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Caracterização genética dos recursos
animais autóctones com novas
tecnologias de sequenciação e tecnologias de sequenciação e
genotipagem
Antonio Marcos Ramos
15/09/201215/09/2012
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Recursos geneticos animais na
Peninsula Iberica
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Recursos geneticos animais na
Peninsula Iberica
• Diversidade genetica bastante elevada
• Numero significativo de raças autoctones
• Bovinos
• Ovinos
• Caprinos
• Suinos
Equinos• Equinos
• Caes
• Aves
• Reservatorio de genes para adaptação a desafios futuros!!!
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Dogma central da biologia molecular
DNA RNADNA(genoma)
RNA(transcriptoma)
Epigenetica(epigenoma)
Proteinas(proteoma)
Metabolitos(metaboloma)
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Sequenciação no seculo XXI
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Sequenciação no seculo XXI
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Plataformas de Sequenciação
ILLUMINA MiSeq ION TORRENT PGM
ILLUMINA HiSeq 2500 ION TORRENT PROTON
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Plataformas de Sequenciação
ROCHE 454 GS-FLX Titanium Pacific Biosciences RS
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Plataformas de Sequenciação
Sequenciador Sanger
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Plataformas de Sequenciação
Oxford Nanopore
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Caracteristicas de cada tecnologia
• Illumina MiSeq, Ion Torrent PGM • Illumina HiSeq, Ion Torrent Proton
• Sequenciadores de bancada
• Mais rapidos
• Menor output
• 3-5M sequencias
• Comprimento ate 250 nt
• Sequenciadores mais utilizados
• Mais lentos
• Maior output
• 1,100-1,400M sequencias
• Comprimento ate 150 nt
• Roche 454, PacBio RS• Roche 454, PacBio RS
• Sequencias (muito) mais longas
• Menor output (numero sequencias)
• 750K – 1M sequencias (454)
• Comprimento medio 350-500 nt (454)
• PacBio ainda na fase inicial, algumas
sequencias ~10 Kb
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Centros de Sequenciação
Serviços incluem preparação amostras, sequenciação, envio e/ou armazenamento dados
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Genotipagem
• SNP chips com elevada densidade de SNPs
• Numero de SNPs de 20-700K, normalmente• Numero de SNPs de 20-700K, normalmentepor volta de 50-60K SNPs
• Chips desenvolvidos em colaboraçoesinternacionais de varias equipas, comercializados posteriormente
– Illumina
– Affymetrix
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Exemplos
• Desenvolvimento de um SNP chip• Desenvolvimento de um SNP chip
• Traçabilidade de produtos animais com
utilizacao de SNPs especificos para raças
• GWAS qualidade da carne
• Diversidade genetica• Diversidade genetica
• RNA-seq: analise do transcriptoma
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SNP Chip
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SNP Chip
Large White Landrace Duroc Pietrain Javali
6x 6x 6x 6x
30x
6x
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SNP Chip
• Sequencias alinhadas utilizando a versao 7 do genoma do
porco
• Identificaçao de SNPs feita entre as 5 raças utilizadas
• Processamento dos SNPs identificados inicialmente, para
remover falsos-positivos
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SNP Chip
• Output inicial bastante elevado (> 9M SNPs), mas a maioria nao
corresponde a variaçao real
• Numero final de SNPs identificados com sequenciaçao Illumina: ~373K
• SNPs identificados com outras plataformas: 176 K
• Total de SNPs disponiveis: 549 K
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SNP chip
• Total de 64,232 SNPs incluidos no chip
• SNPs localizados em todos os
cromossomas, incluindo o cromossoma X
• Aproximadamente 14.5 K SNPs com
localizaçao desconhecida no genoma do localizaçao desconhecida no genoma do
porco
• Taxa de validaçao bastante elevada
(97.5%)
• 125 citaçoes
(Agosto 2012)
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Traçabilidade
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Traçabilidade
• Mesmos dados utilizados na produçao do SNP
chip (mesmas sequencias)chip (mesmas sequencias)
• Objectivo: identificar SNPs especificos para
cada uma das 5 raças utilizadas
• SNP especifico: um dos alelos encontrado
unicamente em uma das raçasunicamente em uma das raças
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Traçabilidade
• SNPs potencialmente especificos: 29,146
• Incluidos no chip de genotipagem: 4,441
• Percentagem disponivel para verificaçao: 15.2%
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Traçabilidade
• SNPs confirmados como
especificos: 193
• Mau resultado? Nao• Mau resultado? Nao
necessariamente
• Estrategia de
sequenciaçao seguida
nao foi a ideal para este
tipo de objectivotipo de objectivo
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Traçabilidade
• Animais sequenciados
– Large White (35)
• Animais genotipados
– Large White (110)– Large White (35)
– Landrace (27)
– Duroc (32)
– Pietrain (22)
– Javali (37)
– TOTAL: 153 animais
– Landrace (74)
– Duroc (57)
– Pietrain (82)
– Javali (167)
– TOTAL: 490 animais– TOTAL: 153 animais – TOTAL: 490 animais
• Animais sequenciados: populaçao base de referencia
• Animais genotipados: tratados como raça desconhecida,
poderiam ser atribuidos a qualquer uma das 5 raças
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Traçabilidade
• Alelos identificados nos animais genotipados provocaram
perca adicional de SNPs
• SNPs especificos: 87
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Traçabilidade Traçabilidade -- ResultadosResultados
Paetkau et al. (1995) Pritchard et al. (2000)
Breed n
Assigned
to wrong
breed
Specificity Av.
