio grado de
libertad en su movimiento, y por consiguiente las interacciones entre ellas son demasiado
débiles; al comenzar a minimizar el área por medio de la compresión, estos grados de
libertad se comienzan a ver limitados, y así mismo las interacciones moleculares se
vuelven cada vez más fuertes (fase líquido-expandida LE), haciendo que la presión
superficial aumente y que las moléculas de surfactante se organicen de una forma en que
las cadenas de acilo (parte hidrofóbica) tome una postura perpendicular a la interfase (fase
líquido-condensada LC), en donde su empaquetamiento en muy alto y su compresibilidad
es cada vez más difícil; en la última parte de la compresión, si la película se continua
comprimiendo, llega a una fase sólida (fase sólida C), en dónde la presión superficial ya
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Introducción
no aumenta y llega al límite en donde, la película puede pasar de una estructura
bidimensional a una tridimensional debida a su colapso (Ospina, 2011).
En este trabajo se pretende evaluar el comportamiento de películas de surfactante pulmonar
mediante la realización de isotermas de comprensión a diferentes masas (10μg, 20μg,
50μg), temperaturas (25°C y 37°C) y velocidades (37mm/min, 70mm/min, 100mm/min);
para de esta manera analizar sus efectos en la organización en la monocapa y su
comportamiento tensioactivo.
I.5. Presión superficial
La variación en la tensión superficial a causa de factores como la temperatura, la cantidad
de material tensioactivo o el área de la interfase, a menudo se describe en términos de la
presión superficial (π) (Riaño, 2016), que se define matemáticamente como:
π = γo
– γ (21)
Donde γo es la tensión superficial de la subfase líquida y γ es la tensión superficial con un
agente tensioactivo. Tanto π como γ tienen las mismas unidades, pero sus direcciones son
opuestas, es decir, que cuando π es máxima la γ es mínima (Notter, 2000).
I.6. Trabajo mecánico durante la espiración
Durante la espiración, el aire sale de los espacios alveolares continuamente sin embargo no
todos los alveolos precisamente están en un estado de máxima compresión, en el mismo
instante otros alveolos pueden estar finalizando la expulsión de aire. Se presume que el
surfactante debe tener una estabilidad para mantener estados de máxima compresión,
durante periodos medianamente largos de tiempo. (Ospina, 2011)
El trabajo realizado en la espiración; es el de reducir el área para expulsar aire, mientras se
alcanzan bajas tensiones superficiales. Este trabajo se ve reflejado en las isotermas de
compresión, como el área bajo la curva y debe ser realizado por los músculos involucrados
en el proceso de respiración. En los segmentos de las isotermas, comúnmente llamados
mesetas o plateaus, es donde el trabajo realizado por el pulmón se gasta en reacomodar las
moléculas en la interfase en vez de disminuir la tensión superficial (Notter, 2000). Hasta
17
Introducción
que el material no esté en condiciones estructurales optimas, la compresión no continúa
reduciendo la tensión superficial.
En este estudio biofísico de surfactante pulmonar nativo colombiano in vitro de origen
porcino, se halla el trabajo mecánico realizado por los músculos que interfieren en el
proceso de espiración, con modificaciones en el programa de análisis de datos elaborado
por (Riaño, 2016), para ciclos isotérmicos de surfactante pulmonar; los cambios en el
programa se encuentran especificados en el anexo A.
18
II. Objetivos
II.1. General
Analizar el comportamiento de las isotermas de compresión para películas interfaciales
de surfactante en función de la cantidad de masa, la temperatura y la velocidad de
compresión.
II.2. Específicos
II.2.1. Describir los cambios en la presión superficial del surfactante pulmonar por medio
de isotermas de compresión.
II.2.2. Determinar el trabajo de compresión que se necesita aplicar a la película
interfacial de surfactante pulmonar, para obtener valores mínimos de tensión
superficial.
19
III. Justificación
Ya que el surfactante pulmonar es el actor principal en el proceso de respiración y
debido al déficit de secreción del mismo en los pulmones de los bebés prematuros, se ve la
necesidad de obtener el surfactante pulmonar de animales, para instilarlo en los pulmones de
los bebés que nacen con enfermedades respiratorias y así evitar la mortalidad de los mismo.
Debido a que esta problemática es muy común en el mundo, se decidió desarrollar esta práctica
con el fin de aportar a la caracterización del surfactante pulmonar con la ayuda de la Pontificia
universidad Javeriana, ya que ofrece una línea de investigación de caracterización biofísica de
surfactante pulmonar obtenido en Colombia; este trabajo se desarrolló en los laboratorios del
Departamento de Física bajo la dirección de la Doctora Olga Lucía Ospina Ramírez.
Para obtener el surfactante de los pulmones de cerdo y poder hacer uso de éste en la
medicina, primero se deben realizar ciertas investigaciones a sus características químicas y
físicas con el fin de analizar qué tan eficiente y productiva puede llegar a ser su fabricación.
