caractérisation du système anti-phage abiq de 'lactococcus
TRANSCRIPT
Caractérisation du système anti-phage AbiQ de Lactococcus lactis
Mémoire
Maxime Bélanger
Maîtrise en microbiologie
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Maxime Bélanger, 2014
iii
Résumé
L’utilisation de mécanismes anti-phages est l’une des stratégies pour prévenir et contrôler la
contamination par les bactériophages qui peuvent causer des pertes importantes pour l’industrie
de la transformation laitière. AbiQ est un mécanisme d’avortement de l’infection phagique de
type toxine-antitoxine (type III) isolé d’une souche de Lactococcus lactis. Des études précédentes
ont démontrées que la toxine ABIQ (protéine) coupe son antitoxine (ARN non codant) in vivo,
et que la protéine virale ORF38 du lactophage P008 joue un rôle essentiel dans l’activité anti-
phage. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés au mode d’action d’AbiQ via trois
objectifs spécifiques : caractériser l’effet de différentes mutations de l’antitoxine, analyser le
comportement viral et cellulaire en présence d’AbiQ et définir le rôle de la cible/activateur viral
ORF38. Nos résultats démontrent qu’il est possible d’optimiser l’efficacité anti-phage par
modification de l’antitoxine et suggèrent que l’ORF38 interagit avec l’ARN antitoxine
permettant la libération de la toxine
v
Abstract
Antiphage mechanisms represent one of the strategies available to prevent or control
contamination by virulent phages, which are a major risk of fermentation failure in the dairy
industry. The lactococcal phage abortive infection system AbiQ belongs to type III toxin-
antitoxin system. It has been previously demonstrated that the toxin ABIQ (protein) cleaves his
antitoxin (non-coding RNA) in vivo, while the protein ORF38 from phage P008 plays an essential
role in the antiphage activity. In this study, we investigated the mode of action of AbiQ through
three specific objectives: describe the effect of specific modifications in the antitoxin, analyse
the viral and cellular behaviours in presence of AbiQ and determine the role of the phage P008
target/activator ORF38. Our results show that we can optimise the antiphage activity of AbiQ
through mutation in the antitoxin and suggest that ORF38 can bind the antitoxin RNA to favour
the release of the toxin.
vii
Table des matières Résumé ............................................................................................................................ iii
Abstract ............................................................................................................................. v
Liste des tableaux ............................................................................................................ ix
Liste des figures ............................................................................................................... xi
Liste des abréviations .................................................................................................... xiii
Avant-propos .................................................................................................................. xix
Introduction ...................................................................................................................... 1
Bactéries lactiques ................................................................................................................................ 1
Lactococcus lactis ...................................................................................................................................... 2
Bactériophages ..................................................................................................................................... 6
Classification des phages .................................................................................................................... 7
Lactophages .......................................................................................................................................... 9
Cycle de réplication ........................................................................................................................... 11
Mécanismes anti-phages ................................................................................................................... 15
1. Inhibition de l'adsorption ................................................................................................ 15
2. Bloquer l'injection de génome viral ................................................................................ 17
3. Coupure des acides nucléiques exogènes ...................................................................... 17
4. Avortement de l'infection (Abi) ...................................................................................... 20
Systèmes d'avortement de l'infection chez L. lactis ....................................................................... 22
Systèmes toxine-antitoxine (TA) ..................................................................................................... 27
TA de type I ................................................................................................................................... 29
TA de type II ................................................................................................................................. 30
TA de type III ................................................................................................................................ 33
TA de type IV ................................................................................................................................ 34
TA de type V .................................................................................................................................. 34
AbiQ .................................................................................................................................................... 35
Hypothèse de travail.......................................................................................................................... 37
Matériel et méthodes ...................................................................................................... 39
viii
Résultats .......................................................................................................................... 53
Objectif 1 : Étude de la spécificité d’antiQ .................................................................................... 53
Analyses bio-informatiques ......................................................................................................... 53
Détermination du site de coupure et d’initiation de la transcription (5’ RACE PCR) ....... 54
I. Caractérisation des mutants Δ répétitions (antiQ) ........................................................ 58
II. Caractérisation des mutants ponctuels (Mut antiQ) ..................................................... 60
Objectif 2 : Étude de la réplication virale et cellulaire en présence du système AbiQ ............ 64
Croissance de L. lactis IL1403 en présence d’AbiQ ................................................................. 65
Courbes de croissance des phages P008 et P008-Q12 (AbiQ+) ............................................. 65
Analyse de la traduction d’abiQ en cours d’infection ............................................................... 66
Objectif 3 : Caractérisation de la protéine virale ORF38 (phage P008) et de son rôle dans l’activité du système AbiQ ............................................................................................................... 68
Expression d’ORF38 chez L. lactis (système NICE) ............................................................... 68
Expression d’ORF38-GST chez E. coli ...................................................................................... 69
Stratégie de clonage en bloc (orf37-orf39) ................................................................................... 70
Test d’interaction entre ORF38 et antiQ ................................................................................... 72
Discussion ....................................................................................................................... 73
Conclusion ...................................................................................................................... 85
Bibliographie................................................................................................................... 87
ix
Liste des tableaux
Tableau 1.1. Tableau comparatif des caractéristiques génomiques des souches de Lactococcus lactis ssp.
lactis et ssp. cremoris. ................................................................................................................................................... 4
Tableau 1.2. Classification des groupes de lactophages .................................................................................... 9
Tableau 1.3. Regroupement des mécanismes Abi de lactocoques ............................................................... 22
Tableau 2.1. Souches, plasmides et phages utilisés dans la cadre du projet ................................................ 40
Tableau 2.2. Tableau des amorces utilisées dans la cadre du projet ............................................................. 44
Tableau 2.3. Matrice partielle d’expérience pour l’expression d’ORF38 (système NICE) ...................... 49
Tableau 2.4. Matrice partielle d’expérience pour l’optimisation de la stabilité d’ORF38 ......................... 52
Tableau 3.1.1. Efficacité anti-phage des mutants Mut Δ répétitions antiQ contre P008 .......................... 58
Tableau 3.1.2. Fréquence d’obtention des clones mutants ponctuels antiQ ............................................... 61
Tableau 3.1.3. Résultats cumulatifs des activités anti-phage (EOP) et endoribonucléique pour les
différents mutants antiQ ....................................................................................................................................... 62
xi
Liste des figures
Figure 1.1. Image de Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 par microscopie à balayage ............................. 3
Figure 1.2. Schéma des systèmes d’expression utilisés pour ce projet ............................................................ 5
Figure 1.3. Morphologie des bactériophages ...................................................................................................... 8
Figure 1.4. Alignements des génomes de phages 936 modèles .................................................................... 11
Figure 1.5. Cycle lytique (A) et lysogénique (B) de réplication des phages ................................................ 12
Figure 1.6. Représentation tridimensionnelle des protéines formant la plaque basale du phage p2 ...... 13
Figure 1.7. Mode de fonctionnement des systèmes CRISPR-Cas ............................................................... 19
Figure 1.8. Schéma des cinq types de systèmes toxine-antitoxine ................................................................ 28
Figure 3.1.1. Schéma de l’opéron AbiQ (A). Séquence de l’opéron AbiQ (B) .......................................... 53
Figure 3.1.2. Produits PCR du 5’ RACE et contrôles migrées sur gel d’agarose ...................................... 55
Figure 3.1.3. Schéma issu du séquençage de l’extrait RACE-AbiQ. ............................................................ 55
Figure 3.1.4. Séquençage de 15 clones pBS-KS (RACE-AbiQ) ................................................................... 56
Figure 3.1.5. Représentation graphique LOGO de l’alignement de trois séquences de coupure par ABIQ
.................................................................................................................................................................................. 57
Figure 3.1.6.. ......................................................................................................................................................... 57
Figure 3.1.7. Hybridation de type Northern ciblant antiQ dans les souches L. lactis IL1403 Δ répétitions
(Mut 1,8r et Mut 3,8r) et pNZ123-AbiQ ........................................................................................................... 59
Figure 3.1.8. Hybridation de type Northern ciblant antiQ et le gène abiQ dans les souches L. lactis IL1403
Δ répétitions (Mut 1,8r et Mut 3,8r) et pNZ123-AbiQ en cours d’infection par le phage P008 .............. 60
Figure 3.1.9. Représentation des mutations ciblées dans antiQ .................................................................... 61
Figure 3.1.10. Comparaison des structures prédites des ARNs antiQ ......................................................... 63
Figure 3.1.11. Analyse de la structure en pseudonoeud d’antiQ chez le mutant AbiQ-(A32C) ............... 64
Figure 3.2.1. Courbes de croissance (DO600nm) de L. lactis IL1403 pNZ123-AbiQ (AbiQ+) ou pNZ123
(AbiQ-) en présence et absence du phage P008 ou le mutant P008-Q12 .................................................... 65
Figure 3.2.2. Courbes de croissance virale (P008 ou P008-Q12) pendant l’infection de L. lactis pSRQ928
(AbiQ+) ou IL1403 pNZ123 (AbiQ-) ................................................................................................................. 66
Figure 3.2.3. Résultats d’immunobuvardage Western (anti-his) ciblant la protéine ABIQ(His) durant une
infection de L. lactis IL1403 AbiQ+ par le phage P008 ou P008-Q12 .......................................................... 67
Figure 3.3.1. Test d’expression d’ORF38-His chez la souche L. lactis NZ9000 (Système NICE) .......... 69
Figure 3.3.2. Résultats de l’expression et purification de GST-ORF38 sur colonne d’affinité
(Glutathione) .......................................................................................................................................................... 70
Figure 3.3.3. Expression et purification de la protéine TRX-ORF38 ......................................................... 71
xii
Figure 3.3.4. Résultats d’interaction préliminaire SPR-Biacore entre antiQ et ORF38 ............................. 72
xiii
Liste des abréviations
2-D En 2-dimensions 5’RACE PCR « Rapid Amplification of cDNA Ends » (Amplification rapide d’extrémités d’ADN
complémentaire 5’) aa Acide aminé A Base adénine Abi « Abortive infection » (Avortement de l’infection) AbiQ Opéron AbiQ abiQ Gène abiQ ABIQ Protéine ABIQ (toxine) ADN Acide désoxyribonucléique ADNc ADN complémentaire ADNdb ADN double brin Amp Ampicilline antiQ ARN non codant (antitoxine) ARN Acide ribonucléique ARNm ARN messager ARNr ARN ribosomal ARNt ARN de transfert ATP Adénosine tri-phosphate BL bactérie lactique BSA « Bovine serum albumin » (Albumine de sérum bovin) C Base cytosine C-ter Extrémité C-terminale Cm Chloramphénicol CRISPR-Cas Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – CRISPR associated cpm Coups par minute (k)Da (Kilo)Dalton DO600nm Densité optique 600nm DoE « Design of experiments » (Plan des expériences) DTT Dithiothréitol EDF « Extracellular death factor » (Facteur extracellulaire de mort) EDTA Acide éthylène diamine tétraacétique EOP « Efficiency of plating » (Efficacité à formé des plages de lyse) enf « Enforces » (Structure forcée) FPLC « Fast protein liquid chromatography » (Chromatographie liquide rapide des protéines) FT Flow through G Base guanine g Temps de génération GF « Gel filtration » (colonne de filtration sur gel) GMP Guanosine monophosphate GST Glutathione S-transferase His (6H) Étiquette 6Histidine HPLC « High-performance liquid chromatography » (Chromatographie liquide à haute
performance) H-T-H « Helix-Turn-Helix » (Hélice-tour-Hélice) IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kDa Kilodalton LB Lysogeny broth
xiv
MCS « Multiple cloning site » (Site multiple de clonage) min Minute mfe « Minimum free energy » (Énergie libre minimum) ml Millilitres MLST « Multilocus sequence typing » (Typage par séquençage de plusieurs loci) mm Millimètre MOI « Multiplicity of infection » (Multiplicité de l’infection) N-ter Extrémité N-terminale NEB Compagnie, New England Biolabs NICE « Nisine controlled gene expression system » (Système d’expression inductible à la nisine)nt Nucléotide NTase GTP-spécifique
Transférase de nucléotide spécifique au guanosine tri-phosphate.
O/N « Over night » (Toute la nuit) orf « Open reading frame » (Cadre de lecture ouvert) p/V Poids par volume PAM « Protospacer adjacent motif » (Motif adjacent au protoespaceur) Km Kanamycine (k)(M)pb (kilo) (million) de paire de bases PBS « Phosphate buffered saline » (Tampon phosphate) PCR « Polymerase chain reaction » (Réaction en chaîne de la polymérase) pI Point isoélectrique PIB Produit intérieur brut Pip Phage infection protein PLE phage-inducible chromosomal island-like element PPR Production de protéine recombinante PTS « Phosphotransferase system » (Système phosphotransférase) PSK « postsegregational killing » (Mortalité post-ségrégationnelle) PVDF Polyfluorure de vinylidène R Résistant R/M Système de restriction-modification RBP « Receptor binding protein » (Protéine de laison au récepteur) RBS « Ribosome binding site » (Site de liaison au ribosome) RF « RNase-Free» (Sans ARNase) RT « Reverse transcriptase » (Transcriptase inverse) s Sensible s Seconde SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE « SDS polyacrylamide gel electrophoresis » (Gel de polyacrylamide SDS) SEC-MALS Size-Exclusion Chromatography + Multi-Angle Static Light Scattering SPR « Surface plasmon resonance » (Résonance des plasmons de surface) SSB « Single-strand binding protein » (Protéine de liaison à l’ADN simple brin) ssp. Sous-espèce T Base thymine TB Terrific broth TMP « Tail major protein » (Protéine majeure de la queue) Tp Température pièce TSS « Transcription start site » (Site d’initiation de la transcription) TT Transférase terminale U Base uracile UFC Unité formant des colonies UFP Unité formant des plages de lyse
xv
UNAG UDP-N-acetyl-D-glucosamine UP Upstream promoter element V0 Volume mort V/V volume/volume W/V « weight/volume » (poids/volume) (n)(µ)(m) g (nano) (micro) (milli)-gramme (n)(µ)(m) m (nano) (micro) (milli)-mètre (n)(µ)(m) M (nano) (micro) (milli)-molaire %G-C Pourcentage des bases guanine et cytosine
xvii
« Science never solves a problem
without creating ten more » (George Bernard Shaw)
xix
Avant-propos
Ma maîtrise en quelques mots… un projet passionnant et inspirant qui m’a permis de définir mes limites
et de les surpasser. Les jours plus difficiles, ainsi que les petits moments « eurêka » de la recherche m’ont
permis d’acquérir énormément d’expérience aux niveaux social et scientifique, expérience qui s’avère
essentiel au développement personnel et professionnel. Au cours de ces années, plusieurs personnes
m’ont accompagné dans mon cheminement et m’ont permis d’atteindre mes objectifs, jusqu’à compléter
mon programme de maîtrise.
Tout d’abord, merci à mon directeur de recherche, professeur Sylvain Moineau pour sa confiance, son
support et son enthousiasme qui m’ont beaucoup inspiré. Aussi, je conserve les mêmes mots pour son
bras droit Denise Tremblay qui a souvent fait office de ressource scientifique de référence. Également, je
ne peux passer sous silence Julie Samson qui a été mon mentor et modèle dès mon début au laboratoire,
et ce même jusqu’à aujourd’hui.
Merci aussi à Bruno pour les nombreuses discussions scientifiques et les bières du vendredi. Également,
j’aimerais remercier les membres de mon comité aviseur pour leurs conseils formateurs, ainsi que les
membres du laboratoire de Québec et de Marseille qui ont fait de ma maîtrise une expérience plaisante
et enrichissante.
Merci à ma famille et mes amis pour votre support constant tout au long de ce projet. Merci à Anton qui,
peut-être même sans le savoir, m’a permis de franchir les obstacles jusqu’à l’université, et ainsi pouvoir
découvrir le domaine passionnant de la microbiologie. Finalement, j’aimerais remercier ma copine Fannie
qui malgré son train de vie acharné, a toujours trouvé du temps pour m’aider à me dépasser, à découvrir
et à avancer.
Allez, bonne lecture!
1
Introduction
Bactéries lactiques
Les travaux de nombreux chercheurs tels que Leeuwenhoek, Fracastoro, Jenner, Pasteur et Koch ont
permis de mettre en place les bases de la microbiologie actuelle (Prescott et al., 2002). Toutefois, l’homme
utilisait déjà des microorganismes bien avant que ceux-ci soient observés et caractérisés. Une étude a
d’ailleurs mis en évidence l’existence d’un breuvage fermenté datant de 7000 ans av. J.-C (McGovern et
al., 2004). Les connaissances acquises depuis ce temps ont permis de domestiquer certains
microorganismes qui jouent désormais des rôles primordiaux dans les domaines pharmaceutique,
environnemental et alimentaire. Un exemple est l’industrie laitière qui est parmi les plus importantres
industries au Canada. Cette industrie génère près de 15 milliards de dollars annuellement et emploie plus
de 215 000 personnes. À lui seul, le secteur de la transformation laitière génére 8 milliards de dollars au
PIB. Trente six pourcent des revenus associés à ce secteur (2,6 milliards de dollars) proviennent de la
province du Québec (ÉcoRessources Consultants, 2011).
En 2010, les usines de transformation laitière ont transformé plus de 2,5 milliards de litres de lait
(http://cilq.ca/industrie/statistiques-sur-lindustrie-laitiere/, 2014) dont 82% sont transformés par trois
grandes entreprises : Agropur, Saputo et Parmalat (http://www.lait.org/fr/leconomie-du-lait/la-
transformation.php, 2014). Chaque jour, ces entreprises utilisent plus de 1010 bactéries par litre de lait afin
de le transformer en produits dérivés comme du fromage ou du yogourt (Moineau et al., 2002). Les
bactéries lactiques (BL) sont utilisées afin d’acidifier le lait et de changer ses propriétés physico-chimiques
(Boucher et Moineau, 2001). Cette acidification permet également l’inhibition de croissance de certains
contaminants (Klaenhammer, 1988). Ces bactéries peuvent être isolées de différents environnements
allant des mamelles d’animaux (Verdier-Metz et al., 2012) aux légumes asiatiques (Chen et al., 2013b).
Les BLs forment un groupe hétérogène qui contient exclusivement des membres appartenant au phylum
Firmicutes. Elles possèdent tous la capacité de métaboliser le lactose et produire de l’acide lactique. Ces
bactéries se subdivisent selon leur type de fermentation hétéro- ou homofermentaires. Le premier
regroupe les bactéries produisant de l’acide lactique, mais également d’autres acides et alcools à partir des
sucres. Pour leur part, les BLs homofermentaires métabolisent les sucres en pyruvate, puis en lactate
comme unique produit final de la glycolyse (Axelsson, 2004). Les bactéries homofermentaires
représentent le groupe le plus utilisé dans l’industrie. Outre leur capacité d’utilisation des sucres, la
température de croissance et la morphologie cellulaire sont d’autres caractéristiques qui ont été utilisées
par Orla-Jensen pour la classification des BLs au début du 20e siècle (Orla-Jensen, 1921; Axelsson, 2004).
Les techniques modernes ont permis de préciser leur classification par l’utilisation notamment de
2
l’identité d’ARNr 16S des bactéries lactiques. Parmi les 12 genres de BL, seuls les genres Lactobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc et Streptococcus sont utilisés pour la transformation laitière (Champagne et Arora,
2009). La sélection du type de bactérie lactique est faite en fonction des caractéristiques enzymatiques qui
dictent le goût, la saveur, la texture ainsi que la vitesse de fermentation (Mierau et al., 1997; Smit et al.,
2005). D’ailleurs, les produits dérivés de fermentation comme l’aldéhyde et le diacétyl, les produits de la
protéolyse de la caséine par les protéases bactériennes ainsi que les exopolysaccharides permettent la
fabrication de produits laitiers fermentés aux propriétés recherchées (Mierau et al., 1997; Geis, 2005; Smit
et al., 2009).
De façon plus spécifique, le genre Lactococcus est divisé en neuf espèces dont seulement deux (lactis et
raffinolactis) sont associés au domaine laitier (Cai et al., 2011). L’espèce lactis est la seule des lactocoques
utilisée par l’industrie laitière. Les autres espèces sont retrouvées sur des végétaux (plantarum, fujiensis,
taiwanensis et formosensis), isolées de boue activée (chungangensis) ou constituent des pathogènes de poissons
(piscium et garvieae) (Cai et al., 2011; Chen et al., 2013a; Chen et al., 2014).
Lactococcus lactis
Les ferments industriels utilisés pour la production de fromages, de babeurre et de crème sure sont le
plus souvent constitués de différentes souches de Lactococcus lactis (Teuber, 1995). L. lactis fut la première
bactérie à être isolée en culture pure par Joseph Lister en 1873 (Lister, 1878). Jusqu’en 1985, cette bactérie
portait le nom de Streptococcus lactis (Schliefer et al., 1985). Morphologiquement, elle à l’aspect d’un coque
de 0,5 à 1,5 µm de diamètre qui s’organise en paire ou en courte chainette (figure 1.1). Sa température
optimale de croissance est de 30°C. De plus, L. lactis est une bactérie anaérobie aérotolérante puisqu’elle
n’utilise pas l’oxygène naturellement comme accepteur final d’électron. Toutefois, elle peut utiliser la
respiration aérobie en présence d’hème (Duwat et al., 2001).
3
Figure 1.1. Image de Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 par microscopie à balayage (Grossiord et al., 2003).
L. lactis est divisé en quatre sous-espèces (ssp.) (cremoris, hordniae, lactis et tructae) où seulement les sous-
espèces cremoris et lactis sont utilisées par l’industrie laitière (Latorre-Guzman et al., 1977; Schliefer et al.,
1985; Pérez et al., 2011; Von Wright, 2012). La sous-espèce lactis est fréquemment utilisée dans la
production de certains fromages frais (Jamet, 2009) alors que la ssp. cremosis est davantage utilisée dans la
fabrication de cheddar (Vedamuthu et al., 1966). Cette dernière produit une plus haute concentration de
certains composés volatiles recherchés pour ce type de fromage (Fernández et al., 2011). Ces deux sous-
espèces sont très similaires au niveau génétique (Identité >99% pour ARN16S et les gènes conservés
rpoB et recA), mais peuvent être distinguées par des caractéristiques métaboliques spécifiques. En effet, la
ssp. cremoris se distingue de lactis par son incapacité à croitre à 40°C, sa croissance en présence de 4%
NaCl ainsi que son aptitude à hydrolyser l’arginine (Holt et al., 1994; Von Wright, 2012).
À ce jour, les génomes de onze souches de L. lactis sont disponibles dans la banque de données GenBank
(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/). Les caractéristiques génétiques de ces souches
sont présentées dans le tableau 1.1. Tout comme pour les autres bactéries lactiques, leur génome est faible
en bases guanine et cytosine (36% G-C). Le nombre moyen de gènes est de 2552 pour des génomes
d’environ 2,5 Mpb chacun. Également, ces souches possèdent entre zéro et huit plasmides différents qui
sont impliqués dans plusieurs fonctions variées. Ils possèdent, entre autres, la majorité des gènes
nécessaires à la production de bactériocines, la résistance aux phages ainsi que le transport et le
métabolisme du lactose (Teuber, 1995). Parmi elles, seules les souches L. lactis ssp. lactis IO-1, CV56,
KF147 et L. lactis ssp. cremoris KW2 n’ont pas été isolées de l’environnement laitier (Siezen et al., 2010;
Gao et al., 2011; Kato et al., 2012; Kelly et al., 2013). La provenance de la souche influence généralement
4
sa capacité à métaboliser les composantes de son environnement. En effet, les souches d’origine laitière
possèdent d’avantage de gènes impliqués notamment dans la protéolyse des caséines du lait et la résistance
aux phages (O'Sullivan et al., 2009).
Tableau 1.1. Tableau comparatif des caractéristiques génomiques des souches de Lactococcus lactis ssp. lactis et ssp. cremoris.
Souche Génome (Mpb)
G+C (%)
Nombre de
gènes
Nombre de
plasmides
Numéro d’accession (GenBank)
Références
L. lactis ssp. lactis
IL1403 2,37 35,3 2425 - AE005176 (Bolotin et al., 2001; Linares et al., 2010)
KF147
2,64 34,9 2662 1 CP001834 (Siezen et al., 2010)
CV56 2,52 35,1 2549 5 CP002365 (Gao et al., 2011)
IO-1
2,42 35,1 2319 - AP012281 (Kato et al., 2012)
KLDS 4.0325
2,59 35,4 2662 3 CP006766 (Yang et al., 2013)
L. lactis ssp. cremoris
MG1363 2,53 37,7 2597 - AM406671 (Wegmann et al., 2007)NZ9000
2,53 37,7 2594 - CP002094 (Linares et al., 2010)
A76
2,58 35,9 2845 4 CP003132 (Bolotin et al., 2012)
SK11 2,60 35,8 2742 5 NC_008527 (Makarova et al., 2006)UC509.9 2,46 35,8 2401 8 CP003157 (Ainsworth et al., 2013)
KW2 2,43 36,7 2278 - CP004884 (Kelly et al., 2013)
Isolées du secteur laitier, les souches L. lactis ssp. cremosis MG1363 et L. lactis ssp. lactis IL1403 sont des
organismes modèles dans l’étude des bactéries à Gram positif (Bolotin et al., 2001; Wegmann et al., 2007;
Linares et al., 2010). Les souches MG1363 et IL1403 sont dérivées respectivement des souches
NCDO712 et IL594 dont leur plasmides naturels ont été éliminés via un traitement aux UV et/ou un
curage-protoplastique (Gasson, 1983; Chopin et al., 1984). D’ailleurs, il a été démontré que la perte des
plasmides de L. lactis MG1363 permet d’augmenter sa stabilité génétique améliorant ainsi cette bactérie
comme outil pour des analyses d’ADN recombinant (Gasson, 1983). La stabilité génomique de ces
souches pourrait également s’expliquer par leur forme diploïde lorsque mis en culture à croissance lente
(Michelsen et al., 2010).
5
L’étude de ces souches a permis d’approfondir nos connaissances sur L. lactis et a mené au développement
de souches « réusinées » avec des caractéristiques de fermentation et de productivité augmentées (de Vos
et Hugenholtz, 2004). Ces études ont aussi favorisé le développement de systèmes de production de
protéines recombinantes (PPR) efficacent chez les bactéries à Gram positif, incluant L. lactis (de Vos et
al., 1997; de Vos, 1999).
Le système NICE (NIsine Controlled gene Expression system) est sans aucun doute le système
d’expression de protéines recombinantes le mieux caractérisé chez cette bactérie (Mierau et Kleerebezem,
2005). La nisine (nisA) est une bactériocine qui induit un enchainement de phosphorylation qui permet
l’activation du promoteur Pnis, et la transcription du gène cloné en aval (figure 1.2-A). Les gènes
régulateurs nisK (récepteur s’autophosphorylant) et nisR (activateur du promoteur) peuvent être introduits
dans le chromosome de la souche bactérienne utilisée pour l’expression ou sur un plasmide, alors que le
promoteur inductible est situé sur le plasmide de clonage du gène d’intérêt (de Ruyter et al., 1996). La
souche L. lactis ssp. cremoris NZ9000 est une souche dérivée de L. lactis MG1363 contenant les gènes
régulateurs nisK/nisR dans son chromosome. Fait intéressant, la souche NZ9000 a une meilleure capacité
à incorporer le glucose que MG1363 et ce phénomène serait causer par la présence de six mutations
ponctuelles ayant été identifiées dans des gènes jouant des rôles dans le système phosphotranférase (PTS)
spécifique à la cellobiose, la synthèse de chaperonnes et le métabolisme des acides aminés (Linares et al.,
2010). Le système NICE a également été adapté pour d’autres bactéries à Gram positif (Kleerebezem et
al., 1997; Pavan et al., 2000).
Figure 1.2. Schéma des systèmes d’expression utilisés pour ce projet. (A) Système NICE chez L. lactis (Mierau et Kleerebezem, 2005). (B) Système T7 de E. coli (Terpe, 2006).
6
Les systèmes Zirex (Mu et al., 2013) et SICE (Benbouziane et al., 2013) permettent également la
production de protéines recombinantes chez L. lactis. Ces systèmes d’expression chez les bactéries à Gram
positif représentent des alternatives intéressantes aux systèmes classiques développés chez Escherichia coli,
mais restent tout de même généralement moins efficaces (Morello et al., 2008; Chen, 2012). Chez E. coli,
le système d’expression le plus utilisé est le système T7. Le gène codant pour l’ARN polymérase du phage
T7 est placé sous le contrôle du promoteur lacUV5 inductible à l’IPTG présent dans la souche
d’expression (DE3). À l’induction, l’ARN polymérase T7 permet l’induction du promoteur en amont du
gène d’intérêt (figure 1.2-B) (Studier et Moffatt, 1986; Terpe, 2006).
Que ce soit dans le secteur de PPR ou dans l’industrie laitière, l’altération des fermentations et des
productions conduit à des pertes financières liées à la diminution des rendements ou à la modification de
la qualité des produits finaux. Parmi les nombreux facteurs qui peuvent influencer la croissance
bactérienne lors des productions industrielles, la présence de bactériophages est un des principaux agents
causal, affectant 0,1 à 10 % des fermentations laitières (Moineau et Lévesque, 2005). De plus, l’incidence
des phages cause des problèmes de croissance cellulaire récurrents pour les cultures procaryotes de
production de protéines recombinantes.
Bactériophages
Les bactériophages (ou phages) sont des virus bactériens. Ils constituent les entités biologiques les plus
abondantes et les plus diversifiées sur terre (Brüssow et Kutter, 2005). Leur nombre total est estimé à
plus de 1030, soit 10 à 15 fois plus que le nombre de bactéries (Suttle, 2005). Tout comme leur hôte, les
phages sont retrouvés dans tous les environnements connus sur Terre. Certains phages ont même été
retrouvés dans des environnements extrêmes comme des étendues d’eau salées et des sources thermales
(Rice et al., 2001; Porter et al., 2007). Bien qu’ils soient ubiquitaires, les phages sont retrouvés en plus
grande majorité dans les océans, estimés à plus de 108 phages par millilitre d’eau (Bergh et al., 1989;
Wommack et Colwell, 2000). Leur prédominance est représentative de la présence de leur hôte et varie
énormément en fonction du temps et de l’espace (Wommack et Colwell, 2000). Selon plusieurs experts,
le rôle des phages serait d’ailleurs de contrôler les populations bactériennes et ainsi conserver l’équilibre
géochimique et écologique des écosystèmes (Wommack et Colwell, 2000; Suttle, 2007). Les
bactériophages permettent la dégradation de 20-40% de la communauté microbienne à chaque jour
(Suttle, 1994).
La découverte de ces entités biologiques remonte au début du 20ième siècle. Les scientifiques Frederick
Twort (1915) et Félix d’Hérelle (1917) ont tous deux observé un agent capable d’infecter respectivement
7
des cultures de Micrococcus et Shigella (Prescott et al., 2002). Toutefois, seul d’Hérelle a poursuivi ses
recherches sur cet agent viral qu’il appellera bactériophage. Cette découverte resta controversée jusqu’à
l’avènement de la microscopie électronique en 1940 qui a permis l’observation directe de ces virus
(Ackermann, 2011).
Les phages sont des virus généralement simples au niveau génétique ce qui fait d’eux d’excellents modèles
pour l’étude des interactions hôte-virus autant pour les procaryotes que pour les eucaryotes. D’ailleurs,
c’est en raison de sa petite taille que le premier génome d’ADN simble brin à avoir été complètement
séquencé fût celui du phage phiX174 (5 386 nt) (Sanger et al., 1977). Cinq ans plus tard, la séquence d’un
premier génome à ADN double brin fut publié, celle du phage modèle lambda ( ) (Sanger et al., 1982).
À ce jour, on compte plus de 2 500 phages dont la séquence de leur génome est disponible dans les
banques de données publiques (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore). Les recherches sur les phages
ont permis, entre autres, le développement d’outils moléculaires indispensables à ce jour. À titre
d’exemple, les méthodes courantes de clonage utilisent les systèmes de restriction qui ont d’abord été
découverts pour leur efficacité anti-phage (Meselson et Yuan, 1968). Une autre méthode met à profit la
capacité lysogénique du phage lambda pour permettre des clonages rapides et efficaces à des sites
d’insertions spécifiques (Walhout et al., 2000). Également, des promoteurs viraux sont fréquemment
utilisés pour la production de protéines recombinantes afin de maximiser la transcription des gènes
d’intérêts. Les phages peuvent aussi constituer des outils intéressants pour d’autres applications comme
le «phage display» ou la thérapie par les phages ciblant des bactéries pathogènes (McAuliffe et al., 2007).
Classification des phages
La très grande majorité des phages sont constitués de trois éléments principaux. (1) Une tête protéique
appelée capside. Celle-ci contient l’information génétique (2) du phage sous forme d’ADN ou d’ARN,
simple ou double brins. Le troisième élément est une queue (3), également de nature protéique, qui est
retrouvée chez 96% des phages connus à ce jour (Ackermann, 2003; Ackermann et Prangishvili, 2012).
Ces caractéristiques morphologiques représentent les bases de la nomenclature phagique actuelle. Jusqu’à
présent, plus de 6000 phages ont été observés au microscope électronique (Ackermann, 2007;
Ackermann, 2009; Ackermann et Prangishvili, 2012). Tous ces résultats permettent de mettre en évidence
la grande diversité des bactériophages retrouvés sur la planète (figure 1.3.). De tous les phages observés,
les phages atypiques (sans queue) ne représentent que 4% et ceux-ci sont divisés en trois groupes
morphologiques différents : polyhédrale, filamenteux ou pléomorphe (Ackermann, 2009). Certains de
ces phages rares possèdent une enveloppe lipidique ce qui n’est pas le cas chez les phages caudés
(Ackermann, 2003).
8
Figure 1.3. Morphologie des bactériophages. Adaptée de (Ackermann, 2007).
Le ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses) regroupe les phages en 14 familles (ICTV
Master Species list 2013). D’un autre côté, certains experts les regroupes en 10 familles (Ackermann,
2007; Ackermann et Prangishvili, 2012). Les nouvelles méthodes de caractérisation des virus telles le
séquençage et la protéomique virale pourrait éventuellement mener au remaniement des taxons actuels
(Lavigne et al., 2009).
L’ordre des Caudovirales contient tous les phages caudés (96%) et se subdivise en trois grandes familles
selon leur type de queue. Les Myoviridae ont une longue queue contractile (25% des Caudovirales), les
Podoviridae ont une petite queue non contractile (14% des Caudovirales) et les Siphoviridae possèdent une
longue queue non contractile (61% des Caudovirales) (Maniloff et Ackermann, 1998). Ces phages
possèdent une capside symétrique et une queue hélicoïdale d’une taille allant de 10 et 800 nm. De plus,
ils ont tous un génome d’ADN double brin d’une taille variant entre 17 à 700 kpb (Ackermann, 2009).
Fait intéressant, les phages caudés seraient les plus vieux virus, expliquant ainsi la diversité génétique à
l’intérieur de cet ordre (Ackermann, 2003).
9
Lactophages
Dans l’industrie de la transformation laitière, les mêmes souches bactériennes de choix sont constamment
utilisées afin de maximiser les rendements de l’entreprise et la fidélité des consommateurs. Depuis
quelques décennies, l’utilisation massive de ces bactéries a conduit à l’émergence de nouveaux phages qui
infectent spécifiquement ces souches d’intérêt (Rousseau et Moineau, 2009). Leur incidence sur les
rendements et la qualité des fromages constitue la raison principale pour expliquer l’intérêt marqué des
chercheurs pour les phages reliés au domaine laitier. Uniquement dans le laboratoire du Prof. Sylvain
Moineau, plus de 125 nouveaux phages de lactocoques en provenance de l’industrie laitière québecoise
ont été isolés depuis 15 ans.
Les phages de Lactococcus lactis ont tous une queue non contractile et la majorité d’entre eux appartiennent
à la famille des Siphoviridae. La classification actuelle subdivise les lactophages en 10 groupes génétiques
distincts (tableau 1.2.) (Deveau et al., 2006). Parmi eux, les groupes 936, c2 et P335 sont, en ordre
d’importance, les plus souvent associés à des problèmes de fermentation dans plusieurs pays du monde
(Rousseau et Moineau, 2009).
Tableau 1.2. Classification des groupes de lactophages. Adaptée de (Deveau et al., 2006).
La barre représente 50 nm.
10
Une méthode de type multiplex PCR ciblant des gènes conservés est disponible et permet de classer
rapidement les nouveaux phages à l’intérieur d’un de ces trois groupes prédominants (Labrie et Moineau,
2000). L’évaluation de l’incidence et de la variabilité des populations phagiques lors de fermentation
industrielle constitue le premier pas dans le contrôle de ces contaminants. L’étude plus approfondie des
phages les plus problématiques, tel ceux du groupe des 936, a d’ailleurs permis de développer des modèles
de recherche et des outils de détection efficaces pour contrer les phages dans cette industrie.