Prob.
Assigned
to wrong
breed
Specificity Av.
Prob. breed
Prob. breed
Prob.
Duroc 57 0 1 1 0 1 1
Landrace 74 3 0.959 0.982 3 0.959 0.976
Large
White 110 1 0.991 0.999 1 0.991 0.994
Pietrain 82 0 1 1 0 1 0.999
Wild
Boar 167 0 1 0.999 0 1 0.992
Boar 167 0 1 0.999 0 1 0.992
Overall 490 4 0.990 0.996 4 0.990 0.992
• Numero de animais atribuidos a raça errada: 4
• Numero de raças com todos os animais atribuidos correctamente: 3
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Traçabilidade
• Numero elevado de produtos de
origem animal protegidos com DOP
ou IGPou IGP
• DOP / IGP: preço mais elevado
• Fraude: “vender gato por lebre”
Tecnologia
Sistemade
controlo
Produtor e consumidor
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SNPs e caracteristicas produtivas
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SNPs e caracteristicas produtivas
• GWAS – genome wide association study
Requesitos• Requesitos
• Animais
• Registos produtivos (fenotipos)
• SNPs
• Exemplo com GWAS para os niveis
de “skatole”
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SNPs e caracteristicas produtivas
• Niveis elevados de skatole e androstenona
provocam mau sabor na carne de porcoprovocam mau sabor na carne de porco
• Melhoramento genetico para niveis reduzidos de
forma a evitar castraçao
• GWAS utilizando o SNP chip em porcos ( 64K SNPs)
• Numero de animais: 954
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SNPs e caracteristicas produtivas
• Regiao no cromossoma 6 com 16 SNPs altamente significativos
• Tamanho da regiao: aproximadamente 3 Mb
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SNPs e caracteristicas produtivas
• Varios estudos efectuados em outras especies
• Bovinos: SNP chip alta densidade com 780K • Bovinos: SNP chip alta densidade com 780K SNPs!!
• Ovinos
• Caes
• Equinos
• Raças autoctones? Todos os pre-requisitos estaoreunidos!!!
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Diversidade genetica
• Numero elevado de SNPs e outro tipo de
marcadores moleculares permite estudos de marcadores moleculares permite estudos de
alta resoluçao, por exemplo:
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Diversidade genetica
• Variaçao genomica
do nivel diversidadedo nivel diversidade
nucleotidica
• Identificaçao de
regioes do genomaregioes do genoma
que diferem entre as
raças
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Re-Sequenciação
• WGRS – whole genome re-sequencing
• Genoma completo de varios animais• Genoma completo de varios animaissequenciado (em especies com genomadeterminado)
• Ate ao momento, numero de animais modesto
• Futuramente, centenas (milhares?) de genomassequenciadossequenciados
• Selecção genomica: centenas de milhar de SNPs utilizados em melhoramento animal
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Re-Sequenciação
• Tecnologia de ponta aplicada a raça• Tecnologia de ponta aplicada a raça
local Japonesa
• Cobertura de 93% do genoma bovino
• 6.3M de SNPs identificados, dos quais
5.5M pela primeira vez!!
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Sequenciação RNA
• Tecnica que gradualmente tem substituido a
utilização de microarraysutilização de microarrays
• Mais versatil e capaz de gerar varios tipos de
resultados
– Expressão diferencial
– “Alternative splicing”– “Alternative splicing”
– Identificação de novos genes
– Identificação de SNPs em genes
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Sequenciação RNA
• Analise do transcriptoma de
celulas somaticas em 3 pontos
da lactaçãoda lactação
• Expressão diferencial
• Identificação de SNPs
• Analise de vias bioquimicas
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Sequenciação E Genotipagem
• “Sequence based genotyping”
• “Genotyping by sequencing”• “Genotyping by sequencing”
• SNPs são identificados simultaneamente em
varios individuos
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Epigenetica
• Chip-seq
“chromatin immuno“chromatin immuno
precipitation”
• Perfil de metilação
(methylation
profiling - bisulfite profiling - bisulfite
sequencing)
PLoS ONE 2011, 6(5): e19428
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Proteoma e Metaboloma
• Tecnologias a evoluirem tambem no sentido de maior
automatizacao e output
• Razão principal: biomarcadores, em medicina humana
• Recursos geneticos animais, aplicação na sua infancia
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Brevemente perto de si …