Por eso el objetivo principal de nuestra investigación, se centra en el estudio de la tensión
superficial de esta sustancia y cómo varia a los cambios de temperatura, concentración y área
superficial. Con lo anterior podemos mencionar, que el propósito de este proyecto de
investigación es caracterizar isotermas de presión superficial de surfactante pulmonar en función
del área, a través de la compresión de películas interfaciales con el fin de comparar la información
obtenida en el laboratorio de la Pontificia Universidad Javeriana, con los datos reportados en la
bibliografía de las investigaciones de otros países.
20
IV. Materiales y Métodos
IV.1. Surfactante Pulmonar de Origen Animal
Para llevar a cabo el estudio biofísico de películas interfaciales de SP, el material se
obtiene a partir de lavados broncoalveolares de pulmones de cerdo.
Figura 10: Pulmones de cerdo obtenidos de una planta de desposte
IV.1.1. Obtención del Lavado Broncoalveolar.
A cada par de pulmones se le añade por la tráquea 2,5L de una solución salina
compuesta de Tris 5mM pH 7,0 conteniendo 150mM de NaCl. Cuando los
pulmones están aproximadamente llenos, esta solución sigue por las vías aéreas
respiratorias y se procede a masajearlos suavemente para estimular la secreción
de surfactante pulmonar en los alveolos. Posteriormente en una probeta con un
filtro de gasa doble, se introduce el lavado que es extraído directamente de los
pulmones, luego este lavado se vuelve a filtrar con gasas en vasos precipitados con
el fin de excluir tejidos de gran tamaño que no son necesarios, y por último este
líquido es vertido en tubos para iniciar con los procesos de aislamiento y
obtención del SP.
21
El primer proceso, es una centrifugación de 5 minutos a 1000g a una temperatura de
4°C; el segundo proceso, es una centrífuga a 100000g durante una hora con
temperatura controlada a 4°C; el tercer proceso, es la extracción del SP que se realiza
mediante un gradiente de densidad en bromuro de sodio al (16% y 13%) y cloruro
de sodio al 1% y por último se realiza una valoración de fosforo para cuantificar la
cantidad de fosfolípidos en el material.
IV.1.1.1. Primer Proceso: Centrifugación del Lavado Bronco-alveolar.
Para realizar este proceso se dispuso de un rotor que se encontraba pre-enfriado a
4ºC y en el cuál se colocaron 4 tubos con el LBA. Los tubos debían estar
equilibrados en peso, dos a dos. Cada centrifugación se realizó en 5 minutos a una
temperatura de 4ºC y con el rotor girando a 2500rpm (1000gravedades), sin freno.
En este proceso se buscó separar sólidos como tejidos y células del LBA por medio
de una fuerza giratoria. Posteriormente lo que se obtuvo fue una pequeña parte
sedimentada o pellet en el fondo del tubo la cual se desechó y una gran parte del
líquido del LBA (sobrenadante) con el cual nos quedamos debido a que contiene
las sustancias que componen el SP. Para finalizar, el sobrenadante fue depositado
en botellas de 1L y congelado a una temperatura de -20ºC.
Figura 11: Centrifugación del LBA: a) Tubos con LBA pesados equitativamente dos a dos. b)
Equipo en el cual se realizó el primer proceso de centrifugación. c) 2L de sobrenadante fueron
obtenidos en la centrifugación del LBA de 8 pulmones de cerdo.
IV.1.1.2. Segundo Proceso: Ultracentrifugación del Lavado Bronco-alveolar.
Para continuar con nuestro aislamiento, en el segundo proceso debimos poner a
descongelar en la nevera un día antes las botellas con LBA que estaban a la
22
temperatura de -20ºC; como en la centrífuga anterior, aquí también se debe tener el
rotor y la centrífuga pre-enfriados. Con el LBA descongelado, se procede a
almacenarlo en los tubos, teniendo presente que los tubos debían quedar
equilibrados en peso y sellados correctamente para evitar la fuga del líquido. Cada
ultracentrífuga se realizó en 1 hora a una temperatura de 4ºC y con el rotor girando
a 31000rpm (100000 gravedades), con freno.
En este proceso también se obtiene un sedimento y un sobrenadante, pero en este
caso se desechó el sobrenadante y se conservó el sedimento, que se retiró de los
tubos solo hasta terminar de ultracentrifugar todo el LBA.
IV.1.1.3. Tercer Proceso: Gradiente de Densidad.
Después del aislamiento del surfactante a partir del LBA con la ultracentrífuga, es
necesario realizar un gradiente de densidad. Para este proceso fue necesario
recolectar todos los sedimentos con mucha precaución para evitar la menor pérdida
posible; después se trasladó el material a un tubo Potter-Elvehjem, y sobre una
cubeta de hielo se procedió a homogenizar los sedimentos, macerando con una
solución de NaBr al 16% y del cual se obtuvo aproximadamente 17,5mL de la
disolución; después esta disolución debía estar distribuida uniformemente en 4
tubos que además debían contener encima una capa de 5,5mL de NaBr al 13% y
otra capa de 2mL de NaCl al 1%.