Chez le groupe 936, certains phages sont bien caractérisés et constituent des modèles d’études : p2 (Sciara
et al., 2010), P008 (Loof et al., 1983), sk1 (Chandry et al., 1997) et bIL170 (Labrie et Moineau, 2000; Crutz-
Le Coq et al., 2002; Dupont et al., 2005). Les phages 936 possèdent une capside icosaédrique et une queue
non contractile(Siphoviridiae), leur génome variant entre 25 et 40 kpb (Brøndsted et Hammer, 2006). Le
nombre total de phages de type 936 dont le génome a été séquencé s’élève aujourd’hui à 52
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Récemment développée dans le laboratoire du Prof. S. Moineau, une
nouvelle méthode MLST (« Multilocus Sequence Typing ») permet la différenciation des phages 936 par
comparaison de séquence nucléotidique de cinq gènes conservés (Moisan et Moineau, 2012). Tel que
démontré à la figure 1.4., les phages 936 forment un groupe génétiquement homogène. Un génome-cœur
composé de 33 gènes a été identifié et est constitué majoritairement de gènes codant pour des protéines
structurales. Au contraire, les produits de gènes précoces sont en générales peu conservés entre les phages
(Rousseau et Moineau, 2009).
11
Figure 1.4. Alignements des génomes de phages 936 modèles. Les ORFs de même couleur sont ceux qui ont plus de 80% d’identité en acide aminé alors que les ombrages gris reliant les génomes démontrent les régions conservés chez tous les génomes des 936. Traduite de (Rousseau et Moineau, 2009).
Cycle de réplication
Que ce soit des phages de lactocoques ou infectant d’autres bactéries, tous les phages se répliquent
exclusivement dans leur hôte. Les phages peuvent utiliser deux types de cycle de réplication. Les phages
sont dit virulents s’ils suivent le cycle lytique de réplication, ou tempérés, s’ils utilisent le cycle lysogénique
(figure 1.5.). Chez les lactophages, les phages du groupe 936 et c2 sont virulents alors que les P335 sont
virulents ou tempérés (Bissonnette et al., 2000).
5 kb 10 kb 15 kb 20 kb 25 kb 30 kb
712
jj50
P008
sk1
bIL170
p2
SL4
CB13
CB14
CB19
CB20
Gènes tardifs Gènes précoces Gènes médians
Encapsidation Morphogenèse Lyse Réplication
1 2 3 4 5 6 78910
11 121314 15 16 17 18 19
2021 22 23 24
252627282930 31 32
3334
35363738 39
4041 42
4344 45
48
495051
52534754461A
1 2 3 4 5 6 78
91011
1213 14 15 16 17 18 19 20 21 22
2324
252627
282930 31
32333435
3637
38394041
42 43 444546474849
1 2 3 4 5 6 7 89101112 13 14
1516 17 18 19 20 21 22 23 24
25262728
293031
323334
3536
373839 40
4142
43444546
47 4849
505152
535455
565758
L1 L2 L3 L4 L5L6
L7L8L9L10L11 L12 L13
L14L15 L16 L17 L18
L19L20
L21L22 E37
E35
E34E33E32
E31E30E29
E28E27E26
E25E24E23
E22E21E20E19E18
E17E16E15E14E13
E12E11E10E9E8E36E7E6
E5E4E3 E1E2
OrfOM1M2M3
M4
15 16 1718 19 20 2122232425
26
28
2930
31 323334 35 36
37383940
4142 43
444546
47 4849
51525354
p3227
p21
1 2 3 4 5 6 789 10 11 12 13 14
50
1 2 3 4 5 6 78910
1112
13 14 15 16 17 18 19 20 2122
232425
262728
29303132
3334 35
3637
3839404142 43 44 45
4647
4849
1 2 3 4 5 6 7 8910
1112 13 14
1516 17 18
1920
2122 23
2425
26272829
303132
33343536
373839404142
43 4445
48495051 52
4746
131415 16 17 18 19 20
2122 23
24252627
2829
30 313233 34
3536
3738
394041
42434445
48 49 505152
534754
46 551 2 3 4 5 6 7 891011
12
2324
252627
2829303132
333435 36
3738 3940
414243
44 454849
5051
524746131415 16 17 18 19 20
21221 2 3 4 5 6 7 8
91011
12
2324
252627
2829303132
333435 36
3738 3940
414243
44 45
48
4950
5147
461314
15 16 17 18 19 2021
221 2 3 4 5 6 7 891011
12
2324
252627
2829303132
33343536
3738 3940
414243
44 45
48
4950
5147
461314
15 16 17 18 19 2021
221 2 3 4 5 6 7 891011
12
p21
50
12
Figure 1.5. Cycle lytique (A) et lysogénique (B) de réplication des phages. Adaptée de (Labrie et al., 2010).
Au cours du cycle lytique, les phages utilisent les cellules bactériennes comme des usines de productions
virales. En contrepartie, les phages tempérés vont plutôt intégrer leur génome à l'intérieur du
chromosome bactérien au moyen d’une intégrase et de séquences d’intégrations spécifiques. Ce génome
viral intégré est appelé prophage. La réplication du chromosome bactérien amène du même coup la
dissémination du prophage dans les cellules filles, et donc la propagation du phage dans l’environnement.
Certaines protéines de répression sont exprimées constitutivement à partir du prophage et permette le
maintien du génome virale à l’intérieur du chromosome bactérien. Toutefois, l'induction par certains
stress tels les rayons ultra-violets (UV), un stress oxydatif, la température et la Mitomycine C peuvent
mener à la déstabilisation de cet état (Little, 1984). Le prophage est alors excisé pour ensuite entrer dans
le cycle lytique de réplication.
Que ce soit pour le cycle lytique ou lysogénique, le point de départ de l’infection est le même. Les phages
se retrouvent dans l’environnement sous forme inerte appelée virion et vont débuter leur cycle de
réplication au moment de la mise en contact avec la bactérie. Malgré les diverses opinions, ce n'est pas
clair si la rencontre phage/hôte est uniquement stochastique ou si elle est guidée par différente forces
d’interactions. Le phage va donc s'attacher à un ou plusieurs récepteurs présents à la surface cellulaire :
protéines membranaires, polysaccharides, pilis, flagelles, acides téicoïques ou lipotéicoïques liés au
13
peptidoglycanes (Kutter et al., 2005). Chez les phages caudés, cette interaction se fait principalement entre
le(s) récepteur(s) et la plaque basale à l'extrémité de leur queue. Cette dernière est composée de plusieurs
protéines jouant un rôle essentiel dans l'adsorption et l'éjection de l'ADN viral lors de l'infection (figure
1.6.). Également, la protéine majeure de la queue (MTP) pourrait participer à la reconnaissance
phage/hôte en permettant un attachement primaire et réversible à la surface de la bactérie (Pell et al.,
2010).
Figure 1.6. Représentation tridimensionnelle des protéines formant la plaque basale du phage p2. (A) Image en microscopie électronique et schématisée de p2. (B, C) Plaque basale avec la première MTP. Les flèches (ou points) bleues représentent les RBP. (D, E) Réprésentation par Cryo-EM de la plaque basale. Adaptée de (Sciara et al., 2010).
Pour les phages de lactocoques, seulement la protéine bactérienne membranaire Pip (phage infection
protein) a été caractérisée au niveau moléculaire. Cette protéine est essentielle pour l'infection des phages
à tête allongée du groupe c2 (Geller et al., 1993), mais n'est pas nécessaire pour l'infection par les phages
à capside isométrique 936 et P335 (Kraus et Geller, 1998).
Les plaques basales sont constituées de plusieurs monomères de la protéine de liaison au récepteur (RBP).
Des études sur la RBP du phage p2 (groupe 936) ont permis de mettre en évidence la liaison RBP au
glycérol/sucre suggérant une liaison des RBP aux acides lipoteichoïques in vivo (Tremblay et al., 2006).
Ces RBP s'assemblent en trimère dans la plaque basale, et sont constituées de trois domaines : 1. épaule
14
en N-terminale, 2. cou et 3. tête en C-terminale. La tête serait essentielle à la spécificité du récepteur
(Spinelli et al., 2006). La liaison RBP au récepteur est irréversible et s'avère nécessaire pour l’étape
subséquente, l'éjection de l'ADN viral. Une étude récente a aussi démontré l'importance de la
composition en sucres formant la pellicule entourant les cellules de L. lactis ssp. cremoris, pour l'adsorption
des phages du groupe 936 (Mahony et al., 2013). Il est évident que le type de récepteur est, du moins en
grande partie, déterminant pour le spectre lytique des phages de L. lactis.
L’étape suivante est l’entrée de l’ADN viral à l’intérieur de la cellule bactérienne. L'éjection de l’ADN
phagique est dépendante du phage avec un maximum de 3000-4000pb/s, soit environ 40 fois plus rapide
que la transformation (Letellier et al., 2003). Deux hypothèses existent pour expliquer ce phénomène
(Molineux et Panja, 2013). Dans un premier temps, la pression totale à l’intérieur de la capside
constituerait une force suffisante pour injecter directement l'ADN, à la façon qu'un coup de revolver à
bout portant. Le deuxième modèle fait appel au concept d'osmose où l'eau entrant (en provenance de
l'environnement et/ou du cytoplasme) dans la capside conduirait à la sortie de l'ADN par manque
d'espace. Les phages peuvent utiliser l'ATP, le potentiel membranaire et/ou la transcription et traduction
pour l’éjection de leur génome (Molineux et Panja, 2013). Le coliphage T7 utilise le potentiel membranaire
comme source d'énergie. Chez ce phage, certaines protéines (présente dans le virion) vont former un
canal pour conduire l’ADN. Après l’entrée de 1 kb, l’ARN polymérase T7 lie le promoteur et tire l'ADN
à l’intérieur de la cellule. (Zavriev et Shemyakin, 1982; Moffatt et Studier, 1988; Kemp et al., 2004).
Dès son entrée dans le cytoplasme, l'ADN viral linéaire est vite recircularisé par ses extrémités cohésives
(cos-type) ou redondantes (pac-type) permettant ainsi d'éviter la dégradation du génome par les
exonucléases bactériennes. À titre indicatif, tous les lactophages appartenant au groupe des 936 sont de
type cos (extrémités cohésives de 11 nt) (Rousseau et Moineau, 2009). L’ADNdb circulaire formé est
ensuite transcrit par des ARN polymérases ADN dépendant d'origine bactérienne. Toutefois, quelques
phages comme le coliphage T7 utilisent leur propre ARN polymérases qui sont nettement plus efficaces
dans la transcription génique (Hausmann, 1976; Kutter et al., 2005).
La transcription des gènes se fait de façon chronologique où les gènes précoces sont transcrits en premier.
L'étude des profils de transcription de deux lactophages appartenant au groupe 936 (sk1 et P008) a
démontré que les gènes précoces sont transcrits respectivement entre 2-5 et 2-10 minutes à partir du
début de l'infection (Chandry et al., 1994; Samson et al., 2013a). Bien que la majorité des gènes précoces
codent pour des protéines aux fonctions hypothétiques (80%), celles-ci semblent être impliquées dans la
prise de contrôle de la cellule (Hatfull et Hendrix, 2011). Pour leur part, les gènes médians codent pour
des protéines jouant un rôle dans la réplication virale. La réplication produit de long concatémères d’ADN
(5-8 génomes) qui seront séparés lors de l'encapsidation (Kutter et al., 2005). Pour le phage sk1, ces gènes
15
sont transcrits entre 7 à 10 minutes (Chandry et al., 1994). Finalement, il y a transcription des gènes tardifs
qui codent pour les protéines de structure, d'assemblage et de lyse cellulaire. Chez les phages caudés, les
capsides et les queues sont produites et assemblées séparément un de l'autre (Kutter et al., 2005). L'ADN
viral est d’abord encapsidé sous l'action des terminases qui sont liées à la procapside. Ces enzymes
permettent également la coupure du concatémère d’ADN et ainsi l'insertion d'un génome unique et
linéaire, ce qui forme la capside virale (Kutter et al., 2005). Le virion mature est ensuite formé grâce aux
protéines du collet (portale) qui lie la queue.
La lyse cellulaire constitue la dernière étape du cycle lytique. Différentes protéines jouant un rôle dans la
lyse ont déjà été identifiées chez les lactophages. Parmi elles, la holine forme des pores membranaires qui
permettent à l'endolysine d'atteindre le peptidoglycane, et d'induire la lyse cellulaire et le relargage des
nouveaux virions (Catalão et al., 2013). Pour les lactophages, un cycle de réplication moyen dure 50
minutes, et permet de relarguer environ 100 nouveaux virions (données non publiées).
Mécanismes anti-phages
Les phages sont toujours présents dans l’environnement et représentent une menace constante pour les
bactéries. Ce stress constant a mené ces bactéries à développer une panoplie de mécanismes afin de
résister à l’infection par les phages (Labrie et al., 2010). Ces mécanismes anti-phages sont divisés en quatre
groupes en fonction du moment où ils interviennent au cours du cycle lytique de réplication. Pour une
revue complète, le lecteur peut consulter cette revue (Labrie et al., 2010).
1. Inhibition de l'adsorption
Comme mentionnée précédemment, l’adsorption du phage à la cellule est essentielle à la réplication virale.
L'idée est donc fort simple, prévenir la reconnaissance de la bactérie par le phage. Pour ce faire, les
bactéries peuvent induire des modifications directes ou indirectes sur les récepteurs reconnus par les
bactériophages.
Une des stratégies bactériennes est la synthèse d’une matrice extracellulaire ayant pour effet de masquer
les récepteurs de surface reconnus par les phages. À titre d'exemple, il a été démontré que la bactérie E.
coli K1 capsulée était en mesure de résister à l'infection par le phage T7 et que cette résistance est perdue
lors de l'élimination de cette capsule (Scholl et al., 2005). Chez certains phages de lactocoque, l'interférence
d'adsorption serait causée par l'augmentation de lipides dans les acides téichoïques et la production de
galactose et/ou rhamnose à la surface extracellulaire (Garvey et al., 1995). La résistance associée à ces
16
polymères extracellulaires n'est toutefois pas très efficace (Deveau et al., 2002; Mahony et al., 2013). En
effet, certains phages possèdent des enzymes capables de dégrader ces exopolysaccharides, leur
permettant ainsi d'atteindre leur récepteur spécifique (Sutherland et al., 2004).
Les bactéries peuvent également produire un compétiteur ayant une forte affinitée pour le récepteur du
phage. Un exemple intéressant fait intervenir le peptide antimicrobien microcin J25 qui est connu pour
l'inhibition de croissance bactérienne en conditions faibles en nutriments. Sous ce stress, le peptide J25
produit se lie au transporteur de fer FhuA (récepteur du phage), compétitionnant ainsi l'infection par les
coliphages comme T1, T5 et Phi80 (Destoumieux-Garzón et al., 2005).
Le phénomène de variation de phase se caractérise par une modification à haute fréquence et variable
dans le temps, de certains constituants cellulaires. Ces changements sont induits par recombinaison de
sites spécifiques, mésappariement de séquences répétées ou modifications épigénétiques (Henderson et
al., 1999). Certaines bactéries comme Bordetella spp. peuvent utiliser la variation de phase pour modifier
leur composition de surface, et ainsi résister au stress phagique (Uhl et Miller, 1996). En effet, le phage
BPP-1 peut infecter efficacement la bactérie uniquement dans la phase Bvg+ (virulence), moment où son
récepteur spécifique est exprimé (l'autotransporteur de pertactine (Prn)) (Beier et Gross, 2008). D’un
autre côté, certains phages mutants ont acquis la capacité d'infecter les cellules n'exprimant pas ce
récepteur (Bvg-). Les taux d'infection sont toutefois nettement inférieurs (Liu et al., 2002). Également,
certains phages de Bordetella peuvent contourner cette résistance en utilisant des « diversity-generating
retroelements » (DGR) (Liu et al., 2002). Ces éléments génétiques permettent des substitutions
nucléotidiques dans une région variable du gène phagique mtd « Major tropism determinant » et modifie
grandement son tropisme (Doulatov et al., 2004). Des analyses génomiques ont permis d'identifier
d'autres DGRs provenant de génomes phagiques, mais également de génomes bactériens (Medhekar et
Miller, 2007; Simon et Zimmerly, 2008).
Bien qu'une multitude de stratégies puissent être utilisées pour bloquer l'adsorption, celles-ci peuvent être
contournées par les phages (Labrie et al., 2010).
17
2. Bloquer l'injection de génome viral
Les bactéries peuvent utiliser les systèmes d'exclusion de type superinfection (Sie) comme deuxième
barrière de défense contre les phages. Ceux-ci sont composés de protéines qui bloquent spécifiquement
l'entrée de l'ADN viral, produisant ainsi une immunité spécifique contre certains phages. Cette stratégie
est utilisée par les prophages afin de prévenir l'infection par un autre phage, laquelle conduirait à la mort
de la cellule dans lequel il est intégré. À ce jour, peu de mécanismes Sie ont été caractérisés. Parmi eux, le
système Sie2009 isolé de L. lactis fut identifié à l'intérieur du génome d'un phage tempéré nommé Tuc2009
(McGrath et al., 2002). Les protéines de ce système s'associent à la membrane pour prévenir l'entrée de
l'ADN (McGrath et al., 2002). D’autres Sie de lactocoques ont une activité spécifique contre certains sous-
groupes de phages chez les 936 (Mahony et al., 2008).
Bien que rare, il existe des mécanismes Sie n'étant pas codés par des prophages. Le Sie imm/sp (coliphage
T4) est un exemple qui a d’ailleurs été très bien caractérisé. Respectivement, les protéines virales imm et
sp changent la conformation des sites d'injection et inhibent l'activité du lysozyme T4, ce qui prévient
ainsi la dégradation du peptidoglycane (Lu et al., 1993; Lu et Henning, 1994). L'activité de ce système
permet de prévenir l'infection par d'autres phages de types T-paires au cours de la réplication du phage
T4 (Lu et Henning, 1994).
3. Coupure des acides nucléiques exogènes
A. Systèmes de restriction-modification
Une fois l'ADN viral à l'intérieur de la cellule, celui-ci peut faire face aux systèmes de restriction-
modification (R/M). Ces systèmes font intervenir 2 à 3 protéines qui occupent les fonctions de méthylase
ou de reconnaissance/restriction. La méthylase permet de modifier l'ADN de l'hôte en ajoutant un
groupement méthyle à un site spécifique. Cela a pour effet de protéger l’hôte puisque l’ADN méthylé
n’est pas reconnu ou coupé par l'enzyme de restriction (Pingoud et al., 2005). Ces systèmes de défense
sont répandus chez les bactéries et les archée dans pas moins de 95 et 99,5% des cas, respectivement
(Roberts et al., 2010). À titre d'exemple, les souches de laboratoire L. lactis ssp. cremoris MG1363 et L. lactis
ssp. lactis IL1403 contiennent chacun trois systèmes R/M sur leur chromosome. D'autres souches telles
L. lactis ssp. Lactis CV56, qui contient 5 plasmides, possède plusieurs R/M plasmidiques et
chromosomiques (Roberts et al., 2010; Gao et al., 2011).
Il existe quatre types de système R/M (I-IV) qui sont définis selon leur nécessité d'un cofacteur spécifique,
la nature des sites de reconnaissance, leur site de coupure et la structure des enzymes (Roberts et al., 2003).
18
La majorité des enzymes de restriction décrites à ce jour appartiennent au R/M de type II, malgré que
les analyses génomiques suggèrent une incidence de seulement 45% (Roberts et al., 2003). Cette différence
s'explique par les projets d'identification/caractérisation de R/M qui ciblent plus spécifiquement les types
II en raison de leur utilité dans les technologies de l'ADN recombinant (Pingoud et al., 2005). Les R/M
type II sont habituellement homodimères et coupent l'ADN à l'intérieur, ou près, des sites de
reconnaissance (courtes séquences palindromique) en présence de Mg++ comme cofacteur (Pingoud et
al., 2005).
Le système LlaDCH-4 (isolé de L. lactis ssp. cremoris DCH-4) fut le premier système de L. lactis pour lequel
la séquence de reconnaissance et la structure génétique ont été identifiées (Moineau et al., 1995). Fait
intéressant, ce système est fort efficace contre les groupes de phages prédominants en industrie laitière,
soit c2, P335 et 936 (Moineau et al., 1995). Plusieurs autres R/M de lactocoques ont également été isolés
et caractérisés au cours des années (Roberts et al., 2010).
De leur côté, les phages ont développé différentes stratégies afin de contourner les systèmes de
restriction-modification. Considérant que l'efficacité du système est directement proportionnelle au
nombre de sites de reconnaissance, certains phages accumulent des mutations ponctuelles afin de réduire
leurs séquences de reconnaissance (Krüger et al., 1988; Wilson et Murray, 1991). Également, il a été
démontré que certains lactophages peuvent acquérir le gène codant pour une méthylase dans leur génome,
et ainsi s'auto protéger contre l'action de l'endoribonucléase du même système R/M (Hill et al., 1991;
McGrath et al., 1999). Pour sa part, le coliphage T7 utilise une autre stratégie qui est tout aussi ingénieuse.
Le gène 0.3 code pour la protéine Ocr qui permet la séquestration des enzymes de restriction en imitant
la structure en B de l'ADNdb viral (Walkinshaw, 2002). Finalement, certains phages comme T4 utilisent
des bases inhabituelles ou la glycosylation pour constituer leur ADN génomique (Krüger et Bickle, 1983;
Labrie et al., 2010). L'essentiel des stratégies d'adaptation des phages sont développées plus en détail dans
la revue de Samson et al. (Samson et al., 2013b).
b. CRISPR-Cas
Les systèmes CRISPR-Cas (« Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – CRISPR
associated genes ») sont très répandus chez les bactéries, et ubiquitaires chez les archées. Une étude
ciblant 102 bactéries lactiques a permis d'identifier 66 systèmes CRISPR-Cas distribués dans 26 souches
différentes (Horvath et al., 2008). Malgré l'abondance, un seul système actif chez L. lactis a pu être identifié
jusqu'à présent, et celui-ci est retrouvé sur un plasmide (Millen et al., 2012).
Ces systèmes sont composés d'un locus CRISPR et de gènes associés appelés cas (Jansen et al., 2002). Ces
locus contiennent des séquences répétées d'environ 40 nt qui sont séparées par des espaceurs variables
19
non répétés de 21 à 72 nt de longueur (Barrangou et Horvath, 2012). Les espaceurs sont issus d'ADN
exogène, généralement de plasmides ou d'ADN de phage (proto-espaceurs) (Garneau et al., 2010).
Contrairement aux mécanismes décrits précédemment, le système CRISPR-Cas constitue une immunité
dite adaptative. L'incorporation de ces espaceurs, dans la majorité des cas en 5' du locus (près de la région
leader), constitue la première étape du système appelé l'adaptation (Fineran et Charpentier, 2012). La
deuxième étape est la synthèse du transcrit ARN pré-crispr qui sera plus tard coupé et maturé par
certaines protéines Cas (Terns et Terns, 2011). Les transcrits d'ARNcr sont utilisés dans la reconnaissance
de séquence complémentaire (proto-espaceur) ainsi que la coupure de ces ARN exogènes (étape
d’interférence). Les systèmes CRISPR-Cas sont présentement séparés en trois types et en 10 subdivisions
en fonction notamment de leur séquence répétée et des protéines Cas (Makarova et al., 2011). Les
systèmes CRISPR-Cas de types I et II ont besoin d'une séquence PAM (motif adjacent au proto-espaceur)
(Mojica et al., 2009). Cette séquence est importante pour l'efficacité du système contre les phages (Deveau
et al., 2008). La figure 1.7. démontre les différentes étapes des systèmes CRISPR-Cas : l'adaptation,
synthèse de l’ARN pré-cr et l'interférence.
Figure 1.7. Mode de fonctionnement des systèmes CRISPR-Cas. Figure tirée de (Wiedenheft et al., 2012).
20
Les phages peuvent contourner ce type de système de résistance par différentes stratégies fort
intéressantes. De façon similaire à d'autres stratégies décrites plus tôt, le phage peut acquérir une
résistance par mutation ponctuelle. Celle-ci peut être retrouvée dans la séquence PAM ou directement
dans le proto-espaceur, inhibant ainsi l'interférence (Deveau et al., 2008). Cette stratégie est toutefois peu
efficace considérant le nombre très élevé de proto-espaceurs, et la distribution quasi complète de ceux-ci
sur le génome phagique (Deveau et al., 2008). Il a été décrit récemment que certains phages tempérés
infectant le pathogène Pseudomonas aeruginosa possèdent des gènes anti-crispr dont les protéines agiraient
au niveau du complexe d'interférence (Bondy-Denomy et al., 2013). De plus, des analyses bio-
informatiques suggèrent que ces gènes pourraient être facilement transférés horizontalement puisqu'on
les retrouvent sur des éléments d’ADN mobiles putatifs (Bondy-Denomy et al., 2013).
Tout récemment, Seed et al. ont démontré la présence d'un système CRISPR-Cas fonctionnel chez un
phage de Vibro cholerae (Seed et al., 2013). Ce dernier cible le «phage-inducible chromosomal island-like
element » (PLE) qui procure normalement une résistance phagique (Seed et al., 2013).
4. Avortement de l'infection (Abi)
Malgré la panoplie de systèmes antiphages décris, et leur rapidité d'adaptation, les phages trouvent
toujours un moyen de les contourner et de se répliquer. Pour cette raison, les bactéries possèdent
également des systèmes de résistance de « dernière chance » connus sous le nom de mécanismes
d’avortement de l'infection (Abi). Contrairement aux systèmes décrits plus tôt, les Abis causent la mort
bactérienne des cellules infectées et de cette façon préviennent la réplication et dissémination des phages.
Outre la mort cellulaire, les Abis peuvent être identifiés par une diminution de l’efficacité à former des
plages de lyse (EOP) et une diminution de la taille de ces plages (Josephsen et Neve, 2004). Jusqu'à
présent, très peu d'Abis ont été caractérisés en détail dans la littérature.
Chez E. coli, on retrouve le système à deux composantes Rex dont les gènes (rexA et rexB) sont retrouvés
sur le prophage de souches lambda-lysogéniques (Molineux, 1991). La protéine RexA joue un rôle dans
la reconnaissance de l'infection virale en identifiant la présence d'un complexe d'ADN-protéines comme
intermédiaires de réplication ou de recombinaison durant l’infection (Snyder, 1995). Une fois reconnu, le
senseur (RexA) active le régulateur de réponse (RexB). RexB est une protéine transmembranaire formant
des canaux ioniques qui mènent à la perte du potentiel membranaire et à l’abaissement du niveau d'ATP
(Snyder, 1995). Fait intéressant, cette protéine (RexB) permet également d'inhiber l'activité des systèmes
toxine-antitoxine Phd-Doc et MazEF, contrôlant ainsi directement la survie bactérienne (Engelberg-
Kulka et al., 1998). Les phages pouvant contourner le système Rex possèdent une mutation dans le gène
21
motA, un coactivateur transcriptionnel qui agit sur la dépolarisation de la membrane en modifiant l'affinité
de l'ARN polymérase bactérienne (Hinton, 2010).
Le système d'exclusion T7 dépendant du plasmide F utilise une stratégie similaire pour le contrôle de
l'infection virale. En effet, une suite d'événements mène à l'altération de la perméabilité membranaire, ce
qui cause une perte d’ATP (Schmitt et al., 1991). De plus, ce système affecte significativement la synthèse
des macromolécules ainsi que l'injection du génome virale (Molineux, 1991; García et Molineux, 1995).
Chez le phage T7, les protéines issues des gènes gp1.2 et gp10 (impliquées respectivement dans le contrôle
de l'énergie lors du cycle de réplication et la synthèse de la protéine majeure de capside) sont séquestrées
par l'interaction avec la protéine membranaire de l'hôte PifA (Condreay et Molineux, 1989; Nakai et
Richardson, 1990). Des mutations dans ces gènes viraux peuvent permettre de contourner la résistance
(Molineux, 1988). Il a aussi été démontré qu'une protéine transmembranaire de l'hôte (FxsA) peut inhiber
l'efficacité du système en interagissant directement avec PifA (Wang et al., 1999; Cheng et al., 2004).
Toujours chez E. coli, les systèmes Abi PrrC et Lit/Gol sont également bien caractérisés. Ceux-ci agissent
par l'inhibition de la machinerie traductionnelle afin de prévenir l'infection par les phages (Uzan et Miller,
2010). La protéine PrrC permet la coupure de l'ARN de transfert Lysine (ARNt Lys) en ciblant sa région
anticodon, prévenant ainsi la synthèse de protéines chez les phages sans polynucléotides kinase ou ARN
ligase comme T4 (Snyder, 1995). L'activité de PrrC est régulée par l'association d'une enzyme de
restriction « prrD-encoded restriction enzyme », dont le gène est d'ailleurs retrouvé dans la même cassette
génétique (Snyder, 1995). Le peptide Stp permet la déstabilisation de l'interaction, le relâchement de PrrC,
et donc l'avortement de l'infection virale (Snyder, 1995; Uzan et Miller, 2010).
Le système Lit/Gol implique le gène lit retrouvé sur le prophage défectueux e14 intégré dans le génome
de la souche E. coli K12 (Hill et al., 1989b). Ce gène code pour protéine (Lit) possédant un domaine
métalloprotéinase zinc dépendant qui, une fois activé, coupe le facteur d'élongation EF-Tu dans une
région conservée chez la bactérie et même chez l'humain (Bergsland et al., 1990; Yu et Snyder, 1994;
Georgiou et al., 1998). Le peptide viral Gol, présent dans la protéine majeure de capside, permet
l’activation de Lit (Bingham et al., 2000). La modification de certains acides aminés clés permet de prévenir
l'interaction, toutefois une activité résiduelle est observable à haute concentration protéique (Georgiou et
al., 1998).
22
Systèmes d'avortement de l'infection chez L. lactis
Jusqu'à présent, un nombre impressionnant de 23 Abis ont pu être identifiés dans différentes souches de
L. lactis (Chopin et al., 2005; Durmaz et Klaenhammer, 2007; Holubova et Josephsen, 2007; Haaber et al.,
2008). Un résumé de ces Abis est présenté dans le tableau 1.3.
Tableau 1.3. Regroupement des mécanismes Abi de lactocoques. Adaptée de (Chopin et al., 2005).
Abi Nombres
d’ORF
Localisation Efficacité anti-phage
Cible de l’activité anti-phage Références
AbiA
1
Plasmide pTR2030 936, c2,
P335 Réplication de l’ADN
(Hill et al., 1989a; Dinsmore et Klaenhammer,
1994; Dinsmore et al., 1998; Tangney et Fitzgerald, 2002a)
AbiB 1 Chromosome
L. lactis IL416
936 Transcription des gènes
(Cluzel et al., 1991; Parreira et al., 1996)
AbiC 1 Plasmide pNT20 936, P335 Tardif*
(Durmaz et Klaenhammer, 2007)
AbiD 1 Plasmide pBF61 936, c2 Tardif
(McLandsborough et al., 1995)
AbiD1 1 Plasmide pIL105 936, c2 Tardif (Anba et al., 1995; Bidnenko et al., 1995)
AbiE 2 Plasmide pNP40 936, P335 Tardif
(Garvey et al., 1995; Tangney et Fitzgerald, 2002b; Dy et al., 2014)
AbiF 1 Plasmide pNP40 936,c2 Réplication de l’ADN
(Garvey et al., 1995; Rince et al., 2000; Tangney
et Fitzgerald, 2002b)
AbiG 2 Plasmide conjugatif pCI750
936,c2 Tardif (O'Connor et al., 1996; Tangney et Fitzgerald, 2002b)
AbiH 1 Plasmide pLDP1 936, c2 -
(Prévots et al., 1996)
AbiI 1 Plasmide pND852
936,c2 Tardif
(Su et al., 1997)
AbiJ 1 Plasmide pND859
936 -
(Deng et al., 1997)
AbiK 1 Plasmide pSRQ800
936, c2, P335
Réplication de l’ADN (P335)
Tardif (936)
(Emond et al., 1997; Boucher et al., 2000; Bouchard et Moineau, 2004; Fortier et al., 2005;
Wang et al., 2011)
AbiL 2 Plasmide pND861 936, c2 Tardif
(Deng et al., 1999)
AbiN 1 Chromosome L. lactis S114 (prophage)
936, c2 -
(Prévots et al., 1998)
*Tardif : Agit au niveau de la traduction, de l’encapsidation ou de la lyse bactérienne.
23
Tableau 1.3.-Suite. Regroupement des mécanismes Abi de lactocoques. Adaptée de (Chopin et al., 2005).
Abi Nombres
d’ORF
Localisation
Efficacité anti-phage
Cible de l’activité anti-phage
Références
AbiO
1
Plasmide pPF44 936, c2 -
(Prévots et al., 1998)
AbiP 1 Plasmide pIL2614 936 Transcription des gènes Tardif
(Domingues et al., 2004b)
AbiQ 1 Plasmide pSRQ900
936, c2 Tardif
(Emond et al., 1998; Samson et al., 2013a)
AbiR
4 Plasmide pKR223 936, c2 Réplication de l’ADN (Twomey et al., 2000; Yang et al., 2006)
AbiS Structure d’ADN
Plasmide pAW601 936 Tardif (Josephsen et Neve, 2004; Holubova et Josephsen, 2007)
AbiT 2 Plasmide pED1 936, P335 Réplication de l’ADN
Tardif (Bouchard et al., 2002; Labrie et al., 2012)
AbiU 2 Plasmide pND001 936, c2, P335
Transcription des gènes
(Dai et al., 2001)
AbiV 1 Chromosome L. lactis MG1363
936, c2 Transcription des gènes
(Haaber et al., 2008)
AbiZ 1 Plasmide pTR2030 P335 Tardif
(Durmaz et Klaenhammer, 2007)
*Tardif : Agit au niveau de la traduction, de l’encapsidation ou de la lyse bactérienne.
Les systèmes Abi agissent à différents moments du cycle de réplication phagique et font intervenir
majoritairement un seul gène bien que certains impliquent deux (AbiE, AbiG, AbiL, AbiT et AbiU) ou
même quatre gènes (AbiR) (Dai et al., 2001; Chopin et al., 2005; Yang et al., 2006). La majorité des gènes
abi sont présents sur des plasmides alors que quelques exceptions se retrouvent sur le chromosome
bactérien (AbiB, AbiN et AbiV) (Parreira et al., 1996; Prévots et al., 1998; Haaber et al., 2008).
Il est intéressant de constater qu’environ 75% de ces systèmes possèdent une activité contre au moins
deux groupes prédominant de phages, et que quatre d’entre eux (AbiA, AbiG, AbiK et AbiU) agissent
contre les trois groupes (Chopin et al., 2005). Malgré l’efficacité de ces Abis, la plupart d’entre eux n’ont
été caractérisés qu’au niveau de leur effet sur la réplication des phages et très peu sont décrits au niveau
de leur mode d’action moléculaire. Les systèmes AbiA, AbiF et AbiR préviennent la réplication de l’ADN
viral alors que AbiB, AbiU et AbiV agissent sur la transcription des gènes. D’autres mécanismes, qui sont
dit tardifs, agissent lors d’étapes subséquentes à la réplication et/ou la transcription de l’ADN viral (AbiC,
AbiD, AbiD1, AbiE, AbiI, AbiL, AbiQ, AbiS et AbiZ). De leur côté, AbiG, AbiK, AbiP et AbiT semblent
agir à des moments différents dépendamment du groupe de phages (Josephsen et Neve, 2004; Chopin et
24
al., 2005). La différence entre le mode d’action des mécanismes est bien supportée par l’hétérogénéité des
protéines Abi (Chopin et al., 2005). Quelques liens peuvent tout de même s’établir entre différents
Abis soit par leur thermosensibilité, la toxicité des protéines, la présence d’éléments d’ADN mobiles près
des gènes abi et/ou l’influence du nombre de copies de plasmide sur l’efficacité du système (Josephsen et
Neve, 2004). Parmi les 23 mécanismes chez L. lactis, certains ont été d’avantages étudiés et sont présentés
ici.