Figura 12: Gradiente de densidad: a) Recolección de los sedimentos que quedan después de realizar el
primer proceso de ultracentrífuga. b) Homogenización de los sedimentos con NaBr al 16%. c)
Distribución de la disolución con NaBr al 13% y NaCl al 1% para proceder a realizar el gradiente de
densidad por medio de una última ultracentrifugación.
23
Los tubos se colocaron en una ultracentrífuga con el rotor SW41 a 27000 rpm
(100000 gravedades) durante 1 hora con freno y con esto el tiempo de espera para
sacar las muestras de la centrifuga en su totalidad era de 2 horas.
Debido a que en los procesos de centrifugación las sustancias se ubican según su
densidad, al sacar los tubos se pudo observar que había cuatro capas de distintas
sustancias, en la cual el SP quedó suspendido en la tercera capa de abajo hacia
arriba entre el NaBr al 13% y el NaCl. Después de tener prácticamente aislado el
surfactante, se retiró cuidadosamente de los tubos para evitar que se mezclara con
las capas en las que se encontraba en medio y fue trasladado de nuevo al Potter-
Elvehjem para homogenizarlo con un poco de buffer monocapas al 1x. Para
finalizar se vertió el surfactante nativo (SN) obtenido, en un eppendorf con
muestras de 20L y 50L y llevado a una temperatura de -80ºC. A partir de 2L de
lavado broncoalveolar, se obtuvieron 3mL de SP a una concentración de
49,7mg/mL.
Figura 13: Ultracentrifugación del LBA: a) Capas formadas por las diferentes densidades de las
disoluciones, en donde el surfactante pulmonar se encuentra aislado y ubicado entre el NaCl y el NaBr al
13%. b) Se procede a retirarlo para ser homogenizado. c) se deposita en eppendorf y es guardado a una
temperatura de -80ºC.
IV.1.1.4. Cuarto Proceso: Cuantificación de Fosfolípidos.
Al tener aislado en su totalidad el surfactante pulmonar, es importante conocer
la cantidad de fosfolípidos que lo componen y así saber cuál es la
concentración en la que se encuentra. Para cuantificar fosfolípidos se debe
realizar una curva de calibración, preparando una disolución madre de 1mg/mL
de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) con agua bidestilada en una
24
proporción de 1:20 respectivamente, de tal forma que su concentración final
sea de 0,05mg/mL. De la disolución anteriormente descrita, se toman 6 parejas
de tubos con volúmenes distintos de KH2PO4, de la forma como se muestra en
la Tabla 1.
Tabla 1:
Dosificación de fosfato de potasio monobásico.
Tubo μL KH2PO4 a
0,05mg/mL
μmoles de
fosfato
Blanco 0 0
2 10 0,0037
3 40 0,0147
4 100 0,0367
5 250 0,0918
6 400 0,1469
Las muestras de KH2PO4 fueron secadas durante un periodo de 2 horas;
posteriormente se les añadió 450μL de ácido perclórico (HClO4) y se incubaron
en un baño de arena a un rango de temperatura de 250ºC-260ºC durante 30
minutos, y se cubren con unas ampollas de vidrio para que se genere la
mineralización del fosforo (Figura 14), es decir, que se solubilicen los
componentes fosfatos de la muestra.
Figura 14: Mineralización de fósforo
25
Luego de esto se agregaron 3,5mL de agua bidestilada, 0,5mL de molibdato de
amonio (2,5% p/V) y 0,5mL de ácido ascórbico (C6H8O6) (10% p/V) que
fueron agitados en un vórtex y luego se incubaron en un baño de agua en punto
de ebullición durante 7 minutos; para finalizar, los tubos se colocaron en hielo
para detener la reacción, e inmediatamente fue posible observar un cambio en
la coloración de cada uno de los tubos, debido a las diferentes concentraciones
de fosfolípidos (Figura 15). Con esto, es posible medir la absorbancia de los
complejos por medio de espectrofotometría a una longitud de onda λ igual a
820nm, con el fin de determinar la concentración del surfactante pulmonar.
Figura 15: Gradiente de color de la curva patrón de KH2PO4 y 3 muestras de surfactante
pulmonar (A-SN2, B-NS2 y C-SN2)
Tabla 2:
Valores de absorción de fosforo. Resultados del espectrofotómetro
Volumen
(μL)
Cantidad
(μmol)
Absorbancia
(Ab)
0
0 0
0 0,0156
10
0,0037 0,0062
0,0037 0,0063
40
0,0150 0,0663
0,0150 0,0695
100
0,0370 0,1736
0,0370 0,1956
250
0,0920 0,4973
0,0920 0,4879
400
0,1470 0,7780
0,1470 0,7934
26
Grafica 1: Gráfica de la absorbancia en función de la cantidad de fosfato de la recta patrón de
(KH2PO4); B1: pendiente, B2: punto de corte.