AbiA
Le système AbiA, anciennement Hsp, fut le premier Abi de Lactococcus lactis découvert et caractérisé (Hill
et al., 1989a). Ce dernier confère une résistance en prévenant la réplication de l’ADN viral (Hill et al.,
1991). Des études sur AbiA ont mis en évidence la présence d’un motif hepta leucines (rappelant les
structures de fermeture éclair à leucine) dans la protéine ABIA (Dinsmore et al., 1998). Il a été démontré
que cette structure est essentielle à l’activité anti-phage. Une mutation faux sens affectant l’hydrophobicité
de la structure leucine ou l’hélice α prédite, réduit ou élimine complètement l’inhibition de l’infection
(Dinsmore et al., 1998). Les phages peuvent également contourner l’activité d’AbiA soit par mutation
ponctuelle dans un gène clé (orf245 du phage φ31) ou par la présence d’une séquence spécifique de 118
nt entouré d’extrémités répétées et inversées (Dinsmore et Klaenhammer, 1997). D’un point de vue
industriel, il est intéressant de constater que ce système est efficace contre les trois groupes de phages
prédominents et qu’il peut aussi être transféré dans la bactérie Streptococcus thermophilus qui est également
fréquemment utilisée par l’industrie laitière (Tangney et Fitzgerald, 2002a).
AbiD1
L’étude des phages résistants au mécanisme AbiD1 a permis d’identifier des gènes médians (M-opéron,
orf1-4) du phage bIL66 important dans l’activation du mécanisme. Une mutation ponctuelle dans le gène
orf1 permet d’éliminer l’activité anti-phage (Bidnenko et al., 1995). Lors d’une infection, la protéine ORF1
du phage bIL66 se lie à la région initiatrice de traduction et active la traduction du transcrit d’abiD1 qui
lui cause la diminution du transcrit de l’orf3 du même phage (Bidnenko et al., 1995). Ce gène orf3 code
pour un homologue de la résolvase RuvC d’E. coli qui est essentiel à la réplication et la maturation de
l’ADN viral (Bidnenko et al., 1998; Curtis et al., 2005; Bidnenko et al., 2009). À noter que la baisse de
température peut activer ce mécanisme, et ce indépendamment d’une infection phagique (Bidnenko et al.,
2009).
25
AbiK
Le système AbiK possède une activité contre les trois espèces de phages de lactocoques prédominents
dans l’industrie laitière (c2, 936 et P335). Toutefois, son efficacité est très grande uniquement contre les
phages des groupes 936 et P335 (Emond et al., 1997). Le mode d’action d’AbiK serait différent selon le
groupe de phages ciblé. En effet, AbiK inhiberait la réplication (P335) ou la maturation de l’ADN viral
(936) (Boucher et al., 2000). L’activité d’AbiK est dépendante de la présence d’une protéine virale (SaK)
qui est homologue aux protéines d’appariement à l’ADN simple brin (SSAP) (Bouchard et Moineau,
2004). L’extrémité N-ter de SaK permettrait la liaison/appariement à l’ADN et l’extrémité C-ter
permettrait pour sa part la liaison à un partenaire, probablement AbiK (Scaltriti et al., 2010). Des études
récentes ont démontré qu’AbiK possède un domaine de transcriptase inverse actif in vitro polymérisant
des fragments aléatoires d’ADN et suggèrent que la résistance virale serait causée par ces fragments
(Fortier et al., 2005; Wang et al., 2011). Les fragments d’ADNc synthétisés permettraient de séquestrer les
transcrits d’ARN, et du même coup leur traduction en protéines (Fortier et al., 2005). Des analyses in sillico
suggèrent que les protéines ABIK et ABIA pourraient appartenir au même groupe en raison de leur
similarité au niveau de la composition en acides aminés, de leur activité sur la réplication/maturation de
l’ADN et de la présence d’un motif de transcriptase inverse (Emond et al., 1997).
AbiP
Rappelant le système AbiD1, l’expression d’abip est augmentée lors de l’infection par le phage bil66M1
(Domingues et al., 2004a). Dans les cellules AbiP+, l’ADN cesse d’être synthétisé à 10 minutes post-
infection. Ce phénotype serait causé par l’arrêt de transcription des gènes précoces ainsi que par
l’accumulation de ces transcrits précoces dans la cellule. Cette modification du contrôle temporel stagne
du même coup la transcription des gènes médians et tardifs (Domingues et al., 2004a).
Aucun phage résistant n’a pu être isolé avec le phage bil66M1, probablement en raison de la trop grande
efficacité du système. Toutefois, la co-infection avec le phage homologue biL170 (AbiPR) a permis
d’obtenir un phage résistant au système suite à une recombinaison homologue entre les deux (Domingues
et al., 2004b). L’analyse des séquences, ainsi qu’un test de complémentation, a mis en évidence le rôle du
produit du gène biL170e6 (pas d’homologue chez bil66M1) dans la résistance à AbiP (Domingues et al.,
2004b). Des études plus récentes ont démontré que la protéine AbiP est ancrée à la membrane via son
motif transmembranaire situé en N-terminal. En C-terminal, il y a un domaine de liaison aux acides
nucléiques qui lit préférentiellement l’ARN puis l’ADNsb respectivement (Domingues et al., 2008). La
séquestration de ces molécules conduirait au phénotype AbiP+ observé. Les auteurs ont également mis
en évidence que la localisation à la membrane ainsi que l’activité de liaison aux acides nucléiques sont
toutes deux essentielles à l’activité complète du système anti-phage (Domingues et al., 2008).
26
AbiR
Le système AbiR agit en réduisant significativement la réplication de l’ADN viral (Twomey et al., 2000).
L’opéron AbiR est composé de trois gènes ainsi que le gène LlaKR21 qui code pour une méthylase
(Twomey et al., 2000). Cette méthylase ne jouerait pas le rôle de protecteur contre une enzyme de
restriction, mais serait plutôt impliquée dans la régulation du cycle cellulaire en méthylant l’ADN de l’hôte
spécifiquement à la séquence GATC (Yang et al., 2006). Ce système est un bel exemple de coévolution
entre les systèmes anti-phages (R/M et Abi).
AbiS
Contrairement aux autres Abi, le système AbiS n’implique pas un gène, mais plutôt des séquences non
codantes répétées possédant un haut niveau d’identité avec les sites cos des phages du groupe 936
(Josephsen et Neve, 2004; Holubova et Josephsen, 2007). Le mode d’action reste toutefois mal compris.
AbiT
Le système AbiT fait intervenir deux gènes (AbiTi et AbiTii) qui sont co-transcrits et seraient activé par
le produit d’un gène viral tardif qui conduit ensuite à une mort cellulaire rapide. Plus précisément,
l’activation du système prévient la maturation de l’ADN viral et ainsi son accumulation sous forme
concatémérique dans le cytoplasme (Bouchard et al., 2002). De plus, le système AbiT semble spécifique
puisqu’il bloque la synthèse de la capside protéique sauf si ces gènes viraux sont mutés (Labrie et al.,
2012).
AbiV
Le système AbiV agit tardivement au cours du cycle viral. En effet, la transcription et traduction des gènes
précoces sont exécutés normalement. Toutefois, il y a diminution significative des transcrits médians
(50%) et tardifs (10%). Cela serait une conséquence directe de l’activité anti-synthèse du système AbiV
(Haaber et al., 2008). L’activité ou l’activation du mécanisme est dépendante de la protéine phagique SaV
(ORF26 de p2). Il est d’ailleurs intéressant de constater que tous les phages sensibles analysés possèdent
un gène homologue SaV et que tous les résistants analysés n’en possèdent pas (Haaber et al., 2009). Cette
protéine aux fonctions inconnues est toxique chez E. coli et L. lactis, démontrant un effet antibactérien
rapide (Haaber et al., 2009). Il a aussi été montré que SaV forme un complexe (2 : 2) avec AbiV en solution
(Haaber et al., 2010). L’hypothèse actuelle suggère qu’une petite quantité de SaV serait produite
rapidement au début de l’infection et forme un complexe actif avec AbiV, inhibant la machinerie
traductionnelle de la cellule (Haaber et al., 2010).
27
AbiZ
AbiZ est le seul système connu qui agit au niveau de la lyse cellulaire. En effet, la protéine AbiZ interagit
de manière indirecte avec la holine d’un phage afin de causer une lyse prématurée (Durmaz et
Klaenhammer, 2007). La liaison se ferait directement au niveau de la membrane puisque deux hélices
transmembranaires ont été prédites dans la structure secondaire d’AbiZ (Durmaz et Klaenhammer,
2007). La sensibilité au mécanisme AbiZ est, du moins en partie, déterminée par l’expression de gènes
précoces et/ou médians (Durmaz et Klaenhammer, 2007).
Systèmes toxine-antitoxine (TA)
Tout comme les Abis, les systèmes toxine-antitoxine (TA) constituent des systèmes bactériens de mort
cellulaire programmée (PDC), de façon similaire aux systèmes apoptotiques chez les eucaryotes (Bayles,
2014). Depuis 2009, certains Abi ont d’ailleurs été identifiés comme étant des systèmes toxine-antitoxine,
et vice-versa (Fineran et al., 2009; Samson et al., 2013c; Dy et al., 2014).
Les systèmes TA sont composés d’une toxine et d’une antitoxine qui sont généralement retrouvées sur
un même opéron (Yamaguchi et al., 2011). Le rôle premier de l’antitoxine est simple; réguler l’activité
toxique de la toxine. Les TAs sont actuellement classés en cinq types selon le mode de régulation de la
toxine (figure 1.8.). En condition de stress, il y a une déstabilisation au niveau de cette régulation ce qui
libère la toxine et mène éventuellement à un arrêt de la croissance bactérienne. L’antitoxine est souvent
moins stable que la toxine alors elle doit être produite constitutivement (Yamaguchi et Inouye, 2009;
Yamaguchi et al., 2011). Également, le ratio toxine/antitoxine est primordial pour l’activité des systèmes
TA. D’ailleurs, les antitoxines, ainsi que certains complexes toxine/antitoxine, peuvent autoréguler leur
opéron pour assurer une régulation adéquate (Yamaguchi et al., 2011). Le gène antitoxique est
normalement retrouvé en amont du gène toxique, permettant ainsi une transcription plus efficace de
l’antitoxine. Toutefois, l’ordre des gènes de certains couples TA sont inversés. Ils peuvent alors utiliser
des stratégies alternatives comme la présence de deux promoteurs (Tian et al., 1996) ou la
présence/absence d’un RBS efficace pour réguler la traduction des protéines (Heaton et al., 2012).
28
Figure 1.8. Schéma des cinq types de systèmes toxine-antitoxine. Adaptée de (Yamaguchi et al., 2011).
Les gènes codant pour des TAs peuvent être chromosomiques, plasmidiques ou retrouvés sur un
prophage (Yamaguchi et al., 2011). Ils sont très diversifiés et impliquent une panoplie de mode d’action
différent de toxicité pour leur toxine : liaison à l’ARNtfmet, liaison à la sous-unité ribosomal 30s ou 50s,
phosphorylation du facteur d’élongation EF-tu, prévention de la formation de la paroi cellulaire,
induction d’une perte de potentiel membranaire en formant des pores dans la membrane interne ou une
interférence avec les ARNm (Yamaguchi et Inouye, 2009; Yamaguchi et al., 2011; Unterholzner et al.,
2013). Les systèmes TA ont une importance capitale au niveau de la cellule. Plusieurs fonctions ont été
associées à ces systèmes au cours des dernières années. Ils sont impliqués entre autres dans la stabilisation
des éléments d’ADN mobiles, la protection contre les phages, la formation de cellules persistantes, la
formation de biofilm et dans la régulation globale bactérienne (Magnuson, 2007; Fineran et al., 2009;
Lewis, 2010; Maisonneuve et al., 2011; Wang et Wood, 2011; Unterholzner et al., 2013).
29
Le système TA CcdA/CcdB fut le premier découvert il y a 30 ans. Ce TA permet d’augmenter la stabilité
d’un plasmide par mortalité post-ségrégationnelle (PSK) (Ogura et Hiraga, 1983). La perte du plasmide
ne permet plus la transcription de l’antitoxine (labile) et laisse la toxine (plus stable) non régulée ce qui
cause l’arrêt de croissance cellulaire. Aujourd’hui, plus de 1 000 modules TA ont été identifiés par analyse
bio-informatique (Pandey et Gerdes, 2005; Fozo et al., 2010; Blower et al., 2012b; Sberro et al., 2013). Ces
systèmes ont été identifiés chez les bactéries, les archées et même chez les eucaryotes (Gerdes et al., 2005;
Pandey et Gerdes, 2005; Blower et al., 2012b; Satwika et al., 2012). Les caractéristiques spécifiques des
cinq types de système TA sont présentées dans les paragraphes suivants.
TA de type I
Sauf une exception, les toxines de type I sont des peptides hydrophobes entre 20-60 acides aminés (Fozo
et al., 2008). Elles contiennent une structure en hélice alpha leur permettant une localisation dans la
membrane interne et/ou liaison avec des protéines s’y trouvant (Fozo et al., 2008). De manière similaire
à une holine phagique, la toxine contribuerait à la perméabilisation de la membrane en y créant des trous,
à la perte du potentiel membranaire, à l’arrêt de synthèse d’ATP et subséquemment à l’inhibition de la
réplication, transcription et traduction dans la cellule (Yamaguchi et al., 2011). Cette activité toxique est
régulée par un ARN antisens (antitoxine) présent sur le brin complémentaire qui, par une portion
chevauchante en 3’ ou 5’, permet l’inhibition de la traduction ou la dégradation de l’ARNm toxique suite
à la formation d’un dimère ARN/ARNm (Gerdes et Wagner, 2007; Fozo et al., 2008).
Le système Hok/Sok fut le premier TA de type I à être identifié et caractérisé. Tout d’abord isolé du
plasmide R1 chez E. coli, il a également été retrouvé sur le plasmide F et dans le chromosome de souches
d’E. coli (Gerdes et al., 1985; Pedersen et Gerdes, 1999). Ce TA est un système à trois composantes,
incluant les gènes hok (code pour la toxine), mok (ARN chevauchant essentiel à la traduction de hok) et
sok (ARN antisens antitoxique). L’ARNm hok pleine longueur est retrouvé sous une forme inactive, de
par son autorepliement liant ses extrémités 5’ et 3’, et son activation est due à l’action d’une ARNase II
et d’une polyribonucléotide nucléotide transférase (Thisted et al., 1994; Gerdes et Wagner, 2007). L’ARN
sok peut se lier à cette forme tronquée (mature) pour former un duplex d’ARNdb par une extrémité
chevauchante dans la région promotrice (Franch et al., 1997; Gerdes et Wagner, 2007). Ceci a pour effet
de réguler la traduction de Hok par l’intermédiaire de la traduction de Mok, en plus de dégrader l’ARNm
hok suite au recrutement de l’ARNase III (Gerdes et al., 1992; Thisted et Gerdes, 1992; Thisted et al.,
1994). Lors d’un stress, l’arrêt de la transcription de l’antitoxine (demi-vie de 30 secondes) permet la
traduction de la toxine Hok (demi-vie de l’ARNm du gène hok de 20 minutes) et mène à la mort cellulaire
en affectant l’intégrité de la membrane (Gerdes et al., 1986; Gerdes et al., 1990).
30
Le système SymE/SymR présente, tout comme Hok/Sok, une régulation multiple de la toxine en
condition normale. L’antitoxine SymR agit au niveau transcriptionnel en se liant au RBS et au ATG de
départ de l’ARNm de SymE. De plus, l’activité de la protéase Lon permet de couper SymE en cas de
fuite d’expression, ce qui constitue un mode de régulation encore plus efficace (Kawano et al., 2007). Au
départ, l’expression de SymE (toxine) est régulée par l’induction de la réponse SOS via un site de liaison
à LexA situé dans le promoteur (Kawano et al., 2007). Ce système jouerait un rôle dans la réutilisation
d’énergie/métabolites par dégradation d’ARN cellulaire en condition de stress (Kawano et al., 2007). De
manière similaire, le système chromosomique TisB-IstR-1 est inductible à la réponse SOS (Gerdes et
Wagner, 2007). Le mode de régulation est toutefois davantage similaire à Hok/Sok. En condition
normale, l’ARN pleine longueur tisB-IstR-1 (peu transcrite) est d’abord maturé par une ARNase et forme
un ARNdb avec l’antitoxine IstR-1 (toxine) qui sera dégradée par l’ARNase III bactérienne (Vogel et al.,
2004; Gerdes et Wagner, 2007). La toxine n’est pas traduite, évitant ainsi l’arrêt de la croissance par une
attaque à la membrane. Il a été démontré que ce système joue un rôle dans la persistance cellulaire,
toutefois le mode d’action complet reste nébuleux (Dörr et al., 2010).
Bien que la majorité des TAs aient été isolés chez E. coli, il existe plusieurs systèmes qui ont été caractérisés
chez d’autres organismes (Fozo et al., 2008). À titre d’exemple, le système TA TxpA-RatA provient de la
bactérie à Gram positif Bacillus subtilis et ces gènes sont retrouvés sur un prophage défectif (skin). Il a été
suggéré que la toxine agirait de façon similaire à certaines protéines de phage qui endommagent l’intégrité
de la membrane, et inhibent la synthèse de la paroi cellulaire (Silvaggi et al., 2005).
TA de type II
Les systèmes toxine-antitoxine de type II sont de loin les plus nombreux et les mieux caractérisés (Gerdes
et al., 2005). En condition normale, la régulation de la toxine survient suite à la liaison directe de
l’antitoxine protéique à son site actif ou provoque un changement conformationnel inhibant son activité
toxique (Gerdes et al., 2005). La majorité des systèmes ont des protéines de point isoélectrique (pI) opposé
(Toxine↑, Antitoxine↓) ce qui favorise la formation du complexe de régulation (Yamaguchi et Inouye,
2009). Ce même complexe permet ensuite l’autorégulation du système en liant une séquence
palindromique du promoteur, ou l’opérateur, via un site de liaison à l’ADN présent dans l’antitoxine
(Overgaard et al., 2009; Moreno-Córdoba et al., 2012). Il est à noter que de nombreuses structures de
liaison à l’ADN ont été identifiées parmi les différentes antitoxines (Gerdes et al., 2005). En condition de
stress, les protéases cellulaires (Lon et Clp) dégradent l’antitoxine en ciblant vraisemblablement une
région désordonnée (flexible), permettant ainsi de libérer la toxine (Aizenman et al., 1996; Hansen et al.,
2012). Des analyses de structure ont permis de démontrer que cette région flexible est stabilisée lors de
la formation du complexe (Kamada et al., 2003; Yamaguchi et al., 2011; Hansen et al., 2012). Outre la
surexpression des protéases, d’autres phénomènes permettent d’inhiber la régulation de la toxine : Perte
31
de séquence régulatrice par ségrégation, diminution de la transcription et/ou traduction de l’antitoxine,
modification du ratio toxine/antitoxine par l’activation de d’autres TA, mutations ponctuelles et
recombinaison (Magnuson, 2007). Chez les systèmes de type II, plusieurs cibles de toxines ont été
identifiées. Toutefois, la majorité de ces systèmes agissent en interférant avec l’ARNm de différentes
façons.
Le système relBE agit en ciblant les ARNm en position A dans la sous-unité 30S des ribosomes (Hayes
et Sauer, 2003; Griffin et al., 2013). La toxine relE est une endoribonucléase qui coupe spécifiquement, et
en ordre d’importance, aux codons stop UAG, UAA et UGA in vitro. Elle coupe également avec la même
incidence que UAG, aux codons CAG et UCG (Pedersen et Gerdes, 1999). In vivo, cette même toxine
permet plutôt une coupure en 5’ de l’ARNm indépendamment du ribosome, et ce sans spécificité liée
aux codons (Hurley et al., 2011). L’opéron est régulé par l’antitoxine relB seul ou en complexe avec relE,
liant l’opérateur directement (Overgaard et al., 2008). Des systèmes relBE-homologues sont présents dans
plusieurs organismes procaryotes (Christensen et Gerdes, 2003). Fait intéressant, la toxine induit
l’apoptose dans les cellules humaines, démontrant le large spectre d’action de ce système (Yamamoto et
al., 2002; Yamaguchi et al., 2011).
Le système Phd-doc provient du prophage P1 extrachromosomique. Il permet également l’inhibition de
la traduction en liant une sous-unité ribosomale (30S), toutefois sans coupure (Liu et al., 2008). Une étude
récente a démontré que la toxine Doc est une kinase qui phosphoryle le facteur d’élongation EF-Tu et la
GTPase à un site bien précis, permettant de bloquer la traduction (Cruz et al., 2014). La toxine HipA est
aussi une kinase qui s’autophosphoryle (Correia et al., 2006) et phosphoryle le facteur EF-Tu (Hansen et
al., 2012). Une autre étude récente a également démontré que HipA mène à l’accumulation d’ARNtglu
non chargé dans la cellule par phosphorylation dans le site de liaison à l’ATP (Kaspy et al., 2013). En
absence d’antitoxine HipB, la toxine inhibe la synthèse protéique par phosphorylation de ces cibles.
Pour le système ωεζ isolé de Streptococcus pyogenes, la toxine (ζ) est une kinase qui phosphoryle le
diphosphate-N-acétylglucosamine (UNAG) (Mutschler et al., 2011). Cela entraine l’inhibition de la
synthèse de la paroi et éventuellement provoque l’autolyse (Mutschler et al., 2011). L’activité toxique du
système est même conservée chez Saccharomyces cerevisiae (Zielenkiewicz et al., 2009) puisque l’UNAG
représente un substrat essentiel pour cet organisme (Durand et al., 2008). Outre la toxine, le système
contient l’antitoxine (ε) et un régulateur de transcription (ω).
Contrairement aux systèmes décris plus haut, certains TA provoquent l’interférence de l’ARNm
indépendamment du ribosome, en coupant des séquences spécifiques (Yamaguchi et al., 2011). Le système
MazEF de E. coli fut le premier du genre à être isolé et caractérisé (Aizenman et al., 1996). La toxine MazF
possède une activité endoribonucléase qui clive spécifiquement l’ARN en 3’ dans les régions ACA (Zhang
32
et al., 2003). En condition normale, cette toxine forme un complexe MazF2-MazE2-MazF2 qui inhibe sa
toxicité (Kamada et al., 2003). De plus, le gène de la toxine MazF (9 ACA) contient plus de sites de
coupure que MazE (2 ACA) ce qui permet une régulation également au niveau transcriptionnel
(Marianovsky et al., 2001; Zhang et al., 2003). En absence de l’antitoxine (MazE), la toxine joue un rôle
global en ciblant la majorité des ARNm due au nombre élevé de séquence ACA dans le génome
(Yamaguchi et Inouye, 2009). Cette activité mène à un état de dormance, jusqu’au point de non-retour et
la mort programmée (Zhang et al., 2003; Kolodkin-Gal et Engelberg-Kulka, 2008). Cet état serait causé
par un peptide associé au quorum-sensing nommé facteur extracellulaire de mort (EDF) (Kolodkin-Gal
et al., 2007).
Plusieurs protéines homologues à MazF ont été identifiées, et ce chez plusieurs organismes (Yamaguchi
et al., 2011). Leur séquence de coupure est de 3, 5 ou 7 bases et leur localisation peut permettre la
régulation de gènes spécifiques, dépendamment du système (Yamaguchi et al., 2011). Parmi eux, le système
MazEF-mx (Mycococcus xanthus) est particulier puisque l’antitoxine est encodée près de 4 Mpb plus loin
que la toxine (Nariya et Inouye, 2006; Yamaguchi et Inouye, 2009).
Les systèmes VapBC et RnlA sont également bien caractérisés et utilisent une toxine pourvue d’activité
ARNase indépendante des ribosomes (Gerdes et al., 2005; Otsuka et al., 2007). RnlA-RnalB est un système
anti-phage toxine-antitoxine présent chez E. coli (Koga et al., 2011). La toxine (RnlA) est activée par le
phage T4 et coupe les ARNm du phage tardivement lors de l’infection, bloquant ainsi le cycle de
réplication virale (Koga et al., 2011). Toutefois, le phage en question doit être défectif dans le gène dmd
(régulation de la stabilité des ARNm au cours de l’infection (Kai et Yonesaki, 2002)), celui-ci jouant un
rôle similaire à l’antitoxine dans la régulation de la toxicité de RnlA (Otsuka et Yonesaki, 2012). Pour le
système VapBC et ses homologues, plusieurs cibles différentes ont été identifiées comme la boucle de
l’anticodon de l’ARNtMet pour les bactéries entériques (Winther et Gerdes, 2011) ou une séquence
spécifique dans une structure en épingle à cheveux chez les mycobactéries (McKenzie et al., 2012).
De leur côté, les protéines toxiques CcdB (Système Ccd) et ParE (Système ParDE) inhibent la réplication
de l’ADN en agissant au niveau de l’ADN gyrase soit en stabilisant le lien ADN-gyrase (CcdB et ParE)
(Critchlow et al., 1997) ou par liaison directe à une sous-unité de la gyrase qui prévient la formation de la
forme active (CcdB) (Loris et al., 1999). Aucune similarité de séquence ou structurale n’existe entre les
deux toxines, suggérant un mode d’action différent malgré une cible commune (Jiang et al., 2002). Pour
le système Ccd, la toxine CcdB est régulée directement par l’antitoxine (CcdA) où le ratio influence la
composition du complexe d’inhibition. En excès de CcdA, un complexe tétramériques (2 : 2) permet
l’autorégulation de l’opéron (Afif et al., 2001). Ces ratios sont également essentiels dans la régulation du
système Kid-Kis. En effet, le complexe (Kid2 : Kis2 : Kid2 : Kis2) permet le contrôle de l’expression de
33
l’opéron seulement. Le complexe (Kid2 : Kis2 : kid2) mène plutôt à la neutralisation de la toxine Kid
(Monti et al., 2007). En condition de stress, cette toxine inhibe la croissance cellulaire en interférant avec
les ARNm de par son activité endoribonucléase indépendante du ribosome (Muñoz-Gómez et al., 2005).
TA de type III
Les systèmes toxine-antitoxine de type III sont régulés par un ARN non codant qui inhibe l’activité de la
toxine par interaction directe avec celle-ci. Le système ToxINPa fut le premier à être identifié et a été isolé
du plasmide pECA1039 du phytopathogène Pectobacterium atrosepticum (Fineran et al., 2009). L’opéron est
constitué dans l’ordre d’un promoteur, d’une séquence répétée antitoxique de 5,5 répétitions de 36 nt
(ToxI), d’un terminateur rho-indépendant fuyant, d’un RBS et du gène toxique (toxN) (Fineran et al.,
2009). La protéine toxique ToxN possède une activité endoribonucléase séquence spécifique (85% :
AAA/U, 15% : AAA/G) qui cible des ARNm cellulaires essentiels ainsi que le transcrit de son partenaire
antitoxine (Blower et al., 2011; Short et al., 2013). Les fragments d’ARN maturés (36 nt) interagissent
directement avec la toxine pour la régulation (Blower et al., 2011). Également, la forte affinité qu’a ToxN
pour le fragment complet de ToxI pourrait prévenir la coupure des ARNm cellulaires, simplement en
occupant la toxine à couper son antitoxine (ToxI) (Short et al., 2013). La structure obtenue par
cristallographie démontre que la toxine est régulée par la formation d’un complexe hétéro-hexamère de
forme triangulaire (3ToxI : 3ToxN) (Blower et al., 2011). Cette structure du complexe a également permis
d’identifier une structure en pseudonoeud dans l’ARN ToxI, structure qui s’avère essentielle pour son
activité antitoxique (Blower et al., 2011). De façon similaire au TA type II, le complexe toxine-antitoxine
permet de réguler l’expression de l’opéron (Blower et al., 2009).
Il a été démontré que ce système constitue un système anti-phage de type Abi autant chez P. atrosepticum
que chez E. coli (Blower et al., 2009; Fineran et al., 2009). En présence d’un stress (phage), le complexe
serait déstabilisé permettant à la toxine d’être libre et de cibler les ARNm cellulaires. Dans l’étude du
comportement anti-phage, des phages résistants à ToxIN ont été analysés. Ces expériences ont indiqué
que le phage ΦTE peut contourner ce système via une séquence pseudo-ToxI de 1,5 répétition qui peut
soit être étendu, soit permettre l’acquisition de ToxI par recombinaison avec le plasmide (Blower et al.,
2012a).
Une analyse bio-informatique a permis d’identifier 125 TA de type III potentiel qui se subdivisent en
trois familles (toxIN, tenpIN et cptIN) en fonction de leur identité au niveau de la toxine (Blower et al.,
2012b). Outre ToxINPa, seulement deux autres systèmes type III (famille toxIN) ont été caractérisés au
niveau moléculaire (Blower et al., 2012b; Samson et al., 2013c). ToxINbt, issu d’un plasmide de Bacillus
thuringiensis, possède 2,9 répétitions de 34 nt en amont d’un terminateur, et du gène de la toxine (Fineran
et al., 2009; Short et al., 2013). Il a été démontré que ce système permet la stabilisation des plasmides
34
comme ToxINPa, mais ne semble pas exercer une fonction anti-phage (Short et al., 2013). La résolution
du complexe d’interaction suggère un mode de régulation similaire au système de P. atrosepticum mais avec
des modifications importantes. Des expériences croisées ont démontré que l’antitoxine ToxIPa ne pouvait
inhiber la toxicité de ToxNbt, et vice versa (Short et al., 2013). ToxNbt est une endoribonucléase
reconnaissant les séquences A/AAAA avec une tolérance en position +2 et +4 (Short et al., 2013). Le
système AbiQ de L. lactis appartient également au TA de type III. La protéine ABIQ a 31% d’identité
avec ToxNPa, une valeur similaire à ToxNbt avec 30% (Fineran et al., 2009; Blower et al., 2012b).
TA de type IV
Les systèmes TA type IV ont été découverts récemment et font intervenir une toxine et une antitoxine
de nature protéique. Contrairement aux types II, les antitoxines type IV n’interagissent pas directement
avec la toxine pour la réguler. Elle interagit plutôt avec sa cible prévenant ainsi son activité toxique
(Unterholzner et al., 2013). Le premier système à avoir été décrit est YeeU(CbeA)/YeeV(CbtA). La toxine
YeeV fixe les protéines du cytosquelette MreB (conservation de la forme cellulaire) et FtsZ (formation
de l’anneau Z pour division cellulaire) pour prévenir leur polymérisation (Bi et Lutkenhaus, 1991; Osborn
et Rothfield, 2007; Tan et al., 2011; Masuda et al., 2012b). En contrepartie, l’antitoxine YeeU permet
d’augmenter le regroupement des polymères de ces protéines du cytosquelette, tout en bloquant l’accès
à la toxine (YeeV) (Masuda et al., 2012a). YeeU prévient aussi l’activité toxique de d’autres inhibiteurs
affectant MreB et FtsZ (A22, SulA et MinC) suggérant un rôle global de régulation cellulaire (Masuda et
al., 2012a).
Isolé également de E. coli, le système YgfY(CptB)/YgfX(CptA) est fort similaire à YeeU/YeeV. La
différence majeure est que la toxine est retrouvée au niveau de la membrane où son extrémité C-terminale
interagit avec MreB et FtsZ dans le cytosol (Masuda et al., 2012b). Tout récemment, il a été suggéré que
le système AbiE de Lactococcus lactis serait un autre système toxine-antitoxine de type IV (Dy et al., 2014).
Dans ce cas-ci, la toxine possède une activité NTase GTP-spécifique qui permettrait la guanylation de
constituants cellulaires alors que l’antitoxine permettrait d’éliminer ces groupements GMP nouvellement
ajoutés (Dy et al., 2014). Cette hypothèse reste toutefois à confirmer.
TA de type V
Le système GhoS(YjdK)/GhoT(YjdO) représente actuellement le seul membre du groupe TA type V.
L’antitoxine (GhoS) possède une activité endoribonucléase spécifique à une région riche en U et A,
permettant de couper l’ARNm de la toxine (Wang et al., 2012). Contrairement à ce qui a été reporté
auparavant pour les systèmes TA, cette antitoxine est stable et ne permet pas de réguler la transcription
de l’opéron (Wang et al., 2012). En condition de stress, l’ARNm de l’antitoxine est dégradé par la toxine
MqsR (TA type II) qui coupe spécifiquement aux sites 5’ GCU 3’ retrouvés régulièrement dans
35
l’antitoxine et très peu dans l’ARNm de la toxine (Wang et al., 2013). Lorsqu’elle n’est pas régulée, la
protéine toxique (GhoT) permet la lyse cellulaire de façon similaire aux toxines TA de type I (Cheng et
al., 2013; Wang et al., 2013).
AbiQ
Le mécanisme AbiQ a été isolé d’un plasmide naturel de la bactérie L. lactis W-37 en 1998 et est un des
23 systèmes Abis découvert chez L. lactis (Emond et al., 1998). AbiQ est très efficace contre les groupes
de phages c2 et 936, mais il n’a toutefois pas d’effet sur la réplication des phages du groupe P335. Il a été
mis en évidence que l’ADN viral s’accumule sous forme de concatémères lorsque le mécanisme est actif
(Emond et al., 1998). Ce mécanisme agirait donc tardivement au niveau de la maturation et de
l’encapsidation de l’ADN lors de la réplication des phages.
Tout récemment, il a été démontré qu’AbiQ est un mécanisme toxine-antitoxine de type III (Samson et
al., 2013c). Cette hypothèse a d’abord été envisagée en raison de la structure de l’opéron qui est similaire
aux TA de type III. L’opéron est constitué d’une séquence répétée (antitoxine antiQ) qui est située en
amont d’un terminateur rho-indépendant et du gène toxique (abiQ). L’antitoxine fait 2,8 répétitions de 35
nucléotides et cette séquence est co-transcrite avec le gène abiQ. La protéine toxique (ABIQ) est
constituée de 172 acides aminés et son pI est de 9,62 (Samson et al., 2013c). Dans la banque de données
Uniprot (www.uniprot.org, # Q9ZJ19), les douze premiers résidus n’appartiennent pas à la séquence
réelle de la protéine ABIQ, ils sont plutôt dus à une erreur lors de l’identification de la séquence codante.
Cette protéine possède une activité endoribonucléase qui cible son antitoxine, mais également des ARNm
viraux (Samson et al., 2013a; Samson et al., 2013c).
La toxicité de la protéine ABIQ a ensuite été prouvée par surexpression en utilisant un vecteur constitutif
pour produire l’antitoxine et un vecteur inductible pour la toxine. La même expérience de surexpression
d’AbiQ a aussi démontré que le mécanisme est bactériostatique dans les conditions utilisées (Samson et
al., 2013c). Ceci est surprenant puisque par définition, le phénotype des systèmes Abi est associé à la mort
bactérienne. Il est possible que, tout comme ce qui a été démontré pour les TAs MazEF chez E. coli et
ToxIN de P. atrosepticum, le mécanisme AbiQ soit bactériostatique tant qu’un point de non-retour n’est
pas atteint (Engelberg-Kulka et al., 2006; Fineran et al., 2009). En effet, la présence constante du phage à
l’intérieur de la cellule constituerait un stress d’assez longue durée pour dépasser ce point de non-retour.
Cela se traduirait par la mort bactérienne et l’inhibition de la réplication virale.
36
Il y a 31 % d’identité en acides aminés entre les protéines toxiques ABIQ et ToxNPa, ce qui indique la
proximité entre les deux systèmes (Fineran et al., 2009). ABIQ est formée de six hélices α entourées de
feuillet β antiparallèles à six brins (Samson et al., 2013c). La superposition de la structure d’ABIQ avec
celle de ToxN a permis d’observer des structures similaires entre les deux protéines et suggère qu’ABIQ
serait aussi régulée par un trimère triangulaire 3ABIQ : 3antiQ où la structure en pseudonœud est
essentielle à la régulation du système (Blower et al., 2011; Samson et al., 2013c). Des expériences de
mutagenèse dirigée dans le gène abiQ ont permis d’identifier des sites clés pour l’activité endoribonucléase
et d’autres pour l’activité du mécanisme anti-phage, démontrant que les deux activités ne sont pas
nécessairement liées (Samson et al., 2013c).
Certains lactophages peuvent déjouer ce système anti-phage uniquement via une mutation ponctuelle
dans un de leurs gènes. Pour le siphophage modèle P008, tous les phages résistants qui ont été isolés
contiennent une mutation dans le gène orf38, ou dans son site de liaison au ribosome (RBS). Ces résultats
suggèrent que c’est la protéine ORF38 qui jouerait un rôle important dans l’activité du système anti-phage
AbiQ. Ce gène est essentiel pour le phage, mais sa fonction est encore inconnue (Samson et al., 2013a).
Chez d’autres lactophages, d’autres cibles ont été identifiées, malgré la présence de gènes hautement
similaire à orf38 dans leur génome (Samson et al., 2013a). Ceci est un bel exemple de la complexité du
système AbiQ.
37
Hypothèse de travail
Afin de contrôler les phages dans l’industrie de la transformation laitière, de nombreux systèmes anti-
phages ont été étudiés depuis deux décennies. Ces mêmes études ont également démontré une panoplie
de stratégies virales leur permettant de contourner efficacement ces systèmes. Cette évolution démontre
l’importance de connaitre en profondeur ces systèmes anti-phages afin de les utiliser adéquatement, de
les optimiser et/ou de les combiner pour un effet optimal. Dans le cadre de ce projet de maîtrise, le
mécanisme AbiQ était notre système d’intérêt. En plus de sa forte efficacité anti-phage, AbiQ appartient
au système toxine-antitoxine de type III rendant ainsi doublement intéressant la caractérisation de ce
mécanisme.