De la relación lineal anterior es posible decir que:
𝐴𝑏 = 5,44𝐶𝑓 − 0,013 (22)
Tabla 3:
Valores de absorbancia de fosfato y concentración para las muestras de surfactante
Muestra
SP Ab Cf
C
(mg/mL)
X C
(mg/mL)
Total C
(mg/mL)
SP1.1 0,3641 0,0693 50,88
51,3
49,7
SP1.2 0,3744 0,0712 52,27
SP1.3 0,3631 0,0691 50,75
SP2.1 0,1648 0,0327 47,98
48,1 SP2.2 0,1652 0,0328 48,09
SP2.3 0,1658 0,0329 48,25
De las muestras de SP se extrae un volumen de 10µl para la muestra SP1 que se encontraba a
1/10 y 1/20 la muestra SP2 para la valoración de fosfolípidos, Ab es medida por el
espectrofotómetro, Cf es calculada de la relación lineal de absorbancia y concentración. De la
tabla se concluye que la concentración del surfactante pulmonar es de 49,7mg/mL.
27
V. Análisis y Resultados
La balanza de tipo Langmuir esta formada por una cubeta termostatizada, con una
capacidad de aproximadamente 500mL, por ello posee un sistema que se conecta a un baño para
controlar la temperatura durante el experimento; las balanzas de superficie son altamente
sensibles a la presencia de compuestos tensioactivos, por lo que en todos los experimentos de
este tipo, la cubeta se llena con una disolución de buffer o tampón monocapas. Por otro lado, el
estudio de presión superficial en función del área se obtiene a través de un software, el cual
transduce los datos análogos del sensor de fuerza que se encuentra conectado a la bandera de
papel de filtro (placa de Wilhelmy) y los envía al software (KSV Nima), ya prediseñado para la
balanza de tensión superficial. Esto permite detectar los cambios inducidos por la compresión en
la organización molecular de la monocapa, correspondientes a una organización del material en
la interfase.
Las isotermas son obtenidas a temperaturas de 25°C y 37°C; siendo la primera la más
estudiada en la caracterización de surfactante pulmonar y la segunda la temperatura fisiológica
(Blanco, 2012). La compresión del material se realiza sobre una superficie que varía desde un
área máxima de 158cm2 hasta un área mínima de 16cm2, la cual está confinada por la cinta de la
balanza. Para realizar dicha compresión se tienen en cuenta dos variables: la primera es la
cantidad de material y la segunda es la razón de cambio del área por minuto, la cual se menciona
como velocidad de compresión de la barrera.
Las muestras de surfactante pulmonar utilizadas se prepararon a una concentración de
1mg/mL. En el experimento se suministra el material con una micro-jeringa de 10μL, teniendo
precaución de no generar grandes perturbaciones; se aplica la muestra en la interfase aire-líquido,
de tal forma que su distribución en la superficie dentro de la barrera sea lo más uniforme posible.
Luego de esto se da un lapso de 10 minutos para que las moléculas del surfactante se equilibren
en la interfase y así, poder iniciar la compresión. Al finalizar cada isoterma de compresión, se
28
retira el material de la interfase, hasta registrar de nuevo valores cercanos a cero en el sensor de
presión superficial; luego se limpia con agua bidestilada la placa de Wilhelmy y la micro-jeringa,
todo esto con el fin de reducir el margen de error en las siguientes mediciones. Se realizan
aproximadamente diez experimentos por cada variación de masa, velocidad de compresión y
temperatura; pretendiendo con esto observar una tendencia en el comportamiento de las películas
interfaciales de surfactante pulmonar nativo de origen porcino colombiano, no obstante, solo tres
de ellas fueron elegidas para la descripción de este trabajo.
Se inicia el análisis con la descripción de los resultados obtenidos en las diferentes
mediciones. En la Tabla 4 se puede observar una matriz compuesta con 9 gráficas; cada gráfica
contiene 3 isotermas de compresión a una temperatura ambiente de 25ºC, obtenidas con la
balanza de Langmuir. Cada isoterma se realizó en condiciones iniciales diferentes que
dependieron de dos factores principales: el primero fue la masa, que se variaba entre valores de
10μg, 25μg y 50μg; y el segundo factor fue la velocidad, la cual se aumentaba desde 37mm/min,
70mm/min hasta 100mm/min.
En las gráficas de la primera columna para una masa de 10μg, se observa que es
necesario comprimir el material aproximadamente un 30-35% del área dentro de la barrera, para
que se evidencie un cambio en la presión superficial con relación a las tres velocidades
mencionadas anteriormente, estas gráficas llegan a tener valores de presión superficial de
50mN/m o en términos de tensión superficial, llegan a valores cercanos a los 25mN/m, valor
correspondiente a la presión de equilibrio; de esto se puede especular que la cantidad de material
no es suficiente y/o es necesario una mayor compresión, para que a estas condiciones sea
evidente un aumento en la presión superficial.
En las gráficas de la segunda columna para una masa de 25μg, se observaron cambios
inmediatos al inicio de la compresión, en donde la presión superficial de las isotermas a
37mm/min y 70mm/min, alcanzó valores cercanos a 70mN/m, sin embargo, para la velocidad de
100mm/min, la presión máxima fue de 62mN/m.
En la tercera columna para una masa de 50μg, se ve un aumento en la presión superficial
inicial en el estado de no compresión debido a la cantidad de material suministrado, es decir, al
depositar el material, la presión superficial llega a valores que se encuentran entre 15mN/m y
29
25mN/m. Durante la compresión se ve que en la mayoría de las isotermas, se alcanzaron valores
de presión superficial altos o por lo menos cercanos a 72mN/m, con un 70 y 80% de área
comprimida.
En términos generales, las isotermas de compresión a 25°C, muestran cada uno de los
estados en los que se puede organizar la película interfacial durante la compresión y las zonas del
periodo de fase correspondientes a cada una de las transiciones. El factor común del surfactante
nativo analizado a esta temperatura, es que llega a la meseta de transición de la fase líquido-
expandida y fase líquido-condensada, en valores próximos a 45mN/m de presión superficial,
adicionalmente, se puede observar que las isotermas llegan a valores máximos de presión ideal.
Tabla 4:
Gráficas de isotermas a una temperatura de 25ºC
10μg 25μg 50μg
37 m
m/m
in
70 m
m/m
in
30
100 m
m/
min
En la Tabla 5, en la primera columna se puede observar que para una masa de 10μg, es
necesario que se comprima el área aproximadamente un 25-30% para que haya un cambio en la
fase gaseosa (G), para después permanecer la mayor parte de la compresión en la fase líquido-
expandida (LE); las isotermas solo llegan a tener valores máximos de presión superficial de
50mN/m. Con esto podemos concluir que la variación en la temperatura no evidenció un
aumento en la presión superficial y que al igual que en las isotermas a 25°C la cantidad de
material suministrado no fue suficiente.
En la segunda columna se puede observar, para una masa de 25μg, que la presión
superficial de las isotermas alcanzó valores entre 6mN/m y 12mN/m en un estado de no
compresión; con base en esto podemos asumir, que el material se encuentra en la fase líquido-
expandida (LE) justo antes de comprimir. Al final de la compresión se evidencian pequeños
aumentos en la presión superficial para una velocidad de compresión de 70mm/min por encima
de los 50mN/m, sin embargo, no llega a fases de mayor empaquetamiento.
En la tercera columna a una masa de 50μg, se puede ver un aumento en la presión
superficial inicial en el estado de no compresión alrededor de 20mN/m y no muestra ninguna
evidencia de pasar a estados más organizados como lo es la fase líquido-condensada (LC).
Ninguna de las isotermas a temperatura fisiológica (37°C) presenta presiones
superficiales máximas, ni arriba de 52mN/m; el factor común del surfactante nativo a 37°C, es
llegar a valores máximos de presión superficial, en torno a la meseta de transición de fase
líquido-expandida y fase líquido condensada.
31
Tabla 5: Gráficas de isotermas de compresión a una temperatura de 37ºC
10μg 25μg 50μg
37 m
m/m
in
70 m
m/m
in
100 m
m/
min
V.1. El trabajo calculado en el proceso de compresión lateral de películas interfaciales
Los resultados obtenidos para el cálculo de trabajo realizado en las isotermas mostradas
anteriormente, en las matrices que aparecen en la Tabla 4 y Tabla 5, donde se varían la
32
masa y la velocidad de la compresión a valores de temperatura de 25°C y 37°C se
encuentran descritos en las siguientes tablas:
Tabla 6:
El trabajo calculado para las isotermas a 25°C
Velocidad de
compresión
Trabajo de las Isotermas a 25°C (x 10-6 J)
10μg 25μg 50μg
37mm/min
208,37 429,15 490,89
231,88 439,64 499,61
220,50 451,55 479,83
70mm/min
331,01 450,16 469,72
298,78 474,50 445,38
317,11 406,15 454,11
100mm/min
322,53 344,99 480,82
288,92 370,95 481,75
285,18 393,77 485,95
En la Tabla 6 se encuentran los valores calculados del trabajo realizado por cada isoterma
ubicada en la matriz de 25°C. Los resultados obtenidos se encuentran en el rango de
208,37x10⁻⁶J hasta 499,61x10⁻⁶J, donde los valores de máximo y mínimo trabajo se
encuentran a una velocidad de compresión de 37mm/min, la velocidad más pequeña
suministrada para las muestras de surfactante pulmonar nativo.
Basándose en los resultados de trabajo calculado y para observar de una forma distinta los
trabajos obtenidos, se calcula el promedio de trabajo asociado a la cantidad de material
suministrado y velocidad de compresión.