Considérant les résultats obtenus préalablement sur AbiQ, nous avons énoncé l’hypothèse suivante pour
expliquer le mode d’action du système : la protéine phagique ORF38 (phage P008) mène à la libération
de la toxine ABIQ suite à sa liaison directe avec les fragments de régulation de la toxine (ARN non codant
antitoxique complet (antiQ) ou antiQ mature (35 nt)). Une fois libre, la toxine (ABIQ) coupe des ARNs
bactériens essentiels avec son activité endoribonucléase et mène à la mort bactérienne, trappant les
nouveaux phages dans la cellule.
Nous avons ciblé notre étude au niveau de la régulation du système et fixé trois objectifs spécifiques afin
de répondre à cette hypothèse. Dans un premier temps, l’identification des points clés de l’antitoxine
antiQ a été réalisée en définissant le site de coupure par ABIQ, mais également l’activité anti-phage et
endoribonucléase pour certains mutants antiQ (ponctuelles et Δ répétitions). Par la suite, nous nous
sommes intéressés au comportement viral et cellulaire en présence du système AbiQ, notamment en
effectuant des courbes de croissance. Finalement, nous avons mis en place une procédure optimisée de
production d’ORF38 et testé son rôle potentiel d’activateur/cible du système via des expériences
d’interaction avec l’ARN (antiQ).
39
Matériel et méthodes
Phages et souches bactériennes
Le tableau 2.1. présente les bactériophages, bactéries et plasmides utilisés au cours de ce projet. Le milieu
M17 (Oxoid) supplémenté de 0,5% glucose a été utilisé pour la croissance des souches de L. lactis alors
que le milieu LB a été utilisé pour E. coli. Les bactéries ont été incubées à leur température optimale de
croissance, soit 30°C et 37°C respectivement. Lorsque nécessaire, un antibiotique de sélection a été ajouté
suivant les concentrations suivantes pour la maintenance des plasmides : Pour L. lactis (a) chloramphénicol
(5 µg/ml). Pour E. coli (a) vecteur de surexpression : chloramphénicol (34 µg/ml), ampicilline (100 µg/ml);
(b) vecteur d’expression : chloramphénicol (20 µg/ml), ampicilline (100 µg/ml).
Pour la propagation des phages P008 et P008-Q12, la souche L. lactis IL1403 a été mise en condition de
croissance jusqu’à l’obtention d’une densité optique (DO600nm) de 0,1. Une fois atteint, le phage et du
CaCl2 ont été ajoutés de façon à obtenir 105-107 phages/ml et 10 mM respectivement. L’incubation a été
poursuivie jusqu’à l’obtention d’une lyse cellulaire complète, observable par un lysat clair (Jarvis, 1978).
Les lysats ont ensuite été filtrés (Filtropur S 0.45 µm, SARSTEDT). La méthode de purification des
phages sur gradient discontinu de chlorure de césium (Sambrook et Russel, 2001) a été utilisée afin
d’obtenir des phages concentrés et purifiés lorsque nécessaire. Le titre de phage a été déterminé en étalant
différents volumes d’une dilution séquentielle sur un tapis de la souche hôte L. lactis IL1403 via la
méthode d’ensemencement dans la masse et ce, en triplicata. L’efficacité à former des plages de lyse
(EOP) a été calculée en divisant le titre de phage sur la souche résistante (AbiQ+) par le titre sur la souche
sensible (AbiQ-).
Analyses bio-informatiques (Structure d’ARN)
Les structures d’ARN ont été prédites en utilisant deux logiciels de prédiction. Le logiciel RNAfold
(mode : mfe-partition function) a été utilisé en combinaison avec le logiciel de visualisation VARNA pour
caractériser la structure des ARNs antiQ complet (Gruber et al., 2008; Darty et al., 2009). Pour l’analyse
de la structure en pseudonoeud, le logiciel pKnotsRG (mode enf) a été utilisé (Reeder et al., 2007). La
visualisation a été faite à l’aide du logiciel Pseudoviewer 3.0 (Byun et Han, 2006).
40
Tableau 2.1. Souches, plasmides et phages utilisés dans la cadre du projet.
Souche, plasmide ou phage
Caractéristiques spécifiques
Source
Souche Lactococcus lactis IL1403 Souche de laboratoire (sans plasmide), hôte du phage P008 (Chopin et al., 1984) MG1363 Souche de laboratoire (sans plasmide), hôte pour sous-clonage (Wegmann et al., 2007) NZ9000 Dérivé de MG1363, NisK NisR (système d’expression NICE) (Kuipers et al., 1998)
Escherichia coli BL21 F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal [malB+]K-12(λS) Stratagene MG1655 F- λ- ilvG- rfb-50 rph-1 (Blattner et al., 1997) NEB 10 Beta araD139Δ(ara-leu)7697 fhuA lacX74 galK (φ80 Δ(lacZ)M15) mcrA galU recA1 endA1 nupG
rpsL (StrR) Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) New England Biolabs
T7 express fhuA2 lacZ::T7 gene1 [lon] ompT gal sulA11 R(mcr-73::miniTn10--TetS)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10--TetS) endA1 Δ(mcrC-mrr)114::IS10
New England Biolabs
XLI-blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’ proAB lacIq ZΔM15 Tn10 (TetR)] Stratagene
Plasmide pBluescript II KS+
(pBS-KS) Vecteur de clonage permettant une selection blanc-bleu, AmpR Stratagene
pSRQ928 pNZ123 + le fragment 2,2 kb contenant AbiQ, CmR (Emond et al., 1998) pNZ123 Vecteur compatible (L. lactis et E. coli), 2,5 kb, CmR pNZ123-AbiQ Opéron AbiQ cloné dans pNZ123 au site EcoRI, CmR (Samson et al., 2013c) pNZ123-AbiQ6H Opéron AbiQ dans pNZ123, étiquette 6Histidine en C-terminale d’ABIQ, CmR (Samson et al., 2013c) pNZ-AbiQ (1,8r) Opéron AbiQ dans pNZ123, 1,8 répétition dans antiQ, CmR, (Mut 1,8r) Cette étude pNZ-AbiQ (3,8r) Opéron AbiQ dans pNZ123, 3,8 répétitions dans antiQ, CmR, (Mut 3,8r) Cette étude pNZ-AbiQ (A13C) Opéron AbiQ dans pNZ123, mutation A13C dans la première répétition d’antiQ, CmR Cette étude pNZ-AbiQ (A24C) Opéron AbiQ dans pNZ123, mutation A24C dans la première répétition d’antiQ, CmR Cette étude pNZ-AbiQ (T25C) Opéron AbiQ dans pNZ123, mutation T25C dans la première répétition d’antiQ, CmR Cette étude pNZ-AbiQ (A26C) Opéron AbiQ dans pNZ123, mutation A26C dans la première répétition d’antiQ, CmR Cette étude pNZ-AbiQ (A28C) Opéron AbiQ dans pNZ123, mutation A28C dans la première et deuxième répétition
d’antiQ, 3,8 répétitions, CmR Cette étude
pNZ-AbiQ (G32A-3,8) Opéron AbiQ dans pNZ123, mutation G32A dans la première et deuxième répétition d’antiQ, 3,8 répétitions, CmR
Cette étude
pNZ-AbiQ (G32A) Opéron AbiQ dans pNZ123, mutation G32A dans la première répétition d’antiQ, CmR Cette étude
pGEX-4T-1 Plasmide de surexpression (inductible à l’IPTG), fusion d’une étiquette GST en N-terminale, 5,0 kb, AmpR
GE Healthcare
pGEX-4T-1 :orf38 Gène orf38 (phage P008) cloné en fusion avec GST (N-ter), AmpR Cette étude pGEX-4T-1 :orf38-Q12 Gène orf38M (phage mutant P008-Q12, P38L) cloné en fusion avec GST (N-ter), AmpR Cette étude pNZ8010 Vecteur d’induction (système NICE) chez L. lactis, 5,0 kb, CmR (de Ruyter et al., 1996) pNZ8010:orf38-6H Gène orf38 dans pNZ8010, étiquette 6Histidine en C-terminale d’ORF38, CmR Cette étude pNZ8010:orf38-6H(abiQ) Gène orf38 dans pNZ8010, étiquette 6Histidine en C-terminale d’ORF38, RBS d’abiQ
(AGGAGA), CmR Cette étude
pNZ8010:orf38-6H(orf6) Gène orf38 dans pNZ8010, étiquette 6Histidine en C-terminale d’ORF38, RBS d’orf6 du phage p2 (ATCAAAAAGAA), CmR
Cette étude
pNZ8010:orf38-6H(con) Gène orf38 dans pNZ8010, étiquette 6Histidine en C-terminale d’ORF38, RBS consensus chez L. lactis (AGAAAGGAGGT), CmR
Cette étude
pDONR201 Intermédiaire de clonage Gateway, 4,5 kb, KmR Invitrogen pETG20A Plasmide de surexpression (inductible à l’IPTG), fusion d’une étiquette TRX(6His) en N-
terminale, 7,5 kb , AmpR Invitrogen
pETG20A:orf38-37 Gène orf38-orf37 (phage P008) dans pETG20A, étiquette TRX(6His) en N-terminale d’ORF38, AmpR
Cette étude
pETG20A:orf39-38 Gène orf39-orf38 (P008) dans pETG20A, étiquette TRX(6His) en N-terminale d’ORF39, AmpR
Cette étude
pETG20A:orf39-37 Gène orf39-orf37 (P008) dans pETG20A, étiquette TRX(6His) en N-terminale d’ORF39, AmpR
Cette étude
pETG20A:orf38 Gène orf38 (P008) dans pETG20A, étiquette TRX(6His) en N-terminale d’ORF38, AmpR
Phage P008 Siphoviridae, groupe 936, propagé sur IL1403, sensible à AbiQ (Mahony et al., 2006) P008-Q12 Mutant résistant à AbiQ (Pro38Leu) (Samson et al., 2013a)
41
Électro- et chimio-transformation (Cellules compétentes)
La chimiotransformation a été utilisée pour les transformations chez E. coli (Sambrook et Russel, 2001)
alors que l’électrotransformation a été utilisée pour la transformation de L. lactis (Holo et Nes, 1989).
a. Chimiotransformation
Tout d’abord, les souches d’intérêts (E. coli) ont été rendues chimiocompétentes. Pour ce faire, 100 ml de
milieu Psi (0,5% extrait de levure (BD), 2% tryptone (BD), 20 mM MgSO4- 7H2O, pH 7,6) ont été
inoculés avec 1% d’une culture ayant poussé toute la nuit (O/N) puis incubé à 37°C avec agitation jusqu’à
l’obtention d’une DO600nm de 0,5. Les cellules ont été déposées sur glace pour 15 minutes avant d’être
centrifugées 5 minutes. Le culot de cellules a ensuite été resuspendu dans le tampon de compétence Tfb1
(30 mM KOAc, 100 mM RbCl, 10 mM CaCl2- 2H2O, 50 mM MnCl2- 4H2O, 15% glycérol, pH 5,8). Après
dépôt sur glace et centrifugation, le culot a été resuspendu dans le tampon de conservation Tfb2 (10 mM
MOPS, 100 mM RbCl, 75 mM CaCl2- 2H2O, 15% glycérol, pH 6,5). Les cellules compétentes ont été
congelées et conservées à -80°C jusqu’à leur utilisation. Avant la transformation, les cellules compétentes
étaient décongelées sur glace. L’ADN (1-5 µl, 0,1 à 1 µg) était mis en contact avec 50 µl de cellules
compétentes et le tout conservé sur glace pour 30 minutes. Les extraits ont subis par la suite un choc
thermique par une incubation de 45 secondes à 42°C, avant d’être remis sur glace pour 2 minutes. La
récupération des cellules a été faite durant 1 h à 37°C dans le milieu SOC (0,5% extrait de levure, 2%
tryptone, 100 mM NaCl, 25 mM KCl, 20 mM glucose). Différents volumes ont ensuite été étalés sur des
boîtes de Pétri avec un antibiotique spécifique, puis incubé à 37°C pour la nuit.
b. Électrotransformation
Pour préparer des cellules électrocompétentes, 400 ml de GM17 (Oxoid) + 0,5 M (sucrose pour L. lactis
MG1363, sorbitol pour L. lactis IL1403) supplémenté de 1% glycine ont été inoculés avec une culture de
L. lactis à 1% et incubés à 30°C jusqu’à l’atteinte d’une DO600nm de 0,2. Les cellules ont été culottées par
centrifugation à 4°C et lavées à trois reprises en utilisant le tampon sucrose/sorbitol 0,5 M + glycérol
10%. Après les lavages, le culot a été resuspendu dans un petit volume du même tampon. Ces cellules
compétentes ont été conservées à -80°C et décongelées sur glace lors de l’utilisation. Pour la
transformation, 40 µl de cellules compétentes étaient ajoutés à 1 µg d’ADN puis conservés sur glace.
Lors de la transformation de produits PCR, les extraits d’ADN étaient microdialysés (eau) afin d’éviter la
formation d’un arc électrique et ainsi augmenter les rendements de transformation (Jacobs et al., 1990;
Sambrook et Russel, 2001). Le courant électrique était généré par le Gene Pulser II (Bio-Rad) réglé à
25000 µF, 200 Ω et 2,5 kV. Suite à l’électroporation, le tampon de récupération (GM17 + 0,5 M sucrose,
20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2) a été ajouté aux cellules puis le tout placé sur glace pour 10 minutes, puis à
30°C pendant 2h pour la récupération des cellules. Les extraits étaient finalement étalés sur des boîtes de
42
GM17 contenant l’antibiotique appropriée, et incubées à 30°C jusqu’à l’apparition de clones résistants.
Extraction d’ARN (Trizol)
Pour l’extraction d’ARN total cellulaire, les cellules des clones d’intérêts de L. lactis ont d’abord été
incubées dans le milieu GM17 frais, lavés, culottés puis congelés à -80°C. Après un traitement lysozyme
(60 mg/ml dans 25% sucrose) de 10 minutes, l’extraction des ARNs totaux a été faite en utilisant le réactif
Trizol selon les recommandations du fabricant (Invitrogen). Toujours selon Invitrogen, ces ARNs ont
été précipités à l’isopropanol, nettoyés à l’éthanol et resuspendu dans l’eau sans ARNase (RF). L’ADN
résiduel a été traité par traitement DNase pour 20 minutes à 37°C (20 U DNase I-rec (Roche), 40 U
RNase inhibitor (Roche)). Les extraits ont été dosés en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop 2000
(ThermoFisher) et dilués à concentration égale de 1 µg/µl. Les manipulations ont été réalisées en
condition RF puisque les RNases sont présentes en grande quantité sur les surfaces ainsi que sur la peau
humaine, et n’ont généralement pas besoin de cofacteur pour dégrader les ARNs (Blumberg, 1987).
Amplification rapide d’extrémités d’ADN complémentaire en 5’ (5’RACE PCR)
Les extraits d’ARN préalablement isolés ont été à nouveau traités à la DNase (30 minutes à 37°C) afin
d’éliminer toute trace d’ADN résiduel (10 U DNase I-rec (Roche), 40 U RNase inhibitor (Roche),
Tampon DNase I 1X). Les ARNs ont ensuite été purifiés suivant le protocole « RNA cleanup » de la
trousse RNeasy selon les recommandations du fabricant (Qiagen). Deux µl de l’amorce JS2 (50 µM) et 2
µl de dNTP (10 mM) ont été ajoutés à 4 µg d’ARN purifiés avant de compléter le volume à 26 µl avec de
l’eau RF. Cet extrait (ARN) a été dénaturé à 65°C pour 5 minutes et déposé sur glace pour 3 minutes. Le
tampon SS RT 5X (8 µL), le DTT 0,1 M (2 µl) et la RNase inhibitor (40 U) ont été ajoutés au mélange.
L’échantillon a été séparé en deux fractions égales avant l’addition de 400 U de Superscript III RT
(Invitrogen) (ADNc) ou de 2 µl d’eau RF (contrôle négatif). Ces extraits ont été rétrotranscrits pendant
1 h à 55°C avant d’être inactivés à 70°C pour 15 minutes. Un traitement RNase H (Roche) a été effectué
afin d’éliminer l’ARN des hétéroduplexes ADNc/ARN (2 U, 37°C pour 20 minutes) (Schultz et
Champoux, 2008). L’échantillon a ensuite été traité avec la trousse « PCR cleanup » (Qiagen) pour purifier
l’ADNc simple brin. Une queue de guanine a ensuite été ajoutée en 5’ par la transférase terminale (TT)
(Invitrogen) à 37°C pour 30 minutes (13 µl ADNc, 2 µl tampon TT (5X), 4 µl dGTP (1 mM), Transférase
terminale (15 U)). Une incubation à 80°C pour 3 minutes a ensuite été réalisée pour inactiver l’enzyme.
Cette queue de polynucléotide a servis de gabarit pour l’amplification des ADNc générés.
43
Les amorces PolyC/AbiQRev ont été utilisées avec l’extrait ADNc (RT+) pour générer le produit PCR
d’intérêt (RACE-AbiQ). D’un autre côté, les amorces AbiQFwd/AbiQRev ont été utilisées pour les
contrôles négatif (RT-) et positif (RT+) de rétrotranscription de l’ARN en ADNc. Des conditions
standards d’amplification PCR ont été utilisées. Ainsi, 35 cycles d’amplification ont été faits suite à l’étape
préliminaire de dénaturation (94°C pour 5 minutes) : 94°C pour 1 minute (dénaturation), 58°C pour 1
minute (hybridation) et 72°C pour 1 minute (élongation). La Taq DNA Polymerase a été utilisée selon les
recommandations (Feldan). 5 µl du produit PCR ont été colorés avec l’agent intercalant EZ-Vision
(Amresco), déposé sur gel d’agarose 2% (p/V) dans du tampon TAE (40 mM Tris-acétate, 1 mM EDTA),
puis visualisés aux rayons ultra-violets (UV) avec un appareil Gel Doc (Bio-Rad).
Ensuite, l’extrait PCR d’intérêt (RACE-AbiQ) a été cloné dans le vecteur pBluescript II KS+ (pBS-KS
II) (Stratagene) via une technique standard de clonage en utilisant des enzymes de restriction (Sambrook
et Russel, 2001). Pour ce faire, 100 µl du produit PCR RACE-AbiQ ont été purifiés sur colonne « PCR
clean up » puis digérés par XhoI (30 U) et EcoRI (30 U) (Tampon H 1X, Roche) à 37°C pour 1 h, avant
d’être à nouveau purifié avec la trousse « PCR clean up » (QIAquick PCR purification, Qiagen). En
parallèle, 5 µg du plasmide (pBS-KS II) ont été digérés par les mêmes enzymes (37°C pour 3 h) puis
purifiés en utilisant la trousse QIAquick PCR purification (Protocole « Gel extraction ») selon les
recommandations du fabricant. Le vecteur a été déphosphorylé (Antartic phosphatase, selon les
recommandations de NEB) afin de diminuer le nombre de clones faux-positif où le plasmide s’est
refermé sur lui-même (Sambrook et Russel, 2001). Différents ratios vecteur : insert (1 : 1, 1 : 3 et 1 : 5)
ont été liés (O/N à 16°C) puis transformés dans des cellules E. coli XL1 blue chimiocompétentes. Les
clones ont été sélectionnés sur milieu LB contenant de l’ampicilline (100 µg/ml). Trente colonies de
chaque ratio ont été repiquées dans chacun 5 µl d’eau stérile, puis le site d’insertion a été amplifié par
PCR (conditions standards) avec les amorces M13Fwd et M13Rev. Les clones possédant un amplicon de
taille attendue (>250 nt) ont été repiqués en liquide et leur plasmide a été extrait en utilisant la trousse
QIAprep Spin (protocole Miniprep) selon le fabricant (Qiagen). Les plasmides ont été séquencés à la
plateforme de séquençage et de génotypage des génomes du CHUL en utilisant les mêmes amorces. Les
séquences ont été analysées en utilisant BioEdit (Hall, 1999) et/ou Staden (Bonfield et Whitwham, 2010).
Les amorces utilisées dans le cadre du projet sont regroupées dans le tableau 2.2.
44
Tableau 2.2. Tableau des amorces utilisées dans la cadre du projet.
aLettre minuscule : séquence complémentaire au gabarit d’ADN. LETTRE MAJUSCULE : région flanquante en 5’. Lettre soulignée : Site de reconnaissance de l’enzyme de restriction. Lettre verte : Première répétition antiQ. Lettre rouge : Nucléotide muté. Lettre en gras : RBS de subsitution. Lettre mauve : Séquence d’homologie Gateway (att). Lettre bleu : Étiquette 6Histidine. Lettre orange : Séquence codant pour le site de la protéase TEV.
Fonction Amorce Séquence (5’-3’)a Tm (°C)
Note
5’RACE PCR de l’opéron AbiQ JS2 ccatctttttcatgagcagctt 53,9 ADNc du transcrit (AbiQ) AbiQFwd ttttacgaatgacgttaagattc 49,3 Contrôle+ ADNc AbiQRev CAGAATTCGAATTCccaagaggattatttatattgcca 50,9 Contrôle+/- ADNc PolyC GACTCGAGTCGACATCGAccccccccccccccccc 73,8 PCR RACE-AbiQ M13Fwd gtaaaacgacggccagt 52,6 MCS de pBS-KS II M13Rev caggaaacagctatgac 47 MCS de pBS-KS II Révertants pour mutants Δ répétitions (antiQ) Mut1,8Fwd attactttatacctttgtcaagctacaaaaaggggaa 59,6 Révertant 1,8R Mut1,8Rev ttcccctttttgtagcttgacaaaggtataaagtaat 59,6 Révertant 1,8R Mut3,8Fwd attactttatacctttgtcaagctacaaaaaggggaacc 61 Révertant 3,8R Mut3,8Rev ggttcccctttttgtagcttgacaaaggtataaagtaat 61 Révertant 3,8R Mutants ponctuels (antiQ) antiQ(A13C)Fwd gatattataattgtaaggaatatccaagccatcgttggaattgataaaattggagtatcc 63,5 Mutant A13C antiQ(A13C)Rev ggatactccaattttatcaattccaacgatggcttggatattccttacaattataatatc 63,5 Mutant A13C antiQ(G23A)Fwd gatattataattgtaaggaatatccaagccatagttggaattaataaaattggagtatcc 63,5 Mutant G23A antiQ(G23A)Rev ggatactccaattttattaattccaactatggcttggatattccttacaattataatatc 63,5 Mutant G23A antiQ(A24C)Fwd gatattataattgtaaggaatatccaagccatagttggaattgctaaaattggagtatcc 63,5 Mutant A24C antiQ(A24C)Rev ggatactccaattttagcaattccaactatggcttggatattccttacaattataatatc 63,5 Mutant A24C antiQ(T25C)Fwd gatattataattgtaaggaatatccaagccatagttggaattgacaaaattggagtatcc 63,5 Mutant T25C antiQ(T25C)Rev ggatactccaattttgtcaattccaactatggcttggatattccttacaattataatatc 63,5 Mutant T25C antiQ(A26C)Fwd gatattataattgtaaggaatatccaagccatagttggaattgatcaaattggagtatccaagccatagttgg 65 Mutant A26C antiQ(A26C)Rev ccaactatggcttggatactccaatttgatcaattccaactatggcttggatattccttacaattataatatc 65 Mutant A26C antiQ(A27C)Fwd gatattataattgtaaggaatatccaagccatagttggaattgatacaattggagtatccaagccatagttgg 65 Mutant A27C antiQ(A27C)Rev ccaactatggcttggatactccaattgtatcaattccaactatggcttggatattccttacaattataatatc 65 Mutant A27C antiQ(A28C)Fwd gatattataattgtaaggaatatccaagccatagttggaattgataacattggagtatccaagccatagttgg 65 Mutant A28C antiQ(A28C)Rev ccaactatggcttggatactccaatgttatcaattccaactatggcttggatattccttacaattataatatc 65 Mutant A28C antiQ(G32A)Fwd gatattataattgtaaggaatatccaagccatagttggaattgataaaattagagtatccaagccatagttgg 65 Mutant G32A antiQ(G32A)Rev ccaactatggcttggatactctaattttatcaattccaactatggcttggatattccttacaattataatatc 65 Mutant G32A antiQ(C40A)Fwd gatattataattgtaaggaatatccaagccatagttggaattgataaaattagagtatcaaagccatagttgg 65 Mutant C40A antiQ(C40A)Rev ccaactatggctttgatactctaattttatcaattccaactatggcttggatattccttacaattataatatc 65 Mutant C40A Clonage d’orf38 (Phage P008) NICEorf38Fwd CAGGATCCGGATCCcggaagatctacctttctagaaagtcgg 58 Orf38-6H (NICE) NICEorf38Rev ACCTGCAGCTGCAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGatttaatactccttcatatatttt
accaaacttcaaagcg 57,9 Orf38-6H (NICE)
orf38-RBS(orf6)F GAGGATCCGGATCCATCAAAAAGAAatatgtacacagcagaagagagagagc 57,6 orf38 : RBS d’orf6 (p2) orf38-RBS(abiQ)F CAGGATCCGGATCCAGGAGAtcggttaaatgtacacagcagaagagagagagc 62 orf38 : RBS d’abiQ orf38-RBS(con)F CAGGATCCGGATCCAGAAAGGAGGTcggttaaatgtacacagcagaagagagagagc 61,3 orf38 : RBS consensus
(L. lactis) pGEX-orf38Fwd CAGAATTCGAATTCatgtacacagcagaagagaga 52,9 GST-ORF38 pGEX-orf38Rev CACTCGAGCTCGAGtgtgtagttctcttaatgttgtca 51,9 GST-ORF38 Mutorf38-Q12Fwd tggcaatgctctttgacttc 53,5 orf38 : Mutagenèse P38L Mutorf38-Q12Rev gaagtcaaagagcattgcca 53,5 orf38 : Mutagenèse P38L pETG-3738Fwd GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGAAAACCTGTACTTCCA
GGGTtacacagcagaagagagagag 53,2 Clonage en bloc Dans :(orf38)
pETG-3738Rev GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTcttatttttctttcaatttatttttgaaccagatgattc
55,7 Clonage en bloc (orf37)
pETG-3839Fwd GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGAAAACCTGTACTTCCAGGGTgcaatcattacagttacagcac
52,2 Clonage en bloc (orf39)
pETG-3839Rev GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTcttaatttaatactccttcatatattttaccaaacttc
54,1 Clonage en bloc (orf38)
Synthèse d’ARN in vitro (antiQ) arnS115ntFwd TAATACGACTCACTATAGGGtaaggaatatccaagccatag 49,1 T7promoteur+ARN 115nt (antiQ) arnS115ntRev aaaaaaagctactcatagagtagctt 52,5 ARN 115nt (antiQ) arnS35nt-oligo TAATACGACTCACTATAGGGTATCCAAGCCATAGTTGGAATTGATAAAA
TTGGAG - T7promoteur+ARN 35nt (1r)
Vecteur (MCS) pNZ-F aatgtcactaacctgccccg 57,4 MCS de pNZ123 pNZ-R cattgaacatgctgaagagc 52,1 MCS de pNZ123
45
Mutagénèse dirigée par amplification de plasmide
Cette méthode de mutagénèse a été utilisée afin de générer les mutants ponctuels (Mut antiQ) et les
révertants (Δ répétitions antiQ). Tout d’abord, le plasmide issu de la souche E. coli MG1655 pNZ123-
AbiQ a été isolé et purifié par QIAprep Spin. Cette souche contient la méthylase dam qui permettait de
méthyler l’ADN plasmidique préalable à une sélection positive de l’ADN d’intérêt. Des amorces inverse-
complémentaire à l’ADN gabarit (mutation ciblée au centre) ont été utilisées pour amplifier le plasmide
complet (pNZ123-AbiQ) en combinaison avec l’enzyme pwo (Roche). Cette polymérase produit une
amplification fidèle grâce à son activité 3’-5’ exonucléase qui permet de corriger les erreurs d’amplification
(Cline et al., 1996; Dabrowski et Kur, 1998). Pour les mutations dans antiQ (séquence répétée), les amorces
dessinées possédaient une courte séquence en 5’ des répétitions afin d’éviter l’appariemement à plusieurs
sites. Le mélange réactionnel d’amplification a été fait selon les recommandations du fabricant (Roche)
notamment avec l’ajout de Diméthyle sulfoxide (DMSO) comparativement aux mélanges décris
précédemment. Seize cycles d’amplification ont été faits suite à l’étape préliminaire de dénaturation (95°C
pour 30 secondes) : 95°C pour 30 secondes, 55-58°C pour 1 minute et 68°C pour 2 minutes. L’extrait
PCR a ensuite été digéré par l’enzyme DpnI (10 U) (Roche) durant 1 h à 37°C afin d’éliminer les plasmides
méthylés (plasmide gabarit) et sélectionner positivement les plasmides mutés (plasmide amplifié par PCR).
Ces plasmides mutés ont été électrotransformés dans la souche de clonage L. lactis MG1363. Lorsque
possible, un minimum de cinq clones a été repiqué en milieu liquide et leurs plasmides extraits. Les
plasmides ont été séquencés en utilisant les amorces entourant le site multiple de clonage (MCS) du
vecteur pNZ123 (amorce pNZ-F et pNZ-R). Une fois confirmés, les plasmides contenant la mutation
souhaitée ont été transformés dans la souche d’intérêt L. lactis IL1403. Les plasmides issus de cette souche
ont également été confirmés par séquençage.
Hybridation de type Northern (Northern blot)
Tout d’abord, le tampon de charge au formamide (98% formamide déionisé, 10 mM EDTA pH 8,0,
0,025% xylene cyanol et 0,025% bromophénol bleu ; conservé à -20°C) a été ajouté à l’ARN purifié (5
µg) suivant un ratio final 1 : 1. Ces extraits d’ARN totaux ont ensuite été migrés sur gel dénaturant
polyacrylamide 10 %/urée 8 M puis transférés sur membrane de nylon chargée positivement (Roche) par
électro-transfert durant 1 h à 60V (EC3000P, E-C). L’ARN a été fixé à la membrane par passage aux UV
durant 2 minutes. Par la suite, la membrane a été préhybridée dans cinq millilitres d’ULTRAHyb-Oligo
(Ambion) pour 30 minutes avec agitation lente à 42°C.
Les sondes utilisées sont des oligonucléotides complémentaires soit à une répétition d’antiQ
46
(GCTCCAATTTTATCAATTCCAACTATGGCTTGGATA) ou à une portion du gène abiQ
(GGGGTATTAATTCGCTGTCAGGAACTGGAATC). Ces sondes étaient marquée radioactivement
([γ- 32P], PerkinElmer) en utilisant la polynucléotide kinase (Roche) selon les recommandations du
fabricant avant d’être purifiées par passage sur colonne d’exclusion Micro Bio-Spin30 (Bio-Rad). La sonde
d’intérêt était ajoutée après la préhybridation afin d’obtenir 1×106 cpm/ml final (compteur à scintillation
Beckman Coulter LS6500). L’hybridation a été poursuivie pour 18 h également à 42°C. Les membranes
ont ensuite été lavées deux fois avec du SSC 2X + SDS 0,05% (NaCl 0,3 M, citrate de sodium 0,03 M,
pH 7,0, SDS 0,05%) avant d’être révélées par autoradiographie (KODAK BioMax XAR film). Les films
ont été exposés de 15 minutes à 18 h et conservés à -80°C afin d’intensifier le signal. Certaines membranes
ont été utilisées pour la détection de deux ARN différents. Dans ces cas, les sondes ont été éliminées de
la membrane par traitement à la chaleur (SSC 2X + SDS 0,05% à ébullition).
Courbe de croissance cellulaire
La croissance cellulaire a été analysée en mesurant la DO630nm des cultures mises en plaques 96 puits à
l’aide d’un spectrophotomètre Synergy 2 (Biotek) avec une température interne de 30°C. Un programme
spécifique dans le logiciel Gen5 (Biotek) a été conçu afin de noter la densité optique des puits à chaque
5 ou 20 minutes, pendant 6 h à 10 h. Chacune des courbes de croissance a été réalisée pour huit essais
expérimentaux, et chacune pour trois plaques au cours de différentes journées.
a. Infection d’AbiQ+/- par les phages
La croissance des souches L. lactis pNZ123 (AbiQ-) et L. lactis pSRQ928 (AbiQ+) a été mesurée avec ou
sans phages (P008 ou le mutant P008-Q12). Chaque puits contenait 140 µl de milieu GM17 + CaCl2 10
mM auquel on ajoutait 30 µl d’une culture O/N de la souche bactérienne. Un total de 5,4 × 104 phages
a été dilué dans un volume final de 30 µl de tampon de phage (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl,
8 mM MgSO4) avant d’être ajouté au milieu additionné de bactéries. Pour les contrôles sans phage, 30 µl
de tampon de phage ont été ajoutés.
b. Croissance des différents mutants (Mut antiQ)
Des cultures O/N de chacun des mutants ponctuels (Mut antiQ) ou variant dans le nombre de répétitions
(Δ répétitions antiQ) ont été diluées dans le milieu de croissance (GM17 + Cm 5 µg/ml) jusqu’à
l’obtention d’une DO600nm de 0,4 (Spectronic 20+, Spectronic Instruments). Le taux de croissance (g) des
mutants a été calculé en sélectionnant deux points se trouvant au début et à la fin de la phase exponentielle
de croissance. Par simplification des formules mathématiques, on obtient [Pente × 2.303 = Taux de
croissance spécifique (k)] et [g = ln2/k].
47
Infection dans le temps
Pour les infections dans le temps, une culture O/N de la souche d’intérêt a d’abord été ensemencée dans
10 ml de milieu GM17 avec ou sans antibiotique puis incubée à 30°C jusqu’à l’obtention d’une DO600nm
de 0,5. Les cellules ont été culottées puis suspendues dans un petit volume (6 ml) de GM17 frais équilibré
à 30°C. Le temps non infecté (NI) était prélevé à ce moment. Le CaCl2 (concentration final 10 mM) et le
phage (MOI 5) ont ensuite été ajoutés. Des prélèvements de 1 ml ont été faits à 2, 10, 20, 30 et 40 minutes
post-infection. Ces cellules ont été centrifugées et les culots congelés rapidement à -80°C jusqu’à
l’utilisation.
Immunobuvardage de type Western (Western blot)
Pour cette expérience, les cellules issues de la méthode d’infection dans le temps ont été utilisées. Les
cellules ont été décongelées sur glace puis resuspendues dans 200 µl de tampon de lyse (10 mM Tris-HCl
pH 8,0, 0,3% SDS (p/V), 1 mM EDTA pH 8,0, 60 mM DTT, 1 pastille/15 ml d’un cocktail inhibiteurs
de protéases (Roche)) équilibré à 4°C. Les cellules ont été lysées par sonication en utilisant un appareil
Sonifier W-350 (Branson Sonic Power Co.) en mode pulsé de 5 à 8 fois 40 secondes (contrôle de sortie
4, durée du cycle 40%). L’intégrité des cellules a été évaluée par observation directe en microscopie
optique sur fonc clair (Optiphot-2, Nikon). Ensuite, les protéines insolubles (culot) ont été séparées des
protéines solubles (surnageant) par centrifugation à 17 000g pendant 30 minutes à 4°C. La fraction
soluble a été récupérée puis dosée en utilisant la méthode Bradford (Bio-Rad) avec un standard de BSA.
Des concentrations finales de 50 ng ou 1 µg de protéines solubles totales ont été mixés avec le tampon
de charge (75 mM Tris, 50% (V/V) glycérol, 10% (p/V) SDS, 10% (V/V) β-mercaptoéthanol, 7,5 µM
bleu de bromophénol), dénaturés à la chaleur (95°C pour 5 minutes) puis migrées sur gel de
polyacrylamide tris-glycine Ny-Kd (Bio-Rad) et 4-15% (Bio-Rad) respectivement (tampon de migration :
25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS). Le marqueur de protéines précoloré (NEB) et le marqueur
BenchMark His-tagged 1 :1 000 (Life Technologies) ont été utilisés afin de déterminer les tailles des
protéines détectées par Western. Les protéines ont ensuite été électrotransférées sur membrane de PVDF
(Pall Corporation). Les membranes ont été bloquées par trempage O/N à 4°C (agitation) dans du tampon
phosphate (PBS) (136 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4) supplémenté
de 0,1% (V/V) Tween 20 (PBST) et de 5% lait (W/V). L’anticorps primaire (IgG anti-6His, Rockland) a
été dilué dans le tampon (PBST-lait 5%) à un ratio 1:1 000 avant d’être incubé pour 1 h à température
pièce avec la membrane (Hybridation). La membrane a ensuite été lavée quatre fois par rinçage de 10
minutes dans du tampon PBST frais. L’anticorps secondaire (anti-IgG-HRP, Rockland) a aussi été dilué
dans le tampon de blocage (PBST-lait 5%), toutefois à un ratio 1:10 000. L’hybridation a été poursuivie
48
pour 1 h avant une autre série de lavages, puis un rinçage final de 10 minutes dans le tampon PBS. Le
réactif Amersham ECL Plus a été utilisé pour la révélation (selon les recommandations du fabricant, GE
Healthcare) du film par chimioluminescence (exposition 1 minute à température pièce) (KODAK Biomax
chemiluminescent film).