Tabla 7:
Promedio del trabajo para las isotermas de 25°C.
Velocidad de
compresión
Trabajo de las Isotermas a 25°C x (10-6 J)
10μg 25μg 50μg
37mm/min 220,3 440,1 490,1
70mm/min 315,6 443,6 456,4
100mm/min 298,9 369,9 482,8
33
En la Tabla 7 se observa una variación del trabajo con relación a la cantidad de material
suministrado en cada experimento, es directamente proporcional a la masa suministrada. Se
ratificar que el trabajo mecánico realizado por los músculos que intervienen en el proceso
de espiración, hace un gasto energético con relación a la cantidad de material que se
encuentra en la interface alveolar para la absorción y organización molecular. En este caso,
el análogo con el trabajo realizado, es generado por la cinta sobre la película interfacial en
la balanza, para alcanzar presiones superficiales altas a medida que se realiza la
compresión.
El trabajo realizado por las isotermas de 25°C que alcanzan presiones superficiales
máximas, se encuentra en el rango de 431.0X10⁻⁶J hasta 463,2X10⁻⁶J
Tabla 8: El trabajo realizado para las isotermas a 37°C
Velocidad de
compresión
Trabajo de las Isotermas a 37°C x (10-6 J)
10μg 25μg 50μg
37mm/min
232,41 430,68 460,66
259,89 416,21 446,34
247,01 446,07 454,94
70mm/min
257,94 430,68 436,13
238,51 416,21 446,93
252,67 446,07 439,41
100mm/min
250,47 455,67 460,94
282,71 454,36 460,42
283,33 456,15 468,16
El trabajo realizado para las isotermas de 37°C se encuentra del orden de 10⁻⁶J
En la Tabla 8 se encuentran los valores calculados para el trabajo realizado por cada
isoterma ubicada en la matriz de 37°C; en la tabla se observan valores de trabajo mecánico
en el rango de 232,41x10⁻⁶J con una velocidad de 37mm/min y una masa 10μg, hasta
468,16x10⁻⁶J con una velocidad de 100mm/min y una masa de 50μg, es preciso resaltar
34
que estos valores de máximo y mínimo trabajo se encuentran directamente proporcional a
la masa y a la velocidad de compresión.
A continuación, se puede observar los promedios de trabajo asociado a la cantidad de
material suministrado y velocidad de compresión para temperaturas fisiológicas.
Tabla 9:
Trabajo promedio calculado para las isotermas de 37°C con relación a la cantidad de material suministrad.
Velocidad de
compresión
Trabajo de las Isotermas a 37°C x (10-6 J)
10μg 25μg 50μg
37mm/min 246,4 431,0 454,0
70mm/min 249,7 431,0 440,8
100mm/min 272,2 455,4 463,2
Del mismo modo que para las isotermas de 25°C, en la Tabla 9 se calculó el promedio del
trabajo para las tres isotermas con las mismas condiciones. El menor promedio de trabajo
calculado se presenta para las isotermas que se comprimen a una velocidad de 37mm/min
con una masa de 10μg.
Como se observó en las gráficas a 37°C ninguna de las isotermas llego a valores máximos
de tensión superficial, el rango de trabajo realizado es menor en estas gráficas, pero
cercano a los valores obtenidos a las isotermas de 25°C. El trabajo calculado para las
isotermas de 37°C a una velocidad de 70mm/min y una masa de 10μg mostro valores
inferiores de trabajo mecánico a diferencia de los resultados obtenidos a 25°C.
Si analizamos las gráficas y los cálculos de trabajo, para las isotermas de 25°C y 37°C
sometidas a una velocidad de 70mm/min, se evidencia que es necesario un mayor gasto
energético para que el complejo tensioactivo logre llegar a tensiones superficiales mínimas,
o lo que es igual, presiones superficiales máximas; ya que se observa que las isotermas a
25°C, registran valores máximos de presión superficial y valores de trabajo semejantes a
los de 37°C, con relación a las masas de 25μg y 50μg;.
35
Tabla 10:
Gráficas de presión superficial en función del tiempo a una temperatura de 25ºC
10μg 25μg 50μg
37 m
m/m
in
70 m
m/m
in
100 m
m/
min
En términos generales en la Tabla 10, se observa que a medida que se tiene más material
de surfactante en la interfase y se comprime a mayor velocidad, el tiempo necesario para
alcanzar máximas presiones superficiales, correspondientes a mínimas tensiones superficiales, va
disminuyendo notablemente. En 60 segundos se alcanzan valores de 70mN/m para 50μg con una
36
velocidad de 100mm/min, es decir, que hay un mayor empaquetamiento molecular en menor
tiempo. Por el contrario, para las isotermas de 10μg con una velocidad de 37mm/min al cabo 170
segundos aproximadamente, no alcanza a llegar presiones de equilibrio.