Courbe de croissance de phage
Les courbes de croissance ont été réalisées telles que décrit précédemment (Moineau et al., 1993) en
triplicata biologique. Brièvement, une culture O/N de bactérie (L. lactis IL1403 pNZ123 (AbiQ-) ou
IL1403 pSRQ928 (AbiQ+)) a été ajoutée à un milieu GM17 frais puis incubée à 30°C jusqu’à l’obtention
d’une DO600nm de 0,8 (≈8×108 UFC/ml). Après l’ajout du CaCl2 (10 mM final), le phage a été ajouté à
une MOI de 0,05 et incubé 5 minutes toujours à 30°C. Ensuite, les cellules infectées ont été lavées deux
fois par centrifugation, concentration et resuspension dans du milieu frais GM17 + CaCl2 10 mM afin
d’éliminer les phages libres. Les cellules infectées ont été diluées de façon séquentielle puis 100 µl des
dilutions d’intérêt ont été ajoutés à 500 µl de bactérie (culture O/N) via la méthode d’ensemencement
dans la masse, et incubés pour la nuit à 30°C. Un échantillon a été pris à toutes les 10 minutes jusqu’à 60
ou 85 minutes. Le nombre de phages relâchés par cellule infectée a été calculé par la formule suivante :
[(Titre final – Titre initial)/ Titre initial]. Pour sa part, le temps de latence a été déterminé comme étant
le point central entre le plateau final et le plateau initial. Dans les deux cas, les données moyennes des
plateaux ont été utilisées pour les calculs.
Clonage et expression d’orf38
a. Système d’expression NICE
L’orf38 du phage P008 a été cloné (avec son RBS natif) dans le vecteur pNZ8010 en utilisant le phage
directement comme gabarit pour l’amplification par PCR. Les amorces NICEorf38Fwd et
NICEorf38Rev ont été utilisées pour l’amplification et ont permis d’insérer les sites de restriction BamHI
et PstI autour du gène, ainsi qu’une étiquette 6-His en fusion avec l’extrémité C-terminale de la protéine
produite. Outre les enzymes de restriction qui sont différentes, la méthode de clonage qui a été utilisée
est la même que celle décrite dans la section 5’RACE PCR. Les produits de ligature ont été transformés
dans la souche d’expression L. lactis NZ9000. Pour la génération des mutants avec un RBS modifié, les
amorces utilisées étaient plutôt orf38-RBS(orf6)F, orf38-RBS(abiQ)F et orf38-RBS(con)F en
combinaison avec l’amorce NICEorf38Rev.
49
Les souches d’expression ont été induites à la nisine suivant une matrice partielle d’expérience
DoE (tableau 2.3.) dans un petit volume (10 ml). Les cellules ont ensuite été culottées par centrifugation.
Une portion de chacun des culots a été piquée et les cellules ont été misent en suspension directement
dans le tampon de charge, avant d’être migrées sur gel de polyacrylamide type Ny-Kd (Bio-Rad) qui lui a
été coloré au bleu de Coomassie G250. Cette méthode est appelée test d’expression puisqu’elle permet
de visualiser les protéines solubles et insolubles (corps d’inclusion) produites par les systèmes
d’expression.
Tableau 2.3. Matrice partielle d’expérience pour l’expression d’ORF38 (système NICE) en utilisant la souche d’expression (L. lactis NZ9000 pNZ8010 :orf38-6H).
Température*
(°C) Temps
(h) DO600nm Concentration nisine
(ng/ml) 18 1 0,2 0.5 25 3 0,5 1 30 - - 5 - - - 10
*La température indiquée est celle d’induction. La température de croissance est 30°C.
b. Système d’expression avec étiquette GST
L’orf38 a été cloné dans le vecteur pGEX-4T-1 en utilisant la même méthode de clonage par enzyme de
restriction. Dans ce cas-ci, les amorces utilisées possédaient les sites de restriction EcoRI et XhoI.
Également, seul le gène orf38 (sans RBS) a été introduit dans le plasmide afin de permettre la fusion du
gène GST (« Glutathione S-transferase ») en N-terminal de la protéine. La souche d’expression utilisée
était E. coli BL21 codon+ (Stratagene). Pour l’expression, deux litres de milieu LB ont été ensemencés
avec une culture O/N de E. coli BL21 codon+ pGEX-4T-1:orf38 à 37°C jusqu’à une DO600nm de 0,5.
L’expression a ensuite été induite avec 0,5 mM IPTG pendant 4 h à une température de 25°C et avec une
forte agitation (200 rpm, INFORS HT). Le culot cellulaire a été congelé à -80°C. Après décongélation
sur glace, le culot cellulaire a été resuspendu dans un tampon de lyse PBS (PBS, 0,25 mg/ml lysozyme)
dans un volume de 1 :100 par rapport au volume initial. Les cellules ont ensuite été lysées par sonication,
puis ont été centrifugées à 4°C pour isoler les protéines solubles (surnageant). Pour diminuer la viscosité
avant la purification, les extraits de protéines totales ont été filtrés (0,45 µm). La protéine d’intérêt (GST-
ORF38) a été purifiée en utilisant une colonne d’affinité GST FF de 5 ml (selon les recommandations du
fabricant, GE Healthcare) sur un appareil FPLC (AKTA, GE Healthcare). Pour la purification, le tampon
de lavage (PBS) permettait l’élimination des protéines contaminantes alors que le tampon d’élution (50
mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM glutathione réduit) permettait l’élution de la protéine d’intérêt par
compétition d’interaction avec la colonne. Les résultats des différentes fractions de purification ont été
analysés suite à la migration sur gel polyacrylamide Ny-Kd.
50
c. Clonage en bloc (Clonage Gateway)
Les expériences subséquentes de clonage, d’expression et de purification d’ORF38 ont été réalisées lors
d’un stage de 5 mois au centre de recherche AFMB (CNRS) à Marseille en France.
Pour le clonage en bloc, la stratégie de clonage Gateway a été utilisée (Invitrogen). Les amorces utilisées
possédaient les séquences spécifiques (régions att, Invitrogen) qui permettent le clonage par
recombinaison homologue (Tableau 2.2.). Dans ce cas-ci, différentes combinaisons des gènes orf37-orf39
(P008) ont d’abord été amplifiées par PCR en utilisant le phage directement comme gabarit : orf37-38
(amorces pETG20A-3738Fwd/pETG20A-3738Rev), orf38-39 (amorces pETG20A-
3839Fwd/pETG20A-3839Rev), orf37-39 (amorces pETG20A-3839Fwd/pETG20A-3738Rev) et orf38
(amorces pETG20A-3738Fwd/pETG20A-3839Rev). Les amorces sens (Fwd) permettaient également
l’ajout d’un site de coupure à la protéase TEV séparant l’étiquette TRX (6His) de la protéine d’intérêt
ORF38 (Plasmide pETG20A, Invitrogen). L’enzyme polymérase haute fidélité PHusion a été utilisée
selon les recommandations (NEB). Les conditions d’amplification PCR suivantes ont été utilisées : 35
cycles d’amplification ont été faits suite à l’étape préliminaire de dénaturation (98°C pour 5 minutes),
98°C pour 30 secondes, 58°C pour 30 secondes et 72°C pour 2 minutes. Après purification des amplicons
(Trousse Nuclospin Gel and PCR clean-up, Macherey-Nagel), ceux-ci ont été insérés dans le vecteur
donneur pDONR201 par réaction BP (recombinaison attL) toujours selon les recommandations du
fabricant (Invitrogen). Les vecteurs ont été chimiotransformés dans la souche de clonage E. coli NEB 10
Beta puis les clones ont été sélectionnés sur LB (Compagnie MP) + Kanamycine 50 µg. Le plasmide des
clones obtenus a été extrait (Trousse NucleoSpin Plasmid, Macherey-Nagel) puis la séquence clonée a été
confirmée par séquençage (Service de séquençage de GATC Biotech) suite à l’amplification PCR entre
les sites de recombinaison attL (Gateway, Invitrogen). Les plasmides ont ensuite été utilisés afin de cloner
l’amplicon dans le vecteur d’expression pETG20A via la réaction LR (recombinaison attB) (Invitrogen)
avant d’être transformés dans la souche de clonage. Après séquençage du produit PCR entre les sites de
recombinaison attB (Gateway, Invitrogen), les constructions ont été transformées dans la souche
d’expression T7 express + pLysS (NEB).
Expression et purification de l’ORF38
Deux litres ou 12 litres de milieu Terrific broth (TB) (compagnie MP) ont été utilisés respectivement pour
les tests d’expression et pour la purification d’ORF38 en grande quantité. Le milieu a été ensemencé à
1% à partir d’une culture O/N et incubé à 37°C jusqu’à l’obtention d’une DO600nm de 0,5. L’expression
des protéines a ensuite été induite par 0,5 mM IPTG à 18°C pour toute la nuit, avec agitation forte (200
51
rpm, INFORS HT). Les cellules ont été culottées puis mises en suspension dans du tampon de lyse Tris
(50 mM Tris pH8,0, 300 mM ou 500 mM NaCl, 10 mM Imidazole, 0,25 mg/ml lysozyme, 10 µg/ml
DNase, 20 mM MgSO4, inhibiteurs de protéases (Roche)). Les cellules ont été lysées par sonication
(Sonifier W-450, Branson Sonic Power Co.) en mode pulsé de 5 fois 45 secondes (contrôle de sortie 6,
durée du cycle 80%). Les protéines ont été séparées par centrifugation puis filtrées telles que décrites
précédemment. Les protéines ont été purifiées sur colonne d’affinité Nickel (Ni2+) HisTrap FF ou HP de
5 ml (selon les recommandations, GE Healthcare) par FPLC suivant un gradient en étape d’imidazole.
L’extrait protéique purifié a été dialysé puis l’étiquette TRX (6His) a été coupée par traitement à la
protéase TEV (van den Berg et al., 2006) à 4°C pour la nuit (1 mg protéase/mg de protéine TRX-ORF38).
Le tout a été à nouveau purifié par affinité afin de séparer la protéine d’intérêt (FT) de l’étiquette
TRX(6His) (élution) qui est resté fixée à la colonne. La protéine a ensuite été purifiée par exclusion de
taille (GF Superdex 75, GE Healthcare) avant d’être concentrée par Amicon Ultracell 3K (Millipore) et
Vivaspin 500 3kDa (Sartorius). La concentration des protéines a été calculée en utilisant le Nanodrop
1000 avec l’absorbance à 280 nm corrigée par son coefficient d’extinction molaire prédit par bio-
informatique (web.expasy.org/protparam/). Les protéines étaient migrées sur gel polyacrylamide 18%
afin de permettre une bonne séparation des protéines de faibles poids moléculaires (5-50 kDa).
La protéine purifiée a ensuite été testée pour sa stabilité et sa taille expérimentale par la technologie Wyatt
(SEC-MALS) avec une colonne 15 ml kW-803 (Shodex), à une vitesse de 0,5 ml/min sur un HPLC, et en
utilisant un tampon de purification filtré 0,2 µm (10 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM).
Optimisation de la stabilité d’ORF38
De la même façon qu’il a été décrit précédemment, l’expression de la protéine ORF38 a été induite à
partir de 2 litres de culture puis purifiée par colonne d’affinité Ni2+. Un volume égal (100 µl) de protéine
TRX-ORF38 a été microdialysé puis coupé (protéase TEV) dans les différents tampons testés (50 ml)
(Tableau 2.4.). La purification de l’ORF38 a été faite en utilisant les billes de résines Ni2+ selon les
recommandations, en conservant le FT. La stabilité des protéines a ensuite été évaluée en mesurant la
DO320nm à concentration protéique équivalente (Vincentelli et al., 2004).
52
Tableau 2.4. Matrice partielle d’expérience pour l’optimisation de la stabilité d’ORF38.
Tampon* pH NaCl (mM)
Sodium acetate 5,5 50 MES 6,0 300
Sodium phosphate 6,5 500 MOPS 7,0 -
Tris 7,5 - HEPES 7,5 -
Imidazole 8,0 - Bicine 8,5 - CHES 9 -
*La concentration des tampons est de 10 mM pour cette matrice d’expérience.
Synthèse d’ARN in vitro
Les ARNs antiQ ont été synthétisés in vitro en utilisant la trousse TranscriptAid T7 High Yield
Transcription selon les recommandations du fabricant (Thermo Scientific). Le fragment 35 nt (1
répétition d’antiQ) a été produit en utilisant l’oligonucléotide arnS35nt-oligo directement puisqu’il
contient la séquence du promoteur T7 en 5’ de l’ARN à synthétiser. Pour sa part, le fragment 130 nt
(antiQ complet) a dû d’abord être amplifié par PCR en utilisant les amorces arnS115ntFwd et
arnS115ntRev. L’amplicon a été purifié sur gel d’agarose 2% (Trousse Nuclospin Gel and PCR clean-up,
Macherey-Nagel) puis transcrit in vitro directement. Une fois transcrit, les ARNs ont été purifiés par
phénol-chloforme tel qu’indiqué (Thermo Scientific) et par multiple passage par colonne d’exclusion de
taille Vivaspin 500 3kDa avec de l’eau RF frais.
Test d’interaction ORF38/ARN (SPR)
Pour tester l’interaction, le BIAcore X100 (BIAcore) été utilisé avec un tampon Tris de faible force
ionique (10 mM Tris, NaCl 150 mM, pH 4,75). Au départ, la protéine ORF38 (ligand) a été fixée à la puce
CM5 chip (BIAcore). Cette puce est constituée de verre et d’une mince couche d’or additionnée de
dextran, ce dernier permettant l’attachement de notre ligand d’intérêt. Au passage de l’analyte, une
interaction ligand/analyte permet de modifier l’angle de réfraction de la lumière, et ce,
proportionnellement au taux d’interaction. Des essais préliminaires ont été faits en passant le fragment
130 nt (antiQ complet) et le fragment 35 nt (1 répétition d’antiQ) sur la surface contenant ORF38 liés. Par
la suite, un essai final a été fait pour le fragment 35 nt seulement en utilisant différentes concentrations
d’analyte (Fragment 35 nt) : 200 µM, 100 µM, 50 µM, 25 µM, 12,5 µM, 6,75 µM et 0 µM. Les résultats
ont été analysés avec le logiciel outil BIAcoevaluation (BIAcore).
53
Résultats
Objectif 1 : Étude de la spécificité d’antiQ
Analyses bio-informatiques
En 1998, la première analyse bio-informatique de l’opéron AbiQ a été publiée (Emond et al., 1998).
Depuis ce temps, beaucoup d’améliorations ont été apportées aux outils d’analyses et permettent
d’obtenir des résultats plus détaillés qu’auparavant. Pour cette raison, une nouvelle caractérisation
génomique de l’opéron AbiQ a été faite (figure 3.1.1.).
Figure 3.1.1. Schéma de l’opéron AbiQ (A). L’échelle retrouvée au dessus indique la position en nucléotides des terminateurs (T) ainsi que le gène abiQ à partir du site d’initiation de la transcription (TSS) comme position +1. Le promoteur est représenté par la lettre P. Séquence de l’opéron AbiQ (B) où les éléments ciblés sont indiqués en haut de la séquence [UP : région promotrice en amont, TSS : Site d’initiation de transcription, R : répétition, T : terminateur, ATG : codon d’initiation d’abiQ et taa : condon d’arrêt]. Le soulignement rouge (ATG) représente le mauvais codon de départ qui avait été identifié en 1998 (Emond et al., 1998).
54
L’opéron est constitué d’un promoteur, d’une séquence répétée de 2,8 répétions (35 nt), d’un terminateur
rho-indépendant (T1), du gène abiQ (519 nt) et d’un autre terminateur (T2). Le site d’initiation de la
transcription (TSS) de cet opéron a été prédit à la base thymine (-7 nt de la première répétition antiQ) en
utilisant le logiciel NNPP2.2 avec un haut degré de confiance (99%). Les boites -35 (TTGCAT, position
-34) et -10 (TATAAT, position -8) constituant le promoteur ont été trouvées manuellement à partir du
TSS prédit. Ces séquences promotrices correspondent aux résultats d’analyses qui avaient été obtenus en
1998 (Emond et al., 1998). Cette analyse a également permis d’identifier une région UP (position -46) qui
pourrait constituer un autre site de liaison de l’ARN polymérase, et ainsi accentuer la force du promoteur
(Ross et al., 1993). Le promoteur en amont des séquences répétées est le seul qui fut identifié sur l’opéron
suggérant donc qu’antiQ et abiQ sont co-transcrits.
Entre les deux, un nouveau terminateur rho-indépendant (T1) a pu être identifié suite à l’identification
manuelle d’une séquence inversée et répétée suivi d’une série de T (thymine). En considérant la présence
de cette structure, il apparait clair que la traduction de abiQ débute non pas au ATG préalablement
identifié (Emond et al., 1998), mais bien au second situé 33 nt en aval. Ce terminateur (T1) ne serait pas
100% efficace afin de permettre une transcription faible du gène toxique (abiQ).
Détermination du site de coupure et d’initiation de la transcription (5’ RACE PCR)
Récemment, il a été établi que l’antitoxine (antiQ) est coupée par la toxine ABIQ in vivo et génère un profil
de coupure caractéristique (Samson et al., 2013c). Afin d’obtenir davantage d’information sur la spécificité
de l’antitoxine, il était d’abord essentiel d’identifier chacun des fragments d’ARN de l’antitoxine générés
par cette coupure. Pour ce faire, la méthode du 5’ RACE PCR fut utilisée pour déterminer
expérimentalement les sites de coupure d’ABIQ dans antiQ et le site d’initiation de la transcription de
l’opéron.
L’ARN total issu de la souche L. lactis IL1403 pNZ123-AbiQ a d’abord été rétrotranscrit puis amplifié
par PCR via l’extrémité polyG ajoutée en 5’. La figure 3.1.2. présente les résultats obtenus suite à cette
réaction PCR. Tel qu’attendu, aucune amplification n’est survenue pour les contrôles négatifs PCR (Eau,
AbiQFwd/AbiQRev) et ADN (RT-, AbiQFwd/AbiQRev), alors que l’amplification d’un fragment de
taille attendue (261 pb) est survenue pour le contrôle positif (ADNc, AbiQFwd/AbiQRev). Pour l’extrait
RACE-AbiQ (ADNc, PolyC/AbiQRev), un fragment d’environ 450 pb a été fortement amplifié ainsi que
deux fragments de plus faibles intensités de taille d’environ 50 pb plus long ou plus court. Les tailles
obtenues sont parmi celles attendues puisque plusieurs fragments pouvaient être amplifiés lors de la
réaction.
55
Figure 3.1.2. Produits PCR du 5’ RACE et contrôles migrées sur gel d’agarose 2,0%. Les amorces utilisées (PolyC, AbiQFwd, AbiQRev et JS2) sont présentées pour chaque réaction PCR et leur position sur l’opéron est indiquée sur le schéma du haut. Les produits PCR sont : Ctrl-PCR (Eau comme gabarit pour le PCR), Ctrl-ADN (ARN sans traitement RT), Ctrl+ (ARN traité RT, donc ADNc) et RACE-AbiQ (Amplification d’intérêt).
Cet extrait amplifié RACE-AbiQ a ensuite été séquencé directement. La position des chaines polyG dans
le chromatogramme de séquence nous a permis d’identifier un site de coupure dans antiQ (A26/A27)
ainsi que le TSS (TAA) (figure 3.1.3.). Ce site d’initiation de transcription est le même que celui présenté
suite aux analyses bio-informatiques et vient donc confirmer ce résultat. Il est à noter qu’aucun polyG
n’a pu être observé dans la portion 0,8 répétition, suggérant une absence de coupure dans cette région.
De plus, les résultats obtenus suggèrent une fréquence équivalente de coupure entre la première (R1) et
la deuxième répétition (R2). La plus faible intensité des pics dans R1 est due au fait que l’ADN a été
séquencé de l’extrémité 3’ vers l’extrémité 5’. Ainsi, une double coupure R1 et R2 ne permet d’observer
qu’une coupure dans la région R2.
Figure 3.1.3. Schéma issu du séquençage de l’extrait RACE-AbiQ. La flèche noire démontre le site d’initiation de transcription. La position des répétitions est indiquée par la ligne noire (R1), grise (R2) et gris pâle (R3). Le site de coupure est présenté par la ligne en zigzag. Les lignes rouges sous le chromatogramme représentent les régions polyG retrouvées dans la séquence.
56
Afin de confirmer les résultats obtenus, ce même extrait PCR (RACE-AbiQ) a été cloné dans le vecteur
pBS-KS et inséré dans la souche E. coli XL1-blue. Trois différents ratios vecteur : insert (1: 1, 1: 3 et 1: 5)
ont été utilisés afin d’éviter une sélection dépendante de la longueur de l’amplicon. Trente clones issus de
chacun des ratios ont été repiqués puis criblés par PCR en ciblant les amplicons de taille attendus (>250
nt). Parmi eux, 15 clones potentiels (ratios 1 : 3 et 1 : 5) ont été identifiés. Les résultats de séquençage
obtenus (clone 6C, 9C, 8C, 5D et 10C) ont permis de confirmer le site de coupure (A26/A27, A/AAA)
et suggèrent que la fréquence de coupure est équivalente pour les répétitions complètes. Toujours comme
ce qui avait été observé auparavant, il ne semble pas y avoir de coupure dans la portion 0,8 répétition
(R3) d’antiQ (figure 3.1.4.). D’autres clones (11E, 4G, 7B, 7G et 12A) ont permis de déterminer le site
d’initiation de la transcription qui alterne entre deux bases adjacentes (TAA et TAA). Certains clones
possèdent des mutations dans antiQ et/ou le gène abiQ. Ces mutations sont probablement non spécifiques
causées par un taux d’erreur élevé de la transcriptase inverse (Potter et al., 2003).
Figure 3.1.4. Séquençage de 15 clones pBS-KS (RACE-AbiQ). Les répétitions (R), le TSS et le terminateur en aval d’antiQ (T1) sont indiqués en haut de la première séquence (11E).
Parmi les résultats qui n’étaient pas prévus, un des clones (clone 7A) avait perdu deux répétitions
complètes et ce, sans aucune mutation dans l’opéron AbiQ. Aussi, il a été possible d’identifier des sites
d’arrêt de la transcription (clone 7H, 10A et 8B) à l’intérieur du gène abiQ. Trois différentes séquences de
coupure ont été alignées sur 10 nucléotides (de part et d’autre du site de coupure) et sont présentées sous
forme LOGO (figure 3.1.5.) (Crooks et al., 2004). Malgré un faible nombre d’échantillons, les résultats
suggèrent que la coupure serait séquence-spécifique aux régions TNAAA (ARN : UNAAA) où N signifie
n’importe quel nucléotide (T (U), A, C ou G).
57
Figure 3.1.5. Représentation graphique LOGO de l’alignement de trois séquences de coupure par ABIQ (Séquence de 10 nt en ADN) (Crooks et al., 2004).
Les données obtenues avec cette expérience nous ont permis de dresser une carte associant les fragments
d’antiQ clivées à leur taille réelle (figure 3.1.6.). Parmi tous les fragments théoriques possibles, seulement
deux fragments (rouge) semblent être moins générés. Il y a une très faible bande pour le fragment 106 nt
alors que le fragment 74 nt n’est pas du tout détecté. Dans les deux cas, ces fragments nécessitent une
coupure dans la portion 0,8 répétition (R3) d’antiQ pour être générés. Ces résultats suggèrent donc une
faible spécificité de coupure dans cette région.
Figure 3.1.6. Profil de digestion d’antiQ incluant tous les fragments théoriques suivant la coupure. Adaptée des résultats d’hybridation Northern (L. lactis IL1403 AbiQ+) de (Samson et al., 2013c). Les fragments en rouge (106 nt et 74 nt) sont absents ou peu présents in vivo.
58
I. Caractérisation des mutants Δ répétitions (antiQ)
Une fois le profil de coupure dressé, nous nous sommes intéressés à l’effet de certaines modifications
spécifiques sur l’antitoxine antiQ. Dans un premier temps, nous cherchions à connaître les effets de l’ajout
ou du retrait de répétitions sur les deux activités du système AbiQ, soit l’activité anti-phage et l’activité
endoribonucléase. Lors d’une expérience de mutagénèse dirigée par amplification de plasmide ciblant le
gène abiQ (Samson et al., 2013c), des mutants avec un nombre variable de répétions (0,8r à 3,8r) ont été
isolés. En utilisant la même méthode, la séquence sauvage d’abiQ a été rétablie tout en conservant les
modifications dans le nombre de répétitions (Mut Δ répétitions). Des clones Mut 1,8r et Mut 3,8r ont été
obtenus mais aucun clone Mut 0,8r, et ce malgré de multiples tentatives. Ces résultats suggèrent que 0,8
répétition n’est pas suffisante pour contrôler l’effet toxique d’ABIQ in vivo.
Les plasmides Mut Δ répétitions ont été transformés dans la souche L. lactis IL1403 et testés contre le
phage P008 (AbiQs). Fait intéressant, l’addition (3,8r) ou la suppression (1,8r) d’une répétition d’antiQ
mènent tous deux à une augmentation de l’EOP comparé à la construction naturelle (2,8r), soit de 4 et 3
logs respectivement (tableau 3.1.1.). En d’autres termes, la modification du nombre de répétitions mène
à une diminution importante de l’efficacité anti-phage. Également, les mutants (Mut 1,8r et Mut 3,8r)
diminuent toujours significativement la capacité d’infection de P008 et cela se traduit par une réduction
de la taille des plages de lyse.
Tableau 3.1.1. Efficacité anti-phage des mutants Mut Δ répétitions antiQ contre P008. L’EOP et la taille des plages de lyse du phage (P008) sont comparés à la souche sauvage L. lactis IL1403 pNZ123-AbiQ.
Souche (L. lactis)
EOP Plages de lyse
(mm)
IL1403 pNZ123 -------------- 3 - 5
IL1403 pNZ123-AbiQ (2,8r) (N=4) 2,4±1,1×10-5 1 – 4
IL1403+ pNZ-AbiQ (1,8r) (N=5) 2,9±2,4×10-2 1
IL1403+ pNZ-AbiQ (3,8r) (N=5) 2,4±1,3×10-1 1
N : Nombre de répétition biologique de l’expérience.
59
Par la suite, nous avons analysé le profil de transcription/digestion d’antiQ par hybridation Northern pour
les trois souches AbiQ (figure 3.1.7.). La sonde était une seule répétition d’antiQ. La figure 3.1.7. montre
que l’antitoxine est coupé de la même façon, tant pour la souche sauvage que pour les mutants. De plus,
il est intéressant de constater que ni le niveau de transcription, ni le site ou la fréquence de coupure ne
semblent être modifiés en fonction du nombre de répétitions.
Figure 3.1.7. Hybridation de type Northern ciblant antiQ dans les souches L. lactis IL1403 Δ répétitions (Mut 1,8r et Mut 3,8r) et pNZ123-AbiQ. La sonde constitue une répétition complète d’antiQ.
Les souches Mut Δ répétitions ont par la suite été infectées avec le phage P008 et différents temps post-
infection ont été mesurés pour suivre le niveau de transcription d’antiQ (Non-infecté (NI), 2, 10, 20, 30
et 40 minutes). Dans les trois cas, on observe une faible réduction d’expression à 10 minutes (figure
3.1.8.A). Cette réduction n’a pas été notée auparavant (Samson et al., 2013c). La même membrane a été
traitée à la chaleur pour éliminer les sondes puis utilisée afin d’évaluer la transcription du gène abiQ.
L’expression de ce gène diminue à partir de 10 minutes jusqu’à la fin de l’infection (30 minutes), encore
une fois sans différence entre les trois souches (figure 3.1.8.B).
Ces résultats compilés suggèrent que la taille standard d’antiQ (2,8 répétitions) est essentielle pour une
efficacité anti-phage maximale, et que l’efficacité n’est pas due à une modification au niveau
transcriptionnel. De plus, l’infection par le phage ne semble pas modifier significativement la transcription
ni d’antiQ ni du gène abiQ, autant chez AbiQ sauvage que pour les mutants. Aussi, le fait que des clones
Mut 1,8r ait été isolés prouve qu’une région antiQ de 1,8 répétition est suffisante pour neutraliser la toxine
ABIQ et permettre la survie cellulaire.
60
Figure 3.1.8. Hybridation de type Northern ciblant antiQ et le gène abiQ dans les souches L. lactis IL1403 Δ répétitions (Mut 1,8r et Mut 3,8r) et pNZ123-AbiQ en cours d’infection par le phage P008. (A) Northern ciblant 1 répétition d’antiQ. (B) Northern ciblant le gène abiQ. Dans les deux cas, les extraits de la figure 3.3.1. (NI 1,8r et NI 3,8r) ont été utilisés comme marqueur de taille.
II. Caractérisation des mutants ponctuels (Mut antiQ)
Suite aux résultats obtenus pour les mutants Δ répétitions (antiQ), nous nous sommes intéressés à
l’importance de certains nucléotides clés dans antiQ. Plus précisément, neuf nucléotides ont été modifiés
en utilisant à nouveau la mutagénèse dirigée par amplification de plasmide. Les mutations étaient
majoritairement introduites près du site de coupure (figure 3.1.9.), dans la première répétition seulement
afin de permettre la conservation d’une région de 1,8 répétition complète qui suffit pour neutraliser ABIQ
et maintenir la survie cellulaire. Les mutations plus éloignées du site de coupure servaient de contrôle
(A13C et A40C) ou de clone test pour analyser l’effet d’une mutation dans la structure secondaire en
pseudonoeud prédite (G32A). Afin de simplifier l’analyse des résultats, les positions des mutations ont
été numérotées en marquant le début de la première répétition comme point de départ.
61
Figure 3.1.9. Représentation des mutations ciblées dans antiQ. La flèche rouge démontre le site de coupure de la première répétition.
Malgré plusieurs tentatives, nous n’avons pas obtenu de clones contenant les mutations G23A et C40A
(tableau 3.1.2.). Ceci suggère que ces sites joueraient un rôle majeur dans la régulation de la toxicité
d’ABIQ. Parmi les clones obtenus, seul le mutant A27C n’a pas été utilisé pour les expériences
subséquentes.
Tableau 3.1.2. Fréquence d’obtention des clones mutants ponctuels antiQ.
L’efficacité anti-phage des mutants antiQ a d’abord été évaluée en utilisant le phage P008 (tableau 3.1.3.).
L’expérience a été réalisée en duplicata biologique et chaque titre était évalué en triplicata. Tel que
mentionné auparavant, l’EOP de P008 sur la souche AbiQ+ sauvage est de 10-5. Des données similaires
ont été obtenues pour les mutants A13C et T25C. À l’inverse, les mutations A24C, A26C et A28C mènent
tous à un EOP de 1, donc une perte totale d’activité d’anti-phage. Il est a noté que le seul clone Mut
A28C obtenu contient 3,8 répétitions (les deux premières répétitions possèdent cette mutation A28C).
Cette acquisition d’une répétition complète est également survenue pour la mutation G32A. Toutefois,
un clone G32A de 2,8 répétitions a aussi pu être isolé. L’EOP des deux clones G32A est de 10-8, indiquant
donc que cette mutation permet d’augmenter significativement l’activité anti-phage.
Par la suite, ces mêmes mutants antiQ ont été utilisés dans une expérience d’hybridation Northern et leur
profil de digestion a été comparé les uns par rapport aux autres (tableau 3.1.3.). Les clones A13C et T25C
possèdent un profil similaire de digestion que la souche sauvage. Pour les mutants A24C et A26C, une
modification majeure a été obtenue en remplaçant partiellement (A24), ou totalement (A26), le fragment
de 97 nt par celui de 106 nt. Ces bandes sont générées respectivement par une coupure d’antiQ complet
dans la première répétition ou dans la dernière (0,8 répétition).
62
Donc, ces mutations spécifiques (A24C ou A26C) permettent de bloquer la coupure dans la première
répétition ce qui favorise la coupure dans la dernière répétition (0,8 répétition). Une diminution partielle
de la fréquence de coupure au premier site a également été observée pour le mutant A28C. Finalement,
les mutants G32A et G32A-3,8 présentaient un profil de digestion similaire au sauvage. Toutefois, une
augmentation significative du fragment 97 nt (1er site jusqu’au terminateur) a été observée. Il est possible
que cette modification permette d’augmenter la fréquence de coupure dans la première répétition,
toutefois d’autres expériences seraient nécessaires afin de le confirmer.
Tableau 3.1.3. Résultats cumulatifs des activités anti-phage (EOP) et endoribonucléique pour les différents mutants antiQ (Northern : Sonde 1 répétition d’antiQ).
Afin d’expliquer ces observations, nous avons analysé la structure secondaire des ARNs mutants antiQ.
Le logiciel RNAfold (Visualisation par Varna) a été utilisé pour déterminer la structure des ARNs antiQ
complets (figure 3.1.10.). L’analyse de l’ARN sauvage démontre une accessibilité facile au site de coupure
(A/AAA) dans antiQ. Autre observation intéressante, la région polyA de la portion 0,8 répétition est
prédite pour former un rallongement de la structure tige boucle (terminateur T1 rho-indépendant
séparant antiQ et le gène abiQ) par liaison avec les multiples T (U) à la fin du terminateur. Cela pourrait
expliquer la faible fréquence de coupure dans cette dernière répétition. La mutation A24C mène à une
modification majeure dans la structure de l’ARN ce qui positionne le site de coupure dans une zone plus
restreinte. Un mésappariement dans la boucle adjacente pourrait également restreindre l’accessibilité de
la protéine ABIQ au site de coupure. D’un autre côté, la base A26 serait essentielle à la reconnaissance
et/ou coupure puisque la structure générale de l’ARN n’a pas été modifiée. La mutation A28C présente
une mutation dans la structure, toutefois ce n’est pas clair si la modification du profil de coupure est
déterminée par la structure ou la séquence. Les autres mutations ne présentaient pas de modification
structurale importante permettant de cacher ou modifier directement le site de reconnaissance et/ou de
coupure par ABIQ.
63
Figure 3.1.10. Comparaison des structures prédites des ARNs antiQ. antiQ complet (A), les différents mutants Δ répétitions (B, C) et les mutants ponctuels (D-J). Les nucléotides verts entourent le site de coupure alors que les rouges montrent le nucléotide muté.
64
La base G32 est la seule ayant été mutée qui appartient à la structure en pseudonoeud prédite. Le logiciel
pknotsRG, en combinaison avec pseudoviewer3, a donc été utilisé pour analyser cette structure. Les
résultats démontrent une modification majeure dans la structure en pseudonoeud du premier ARN
mature (généré par la coupure dans la première et deuxième répétition) (figure 3.1.11.). Cette mutation
formerait donc des ARN immatures incapable de se lier à la toxine, et expliquerait du même coup
l’augmentation de l’activité anti-phage observé préalablement.
Figure 3.1.11. Analyse de la structure en pseudonoeud d’antiQ chez le mutant AbiQ-(A32C). La structure de antiQ sauvage (gauche) et la structure antiQ-A32C ont été prédites par pKnotsRG. Seuls les nucléotides des répétitions sont inclus dans la séquence (T en remplacement de U pour simplifier l’analyse). Les flèches rouges démontrent le site G32 (sauvage) ou A32 (mutant).
Nous nous sommes également demandé si ces différentes mutations pouvaient influencer la croissance
des bactéries. À titre comparatif, les mutants Δ répétitions ont aussi été testés dans cette expérience. Les
temps de génération (g) des clones mutés (sauf A28C) sont tous similaires entre eux, aux mutants Δ
répétitions et à la souche avec AbiQ sauvage (60 minutes). Dans la littérature, on dénote un temps de
dédoublement de 48 minutes pour L. lactis IL1403 (Panoff et al., 1994), différence qui est probablement
due à la présence de l’antibiotique (chloramphénicol) présent pour la sélection du plasmide contenant
AbiQ. Le mutant AbiQ (A28C) a un temps de dédoublement de 100 minutes, suggérant une modification
importante au niveau de la régulation toxique. Toutefois, nous ne pouvons exclure pour l’instant la
possibilité que des mutations extérieures à l’opéron AbiQ soient la cause de ce ralentissement de
croissance.
Objectif 2 : Étude de la réplication virale et cellulaire en présence du système AbiQ
Le système AbiQ est efficace contre les espèces de phage 936 (phage P008 et biL170) et c2 (phage c2)
(Emond et al., 1998). Les phages modèles P008 et P008-Q12 (orf38M, Pro38Leu) ont été utilisés pour
analyser plus en détail cette activité anti-phage.
65
Croissance de L. lactis IL1403 en présence d’AbiQ
Pour ce faire, la croissance cellulaire de L. lactis IL1403 pNZ123-AbiQ (AbiQ+) a été évaluée en suivant
la densité optique à 600nm en cours d’infection (figure 3.2.1.). En plus de tester la souche non infectée
(NI), la souche L. lactis IL1403 pNZ123 (AbiQ-) a également été utilisée comme contrôle négatif dans
cette expérience.
Les résultats démontrent que le phage P008 cause rapidement l’arrêt de la croissance chez l’hôte sensible
(L. lactis AbiQ-) avec un temps de 100 minutes avant d’atteindre la phase de déclin. En observant le
graphique, on constate que ces 100 premières minutes correspondent à la phase d’adaptation de la
réplication cellulaire, moment où le taux de dédoublement (g) est pratiquement nul. En présence du
système AbiQ, la souche peut neutraliser partiellement l’infection par ce phage ce qui permet une bonne
croissance cellulaire jusqu’au temps 200 minutes avant d’atteindre la phase stationnaire et 300 minutes
pour la phase de déclin. Le phage mutant P008-Q12 infecte aussi la souche (AbiQ-) toutefois avec une
moins grande efficacité (déclin à 125 minutes). Ce même phage permet de contourner efficacement le
système AbiQ puisque la mort cellulaire est aussi observée rapidement (déclin à 150 minutes)
comparativement au phage sauvage P008.
Figure 3.2.1. Courbes de croissance (DO600nm) de L. lactis IL1403 pNZ123-AbiQ (AbiQ+) ou pNZ123 (AbiQ-
) en présence et absence du phage P008 ou le mutant P008-Q12 (Q12). Prélèvement à chaque 5 minutes.
Courbes de croissance des phages P008 et P008-Q12 (AbiQ+)
Les phages P008 et P008-Q12 ont été utilisés afin de définir le rôle du produit de gène orf38 sur l’efficacité
de réplication en présence d’AbiQ. Le temps de latence, ainsi que le nombre de phages relâché par cellule
infectée ont été calculés. Seules les combinaisons P008/pNZ (AbiQ-), P008-Q12/pNZ (AbiQ-) et P008-
Q12/AbiQ (AbiQ+) ont été testées (figure 3.2.2.) et ces résultats ont été publiés en 2013 (Samson et al.,
2013a).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 100 200 300 400
DO
600n
m
Temps (min)
pNZ-NI
AbiQ-NI
pNZ-Q12
AbiQ-Q12
pNZ-P008
AbiQ-P008
66
Lorsque P008 infecte la souche sensible (AbiQ-), 310 ± 67 phages sont relargués par cellule infectée en
38,9 ± 0,6 minutes. En comparaison, le phage mutant P008-Q12 nécessite 43,0 ± 1,5 minutes pour sa
réplication et relargue 230 ± 47 phages par cellule infectée. La réduction d’efficacité d’infection est encore
plus importante lorsque ce même phage mutant croit sur la souche AbiQ+. Le temps de latence est alors
de 47,1 ± 0,7 min et seulement 9 ± 4 phages sont relâchés. Ces résultats démontrent que la mutation
dans le gène orf38 diminue significativement l’efficacité d’infection de P008 mais lui permet d’échapper
au système AbiQ.
Figure 3.2.2. Courbes de croissance virale (P008 ou P008-Q12) pendant l’infection de L. lactis pSRQ928 (AbiQ+) ou IL1403 pNZ123 (AbiQ-). Prélèvement à chaque 10 minutes. Les barres d’erreur représentent l’écart-type sur la moyenne des trois essais réalisés par courbe de croissance.
Analyse de la traduction d’abiQ en cours d’infection
Tel que démontré dans l’objectif 1, l’infection par le phage ne semble pas modifier le niveau de
transcription d’antiQ et d’abiQ. Considérant cela, il nous apparaissait important de vérifier si l’infection
par le phage cause une modification au niveau de la traduction du transcrit d’abiQ.
Pour ce faire, la souche L. lactis IL1403 pNZ123-AbiQ6H (étiquette 6His en C-ter d’ABIQ) et la souche
contrôle (L. lactis IL1043 pNZ123) ont été infectées par le phage P008 ou le mutant P008-Q12. Les
protéines solubles ont été extraites à différents temps d’infection, dosées puis migrées sur gel SDS-PAGE
à concentration égale (50 ng ou 1 µg). Aucune modification significative n’a été observée au niveau de
l’expression des protéines totales (données non présentées).
10000000
100000000
1E+09
1E+10
1E+11
0 20 40 60 80 100
Tit
re d
u ph
age
(log
10)
Temps (min)
AbiQ-Q12
pNZ-Q12
pNZ-P008
67
Les protéines (50 ng) ont été transférées sur membrane et la protéine ABIQ (20,3 kDa) ciblée par un
anticorps spécifique aux régions riches en histidines (immunobuvardage de type Western). Les résultats
démontrent que la protéine ABIQ est produite de façon constante et/ou qu’elle est stable tout au long
de l’infection par P008 (figure 3.2.3.). Ces résultats ont été publiés en 2013 (Samson et al., 2013c). De
façon similaire, le mutant P008-Q12 ne semble pas affecter le niveau de traduction d’abiQ. Toutefois, il
semble y avoir une légère diminution d’ABIQ au temps 40 minutes seulement dans le cas du phage P008-
Q12. Nous n’avons pas jusqu’à présent trouvé d’hypothèse pour expliquer ce résultat. Fait intéressant,
l’augmentation de la concentration de protéines totales (1 µg) nous a permis d’observer l’apparition d’une
bande supérieure estimée à 40 kDa. Pour P008, cette bande augmente en intensité au cours de l’infection
jusqu’au temps 30 minutes, avant de diminuer par la suite. Chez le phage mutant P008-Q12, cette bande
semble plutôt stable au cours de l’infection. En fonction des tailles (40 kDa), cette bande pourrait être un
dimère ABIQ : ABIQ. La protéine ABIQ contient un résidu cystéine. Cet acide aminé permet la
formation de dimère protéique via la formation de pont disulfure entre deux cystéines.
Figure 3.2.3. Résultats d’immunobuvardage Western (anti-his) ciblant la protéine ABIQ(His) durant une infection de L. lactis IL1403 AbiQ+ par le phage P008 ou P008-Q12. Une concentration de protéine totale de 50 ng (gels du haut) ou 1 µg (gels du bas) a été utilisée.
68
Objectif 3 : Caractérisation de la protéine virale ORF38 (phage P008) et de son rôle dans l’activité du système AbiQ
La protéine ORF38 du phage P008 constitue un activateur/cible du mécanisme anti-phage AbiQ
(Samson et al., 2013a). Cette protéine n’a pas de fonction connue sur la réplication du phage, malgré que
les résultats suggèrent que celle-ci soit essentielle (Samson et al., 2013a). ORF38 est une petite protéine
de 8,3 kDa avec un pI de 4,46 (http://web.expasy.org/protparam/). Une analyse avec le logiciel Phyre a
permis d’identifier une région de 29 aa (N-ter) qui possède 20,5% de similarité structurale avec un
domaine de liaison aux acides nucléiques, suggérant un rôle similaire (Kelley et Sternberg, 2009). La
structure secondaire prédite est composée de deux hélices alpha séparées au centre par un résidu proline
(http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (Cole et al., 2008). Afin de la caractériser davantage,
des systèmes d’expression procaryotes ont été utilisés pour produire la protéine ORF38 sous forme
recombinante. La majeure partie de cet objectif a été réalisé lors d’un stage dans un laboratoire Marseillais
spécialisé dans l’étude structurale et fonctionnelle des protéines (AFMB, Laboratoire de C. Cambillau).
Expression d’ORF38 chez L. lactis (système NICE)
Le système NICE (NIsin Controlled gene Expression system) a été le premier système d’expression testé
chez Lactococcus lactis. Le gène d’orf38 a été cloné dans le plasmide pNZ8010 par clonage directionnel de
sorte que la protéine soit en fusion avec une étiquette 6His en C-terminale. Cette construction a été
transformée dans la souche d’expression L. lactis NZ9000 puis les cellules induites suivant une matrice
partielle d’expérience (DoE) afin d’optimiser les conditions d’expression. La surexpression d’ORF38-His
était évaluée sur gel de polyacrylamide suite à la séparation des protéines insolubles (culot) et des protéines
solubles (surnageant) par centrifugation. Malgré les nombreuses conditions testées, aucune n’a permis
d’observer une surexpression de la protéine d’intérêt (figure 3.3.1.).
Nous nous sommes ensuite posé la question si le site de liaison au ribosome (RBS) pouvait être optimisé
afin de favoriser cette surexpression. Pour ce faire, le RBS natif d’orf38 (AGAAAGTCGGT) a été
remplacé par le RBS du gène abiQ (AGGAGA), du gène orf6 du phage p2 (ATCAAAAAGAA) (Labrie et
al., 2012) ou le RBS consensus chez L. lactis (AGAAAGGAGGT). Les profils protéiques étaient similaires
à ceux avec le RBS natif d’orf38, c’est-à-dire qu’aucune surexpression n’a été observée (données non
présentées). L’absence de surexpression d’ORF38 a par la suite été confirmée par des résultats négatifs
d’immunobuvardage Western puis de purification par affinité (Colonne Ni2+), tous deux ciblant l’étiquette
histidine (données non présentées).
69
Figure 3.3.1. Test d’expression d’ORF38-His chez la souche L. lactis NZ9000 (Système NICE) en utilisant différentes conditions d’expression. Migration sur gel polyacrylamide Ny-Kd (Bio-Rad). La température d’induction (18, 25 et 30°C), le temps d’induction (1 h et 3 h) et la DO600nm d’induction (0,2 et 0,5) étaient des conditions variables avec une même concentration d’inducteur (0,5 mM IPTG). Les extraits de culot cellulaire (insoluble) sont indiqués par un astérisque (*) alors que les autres sont des extraits de protéines solubles. La flèche représente la taille d’ORF38-His attendue (8,3kDa).
Expression d’ORF38-GST chez E. coli
Suite aux essais infructueux de surexpression d’ORF38-His, l’utilisation d’une étiquette GST en N-
terminale a été considérée pour permettre l’expression d’ORF38. Cette étiquette permet d’augmenter la
solubilité des protéines recombinantes tout en permettant une purification rapide par colonne sépharose
gluthathione. Tout d’abord, l’orf38 a été cloné dans le vecteur pGEX-4T-1 puis transformé dans la souche
d’expression E. coli BL21 codon+. Les résultats d’expression et de purification sont présentés dans la
figure 3.3.2. L’addition de l’étiquette GST a permis une bonne expression de la protéine d’intérêt malgré
que la majorité de GST-ORF38 soit retrouvée dans le culot, donc retrouvé sous forme de corps
d’inclusion (insoluble). La purification par affinité permettait de séparer efficacement notre protéine
d’intérêt des autres protéines contaminantes. Toutefois, la protéine ORF38 est rapidement dégradée telle
qu’observée sur gel SDS-PAGE par la présence de plusieurs bandes entre 34 kDa (GST-ORF38) et 26
kDa (GST). Face à ce problème, nous avons muté l’orf38 directement dans le système d’expression via la
mutagénèse dirigée afin de tester si une modification dans la protéine pouvait la rendre moins sensible à
la dégradation et du coup, facilité son expression. La mutation présente chez le phage mutant P008-Q12
(Pro38Leu) a été choisie puisqu’elle induit une modification majeure de la protéine par le remplacement
d’un résidu proline. Ceux-ci sont le plus souvent impliqués dans la cassure de la structure secondaire des
protéines (MacArthur et Thornton, 1991). Contrairement aux résultats souhaités, la protéine ORF38-
Q12 est plus sensible à la dégradation que la protéine sauvage. En fait, aucune bande correspondant à la
taille GST-ORF38 n’a été observée (données non présentées).
70
Figure 3.3.2. Résultats de l’expression et purification de GST-ORF38 sur colonne d’affinité (Glutathione). Un extrait non induit est présenté à gauche de l’extrait induit (0,5 mM IPTG). Encore une fois, les extraits de culot cellulaire (insoluble) sont indiqués par un astérisque (*). La flèche rouge indique GST-ORF38 (34 kDa) alors que la flèche bleue indique l’étiquette GST (26 kDa) attendu. Migration sur gel polyacrylamide Ny-Kd (Bio-Rad).
Stratégie de clonage en bloc (orf37-orf39)
Le clonage en bloc a ensuite été choisi comme alternative pour la production d’ORF38 (Campanacci et
al., 2010). L’orf38 appartient à un groupe de trois gènes (orf37-orf39) qui sont cotranscripts, et qui sont
également très conservés chez les phages du groupe 936 (Rousseau et Moineau, 2009; Samson et al.,
2013a). De fait, nous envisagions la possibilité que les produits de ces gènes puissent interagir ensemble
et qu’il serait ainsi possible de les copurifier afin d’augmenter les rendements de production de notre
protéine d’intérêt. Les différentes combinaisons de gènes ont été clonées dans le vecteur pETG20A (TRX
en N-ter) via la technique Gateway et transformées dans la souche de clonage (E.coli NEB 10-beta). Seuls
les clones pETG20A:orf38 et pETG20A:orf39-orf38 ont pu être isolé, et ce malgré plusieurs tentatives. Ces
résultats suggèrent que le produit de l’orf37 est toxique chez E. coli puisqu’aucun clone n’a été obtenu avec
ce gène. Les bonnes constructions (TRX-ORF38 et TRX-ORF39-ORF38) ont été transformées dans la
souche d’expression E. coli T7 express pLysS avant d’être induit. Les protéines d’intérêts ont été purifiées
par affinité (Ni2+) puis migrées sur gel SDS-PAGE. Les résultats démontrent qu’il n’existe pas
d’interaction stable entre TRX-ORF39 et ORF38 qui peut permettre une co-purification, rendant ainsi
la stratégie de clonage en bloc inefficace dans ce cas précis (données non présentées).
Néanmoins, ces combinaisons de clonage ont permis de générer un clone pour l’expression de TRX-
ORF38. Suite à l’induction du système, la protéine fut purifiée par affinité (Ni2+ + dialyse), séparée de
l’étiquette TRX (Ni2+ 2) et purifiée par exclusion de taille (GF Superdex 75). Les étapes de purification
71
étaient faites dans le tampon Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM. Les rendements de production étaient
trop bas pour que la protéine puisse être utilisée lors des expériences subséquentes (≈100 µg/L). Des
prélèvements de chacune des étapes de purification ont été migrés sur gel SDS-PAGE (figure 3.3.3.).
L’analyse du gel obtenu a permis d’identifier les problèmes majeurs expliquant ce faible rendement de
production. La majorité de la protéine est produite sous forme de corps d’inclusion (Puits 2, TRX-
ORF38*), elle est rapidement dégradée (Puits 3-4, TRX-ORF38) et elle s’agrège au cours de la purification
et/ou coupure de l’étiquette TRX(His) (Puits 7, V0 GF S75 : Agrégats ORF38).
Figure 3.3.3. Expression et purification de la protéine TRX-ORF38. 1. Marqueur pré-coloré, 2. Culot, 3. Surnageant, 4. Élution de Ni2+-1 (TRX-ORF38, Imidazole 250 mM), 5. FT de Ni2+-2 (ORF38), 6. Élution de Ni2+-
(TRX(His)+TEV), 7. V0 de GFS75 (Agrégats ORF38), 8. VElution de GFS75 (ORF38). V0 (Volume mort) contient tout les molécules dépassant la limite de la colonne soit 75 kDa pour la GFS75. Migration sur gel polyacrylamide 18%.
Afin d’augmenter les rendements de production d’ORF38, les conditions d’expression et de stabilité ont
été optimisées en utilisant différents tampons de purification (voir Matériel et Méthodes). La stabilité était
testée en mesurant la DO320nm (Vincentelli et al., 2004) et l’expression sur gel de la protéine d’intérêt. Le
tampon optimal identifié fut le Tris pH 7.5, NaCl 500 mM démontrant ainsi que la force ionique permet
d’augmenter la stabilité d’ORF38 (données non présentées). Les conditions déterminées au cours de ces
expériences d’optimisation ont été réutilisées pour la purification complète d’ORF38 (Puits 8, ORF38) et
ont permis d’augmenter les rendements de production à ≈ 250 µg/L, soit un rendement 2,5 fois plus
élevé. L’augmentation de la stabilité était facilement observable sur colonne d’exclusion de taille (GF) par
diminution du pic au volume mort (V0, agrégats d’ORF38) et l’augmentation du pic d’ORF38 soluble (≈
8 kDa) (données non présentées).
72
Ensuite, l’analyse de la protéine par SEC-MALS (Wyatt) a démontré que celle-ci était stable une fois
purifiée, même avec une diminution de la force ionique dans le tampon (150 mM NaCl). Cette expérience
a également permis de démontrer la masse experimental d’ORF38 qui est de 8,5 kDa ce qui correspond
à la taille théorique calculée de 8,3 kDa.
Test d’interaction entre ORF38 et antiQ
Différents ARNs d’antiQ ont été synthétisés in vitro et utilisés pour tester leur interaction avec ORF38 par
résonance des plasmons de surface (SPR-Biacore). La protéine ORF38 a été fixée à la surface puis exposée
aux analytes potentiels : le fragment d’ARN 130 nt (antiQ complet) ou 35 nt (1 répétition d’antiQ). Les
résultats préliminaires démontrent une faible interaction entre les deux molécules ORF38 et antiQ-1
répétition (35 nt) qui se traduit dans la figure 3.3.4.A par une augmentation rapide de la réponse d’unité
relative (RU). Cette interaction n’est pas observée pour antiQ complet. En effet, le signal observé pour
antiQ complet est simplement la poursuite du signal pour le passage d’antiQ 35 nt. Afin de définir la force
de l’interaction, une expérience complète a été réalisée en exposant différentes concentrations d’ARN 35
nt à la surface-ORF38 (figure 3.3.4.B). L’interaction entre les deux est faible, plus précisément elle est de
l’ordre du mM. Le taux de dissociation est très lent, ce qui suggère une faible fréquence de dissociation
entre les deux molécules lorsqu’elles sont liées. Comme nous n’avons pas été en mesure de saturer la
surface avec l’ORF38, les valeurs décrivant la cinétique de l’intéreraction tel Kon et Koff n’ont pas pu être
déterminées. Ces résultats ne sont pas absolus et nécessitent d’autres essais afin d’être confirmés.
Figure 3.3.4. Résultats d’interaction préliminaire SPR-Biacore entre antiQ et ORF38. (A) Analyse primaire d’interaction avec les fragments ARN 35 nt (1 répétition) et 130 nt (antiQ complet). (B) Expérience d’interaction d’ORF38 avec différentes concentration (0-200 µM) d’ARN 35 nt.
73
Discussion
Les bactériophages constituent une des causes majeures associées à la perte de productivité dans
l’industrie de la transformation du lait. Pour cette raison, de nombreux projets de recherche ont été
réalisés sur cette problématique et sur les moyens possibles afin de réduire ce problème. Parmi les
stratégies disponibles, l’utilisation de système génétique permettant aux cellules de résister aux phages est
une avenue intéressante. De nombreux systèmes anti-phages de L. lactis ont été caractérisés (Labrie et al.,
2010), toujours dans le but ultime de pouvoir les utiliser en industrie. Dans le cadre de ce projet, nous
nous sommes intéressés à la caractérisation moléculaire du mécanisme de l’avortement de l’infection
AbiQ. Notre intérêt a porté sur son activité anti-phage, mais également sur son activité toxine-antitoxine
de type III qui a récemment été décrite (Samson et al., 2013c).
Étude de la spécificité d’antiQ dans le système AbiQ
Le système AbiQ a été décrit et caractérisé pour la première fois en 1998 (Emond et al., 1998). Tout
d’abord, nous avons cherché à confirmer les résultats obtenus en réalisant quelques analyses bio-
informatiques ciblant l’opéron AbiQ (figure 3.1.1.). Nos analyses ont mis en évidence la présence d’une
séquence répétée de 2,8 répétitions comparativement aux 2,5 répétitions préalablement identifiées, ainsi
qu’un terminateur rho-indépendant (T1) séparant les séquences répétées (antiQ) du gène abiQ. En 1998,
le codon d’initiation (ATG) d’abiQ avait été identifié dans la séquence de ce terminateur. Ce mauvais
codon d’initiation est situé 33 nt en amont du codon d’initiation (ATG) du gène abiQ que nous avons
identifié ici. Dans le cas des boites -35 (TTGCAT) / -10 (TATAAT) du promoteur, le codon d’arrêt et le
terminateur de l’opéron (T2), les résultats obtenus correspondaient à ceux présentés auparavant (Emond
et al., 1998). Lors de la caractérisation du promoteur, nous avons identifié une séquence UP
(AAAAAATA) similaire à la séquence consensus (AAAAAARNR) (Estrem et al., 1999). Cette dernière
constitue généralement un site additionnel de liaison de l’ARN polymérase et joue un rôle dans la force
du promoteur. Les régions promotrices -35/-10 sont également similaires aux séquences consensus chez
L. lactis et E. coli : (-35) TTGACA et (-10) TATAAT (Doi et Wang, 1986; de Vos et Simons, 1994).
Toutefois, à l’inverse de ce qui fut observé chez E. coli, il ne semble pas y avoir un lien solide entre la
similarité (boîtes -10 et -35) et la force du promoteur chez L. lactis (Jeong et al., 2006). Néamoins, nos
analyses bio-informatiques suggèrent qu’il y aurait une forte transcription d’antiQ et une faible
transcription d’abiQ due à la présence d’un terminateur (T1) entre les deux. À titre comparatif, le
terminateur de l’opéron d’un autre système toxine-antitoxine de type III (ToxINPa) permet de bloquer
approximativement 90% de la transcription du gène toxique toxN (Fineran et al., 2009). La similarité entre
74
les deux systèmes nous amène à croire que les résultats seraient similaires pour AbiQ.
Suite aux analyses informatiques, nous nous sommes intéressés à l’antitoxine antiQ au sein du système
AbiQ. antiQ est un ARN non codant (2,8 répétitions de 35 nt) qui est coupé de façon séquence spécifique
par la toxine ABIQ, formant un profil de coupure caractéristique (Samson et al., 2013c). L’étape primaire
était donc de définir le site de coupure et le site d’initiation de l’opéron afin de déterminer les fragments
d’antiQ matures (coupés) qui sont générés. Pour ce faire, la méthode 5’ RACE PCR a été utilisée à partir
des ARNs totaux extraits de la souche L. lactis IL1403 pNZ123-AbiQ. Avec cette méthode, tous les
fragments d’ARN générés par le promoteur de l’opéron AbiQ ont été amplifiés par PCR. Tel qu’attendu,
plusieurs fragments étaient observés sur gel d’agarose démontrant que différents fragments d’ARN sont
présents, et ce, en raison des multiples sites de coupure (répétitions) (figure 3.1.2.). Cet extrait PCR
hétérogène (RACE-AbiQ) a été directement séquencé et l’analyse du chromatogramme a permis
d’identifier le site d’initiation de la transcription (TAA) et le site de coupure dans antiQ (A/AAA).
Ces résultats ont par la suite été confirmés en clonant l’extrait RACE-AbiQ dans le vecteur pBS-KS chez
E. coli. Dans ce cas-ci, chacun des clones contenait uniquement un fragment d’ADNc permettant une
analyse plus efficace des sites de coupures. Quelques différences ont pu être identifiées entre le clonage
et le séquençage du produit PCR directement. Nos résultats démontrent qu’il n’y a pas un, mais bien deux
sites d’initiation de transcription (TAA et TAA) qui sont respectivement les positions -7 et -6 en amont
de la première répétition. Ce phénomène a été observé dans une étude portant sur la caractérisation des
sites d’initiation de transcription chez E. coli (Mendoza-Vargas et al., 2009). Fait intéressant, cette même
étude a mis en évidence la prévalence des bases thymine (35%) et adénine (31%) comme nucléotides de
départ (+1) lors de la transcription. Le site de coupure est le même qui fut identifié auparavant (A/AAA).
Ce site de coupure est similaire, mais tout de même différent, à la prédiction bio-informatique des
systèmes TA type III (/AAAA) fait par l’équipe de Salmond en 2012 (Blower et al., 2012b). Finalement,
nos résultats suggèrent qu’il n’y a pas de différence au niveau de la fréquence de coupure entre la première
et la deuxième répétition, alors que la coupure dans la troisième répétition (0,8 répétition) serait très faible
ou même nulle.
Deux des quinze clones analysés ont permis d’observer une délétion de deux répétitions complètes dans
l’antitoxine antiQ (0,8 répétition totale). Ce genre de mutants avec un nombre variable de répétitions (0,8,
1,8 et 3,8 répétitions) avaient déjà été observés lorsque le gène abiQ était muté spécifiquement (Samson
et al., 2013c). Toutefois, un de nos clones ne possède aucune mutation dans l’opéron AbiQ indiquant ainsi
que la modification du nombre de répétitions n’est pas nécessairement liée à une mutation dans le gène
de la toxine (abiQ).
75
Certains clones possédaient un insert (amplicon) qui n’atteignait pas la région antiQ, probablement en
raison d’une coupure dans le gène abiQ. Trois différents sites de coupures potentielles ont pu être
identifiés et ont été comparés par alignement LOGO. Bien que le nombre de séquences soit faible, les
résultats obtenus suggèrent que la coupure par ABIQ serait séquence spécifique aux régions UNAAA.
Toutefois, l’analyse des résultats de mutagenèse dans antiQ (AbiQ- (T25C), U25) permet d’éliminer le U
de cette séquence consensus puisque la mutation U25 ne modifie pas le profil de coupure d’antiQ. Ce
nucléotide n’est donc pas essentiel ce qui laisse une séquence spécifique aux régions riches en A comme
séquence de coupure. Cette caractéristique est également retrouvée chez les deux autres systèmes TA de
type III (ToxINPa : AA/AU et ToxINBt : A/AAAA) (Short et al., 2013).
La détermination du site de coupure et du TSS nous a permis de dresser le profil de digestion d’antiQ
(Figure 3.1.6.). Chacun des fragments théoriques a été utilisé pour l’identification des bandes de
l’expérience Northern démontrant la digestion d’antiQ (Samson et al., 2013c). La majorité des fragments
obtenus a pu être associée aux fragments théoriques. À l’inverse, le fragment 74 nt (1ier jusqu’au 3ième site
de coupure) n’est pas visible alors que le signal du fragment 106 nt (TSS jusqu’au 3ième site de coupure)
est très faible. Dans les deux cas, ces fragments matures nécessitent une coupure dans la troisième
répétition (0,8 répétition) pour être générés. Ces résultats suggèrent que la fréquence de coupure serait
très faible dans cette région, probablement en raison de la structure en tige-boucle du terminateur à
proximité. Les analyses de prédiction de structure d’ARN (figure 3.1.10.) démontrent que la série polyA
de la troisième répétition (0,8 répétition) d’antiQ interagit avec la séquence polyU du terminateur et
augmente la taille de la structure tige-boucle. Ceci pourrait séquestrer le site de coupure et ainsi diminuer
la fréquence de coupure par ABIQ à ce site. D’un autre côté, il a été démontré que le rallongement de la
structure en tige boucle (terminateur rho-indépendant) diminue l’efficacité de terminaison (Wilson et von
Hippel, 1995). Cette structure rallongée pourrait donc contribuer à la diminution de la terminaison, ce
qui permet la transcription d’abiQ en aval de ce terminateur.
Par la suite, nous nous sommes intéressés à l’effet de différentes modifications de l’antitoxine antiQ sur
l’activité du mécanisme AbiQ. Tout d’abord, des clones révertants avec un nombre variable de répétitions
(Mut Δ répétitions) ont été générés à partir de souches mutés dans abiQ ayant perdu ou acquit des
répétitions. Les multiples tentatives infructueuses pour obtenir pNZ-AbiQ (0,8r) suggèrent que 0,8
répétition n’est pas suffisante pour contrôler la toxicité d’AbiQ. Avec le même raisonnement, 1,8
répétition serait suffisant pour la régulation puisque de bons clones ont pu être obtenus. À titre
comparatif, le mécanisme ToxINPa nécessite 2,5 répétitions (sur 5,5 répétitions) pour prévenir la toxicité
de ToxN in vivo (Blower et al., 2009). Toutefois lorsque la protéine est exprimée en trans, seulement 1,5
répétition est nécessaire (Fineran et al., 2009). L’important serait d’obtenir au minimum une répétition
mature complète puisque ce fragment joue un rôle clé dans la régulation de la toxine dans les systèmes
76
TA de type III (Blower et al., 2011; Short et al., 2013).
Les souches Mut Δ répétitions obtenues (Mut 1,8r et Mut 3,8r) ont été testées pour leur activité anti-
phage et endoribonucléase en comparaison avec la souche sauvage (L. lactis IL1403 pNZ123-AbiQ). Cette
combinaison d’expériences est essentielle puisque ces deux activités ne sont pas nécessairement reliées.
En effet, certaines modifications dans ABIQ permettent d’éliminer l’activité anti-phage tout en
conservant la coupure spécifique de l’ARN (Samson et al., 2013c). Nos résultats démontrent que l’addition
et la réduction d’une répétition dans antiQ mène tous deux à une diminution significative de l’efficacité
anti-phage. Plus précisément, 1 phage sur 4 sera capable de contourner le mécanisme AbiQ-(3,8r) et 1
phage sur 35 pour la souche AbiQ-(1,8r), valeurs qui sont de loin inférieures au 1 phage sur 40,000 calculé
pour AbiQ sauvage. Aucune différence n’a été observée au niveau des profils de coupure (Figure 3.1.7.).
Selon l’hypothèse de départ, la libération de la toxine mène à la mort cellulaire permettant de trapper les
phages à l’intérieur de la cellule. Le mutant AbiQ-(3,8r) possède davantage de fragments d’inhibitions ce
qui permettrait une meilleure régulation de la toxine ABIQ, une meilleure survie cellulaire et ainsi que
une diminution de l’activité anti-phage. Dans le cas du mutant AbiQ-(1,8r), la raison qui explique ce
phénotype de diminution d’activité anti-phage demeure énigmatique. Nous nous sommes alors demandés
si ce phénomène pouvait résulter d’une différence au niveau de la transcription d’antiQ ou du gène abiQ
provenant d’un effet polaire lié à la variation dans la longueur d’antiQ. Les ratios entre toxine (abiQ) et
antitoxine (antiQ) pourraient être important dans la régulation et/ou fonction du système, comme c’est
souvent le cas chez les systèmes TA (Afif et al., 2001). De plus, la toxine ToxN (structure similaire à
ABIQ) est similaire au niveau structural à l’endonucléase Kid qui est impliquée dans un système TA (Kid-
Kis) où l’importance du ratio toxine et antitoxine a été démontrée pour influencer la fonction du
complexe (Monti et al., 2007; Blower et al., 2011). Toutefois, les résultats d’hybridation Northern obtenus
ne démontrent aucune différence au niveau de la transcription d’antiQ et du gène abiQ entre les trois
souches AbiQ (Mut 1,8r, AbiQ et Mut 3,8r), et ce, tout au long d’un cycle d’infection par le phage P008
(figure 3.1.8.).
Dans la poursuite de la caractérisation de l’antitoxine, des mutants ponctuels ont par la suite été générés.
Les mutations désirées étaient positionnées dans la première répétition, étaient non complémentaires et
la majorité entouraient le site de coupure. Sept mutants ont été isolés et testés pour les deux activités du
système AbiQ. Pour deux d’entre eux (A13C et T25C), aucune modification n’a été observée au niveau
de l’activité anti-phage et au niveau de l’activité endoribonucléase (tableau 3.1.3.). Dans le cas du mutant
AbiQ-(A13C) ce n’est pas surprenant puisque le nucléotide ciblé ce retrouve loin du site de coupure, mais
également dans le fragment 33 nt (TSS jusqu’au 1ier site de coupure) qui n’est probablement pas impliqué
dans la régulation d’ABIQ. Toutefois, la mutation AbiQ-(T25C) donne des résultats plus surprenants.
77
Nous nous serions attendus à ce que ce nucléotide soit essentiel à la reconnaissance/coupure par ABIQ
en fonction des résultats d’analyse comparative de séquence de coupure. Tel que mentionné
précédemment, ces résultats démontrent que le nucléotide T25 n’est pas essentiel pour la coupure, et ce,
malgré qu’il soit adjacent au site de coupure.
Nos résultats ont également permis de mettre en évidence des mutations permettant d’éliminer l’activité
anti-phage. En effet, les mutants AbiQ-(A24C), AbiQ-(A26C) et AbiQ-(A28C) causent cet effet et cela
est associé à une modification du profil de digestion. Dans le but d’expliquer ces observations, des
analyses bio-informatiques de structure 2-D des ARNs antiQ ont été réalisées. Les résultats suggèrent que
le site de coupure peut être séquestré (A24C) par modification de la structure, ce qui a pour effet de
bloquer partiellement la coupure dans la première répétition. La mutation AbiQ-(A26C) prévient
totalement cette coupure sans modifier la structure, indiquant que ce nucléotide est essentiel à la
reconnaissance et/ou coupure par ABIQ. Ce nucléotide (A26) est d’ailleurs un des deux nucléotides qui
constitue le site exact de coupure.
Dans tous les cas, il est intéressant de constater que le blocage du premier site de coupure amène ABIQ
à couper plus fréquemment dans la troisième répétition (0,8 répétition) ce qui modifie le ratio de certains
fragments. Chez les mutants (A24C ou A26C), le fragment 106 nt (TSS jusqu’à la 3ième répétition) est
augmenté significativement et ceci ce traduit par une perte totale de l’efficacité anti-phage. Toujours selon
notre hypothèse, la diminution de l’efficacité anti-phage serait causée par l’augmentation du nombre de
fragments d’inhibition qui se traduirait par une meilleure régulation de la toxine, une diminution de la
mortalité cellulaire, et donc une réplication virale efficace. Bref, les résultats suggèrent que le fragment
106 nt (TSS jusqu’à la 3ième répétition) serait également un fragment d’inhibition pour la toxine. De fait,
il n’y aurait pas seulement le fragment 35 nt (1 répétition mature) qui serait impliqué dans la régulation
directe de la toxine, comme il a été avancé dans le cas du système ToxINPa (Short et al., 2013). En fonction
des résultats, il serait logique de croire que les fragments sans terminateur, et possédant au minimum une
structure en pseudonoeud, pourraient également jouer un rôle dans la régulation. Toutefois, des
expériences supplémentaires seront nécessaires afin de confirmer cette hypothèse. D’un autre côté, il est
également possible que le fragment 97 nt (1er site jusqu’au terminateur) puisse agir comme un fragment
anti-inhibiteur et que sa diminution mène à la libération de la toxine.
À l’inverse des mutations décrites dans les paragraphes précédents, la mutation AbiQ-(G32A) a permis
d’augmenter significativement l’efficacité anti-phage. Parmi les 7 testés, cette mutation est la seule qui
ciblait un nucléotide impliqué dans la structure en pseudonoeud prédite de l’ARN antiQ. Nos résultats
d’analyses bio-informatiques suggèrent une modification majeure des nucléotides qui sont impliqués dans
la formation de la structure en pseudonoeud si AbiQ sauvage et AbiQ-(G32C) sont comparés. Il a déjà
78
été démontré qu’une telle mutation peut affecter le pouvoir antitoxique de l’ARN non codant chez un
autre système TA de type III, toutefois le rôle de cette mutation sur l’activité anti-phage n’avait pas été
investigué (Blower et al., 2011). Néanmoins, il est fort probable qu’une mutation modifiant la structure
en pseudonoeud de l’ARN affecte le pouvoir antitoxique, et par le fait même, l’activité anti-phage. Il a été
démontré que de telles structures secondaires (pseudonoeuds) pouvaient jouer un rôle dans la régulation
des gènes, la séquestration de petite molécule par liaison directe et/ou d’inhiber l’activité de certaines
protéines comme la transcriptase inverse HIV-1 (Tuerk et al., 1992) ou certaines petites molécules
(Sussman et al., 2000). Fait intéressant, l’efficacité de réplication de la souche L. lactis IL1403 pNZ-AbiQ
n’est pas affectée par la mutation AbiQ-(G32C), malgré que l’activité antitoxique soit probablement
diminuée. Cette mutation unique permet donc d’augmenter la résistance aux phages sans affecter les
rendements de croissance ce qui constitue un atout majeur pour une éventuelle application industrielle.