Tabla 11: Gráficas de presión superficial en función del tiempo a una temperatura de 37ºC
10μg 25μg 50μg
37 m
m/m
in
70 m
m/m
in
10
0 m
m/m
in
37
En Tabla 11. Se observa que el surfactante pulmonar no llega a valores de máxima
presión superficial y al transcurrir 60, 80 y 160 segundos a diferencia de las isotermas de 25°C,
alcanza valores de ±50mN/m para las masas de 25μg y 50μg. El tiempo que transcurre en la
compresión, se invierte en encontrar una organización molecular óptima para empezar después a
maximizar los niveles de presión superficial
38
VI. Discusión
Es importante tener presente que el análisis que se describe en este trabajo, se le realizó a
procesos de compresión in vitro, que ocurren en condiciones fuera del equilibrio. Se evaluó la
capacidad de las películas interfaciales para alcanzar valores máximos de presión superficial al
ser comprimidas, donde los comportamientos de las películas de surfactante pulmonar se
obtuvieron a partir del análisis de isotermas de compresión y se consideraron los cambios en
función de la cantidad de material y de la velocidad de compresión de las películas.
A lo largo de este trabajo hemos analizado el comportamiento del surfactante pulmonar
frente a:
Isotermas de presión superficial: con las cuales se puede evidenciar una meseta de
equilibrio que se asocia a la formación de plegamientos y estructuras tridimensionales.
A. SP de 25μg a una velocidad de compresión de
37mm/min y 25°C. B. SP de 50μg a una velocidad de compresión de
37mm/min y 25°C.
En el caso de las gráficas observadas anteriormente a 25°C y 37°C, se observa que las
isotermas llegan a la meseta de transición de la fase líquido-expandida y fase líquido-
condensada en valores próximos 45mN/m de presión superficial. En las isotermas de
25°C a 25μg y 50μg se observa claramente, un surfactante pulmonar óptimo en la
39
reorganización molecular y en la disminución de la tensión superficial o lo que es lo
mismo, un aumento importante en la presión superficial.
Cálculos de trabajo mecánico: Estos cálculos nos indican la cantidad de energía
correspondiente al trabajo realizado por la cinta de confinamiento de la balanza, para la
compresión de películas interfaciales como análogo de la compresión de los músculos
que intervienen en el proceso de espiración. Se encontraron valores de trabajo calculado,
del orden 278,25x10-6J hasta 476,71x10-6J.
Temperatura
de compresión
Relación del promedio de trabajo calculado con relación a
la masa (x10-6J)
Velocidad de
compresión 10μg 25μg 50μg
a 25°C
37mm/min 220,3 440,1 490,1
70mm/min 315,6 443,6 456,4
100mm/min 298,9 369,9 482,8
a 37°C
37mm/min 246,4 431,0 454,0
70mm/min 249,7 431,0 440,8
100mm/min 272,2 455,4 463,2
Se evidencia claramente en la tabla anterior, que existe una relación directamente
proporcional del trabajo mecánico de la cinta con relación a la cantidad de material
adsorbido en la interface. Esto es el equivalente a la función propia del pulmón en el
proceso de respiración.
Cinéticas de adsorción en la compresión: relaciona la variación de la presión
superficial con el tiempo transcurrido en la compresión de la película interfacial; los
tiempos están relacionados con la velocidad en la que se comprimió cada una de las
muestras y estos tiempos fueron de 60, 80 y 160 segundos aproximadamente. Como
ejemplo se puede observar que, para las cinéticas de adsorción a una temperatura de
25°C, con una masa de 50μg y una velocidad de 100mm/min, se alcanzaron valores
aproximados de 70mN/m al cabo de 60 segundos.
40
VII. Conclusiones
Para los estudios de isotermas de compresión de películas interfaciales de surfactantes
pulmonares de origen porcino, según los cambios de temperatura, cantidad de masa y velocidad
de compresión, se puede concluir que:
A 25°C las isotermas de compresión muestran los posibles estados en los que se puede
organizar la película interfacial durante la compresión y las zonas correspondientes a
cada una de las transiciones de fase.
A 25°C, las isotermas llegan a la meseta de transición de la fase líquido-expandida y fase
líquido condensada en valores próximos 45mN/m de presión superficial, donde sin
embargo no todas las isotermas llegan a valores máximos de presión.
A 37°C, los mayores valores alcanzados de presión superficial están en el orden de
±50mN/m. Por el contrario, a 25°C si se alcanzan valores máximos 70mN/m de presión
superficial y con mayor promedio de valores calculados de trabajo, para las tres
cantidades de masa suministradas.
A 37°C, se observaron valores de trabajo mecánico en el rango de 232,41x10-6J con una
velocidad de 37mm/min y una masa 10μg, hasta 468,16x10-6J con una velocidad de
100mm/min y una masa de 50μg,
Ninguna de las isotermas a temperatura fisiológica (37°C) presenta presiones
superficiales máximas, ni arriba de 52mN/m, el factor común del surfactante nativo a
37°C, es llegar a valores máximos en torno a la meseta de transición de fase líquido-
expandida y fase líquido-condensada.