Réplication virale et cellulaire en présence du système AbiQ
Pour le second objectif, nous nous sommes intéressés à la relation entre l’infection et le mécanisme AbiQ
via principalement l’étude de la réplication virale et bactérienne. Pour ce faire, des courbes de croissance
ont été réalisées pour les souches L. lactis IL1403 pNZ-AbiQ et son contrôle IL1403 pNZ123 (AbiQ-)
en présence (P008 ou P008-Q12) ou absence de phages. Les résultats obtenus démontrent que le phage
sauvage est très efficace pour infecter la souche hôte sensible. En présence d’AbiQ, l’efficacité d’infection
est diminuée significativement ce traduisant par une augmentation du temps avant d’atteindre la phase de
déclin (figure 3.2.1.). Puisque cette phase de déclin est présente même sur la souche résistante AbiQ+,
cela indique que le système anti-phage AbiQ n’est pas totalement efficace.
Ce résultat est en accord avec l’efficacité intermédiaire déterminé par l’EOP (10-5) pour le phage P008
(Samson et al., 2013a) comparativement à une activité maximale (EOP <10-8) contre p2 (Emond et al.,
1998). La génération de phages mutants AbiQR est probablement la cause de ce résultat. Une autre
hypothèse possible est que la souche en croissance pourrait perdre son plasmide pNZ123-AbiQ et ainsi
constituer un hôte sensible pour P008. Cette avenue est toutefois moins probable notamment pour deux
raisons. Aucun phage sauvage n’a été retrouvé suite à une amplification sur AbiQ+ (Samson et al., 2013a).
De plus, les systèmes TA sont généralement impliqués dans la maintenance des plasmides (Jensen et
Gerdes, 1995). Cette fonction a d’ailleurs été démontrée spécifiquement pour les deux autres systèmes
TA de type III (Short et al., 2013). D’autres courbes de croissance ont permis de montrer que le phage
mutant P008-Q12 (ORF38M, Pro38Leu) contourne efficacement le mécanisme AbiQ, mais mènent
toutefois à une petite diminution de l’efficacité de réplication sur la souche sensible (AbiQ-). La protéine
ORF38 est essentielle pour l’activité anti-phage et pour la réplication du phage (Samson et al., 2013a).
79
Cela suggère que l’ORF38-Q12 ne serait pas totalement inefficace et que la mutation pourrait affecter
l’affinité de liaison à sa cible ou sa traduction. Les autres mutants AbiQR possèdent d’ailleurs des
mutations dans le RBS ou dans la séquence d’orf38, toutefois l’effet de ces mutations n’est pas clairement
établi (Samson et al., 2013a).
Des courbes de croissance de phages ont par la suite été réalisées afin de déterminer l’incidence de cette
protéine (ORF38 sauvage) sur la réplication du phage P008. L’efficacité de réplication était évaluée en
fonction du nombre de phages relargué par cellule infectée et du temps de latence des phages. Nos
résultats confirment que le phage modèle P008 est très efficace pour infecter la souche sensible L. lactis
IL1403 pNZ123 (AbiQ-) en relarguant plus de 300 phages par cellule et ce en 39 minutes. Il est intéressant
de constater qu’une seule mutation dans le gène orf38 (Phage P008-Q12) diminue de 26% le nombre de
phages relâchés, tout en rallongeant de 5 minutes le temps pour un cycle d’infection. En présence du
système AbiQ, l’efficacité de ce même phage (P008-Q12) est diminuée encore davantage puisque
seulement 10 phages sont relâchés par cycle de 47 minutes. Néanmoins, bien que la mutation dans orf38
diminue les rendements d’infection, cette stratégie s’avère essentielle pour contourner, du moins
partiellement, l’activité anti-phage du système AbiQ. Le produit du gène orf38 (protéine ORF38) joue un
rôle majeur dans l’activité du mécanisme anti-phage toutefois sa fonction précise reste incomprise. Selon
le schéma transcriptionnel de P008, le gène orf38 est transcrit à partir de 2 minutes, mais le plus fortement
à 10 minutes avant de diminuer pour le reste de l’infection (Samson et al., 2013a). Afin de mieux
comprendre son rôle, nous avons cherché à savoir si le produit du gène orf38 (ou orf38-Q12) pouvait
influencer la traduction de la protéine toxique ABIQ.
Les expériences d’immunobuvardage Western (ciblant ABIQ via son étiquette 6His) ont indiqué que la
quantité d’ABIQ détectée est constante en cours d’infection, autant pour le phage P008 que pour le
mutant P008-Q12 (Figure 3.2.3.). La transcription d’abiQ est constitutive, mais diminue en cours
d’infection en raison de la mortalité des cellules (Samson et al., 2013a). Ces deux résultats compilés
permettent donc d’affirmer que la protéine est stable puisque le transcrit diminue, mais pas la quantité
totale de protéines (ABIQ). La stabilité des toxines est une caractéristique retrouvée chez la majorité des
systèmes de types toxines-antitoxines. En condition de stress, cette stabilité permet à la toxine de persister
et causer l’arrêt de croissance cellulaire, comparativement à l’antitoxine (labile) qui est rapidement
dégradée (Yamaguchi et Inouye, 2009; Yamaguchi et al., 2011).
Nos résultats ont également démontré qu’une concentration plus élevée en protéine intracellulaire totale
permet de détecter une bande supplémentaire (40 kDa) qui selon la taille, pourrait être un complexe
dimérique ABIQ : ABIQ. Fait intéressant, la présence de ce complexe augmente en cours d’infection par
P008, mais reste stable lors de l’infection par le mutant P008-Q12 (figure 3.2.3.). La formation de ce
80
complexe serait donc dépendante de la protéine ORF38. L’observation d’un présumé complexe par
Immunobuvardage Western était un résultat surprenant puisque l’expérience était réalisée en condition
dénaturante (SDS-page, traitement à la chaleur). Toutefois, ce phénomène de complexe non dissocié a
déjà été recensé dans la littérature et suggère une très forte interaction entre les molécules du complexe
(Duda et al., 1995; Labrie et al., 2012). Vu la différence entre les deux phages testés, il est possible que la
présence de ce complexe puisse aussi constituer une pièce dans le casse-tête du mode d’action d’AbiQ.
D’autres expériences seront toutefois nécessaires.
Caractérisation de la protéine ORF38 et de son rôle dans l’activité du système AbiQ
Comme dernier objectif du projet, nous nous sommes intéressés à la protéine ORF38 (phage P008) et à
son rôle dans le mode d’action du mécanisme AbiQ. ORF38 est une petite protéine (8,3 kDa) prédite de
2 hélices alpha séparées par la présence du résidu proline (structure hélice-tour-hélice (H-T-H)). Afin de
l’étudier, la protéine a été produite sous forme recombinante en utilisant différents systèmes d’expression.
Tout d’abord, le système NICE de L. lactis a été utilisé. Cette stratégie a été envisagée puisque la protéine
d’intérêt (ORF38) est produite par un phage infectant spécifiquement cette même bactérie. Nous avons
émis l’hypothèse que cet environnement serait plus propice pour l’expression que d’autres organismes
comme E. coli par exemple. L’incidence de l’environnement cellulaire est non négligeable pour la
transcription, la traduction et le repliement de protéines d’intérêt, toutefois ces facteurs dépendent aussi
énormément de la protéine elle-même. Lors du clonage dans le vecteur d’expression pNZ8010, une
étiquette 6His a été ajoutée en C-terminale d’ORF38 afin de faciliter sa purification. De plus, ce type
d’étiquette est souvent utilisé puisqu’il n’interfère que rarement avec la fonction (structure) de la protéine
principalement en raison de sa petite taille (Carson et al., 2007). La meilleure position de l’étiquette est
dépendante de la protéine bien qu'elle soit le plus souvent positionnée en N-terminale pour faciliter la
coupure de celle-ci (Eschenfeldt et al., 2010). D’un autre côté, une étiquette en C-terminale peut permettre
une meilleure cristallation de la protéine tout en prévenant des changements structuraux majeurs dans la
portion N-terminale. (Eschenfeldt et al., 2010). Le vecteur pNZ8010 :orf38-6H a ensuite été transformé
dans la souche d’expression L. lactis NZ9000. Cette souche contient les gènes (NisK et NisR) permettant
l’activation du promoteur Pnis en amont du gène d’intérêt (orf38-6His), évitant ainsi le désavantage
d’utiliser un deuxième vecteur qui est le plus souvent associé à une diminution des rendements de
production (Kleerebezem et al., 1997). Plusieurs conditions d’expression ont été testées, toutefois aucune
d’elles ne permettaient d’obtenir une surexpression d’ORF38-His. Nous nous sommes alors posés la
question si la protéine ne pouvait être surexprimée en raison du RBS natif (ORF38) qui serait peu efficace.
Afin d’y répondre, des constructions contenant un site de liaison au ribosome différent ont été générées
81
(RBS d’abiQ, RBS d’orf6 (phage p2) et RBS consensus de L. lactis). Aucune surexpression n’a pu être
observée malgré ces modifications. Des expériences récentes ont démontré que la protéine ORF38 ne
peut être surexprimée en présence uniquement d’une étiquette 6His (N ou C-terminale, système T7 chez
E. coli ou NICE chez L. lactis) probablement pour des raisons de sensibilité à la dégradation et/ou de
solubilité (données non présentées). Pour certaines protéines, une étiquette 6His n’est pas suffisamment
grosse pour favoriser la solubilité, et parfois même pour permettre l’expression comme il semble être le
cas ici (Huang et al., 2010).
Face au problème, nous avons modifié notre approche en utilisant des systèmes d’expression présents
chez E. coli. Ceux-ci sont généralement plus nombreux, mieux caractérisés et plus efficaces au niveau des
rendements de production (Terpe, 2006). Plus précisément, la stratégie a été d’utiliser une étiquette de
fusion plus grosse afin de favoriser l’expression de la protéine d’intérêt (Huang et al., 2010). Tout d’abord,
le gène orf38 a été cloné dans le vecteur d’expression pGEX-4T-1 qui permet d’ajouter une étiquette GST
en N-terminale d’ORF38. Cette étiquette permet d’augmenter la solubilité des protéines auxquelles elle
est fusionnée, tout en permettant une purification d’affinité par colonne glutathion (Smith et Johnson,
1988). Nos résultats démontrent que la protéine GST-ORF38 est bien produite, mais qu’elle est
rapidement dégradée via son extrémité C-terminale alors que l’étiquette GST reste stable (N-terminale)
(figure 3.3.2.). Il n’est pas rare d’observer une telle dégradation avec cette stratégie puisque l’étiquette
GST est grosse (dimère de GST-26 kDa), rendant le produit plus sensible à la dégradation (Sigrell, 2001).
Toutefois, les rendements demeurent suppérieurs malgré cette dégradation. Nos résultats démontrent
également que la protéine mutante ORF38-Q12 (Pro38Leu) est encore plus sensible à la dégradation
dans ces mêmes conditions d’expression. Au contraire de ce qui était envisagé, l’élimination de la cassure
dans la structure en hélice alpha de la protéine (résidu proline) ne permet pas d’augmenter la stabilité de
cette protéine face à la dégradation.
Suite aux insuccès de la construction précédente, le clonage en bloc a été utilisé comme stratégie
alternative pour la production d’ORF38 (P008). Cette stratégie a été considérée puisque le gène orf38
appartient à un opéron de trois gènes (orf37-orf39) co-transcrits qui est très conservé chez les phages du
groupe 936 (Rousseau et Moineau, 2009; Samson et al., 2013a). Les produits de ces gènes pourraient
interagir afin de permettre d’augmenter les rendements de production de notre protéine d’intérêt.
L’ORF37 n’a pas de fonction connue alors que l’ORF39 possède 96% identité avec une protéine
d’appariement à l’ADN simple brin (SSB) du phage p2 (orf34) (Bouchard et Moineau, 2004). Il a été
démontré que le clonage en bloc pouvait s’avérer une stratégie efficace pour la surexpression/purification
de protéines de phage sous forme recombinantes (Campanacci et al., 2010). Dans ce cas-ci, le plasmide
pETG20A a été utilisé ce qui permet l’ajout d’une étiquette TRX (6His) en N-terminale de la protéine.
L’étiquette TRX (14 kDa) permet d’augmenter la solubilité (Huang et al., 2010) alors que l’étiquette 6His
82
est présente pour faciliter la purification par affinité. Bien que l’étiquette soit moins grosse que GST, elle
doit tout de même être coupée puisqu’il y a de fortes chances qu’elle interfère avec la structure de la
protéine d’intérêt (ORF38). Nos résultats démontrent qu’il n’y a pas de copurification possible entre
ORF38 et ORF39 en plus de suggérer que la protéine ORF37 serait toxique chez E. coli.
Néamoins, les combinaisons de clonage en bloc nous ont permis de générer une construction
(pETG20A:orf38) permettant la surexpression de TRX-ORF38. Les rendements associés étaient toutefois
faibles en raison notamment des points problématiques suivants : ORF38 est produit en bonne partie
sous forme insoluble (corps d’inclusion), elle est rapidement dégradée et s’agrège au cours de la
purification. Des analyses bio-informatiques utilisant le programme MeDor («Metaserver of Disorder»)
n’ont pas permis d’identifier des régions désordonnées qui sont fréquemment associées à l’instabilité des
protéines (données non présentées) (Dunker et al., 2001; Lieutaud et al., 2008). D’autres analyses avec le
programme PROSO II (http://mips.helmholtz-muenchen.de/prosoII/prosoII.seam#, 2014) identifient
ORF38 comme une protéine hautement insoluble avec un score 0.299 (soluble à >0.6).
Afin d’augmenter les rendements, les conditions d’expression et de purification ont été optimisées suivant
un plan d’expérience partielle variant la force ionique et le tampon (solubilité et stabilité). Parmi les
conditions testées, seule l’augmentation de la force ionique (NaCl 300 mM vers 500 mM) du tampon de
purification a eu un effet significatif sur la production d’ORF38, permettant d’augmenter la stabilité de
cette protéine. C’est également le cas pour plusieurs autres protéines où la force ionique joue un rôle
critique dans les rendements de production (Vojdani, 1996). D’autres conditions tel l’ajout d’acides
aminés, de sucres, d’agent chaotropiques ou de détergents peuvent permettre d’augmenter la stabilité des
protéines recombinantes (Bondos et Bicknell, 2003). Quelques conditions d’induction ont également été
testées (température, souche et milieu) mais n’ont pas permis d’obtenir de meilleur rendement que la
condition de départ (17°C, T7 express, TB) (données non présentées). Parmi ces conditions, la réduction
de la température d’induction est pratiquement un standard puisqu’il permet d’augmenter
significativement la solubilité des protéines, vraisemblablement en réduisant la vitesse de production des
protéines (Vera et al., 2007).
Bien que les rendements finaux restent peu élevés (approx. 250 µg/L), cette méthode nous a permis
d’utiliser ORF38 lors d’essais préliminaires d’interaction. Nos résultats de résonance des plasmons de
surface suggèrent une faible interaction (mM) entre le fragment 35 nt (antiQ - 1 répétition) et la protéine
ORF38. Toutefois, la dissociation serait très lente ce qui permettrait de séquestrer l’ARN régulateur antiQ
en s’y fixant pour une longue durée. Cette interaction n’a pas été observée pour le fragment 130 nt (antiQ
complet) suggérant que la taille, ou la présence du terminateur, pourraient prévenir la liaison à l’ORF38.
La deuxième hypothèse semble plus réaliste et est également en accord avec les résultats discutés
83
précédemment sur les fragments d’inhibition impliqués dans la régulation du mécanisme AbiQ. Toutefois,
les résultats présentés dans cette section demeurent préliminaires. D’autres séries d’expériences devront
être faites afin de confirmer ces résultats.
Hypothèse
Selon l’hypothèse envisagée au départ, la libération de la toxine par différents stress permet à celle-ci de
cibler spécifiquement des ARNm cellulaires essentiels via son activité endoribonucléique, causant ainsi
un arrêt de croissance qui permet de prévenir le relargage de nouveaux phages dans l’environnement. Les
résultats que nous avons obtenus au cours de ce projet nous ont permis d’ajouter à ce modèle définissant
le mode d’action d’AbiQ (et les systèmes TA de type III), principalement au niveau de la régulation.
En condition normale, la toxine (ABIQ) du système serait régulée par différents fragments d’ARN non
codant (antiQ mature) via une interaction directe ARNs : protéines. La structure en pseudonoeud serait
essentielle à l’activité antitoxine de ces fragments régulateurs. Tel qu’il a été envisagé pour le système
ToxINPa, il est possible que la spécificité de coupure pour le fragment d’ARN complet (antiQ immature)
puisse occuper la toxine et ainsi constituer un deuxième mode de régulation (Short et al., 2013).
En condition de stress (infection phagique), le produit d’un gène viral (ORF38 du phage P008) semble
interagir avec certains fragments régulateurs par interaction directe. Cela aurait pour effet de séquester
ces ARNs avant leur liaison à la toxine, ou bien de déstabiliser les complexes de régulation en ciblant les
ARNs au sein de ces complexes. La toxine serait ainsi libérée dans la cellule jusqu’à l’arrêt de croissance
bactérienne. Différentes protéines activatrices comme ORF38 ont pu être identifiées chez d’autres phages
suggérant que d’autres types d’activation pourraient être possibles. Curieusement, certains de ces phages
possèdent un gène homologue à orf38 mais utilisent le produit d’un autre gène pour l’activation (Samson
et al., 2013a). Peut-être existe-t-il un mode d’action différent en fonction du phage qui infecte? Pour sa
part, le système ToxINPa ne semble pas impliquer d’activateur provenant du phage comme c’est le cas
pour AbiQ. En effet, tous les phages ToxINR possèdent des séquences pseudo-ToxI afin de contourner
le système anti-phage, comparativement aux phages AbiQR qui possèdent des mutations affectant la
protéine activatrice (ORF38 de P008) (Blower et al., 2012a; Samson et al., 2013a).
Malgré le modèle présenté ici, il est également possible que le mode d’action soit différent. Parmi les
autres hypothèses plausibles, il est possible qu’une molécule de phage (ORF38) puisse lier AbiQ
directement et ainsi modifier son activité (ou spécificité de coupure) vers les ARNs cellulaires essentiels
plutôt que l’antitoxine antiQ.
85
Conclusion
L’interaction constante entre les bactéries (proie) et les bactériophages (prédateur) a mené ces deux entités
biologiques à s’adapter l’un à l’autre, à co-évoluer. Différentes stratégies ont été développées par les
bactéries afin de résister à l’infection par les phages et celles-ci ont été beaucoup étudiées au cours des
trois dernières décennies en raison de l’impact industriel qu’ils représentent. Toutefois, ces mêmes études
ont également mis en évidence la capacité des phages à contourner assez facilement ces systèmes anti-
phages, les rendant parfois même plus efficaces (Cherwa et al., 2009). Une meilleure compréhension des
mécanismes est donc un point crucial afin de pouvoir utiliser ces systèmes de façon optimale, tout en
évitant que les phages puissent les contourner facilement.
Dans le cadre de mon projet de maîtrise, nous nous sommes intéressés spécifiquement au mécanisme
anti-phage AbiQ (TA de type III) présent chez Lactococcus lactis. L’objectif fondamental était de
comprendre le mode d’action du système en s’attardant principalement à l’aspect de la régulation. Bien
que nous n’ayons pas été en mesure de définir clairement les rouages de ce système, nos résultats
permettent une meilleure compréhension des systèmes TA (type III) et de leurs rôles dans la résistance
au phage.
Nous avons mis en évidence la spécificité de coupure de la toxine (ABIQ) pour son antitoxine (antiQ) via
une séquence spécifique, où toutefois la structure générale semble jouer un rôle majeur. Nos résultats
suggèrent également que plusieurs de ces fragments matures pourraient être impliqués dans la régulation
de la toxicité d’ABIQ. En condition de stress, le produit d’un gène viral permet l’activation du système
anti-phage via vraisemblablement une séquestration de ces fragments régulateurs causant l’arrêt de
croissance cellulaire et donc l’inhibition de la réplication des phages. Ces résultats constituent des
informations clés qui n’avaient pas été mises de l’avant jusqu’à présent chez les systèmes TA de type III.
Autre fait intéressant, nos travaux ont démontré la capacité d’optimisation du système AbiQ via une
mutation ponctuelle dans l’antitoxine antiQ qui permet d’augmenter significativement l’efficacité anti-
phage, sans même affecter la réplication de la bactérie AbiQ+. Ces données sont intéressantes puisqu’elles
ouvrent la porte sur un univers de possibilités d’optimisation simples et efficaces.
En perspective, il serait intéressant de mettre en commun les connaissances acquises sur les différents
systèmes anti-phages et de voir comment ceux-ci pourraient être utilisés conjointement afin de maximiser
l’efficacité. Dans la nature, ces systèmes combinés de défense sont déjà très fréquents (Makarova et al.,
2011), toutefois leur complexité constitue un défi majeur. Une meilleure compréhension de ces systèmes
individuellement serait elle la clé afin d’avoir un coup d’avance sur l’évolution des phages?
87
Bibliographie
Ackermann, H. W. 2003. Bacteriophage observations and evolution. Res. Microbiol. 154:245-251. Ackermann, H. W. 2007. 5500 Phages examined in the electron microscope. Arch. Virol. 152:227-243. Ackermann, H. W. 2009. Phage classification and characterization. Methods Mol. Biol. 501:127-140. Ackermann, H. W. 2011. The first phage electron micrographs. Bacteriophage 1:225-227. Ackermann, H. W. et D. Prangishvili. 2012. Prokaryote viruses studied by electron microscopy. Arch. Virol. 157:1843-1849. Afif, H., N. Allali, M. Couturier et L. Van Melderen. 2001. The ratio between CcdA and CcdB modulates the transcriptional repression of the ccd poison-antidote system. Mol. Microbiol. 41:73-82. Ainsworth, S., A. Zomer, V. de Jager, F. Bottacini, S. A. van Hijum, J. Mahony et D. van Sinderen. 2013. Complete genome of Lactococcus lactis subsp. cremoris UC509.9, host for a model lactococcal P335 bacteriophage. Genome Announc. 1:e00119-00112. Aizenman, E., H. Engelberg-Kulka et G. Glaser. 1996. An Escherichia coli chromosomal "addiction module" regulated by guanosine [corrected] 3',5'-bispyrophosphate: a model for programmed bacterial cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93:6059-6063. Anba, J., E. Bidnenko, A. Hillier, D. Ehrlich et M. C. Chopin. 1995. Characterization of the lactococcal abiD1 gene coding for phage abortive infection. J. Bacteriol. 177:3818-3823. Axelsson, L. 2004. Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. Dans: Lactic Acid Bacteria-Microbiological and Functional Aspects, Third Edition. S. Salminen, A. Von Wright et A. Ouwehand. (eds) Marcel Dekker, Inc. p. 19-85. Barrangou, R. et P. Horvath. 2012. CRISPR: new horizons in phage resistance and strain identification. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 3:143-162. Bayles, K. W. 2014. Bacterial programmed cell death: making sense of a paradox. Nat. Rev. Microbiol. 12:63-69. Beier, D. et R. Gross. 2008. The BvgS/BvgA phosphorelay system of pathogenic Bordetellae. Dans: Bacterial Signal Transduction: Networks and Drug Targets, Adv. Exp. Med. Biol. (eds) R. Utsumi. 631: 149-160. Benbouziane, B., P. Ribelles, C. Aubry, R. Martin, P. Kharrat, A. Riazi, P. Langella et L. G. Bermúdez-Humarána. 2013. Development of a Stress-Inducible Controlled Expression (SICE) system in Lactococcus lactis for the production and delivery of therapeutic molecules at mucosal surfaces. J. Biotechnol. 168:120-129. Bergh, O., K. Y. Børsheim, G. Bratbak et M. Heldal. 1989. High abundance of viruses found in aquatic environments. Nature 340:467-468. Bergsland, K. J., C. Kao, Y. T. Yu, R. Gulati et L. Snyder. 1990. A site in the T4 bacteriophage major head protein gene that can promote the inhibition of all translation in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 213:477-494. Bi, E. F. et J. Lutkenhaus. 1991. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature 354:161-164. Bidnenko, E., A. Chopin, S. D. Ehrlich et M-C. Chopin. 2009. Activation of mRNA translation by phage protein and low temperature: the case of Lactococcus lactis abortive infection system AbiD1. BMC Mol. Biol. 10:4. Bidnenko, E., D. Ehrlich et M-C. Chopin. 1995. Phage operon involved in sensitivity to the Lactococcus lactis abortive infection mechanism AbiD1. J. Bacteriol. 177:3824-3829. Bidnenko, E., S. D. Ehrlich et M-C. Chopin. 1998. Lactococcus lactis phage operon coding for an endonuclease homologous to RuvC. Mol. Microbiol. 28:823-834. Bingham, R., S. I. Ekunwe, S. Falk, L. Snyder et C. Kleanthous. 2000. The major head protein of bacteriophage T4 binds specifically to elongation factor Tu. J. Biol. Chem. 275:23219-23226. Bissonnette, F., S. Labrie, H. Deveau, M. Lamoureux et S. Moineau. 2000. Characterization of mesophilic mixed starter cultures used for the manufacture of aged cheddar cheese. J. Dairy Sci. 83:620-627.
88
Blattner, F. R., G. Plunkett III, C. A. Bloch, N. T. Perna, V. Burland, M. Riley, J. Collado-Vides, J. D. Glasner, C. K. Rode, G. F. Mayhew, J. Gregor, N. W. Davis, H. A. Kirkpatrick, M. A. Goeden, D. J. Rose, B. Mau et Y. Shao. 1997. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277:1453-1462. Blower, T. R., T. J. Evans, R. Przybilski, P. C. Fineran et G. P. Salmond. 2012a. Viral evasion of a bacterial suicide system by RNA-based molecular mimicry enables infectious altruism. PLoS Genet. 8:e1003023. Blower, T. R., P. C. Fineran, M. J. Johnson, I. K. Toth, D. P. Humphreys et G. P. Salmond. 2009. Mutagenesis and functional characterization of the RNA and protein components of the toxIN abortive infection and toxin-antitoxin locus of Erwinia. J. Bacteriol. 191:6029-6039. Blower, T. R., X. Y. Pei, F. L. Short, P. C. Fineran, D. P. Humphreys, B. F. Luisi et G. P. Salmond. 2011. A processed noncoding RNA regulates an altruistic bacterial antiviral system. Nat. Struct. Mol. Biol. 18:185-190. Blower, T. R., F. L. Short, F. Rao, K. Mizuguchi, X. Y. Pei, P. C. Fineran, B. F. Luisi et G. P. Salmond. 2012b. Identification and classification of bacterial Type III toxin-antitoxin systems encoded in chromosomal and plasmid genomes. Nucleic Acids Res. 40:6158-6173. Blumberg, D. D. 1987. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152:20-24. Bolotin, A., B. Quinquis, S. D. Ehrlich et A. Sorokin. 2012. Complete genome sequence of Lactococcus lactis subsp. cremoris A76. J. Bacteriol. 194:1241-1242. Bolotin, A., P. Wincker, S. Mauger, O. Jaillon, K. Malarme, J. Weissenbach, S. D. Ehrlich et A. Sorokin. 2001. The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403. Genome Res. 11:731-753. Bondos, S. E. et A. Bicknell. 2003. Detection and prevention of protein aggregation before, during, and after purification. Anal. Biochem. 316:223-231. Bondy-Denomy, J., A. Pawluk, K. L. Maxwell et A. R. Davidson. 2013. Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system. Nature 493:429-432. Bonfield, J. K. et A. Whitwham. 2010. Gap5--editing the billion fragment sequence assembly. Bioinformatics 26:1699-1703. Bouchard, J. D., E. Dion, F. Bissonnette et S. Moineau. 2002. Characterization of the two-component abortive phage infection mechanism AbiT from Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 184:6325-6332. Bouchard, J. D. et S. Moineau. 2004. Lactococcal phage genes involved in sensitivity to AbiK and their relation to single-strand annealing proteins. J. Bacteriol. 186:3649-3652. Boucher, I., E. Emond, E. Dion, D. Montpetit et S. Moineau. 2000. Microbiological and molecular impacts of AbiK on the lytic cycle of Lactococcus lactis phages of the 936 and P335 species. Microbiology 146:445-453. Boucher, I. et S. Moineau. 2001. Phages of Lactococcus lactis: an ecological and economical equilibrium. Recent Res. Devel. Virol. 3:243-256. Brøndsted, L. et K. Hammer. 2006. Phages of Lactococcus lactis. Dans: The Bacteriophages, Second Edition. R. Calendar. (eds) Oxford University Press. p. 572-592. Brüssow, H. et K. Kutter. 2005. Genomics and evolution of tailed phages. Dans: Bacteriophages: Biology and Applications. E. Kutter et A. Sulakvelidze. (eds) CRC Press. p. 91-127. Byun, Y. et K. Han. 2006. PseudoViewer: web application and web service for visualizing RNA pseudoknots and secondary structures. Nucleic Acids Res. 34:W416-422. Cai, Y., J. Yang, H. Pang et M. Kitahara. 2011. Lactococcus fujiensis sp. nov., a lactic acid bacterium isolated from vegetable matter. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61:1590-1594. Campanacci, V., D. Veesler, J. Lichière, S. Blangy, G. Sciara, S. Moineau, D. van Sinderen, P. Bron et C. Cambillau. 2010. Solution and electron microscopy characterization of lactococcal phage baseplates expressed in Escherichia coli. J. Struct. Biol. 172:75-84. Carson, M., D. H. Johnson, H. McDonald, C. Brouillette et L. J. Delucas. 2007. His-tag impact on structure. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63:295-301. Catalão, M. J., F. Gil, J. Moniz-Pereira, C. São-José et M. Pimentel. 2013. Diversity in bacterial lysis systems: bacteriophages show the way. FEMS Microbiol. Rev. 37:554-571.
89
Champagne, C. P. et G. Arora. 2009. Préparation des ferments en usine. Dans: Physiologie, métabolisme, génomique et applications industrielles des bactéries lactiques. D. Drider et H. Prévost. (eds) Economica. p. 549-576. Chandry, P. S., B. E. Davidson et A. J. Hillier. 1994. Temporal transcription map of the Lactococcus lactis bacteriophage sk1. Microbiology 140:2251-2261. Chandry, P. S., S. C. Moore, J. D. Boyce, B. E. Davidson et A. J. Hillier. 1997. Analysis of the DNA sequence, gene expression, origin of replication and modular structure of the Lactococcus lactis lytic bacteriophage sk1. Mol. Microbiol. 26:49-64. Chen, R. 2012. Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and beyond. Biotechnol. Adv. 30:1102-1107. Chen, Y. S., C. H. Chang, S. F. Pan, L. T. Wang, Y. C. Chang, H. C. Wu et F. Yanagida. 2013a. Lactococcus taiwanensis sp. nov., a lactic acid bacterium isolated from fresh cummingcordia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63:2405-2409. Chen, Y. S., M. S. Liou, S. H. Ji, C. R. Yu, S. F. Pan et F. Yanagida. 2013b. Isolation and characterization of lactic acid bacteria from Yan-tsai-shin (fermented broccoli stems), a traditional fermented food in Taiwan. J. Appl. Microbiol. 115:125-132. Chen, Y. S., M. Otoguro, Y. H. Lin, S. F. Pan, S. H. Ji, C. R. Yu, M. S. Liou, Y. C. Chang, H. C. Wu et F. Yanagida. 2014. Lactococcus formosensis sp. nov., a lactic acid bacterium isolated from yan-tsai-shin (fermented broccoli stems). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 64:146-151. Cheng, H. Y., V. W. Soo, S. Islam, M. J. McAnulty, M. J. Benedik et T. K. Wood. 2013. Toxin GhoT of the GhoT/GhoS TA system damages the cell membrane to reduce ATP and to reduce growth under stress. Environ. Microbiol.: doi: 10.1111/1462-2920.12373. Cheng, X., W. Wang et I. J. Molineux. 2004. F exclusion of bacteriophage T7 occurs at the cell membrane. Virology 326:340-352. Cherwa, J. E., Jr., P. Sanchez-Soria, Members of the University of Arizona Virology Laboratory Course 2007, H. A. Wichman et B. A. Fane. 2009. Viral adaptation to an antiviral protein enhances the fitness level to above that of the uninhibited wild type. J. Virol. 83:11746-11750. Chopin, A., M-C. Chopin, A. Moillo-Batt et P. Langella. 1984. Two plasmid-determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis. Plasmid 11:260-263. Chopin, M-C., A. Chopin et E. Bidnenko. 2005. Phage abortive infection in lactococci: variations on a theme. Curr. Opin. Microbiol. 8:473-479. Christensen, S. K. et K. Gerdes. 2003. RelE toxins from bacteria and Archaea cleave mRNAs on translating ribosomes, which are rescued by tmRNA. Mol. Microbiol. 48:1389-1400. Cline, J., J. C. Braman et H. H. Hogrefe. 1996. PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 24:3546-3551. Cluzel, P. J., A. Chopin, S. D. Ehrlich et M. C. Chopin. 1991. Phage abortive infection mechanism from Lactococcus lactis subsp. lactis, expression of which is mediated by an Iso-ISS1 element. Appl. Environ. Microbiol. 57:3547-3551. Cole, C., J. D. Barber et G. J. Barton. 2008. The Jpred 3 secondary structure prediction server. Nucleic Acids Res. 36:W197-201. Condreay, J. P. et I. J. Molineux. 1989. Synthesis of the capsid protein inhibits development of bacteriophage T3 mutants that abortively infect F plasmid-containing cells. J. Mol. Biol. 207:543-554. Correia, F. F., A. D'Onofrio, T. Rejtar, L. Li, B. L. Karger, K. Makarova, E. V. Koonin et K. Lewis. 2006. Kinase activity of overexpressed HipA is required for growth arrest and multidrug tolerance in Escherichia coli. J. Bacteriol. 188:8360-8367. Critchlow, S. E., M. H. O'Dea, A. J. Howells, M. Couturier, M. Gellert et A. Maxwell. 1997. The interaction of the F plasmid killer protein, CcdB, with DNA gyrase: induction of DNA cleavage and blocking of transcription. J. Mol. Biol. 273:826-839. Crooks, G. E., G. Hon, J. M. Chandonia et S. E. Brenner. 2004. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14:1188-1190. Crutz-Le Coq, A. M., B. Cesselin, J. Commissaire et J. Anba. 2002. Sequence analysis of the lactococcal bacteriophage bIL170: insights into structural proteins and HNH endonucleases in dairy
90
phages. Microbiology 148:985-1001. Cruz, J. W., F. P. Rothenbacher, T. Maehigashi, W. S. Lane, C. M. Dunham et N. A. Woychik. 2014. Doc toxin is a kinase that inactivates elongation factor Tu. J. Biol. Chem. 289:7788-7798. Curtis, F. A., P. Reed et G. J. Sharples. 2005. Evolution of a phage RuvC endonuclease for resolution of both Holliday and branched DNA junctions. Mol. Microbiol. 55:1332-1345. Dabrowski, S. et J. Kur. 1998. Cloning and expression in Escherichia coli of the recombinant his-tagged DNA polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcus woesei. Protein Expr. Purif. 14:131-138. Dai, G., P. Su, G. E. Allison, B. L. Geller, P. Zhu, W. S. Kim et N. W. Dunn. 2001. Molecular characterization of a new abortive infection system (AbiU) from Lactococcus lactis LL51-1. Appl. Environ. Microbiol. 67:5225-5232. Darty, K., A. Denise et Y. Ponty. 2009. VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure. Bioinformatics 25:1974-1975. de Ruyter, P. G., O. P. Kuipers et W. M. de Vos. 1996. Controlled gene expression systems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin. Appl. Environ. Microbiol. 62:3662-3667. de Vos, W. M. 1999. Gene expression systems for lactic acid bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 2:289-295. de Vos, W. M. et J. Hugenholtz. 2004. Engineering metabolic highways in lactococci and other lactic acid bacteria. Trends Biotechnol. 22:72-79. de Vos, W. M., M. Kleerebezem et O. P. Kuipers. 1997. Expression systems for industrial Gram-positive bacteria with low guanine and cytosine content. Curr. Opin. Biotechnol. 8:547-553. de Vos, W. M. et G. F. M. Simons. 1994. Gene cloning and expression systems in lactococci. Dans: Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. M. J. Gasson et W. M. de Vos. (eds) Blackie Academic & Professional. p. 52–105. Deng, Y. M., M. L. Harvey, C. Q. Liu et N. W. Dunn. 1997. A novel plasmid-encoded phage abortive infection system from Lactococcus lactis biovar. diacetylactis. FEMS Microbiol. Lett. 146:149-154. Deng, Y. M., C. Q. Liu et N. W. Dunn. 1999. Genetic organization and functional analysis of a novel phage abortive infection system, AbiL, from Lactococcus lactis. J. Biotechnol. 67:135-149. Destoumieux-Garzón, D., S. Duquesne, J. Peduzzi, C. Goulard, M. Desmadril, L. Letellier, S. Rebuffat et P. Boulanger. 2005. The iron-siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11-Pro16 beta-hairpin region in the recognition mechanism. Biochem. J. 389:869-876. Deveau, H., R. Barrangou, J. E. Garneau, J. Labonté, C. Fremaux, P. Boyaval, D. A. Romero, P. Horvath et S. Moineau. 2008. Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. J. Bacteriol. 190:1390-1400. Deveau, H., S. J. Labrie, M-C. Chopin et S. Moineau. 2006. Biodiversity and classification of lactococcal phages. Appl. Environ. Microbiol. 72:4338-4346. Deveau, H., M-R. Van Calsteren et S. Moineau. 2002. Effect of exopolysaccharides on phage-host interactions in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 68:4364-4369. Dinsmore, P. K. et T. R. Klaenhammer. 1994. Phenotypic consequences of altering the copy number of abiA, a gene responsible for aborting bacteriophage infections in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 60:1129-1136. Dinsmore, P. K. et T. R. Klaenhammer. 1997. Molecular characterization of a genomic region in a Lactococcus bacteriophage that is involved in its sensitivity to the phage defense mechanism AbiA. J. Bacteriol. 179:2949-2957. Dinsmore, P. K., D. J. O'Sullivan et T. R. Klaenhammer. 1998. A leucine repeat motif in AbiA is required for resistance of Lactococcus lactis to phages representing three species. Gene 212:5-11. Doi, R. H. et L. F. Wang. 1986. Multiple procaryotic ribonucleic acid polymerase sigma factors. Microbiol. Rev. 50:227-243. Domingues, S., A. Chopin, S. D. Ehrlich et M-C. Chopin. 2004a. The Lactococcal abortive phage infection system AbiP prevents both phage DNA replication and temporal transcription switch. J. Bacteriol. 186:713-721. Domingues, S., A. Chopin, S. D. Ehrlich et M-C. Chopin. 2004b. A phage protein confers resistance to the lactococcal abortive infection mechanism AbiP. J. Bacteriol. 186:3278-3281.