A 25°C, el menor tiempo invertido en alcanzar presiones cercanas 70mN/m, fue de 60
segundos para la masa de 50μg y velocidades de compresión de 100mm/min.
El mayor trabajo calculado fue de 499,61x10-6 J para una isoterma con 50μg, a una
velocidad de compresión de 37mm/min y con una temperatura de 25°C.
41
Perspectivas
En este trabajo se logró determina que para la caracterización de surfactante nativo
colombiano de origen porcino a temperaturas de 25°C, la película tensioactiva de las masas de
25μg y 50μg se comporta coherentemente con la teoría. Se evidenció, que en la compresión del
material de 10μg para las isotermas de 25°C y 37°C, no llegan a estados de máximo
empaquetamiento; muy seguramente la cantidad de material suministrado no está acorde con el
área comprimida y sea necesario administrar una mayor cantidad de material. Por otro lado, para
las películas interfaciales que se encontraban a temperaturas fisiológicas, creemos que la
dificultad en las mediciones posiblemente fue, que ésta temperatura es muy cercana a la de
transición de fase de la DPPC y por consiguiente, sería necesaria una mayor área comprimida.
El desarrollo de estudios adicionales con las velocidades y masas a las cuales se sometió
la película tensoactiva en este estudio, permitiría una visión más profunda sobre el
comportamiento tensioactivo. Creemos que estudios reológicos, expondrían claramente el
comportamiento elásticos y viscosos en la monocapa y la energía requerida para la
reorganización del surfactante pulmonar. También estudios de cualificación de lípidos saturados,
caracterización de extracto orgánico de origen porcino y análisis comparativo de Corusorf,
permitirían seguramente una representación más completa de SP para posibles preparaciones de
surfactantes nativos y/o mixtos de origen colombiano.
42
Anexos
A.1. Programación en el análisis de datos de las
isotermas #include <iostream>
#include <stdlib.h>
#include <stdio.h>
#include <math.h>
#include <fstream>
#include "TMath.h"
const int arrMax = 10000;
void kk2_fit() {
TF1 *fCom1 = new TF1("fCom1","pol9",0,150);
TF1 *fCom2 = new TF1("fCom2","pol9",0,150);
TF1 *fCom3 = new TF1("fCom3","pol9",0,150);
ifstream inFileCom1, inFileCom2, inFileCom3;//
double x1[arrMax], y1[arrMax];
double x2[arrMax], y2[arrMax];
double x3[arrMax], y3[arrMax];
inFileCom1.open("25c37v10mg1.dat");
inFileCom2.open("25c37v10mg2.dat");
inFileCom3.open("25c37v10mg3.dat");
int n = 0;
while(!inFileCom1.eof()){
n++;
cout << "n: " << n << endl;
inFileCom1 >> x1[n];
inFileCom1 >> y1[n];
cout << x1[n] << " " << y1[n] << " " << n << endl;
}
inFileCom1.close();
int nn = 0;
while(!inFileCom2.eof()){
nn++;
cout << "nn: " << nn << endl;
inFileCom2 >> x2[nn];
inFileCom2 >> y2[nn];
cout << x2[nn] << " " << y2[nn] << " " << nn << endl;
}
43
inFileCom2.close();
int nnn = 0;
while(!inFileCom3.eof()){
nnn++;
cout << "nnn: " << nnn << endl;
inFileCom3 >> x3[nnn];
inFileCom3 >> y3[nnn];
cout << x3[nnn] << " " << y3[nnn] << " " << nnn << endl;
}
inFileCom3.close();
TGraph *gCom1=new TGraph(n,x1,y1);
gCom1->SetMarkerColor(1);
TGraph *gCom2=new TGraph(nn,x2,y2);
gCom2->SetMarkerColor(2);
TGraph *gCom3=new TGraph(nnn,x3,y3);
gCom3->SetMarkerColor(5);
fCom1->SetLineColor(3);
fCom2->SetLineColor(4);
fCom3->SetLineColor(6);
gCom1->Fit("fCom1","R+");
gCom2->Fit("fCom2","Rx+");
gCom3->Fit("fCom3","Rx+");
gCom1->Draw("A*");
gCom2->DrawClone("p*");
gCom3->DrawClone("p*");
//fCom1->DrawClone();
//fCom2->DrawClone();
//fCom3->DrawClone();
cout << "integral from fit com1: " << fCom1->Integral(5,150) << endl;
cout << "integral from fit com2: " << fCom2->Integral(5,150) << endl;
cout << "integral from fit com3: " << fCom3->Integral(5,150) << endl;
cout << "integral from graph Com1: " << gCom1->Integral() <<endl;
cout << "integral from graph Com2: " << gCom2->Integral() <<endl;
cout << "integral from graph Com3: " << gCom3->Integral() <<endl;
44
VIII. Referencias
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