91
Domingues, S., S. McGovern, D. Plochocka, M. A. Santos, S. D. Ehrlich, P. Polard et M-C. Chopin. 2008. The lactococcal abortive infection protein AbiP is membrane-anchored and binds nucleic acids. Virology 373:14-24. Dörr, T., M. Vulić et K. Lewis. 2010. Ciprofloxacin causes persister formation by inducing the TisB toxin in Escherichia coli. PLoS Biol. 8:e1000317. Doulatov, S., A. Hodes, L. Dai, N. Mandhana, M. Liu, R. Deora, R. W. Simons, S. Zimmerly et J. F. Miller. 2004. Tropism switching in Bordetella bacteriophage defines a family of diversity-generating retroelements. Nature 431:476-481. Duda, R. L., K. Martincic, Z. Xie et R. W. Hendrix. 1995. Bacteriophage HK97 head assembly. FEMS Microbiol. Rev. 17:41-46. Dunker, A. K., J. D. Lawson, C. J. Brown, R. M. Williams, P. Romero, J. S. Oh, C. J. Oldfield, A. M. Campen, C. M. Ratliff, K. W. Hipps, J. Ausio, M. S. Nissen, R. Reeves, C. Kang, C. R. Kissinger, R. W. Bailey, M. D. Griswold, W. Chiu, E. C. Garner et Z. Obradovic. 2001. Intrinsically disordered protein. J. Mol. Graph. Model. 19:26-59. Dupont, K., F. K. Vogensen et J. Josephsen. 2005. Detection of lactococcal 936-species bacteriophages in whey by magnetic capture hybridization PCR targeting a variable region of receptor-binding protein genes. J. Appl. Microbiol. 98:1001-1009. Durand, P., B. Golinelli-Pimpaneau, S. Mouilleron, B. Badet et M. A. Badet-Denisot. 2008. Highlights of glucosamine-6P synthase catalysis. Arch. Biochem. Biophys. 474:302-317. Durmaz, E. et T. R. Klaenhammer. 2007. Abortive phage resistance mechanism AbiZ speeds the lysis clock to cause premature lysis of phage-infected Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 189:1417-1425. Duwat, P., S. Sourice, B. Cesselin, G. Lamberet, K. Vido, P. Gaudu, Y. Le Loir, F. Violet, P. Loubière et A. Gruss. 2001. Respiration capacity of the fermenting bacterium Lactococcus lactis and its positive effects on growth and survival. J. Bacteriol. 183:4509-4516. Dy, R. L., R. Przybilski, K. Semeijn, G. P. Salmond et P. C. Fineran. 2014. A widespread bacteriophage abortive infection system functions through a Type IV toxin-antitoxin mechanism. Nucleic Acids Res. 42:4590-4605. ÉcoRessources Consultants. 2011. Les retombées économiques de l'industrie laitière au Canada, Rapport final. Pour: Les producteurs laitiers du Canada. Emond, E., E. Dion, S. A. Walker, E. R. Vedamuthu, J. K. Kondo et S. Moineau. 1998. AbiQ, an abortive infection mechanism from Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 64:4748-4756. Emond, E., B. J. Holler, I. Boucher, P. A. Vandenbergh, E. R. Vedamuthu, J. K. Kondo et S. Moineau. 1997. Phenotypic and genetic characterization of the bacteriophage abortive infection mechanism AbiK from Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 63:1274-1283. Engelberg-Kulka, H., S. Amitai, I. Kolodkin-Gal et R. Hazan. 2006. Bacterial programmed cell death and multicellular behavior in bacteria. PLoS Genet. 2:e135. Engelberg-Kulka, H., M. Reches, S. Narasimhan, R. Schoulaker-Schwarz, Y. Klemes, E. Aizenman et G. Glaser. 1998. rexB of bacteriophage lambda is an anti-cell death gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 95:15481-15486. Eschenfeldt, W. H., N. Maltseva, L. Stols, M. I. Donnelly, M. Gu, B. Nocek, K. Tan, Y. Kim et A. Joachimiak. 2010. Cleavable C-terminal His-tag vectors for structure determination. J. Struct. Funct. Genomics 11:31-39. Estrem, S. T., W. Ross, T. Gaal, Z. W. Chen, W. Niu, R. H. Ebright et R. L. Gourse. 1999. Bacterial promoter architecture: subsite structure of UP elements and interactions with the carboxy-terminal domain of the RNA polymerase alpha subunit. Genes Dev. 13:2134-2147. Fernández, E., A. Alegría, S. Delgado, M. C. Martín et B. Mayo. 2011. Comparative phenotypic and molecular genetic profiling of wild Lactococcus lactis subsp. lactis strains of the L. lactis subsp. lactis and L. lactis subsp. cremoris genotypes, isolated from starter-free cheeses made of raw milk. Appl. Environ. Microbiol. 77:5324-5335. Fineran, P. C., T. R. Blower, I. J. Foulds, D. P. Humphreys, K. S. Lilley et G. P. Salmond. 2009. The phage abortive infection system, ToxIN, functions as a protein-RNA toxin-antitoxin pair. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 106:894-899.
92
Fineran, P. C. et E. Charpentier. 2012. Memory of viral infections by CRISPR-Cas adaptive immune systems: acquisition of new information. Virology 434:202-209. Fortier, L-C., J. D. Bouchard et S. Moineau. 2005. Expression and site-directed mutagenesis of the lactococcal abortive phage infection protein AbiK. J. Bacteriol. 187:3721-3730. Fozo, E. M., M. R. Hemm et G. Storz. 2008. Small toxic proteins and the antisense RNAs that repress them. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72:579-589. Fozo, E. M., K. S. Makarova, S. A. Shabalina, N. Yutin, E. V. Koonin et G. Storz. 2010. Abundance of type I toxin-antitoxin systems in bacteria: searches for new candidates and discovery of novel families. Nucleic Acids Res. 38:3743-3759. Franch, T., A. P. Gultyaev et K. Gerdes. 1997. Programmed cell death by hok/sok of plasmid R1: processing at the hok mRNA 3'-end triggers structural rearrangements that allow translation and antisense RNA binding. J. Mol. Biol. 273:38-51. Gao, Y., Y. Lu, K. L. Teng, M. L. Chen, H. J. Zheng, Y. Q. Zhu et J. Zhong. 2011. Complete genome sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis CV56, a probiotic strain isolated from the vaginas of healthy women. J. Bacteriol. 193:2886-2887. García, L. R. et I. J. Molineux. 1995. Incomplete entry of bacteriophage T7 DNA into F-plasmid containing Escherichia coli. J. Bacteriol. 177:4077-4083. Garneau, J. E., M-È. Dupuis, M. Villion, D. A. Romero, R. Barrangou, P. Boyaval, C. Fremaux, P. Horvath, A. H. Magadán et S. Moineau. 2010. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature 468:67-71. Garvey, P., G. F. Fitzgerald et C. Hill. 1995. Cloning and DNA sequence analysis of two abortive infection phage resistance determinants from the lactococcal plasmid pNP40. Appl. Environ. Microbiol. 61:4321-4328. Gasson, M. J. 1983. Plasmid complements of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci after protoplast-induced curing. J. Bacteriol. 154:1-9. Geis, A. 2005. Perspectives of genetic engineering of bacteria used in food fermentations. Dans: Genetically engineered food: Methods and Detection. K. J. Heller. (eds) Wiley-VCH. p. 100-118. Geller, B. L., R. G. Ivey, J. E. Trempy et B. Hettinger-Smith. 1993. Cloning of a chromosomal gene required for phage infection of Lactococcus lactis subsp. lactis C2. J. Bacteriol. 175:5510-5519. Georgiou, T., Y. N. Yu, S. Ekunwe, M. J. Buttner, A. Zuurmond, B. Kraal, C. Kleanthous et L. Snyder. 1998. Specific peptide-activated proteolytic cleavage of Escherichia coli elongation factor Tu. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 95:2891-2895. Gerdes, K., S. K. Christensen et A. Løbner-Olesen. 2005. Prokaryotic toxin-antitoxin stress response loci. Nat. Rev. Microbiol. 3:371-382. Gerdes, K., J. E. Larsen et S. Molin. 1985. Stable inheritance of plasmid R1 requires two different loci. J. Bacteriol. 161:292-298. Gerdes, K., A. Nielsen, P. Thorsted et E. G. Wagner. 1992. Mechanism of killer gene activation. Antisense RNA-dependent RNase III cleavage ensures rapid turn-over of the stable hok, srnB and pndA effector messenger RNAs. J. Mol. Biol. 226:637-649. Gerdes, K., P. B. Rasmussen et S. Molin. 1986. Unique type of plasmid maintenance function: postsegregational killing of plasmid-free cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 83:3116-3120. Gerdes, K., T. Thisted et J. Martinussen. 1990. Mechanism of post-segregational killing by the hok/sok system of plasmid R1: sok antisense RNA regulates formation of a hok mRNA species correlated with killing of plasmid-free cells. Mol. Microbiol. 4:1807-1818. Gerdes, K. et E. G. Wagner. 2007. RNA antitoxins. Curr. Opin. Microbiol. 10:117-124. Griffin, M. A., J. H. Davis et S. A. Strobel. 2013. Bacterial toxin RelE: a highly efficient ribonuclease with exquisite substrate specificity using atypical catalytic residues. Biochemistry 52:8633-8642. Grossiord, B. P., E. J. Luesink, E. E. Vaughan, A. Arnaud et W. M. de Vos. 2003. Characterization, expression, and mutation of the Lactococcus lactis galPMKTE genes, involved in galactose utilization via the Leloir pathway. J. Bacteriol. 185:870-878. Gruber, A. R., R. Lorenz, S. H. Bernhart, R. Neuböck et I. L. Hofacker. 2008. The Vienna RNA websuite. Nucleic Acids Res. 36:W70-74.
93
Haaber, J., S. Moineau, L-C. Fortier et K. Hammer. 2008. AbiV, a novel antiphage abortive infection mechanism on the chromosome of Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. Appl. Environ. Microbiol. 74:6528-6537. Haaber, J., G. M. Rousseau, K. Hammer et S. Moineau. 2009. Identification and characterization of the phage gene sav, involved in sensitivity to the lactococcal abortive infection mechanism AbiV. Appl. Environ. Microbiol. 75:2484-2494. Haaber, J., J. E. Samson, S. J. Labrie, V. Campanacci, C. Cambillau, S. Moineau et K. Hammer. 2010. Lactococcal abortive infection protein AbiV interacts directly with the phage protein SaV and prevents translation of phage proteins. Appl. Environ. Microbiol. 76:7085-7092. Hall, T. A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser. 41:95-98. Hansen, S., M. Vulić, J. Min, T. J. Yen, M. A. Schumacher, R. G. Brennan et K. Lewis. 2012. Regulation of the Escherichia coli HipBA toxin-antitoxin system by proteolysis. PLoS One 7:e39185. Hatfull, G. F. et R. W. Hendrix. 2011. Bacteriophages and their genomes. Curr. Opin. Virol. 1:298-303. Hausmann, R. 1976. Bacteriophage T7 genetics. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 75:77-110. Hayes, C. S. et R. T. Sauer. 2003. Cleavage of the A site mRNA codon during ribosome pausing provides a mechanism for translational quality control. Mol. Cell. 12:903-911. Heaton, B. E., J. Herrou, A. E. Blackwell, V. H. Wysocki et S. Crosson. 2012. Molecular structure and function of the novel BrnT/BrnA toxin-antitoxin system of Brucella abortus. J. Biol. Chem. 287:12098-12110. Henderson, I. R., P. Owen et J. P. Nataro. 1999. Molecular switches--the ON and OFF of bacterial phase variation. Mol. Microbiol. 33:919-932. Hill, C., I. J. Massey et T. R. Klaenhammer. 1991. Rapid method to characterize lactococcal bacteriophage genomes. Appl. Environ. Microbiol. 57:283-288. Hill, C., D. A. Romero, D. S. McKenney, K. R. Finer et T. R. Klaenhammer. 1989a. Localization, cloning, and expression of genetic determinants for bacteriophage resistance (Hsp) from the conjugative plasmid pTR2030. Appl. Environ. Microbiol. 55:1684-1689. Hill, C. W., J. A. Gray et H. Brody. 1989b. Use of the isocitrate dehydrogenase structural gene for attachment of e14 in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 171:4083-4084. Hinton, D. M. 2010. Transcriptional control in the prereplicative phase of T4 development. Virol. J. 7:289. Holo, H. et I. F. Nes. 1989. High-frequency transformation, by electroporation, of Lactococcus lactis subsp. cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media. Appl. Environ. Microbiol. 55:3119-3123. Holt, J. G., N. R. Kreig, P. H. Sneath, J. T. Staley et S. T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative of Bacteriology, Ninth Edition. (eds) Williams and Willkins. Holubova, J. et J. Josephsen. 2007. Potential of AbiS as defence mechanism determined by conductivity measurement. J. Appl. Microbiol. 103:2382-2391. Horvath, P., D. A. Romero, A. C. Coûté-Monvoisin, M. Richards, H. Deveau, S. Moineau, P. Boyaval, C. Fremaux et R. Barrangou. 2008. Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus. J. Bacteriol. 190:1401-1412. http://cilq.ca/industrie/statistiques-sur-lindustrie-laitiere/. 2014. Page consultée le 24 mai 2014. http://mips.helmholtz-muenchen.de/prosoII/prosoII.seam#. 2014. Page consultée le 16 novembre 2014. http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html. 2014. Page consultée le 24 janvier 2014. http://www.lait.org/fr/leconomie-du-lait/la-transformation.php. 2014. Page consultée le 14 février 2014. Huang, A., R. N. de Jong, G. E. Folkers et R. Boelens. 2010. NMR characterization of foldedness for the production of E3 RING domains. J. Struct. Biol. 172:120-127. Hurley, J. M., J. W. Cruz, M. Ouyang et N. A. Woychik. 2011. Bacterial toxin RelE mediates frequent codon-independent mRNA cleavage from the 5' end of coding regions in vivo. J. Biol. Chem. 286:14770-14778. Jacobs, M., S. Wnendt et U. Stahl. 1990. High-efficiency electro-transformation of Escherichia coli with
94
DNA from ligation mixtures. Nucleic Acids Res. 18:1653. Jamet, E. 2009. Les bactéries lactiques: une composante de l'écosystème microbien des fromages. Dans: Physiologie, métabolisme, génomique et applications industrielles des bactéries lactiques. D. Drider and H. Prévost. (eds) Economica. p. 325-348. Jansen, R., J. D. A. van Embden, W. Gaastra et L. M. Schouls. 2002. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol. Microbiol. 43:1565-1575. Jarvis, A. W. 1978. Serological studies of a host range mutant of a lactic streptococcal bacteriophage. Appl. Environ. Microbiol. 36:785-789. Jensen, R. B. et K. Gerdes. 1995. Programmed cell death in bacteria: proteic plasmid stabilization systems. Mol. Microbiol. 17:205-210. Jeong, D. W., Y. C. Choi, J. M. Lee, J. H. Kim, J. H. Lee, K. H. Kim et H. J. Lee. 2006. Isolation and characterization of promoters from Lactococcus lactis ssp. cremoris LM0230. Food Microbiol. 23:82-89. Jiang, Y., J. Pogliano, D. R. Helinski et I. Konieczny. 2002. ParE toxin encoded by the broad-host-range plasmid RK2 is an inhibitor of Escherichia coli gyrase. Mol. Microbiol. 44:971-979. Josephsen, J. et H. Neve. 2004. Bacteriophage and antiphage mechanisms of lactic acid bacteria. Dans: Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functionnal Aspects, Third Edition. S. Lahtinen, A. C. Ouwehand, S. Salminen et A. Von Wright. (eds) Marcel Dekker. p. 295-350. Kai, T. et T. Yonesaki. 2002. Multiple mechanisms for degradation of bacteriophage T4 soc mRNA. Genetics 160:5-12. Kamada, K., F. Hanaoka et S. K. Burley. 2003. Crystal structure of the MazE/MazF complex: molecular bases of antidote-toxin recognition. Mol. Cell. 11:875-884. Kaspy, I., E. Rotem, N. Weiss, I. Ronin, N. Q. Balaban et G. Glaser. 2013. HipA-mediated antibiotic persistence via phosphorylation of the glutamyl-tRNA-synthetase. Nat. Commun. 4:3001. Kato, H., Y. Shiwa, K. Oshima, M. Machii, T. Araya-Kojima, T. Zendo, M. Shimizu-Kadota, M. Hattori, K. Sonomoto et H. Yoshikawa. 2012. Complete genome sequence of Lactococcus lactis IO-1, a lactic acid bacterium that utilizes xylose and produces high levels of L-lactic acid. J. Bacteriol. 194:2102-2103. Kawano, M., L. Aravind et G. Storz. 2007. An antisense RNA controls synthesis of an SOS-induced toxin evolved from an antitoxin. Mol. Microbiol. 64:738-754. Kelley, L. A. et M. J. Sternberg. 2009. Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server. Nat. Protoc. 4:363-371. Kelly, W. J., E. Altermann, S. C. Lambie et S. C. Leahy. 2013. Interaction between the genomes of Lactococcus lactis and phages of the P335 species. Front. Microbiol. 4:257. Kemp, P., M. Gupta et I. J. Molineux. 2004. Bacteriophage T7 DNA ejection into cells is initiated by an enzyme-like mechanism. Mol. Microbiol. 53:1251-1265. Klaenhammer, T. R. 1988. Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie 70:337-349. Kleerebezem, M., M. M. Beerthuyzen, E. E. Vaughan, W. M. de Vos et O. P. Kuipers. 1997. Controlled gene expression systems for lactic acid bacteria: transferable nisin-inducible expression cassettes for Lactococcus, Leuconostoc, and Lactobacillus spp. Appl. Environ. Microbiol. 63:4581-4584. Koga, M., Y. Otsuka, S. Lemire et T. Yonesaki. 2011. Escherichia coli rnlA and rnlB compose a novel toxin-antitoxin system. Genetics 187:123-130. Kolodkin-Gal, I. et H. Engelberg-Kulka. 2008. The extracellular death factor: physiological and genetic factors influencing its production and response in Escherichia coli. J. Bacteriol. 190:3169-3175. Kolodkin-Gal, I., R. Hazan, A. Gaathon, S. Carmeli et H. Engelberg-Kulka. 2007. A linear pentapeptide is a quorum-sensing factor required for mazEF-mediated cell death in Escherichia coli. Science 318:652-655. Kraus, J. et B. L. Geller. 1998. Membrane receptor for prolate phages is not required for infection of Lactococcus lactis by small or large isometric phages. J. Dairy Sci. 81:2329-2335. Krüger, D. H., G. J. Barcak et H. O. Smith. 1988. Abolition of DNA recognition site resistance to the restriction endonuclease EcoRII. Biomed. Biochim. Acta 47:K1-5. Krüger, D. H. et T. A. Bickle. 1983. Bacteriophage survival: multiple mechanisms for avoiding the deoxyribonucleic-acid restriction systems of their hosts. Microbiol. Rev. 47:345-360.
95
Kuipers, O. P., P. G. G. A. de Ruyter, M. Kleerebezem et W. M. de Vos. 1998. Quorum sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria. J. Biotechnol. 64:15-21. Kutter, E., R. Raya et K. Carlson. 2005. Molecular mechanisms of phage infection. Dans: Bacteriophages: Biology and Applications. E. Kutter et A. Sulakvelidze. (eds) CRC Press. p. 161-220. Labrie, S. et S. Moineau. 2000. Multiplex PCR for detection and identification of lactococcal bacteriophages. Appl. Environ. Microbiol. 66:987-994. Labrie, S. J., J. E. Samson et S. Moineau. 2010. Bacteriophage resistance mechanisms. Nat. Rev. Microbiol. 8:317-327. Labrie, S. J., D. M. Tremblay, M. Moisan, M. Villion, A. H. Magadán, V. Campanacci, C. Cambillau et S. Moineau. 2012. Involvement of the major capsid protein and two early-expressed phage genes in the activity of the lactococcal abortive infection mechanism AbiT. Appl. Environ. Microbiol. 78:6890-6899. Latorre-Guzman, B. A., C. I. Kado et R. E. Kunkee. 1977. Lactobacillus hordniae, a new species from the leafhopper (Hordnia circellata). Int. J. Syst. Bacteriol. 27:362-370. Lavigne, R., P. Darius, E. J. Summer, D. Seto, P. Mahadevan, A. S. Nilsson, H. W. Ackermann et A. M. Kropinski. 2009. Classification of Myoviridae bacteriophages using protein sequence similarity. BMC Microbiol. 9:224. Letellier, L., P. Boulanger, M. de Frutos et P. Jacquot. 2003. Channeling phage DNA through membranes: from in vivo to in vitro. Res. Microbiol. 154:283-287. Lewis, K. 2010. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64:357-372. Lieutaud, P., B. Canard et S. Longhi. 2008. MeDor: a metaserver for predicting protein disorder. BMC Genomics 9 Suppl 2:S25. Linares, D. M., J. Kok et B. Poolman. 2010. Genome sequences of Lactococcus lactis MG1363 (revised) and NZ9000 and comparative physiological studies. J. Bacteriol. 192:5806-5812. Lister, J. 1878. On the lactic fermentation and its bearing on pathology. Trans Path. Soc. 29:425-467. Little, J. W. 1984. Autodigestion of lexA and phage lambda repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 81:1375-1379. Liu, M., R. Deora, S. R. Doulatov, M. Gingery, F. A. Eiserling, A. Preston, D. J. Maskell, R. W. Simons, P. A. Cotter, J. Parkhill et J. F. Miller. 2002. Reverse transcriptase-mediated tropism switching in Bordetella bacteriophage. Science 295:2091-2094. Liu, M., Y. Zhang, M. Inouye et N. A. Woychik. 2008. Bacterial addiction module toxin Doc inhibits translation elongation through its association with the 30S ribosomal subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 105:5885-5890. Loof, M., J. Lembke et M. Teuber. 1983. Characterization of the genome of the Streptococcus lactis "subsp. diacetylactis" bacteriophage P008 wide-spread in german cheese factories. Syst. Appl. Microbiol. 4:413-423. Loris, R., M. H. Dao-Thi, E. M. Bahassi, L. Van Melderen, F. Poortmans, R. Liddington, M. Couturier et L. Wyns. 1999. Crystal structure of CcdB, a topoisomerase poison from E. coli. J. Mol. Biol. 285:1667-1677. Lu, M. J. et U. Henning. 1994. Superinfection exclusion by T-even-type coliphages. Trends Microbiol. 2:137-139. Lu, M. J., Y. D. Stierhof et U. Henning. 1993. Location and unusual membrane topology of the immunity protein of the Escherichia coli phage T4. J. Virol. 67:4905-4913. MacArthur, M. W. et J. M. Thornton. 1991. Influence of proline residues on protein conformation. J. Mol. Biol. 218:397-412. Magnuson, R. D. 2007. Hypothetical functions of toxin-antitoxin systems. J. Bacteriol. 189:6089-6092. Mahony, J., H. Deveau, S. Mc Grath, M. Ventura, C. Canchaya, S. Moineau, G. F. Fitzgerald et D. van Sinderen. 2006. Sequence and comparative genomic analysis of lactococcal bacteriophages jj50, 712 and P008: evolutionary insights into the 936 phage species. FEMS Microbiol. Lett. 261:253-261. Mahony, J., W. Kot, J. Murphy, S. Ainsworth, H. Neve, L. H. Hansen, K. J. Heller, S. J. Sørensen, K. Hammer, C. Cambillau, F. K. Vogensen et D. van Sinderen. 2013. Investigation of the relationship between lactococcal host cell wall polysaccharide genotype and 936 phage receptor binding
96
protein phylogeny. Appl. Environ. Microbiol. 79:4385-4392. Mahony, J., S. Mc Grath, G. F. Fitzgerald et D. van Sinderen. 2008. Identification and characterization of lactococcal-prophage-carried superinfection exclusion genes. Appl. Environ. Microbiol. 74:6206-6215. Maisonneuve, E., L. J. Shakespeare, M. G. Jørgensen et K. Gerdes. 2011. Bacterial persistence by RNA endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 108:13206-13211. Makarova, K., A. Slesarev, Y. Wolf, A. Sorokin, B. Mirkin, E. Koonin, A. Pavlov, N. Pavlova, V. Karamychev, N. Polouchine, V. Shakhova, I. Grigoriev, Y. Lou, D. Rohksar, S. Lucas, K. Huang, D. M. Goodstein, T. Hawkins, V. Plengvidhya, D. Welker, J. Hughes, Y. Goh, A. Benson, K. Baldwin, J. H. Lee, I. Diaz-Muñiz, B. Dosti, V. Smeianov, W. Wechter, R. Barabote, G. Lorca, E. Altermann, R. Barrangou, B. Ganesan, Y. Xie, H. Rawsthorne, D. Tamir, C. Parker, F. Breidt, J. Broadbent, R. Hutkins, D. O'Sullivan, J. Steele, G. Unlu, M. Saier, T. Klaenhammer, P. Richardson, S. Kozyavkin, B. Weimer et D. Mills. 2006. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 103:15611-15616. Makarova, K. S., D. H. Haft, R. Barrangou, S. J. Brouns, E. Charpentier, P. Horvath, S. Moineau, F. J. Mojica, Y. I. Wolf, A. F. Yakunin, J. van der Oost et E. V. Koonin. 2011. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat. Rev. Microbiol. 9:467-477. Maniloff, J. et H. W. Ackermann. 1998. Taxonomy of bacterial viruses: establishment of tailed virus genera and the order Caudovirales. Arch. Virol. 143:2051-2063. Marianovsky, I., E. Aizenman, H. Engelberg-Kulka et G. Glaser. 2001. The regulation of the Escherichia coli mazEF promoter involves an unusual alternating palindrome. J. Biol. Chem. 276:5975-5984. Masuda, H., Q. Tan, N. Awano, K. P. Wu et M. Inouye. 2012a. YeeU enhances the bundling of cytoskeletal polymers of MreB and FtsZ, antagonizing the CbtA (YeeV) toxicity in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 84:979-989. Masuda, H., Q. Tan, N. Awano, Y. Yamaguchi et M. Inouye. 2012b. A novel membrane-bound toxin for cell division, CptA (YgfX), inhibits polymerization of cytoskeleton proteins, FtsZ and MreB, in Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 328:174-181. McAuliffe, O., P. R. Ross et G. F. Fitzgerald. 2007. The New Phage Biology: From Genomics to Applications. Dans: Bacteriophage: Genetics and Molecular Biology. S. Mc Grath, et D. van Sinderen. (eds) Caister Academic Press. p. 1-42. McGovern, P. E., J. Zhang, J. Tang, Z. Zhang, G. R. Hall, R. A. Moreau, A. Nuñez, E. D. Butrym, M. P. Richards, C. S. Wang, G. Cheng, Z. Zhao et C. Wang. 2004. Fermented beverages of pre- and proto-historic China. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 101:17593-17598. McGrath, S., G. F. Fitzgerald et D. van Sinderen. 2002. Identification and characterization of phage-resistance genes in temperate lactococcal bacteriophages. Mol. Microbiol. 43:509-520. McGrath, S., J. F. Seegers, G. F. Fitzgerald et D. van Sinderen. 1999. Molecular characterization of a phage-encoded resistance system in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 65:1891-1899. McKenzie, J. L., J. Robson, M. Berney, T. C. Smith, A. Ruthe, P. P. Gardner, V. L. Arcus et G. M. Cook. 2012. A VapBC toxin-antitoxin module is a posttranscriptional regulator of metabolic flux in mycobacteria. J. Bacteriol. 194:2189-2204. McLandsborough, L. A., K. M. Kolaetis, T. Requena et L. L. McKay. 1995. Cloning and characterization of the abortive infection genetic determinant abiD isolated from pBF61 of Lactococcus lactis subsp. lactis KR5. Appl. Environ. Microbiol. 61:2023-2026. Medhekar, B. et J. F. Miller. 2007. Diversity-generating retroelements. Curr. Opin. Microbiol. 10:388-395. Mendoza-Vargas, A., L. Olvera, M. Olvera, R. Grande, L. Vega-Alvarado, B. Taboada, V. Jimenez-Jacinto, H. Salgado, K. Juárez, B. Contreras-Moreira, A. M. Huerta, J. Collado-Vides et E. Morett. 2009. Genome-wide identification of transcription start sites, promoters and transcription factor binding sites in E. coli. PLoS One 4:e7526. Meselson, M. et R. Yuan. 1968. DNA restriction enzyme from E. coli. Nature 217:1110-1114. Michelsen, O., F. G. Hansen, B. Albrechtsen et P. R. Jensen. 2010. The MG1363 and IL1403 laboratory strains of Lactococcus lactis and several dairy strains are diploid. J. Bacteriol. 192:1058-1065. Mierau, I. et M. Kleerebezem. 2005. 10 years of the nisin-controlled gene expression system (NICE)
97
in Lactococcus lactis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68:705-717. Mierau, I., E. R. S. Kunji, G. Venema et J. Kok. 1997. Casein and peptide degradation in lactic acid bacteria. Biotechnol. Genet. Eng. 14:279-301. Millen, A. M., P. Horvath, P. Boyaval et D. A. Romero. 2012. Mobile CRISPR/Cas-mediated bacteriophage resistance in Lactococcus lactis. PLoS One 7:e51663. Moffatt, B. A. et F. W. Studier. 1988. Entry of bacteriophage T7 DNA into the cell and escape from host restriction. J. Bacteriol. 170:2095-2105. Moineau, S., E. Durmaz, S. Pandian et T. R. Klaenhammer. 1993. Differentiation of two abortive mechanisms by using monoclonal antibodies directed toward lactococcal bacteriophage capsid proteins. Appl. Environ. Microbiol. 59:208-212. Moineau, S. et C. Lévesque. 2005. Control of bacteriophages in industrial fermentations. Dans: Bacteriophages: Biology and Applications. E. Kutter et A. Sulakvelidze. (eds) CRC Press. p. 285-296. Moineau, S., D. Tremblay et S. Labrie. 2002. Phages of lactic acid bacteria: from genomics to industrial applications. ASM News 68:388-393. Moineau, S., S. A. Walker, E. R. Vedamuthu et P. A. Vandenbergh. 1995. Cloning and sequencing of LlaDCHI [corrected] restriction/modification genes from Lactococcus lactis and relatedness of this system to the Streptococcus pneumoniae DpnII system. Appl. Environ. Microbiol. 61:2193-2202. Moisan, M. et S. Moineau. 2012. Multilocus sequence typing scheme for the characterization of 936-like phages infecting Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 78:4646-4653. Mojica, F. J., C. Díez-Villaseñor, J. García-Martínez et C. Almendros. 2009. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology 155:733-740. Molineux, I. 1988. A burst of phages: the bacteriophages. Science 242:1317. Molineux, I. J. 1991. Host-parasite interactions: recent developments in the genetics of abortive phage infections. New Biol. 3:230-236. Molineux, I. J. et D. Panja. 2013. Popping the cork: mechanisms of phage genome ejection. Nat. Rev. Microbiol. 11:194-204. Monti, M. C., A. M. Hernández-Arriaga, M. B. Kamphuis, J. López-Villarejo, A. J. Heck, R. Boelens, R. Díaz-Orejas et R. H. van den Heuvel. 2007. Interactions of Kid-Kis toxin-antitoxin complexes with the parD operator-promoter region of plasmid R1 are piloted by the Kis antitoxin and tuned by the stoichiometry of Kid-Kis oligomers. Nucleic Acids Res. 35:1737-1749. Morello, E., L. G. Bermúdez-Humaran, D. Llull, V. Solé, N. Miraglio, P. Langella et I. Poquet. 2008. Lactococcus lactis, an efficient cell factory for recombinant protein production and secretion. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 14:48-58. Moreno-Córdoba, I., E. Diago-Navarro, A. Barendregt, A. J. Heck, C. Alfonso, R. Díaz-Orejas, C. Nieto et M. Espinosa. 2012. The toxin-antitoxin proteins relBE2Spn of Streptococcus pneumoniae: characterization and association to their DNA target. Proteins 80:1834-1846. Mu, D., M. Montalbán-López, Y. Masuda et O. P. Kuipers. 2013. Zirex: a novel zinc-regulated expression system for Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 79:4503-4508. Muñoz-Gómez, A. J., M. Lemonnier, S. Santos-Sierra, A. Berzal-Herranz et R. Díaz-Orejas. 2005. RNase/anti-RNase activities of the bacterial parD toxin-antitoxin system. J. Bacteriol. 187:3151-3157. Mutschler, H., M. Gebhardt, R. L. Shoeman et A. Meinhart. 2011. A novel mechanism of programmed cell death in bacteria by toxin-antitoxin systems corrupts peptidoglycan synthesis. PLoS Biol. 9:e1001033. Nakai, H. et C. C. Richardson. 1990. The gene 1.2 protein of bacteriophage T7 interacts with the Escherichia coli dGTP triphosphohydrolase to form a GTP-binding protein. J. Biol. Chem. 265:4411-4419. Nariya, H. et S. Inouye. 2006. A protein Ser/Thr kinase cascade negatively regulates the DNA-binding activity of MrpC, a smaller form of which may be necessary for the Myxococcus xanthus development. Mol. Microbiol. 60:1205-1217. O'Connor, L., A. Coffey, C. Daly et G. F. Fitzgerald. 1996. AbiG, a genotypically novel abortive infection mechanism encoded by plasmid pCI750 of Lactococcus lactis subsp. cremoris UC653. Appl. Environ. Microbiol. 62:3075-3082. O'Sullivan, O., J. O'Callaghan, A. Sangrador-Vegas, O. McAuliffe, L. Slattery, P. Kaleta, M.
98
Callanan, G. F. Fitzgerald, R. P. Ross et T. Beresford. 2009. Comparative genomics of lactic acid bacteria reveals a niche-specific gene set. BMC Microbiol. 9:50. Ogura, T. et S. Hiraga. 1983. Mini-F plasmid genes that couple host cell division to plasmid proliferation. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 80:4784-4788. Orla-Jensen, S. 1921. The main lines of the natural bacterial system. J. Bacteriol. 6:263-273. Osborn, M. J. et L. Rothfield. 2007. Cell shape determination in Escherichia coli. Curr. Opin. Microbiol. 10:606-610. Otsuka, Y., M. Koga, A. Iwamoto et T. Yonesaki. 2007. A role of RnlA in the RNase LS activity from Escherichia coli. Genes Genet. Syst. 82:291-299. Otsuka, Y. et T. Yonesaki. 2012. Dmd of bacteriophage T4 functions as an antitoxin against Escherichia coli LsoA and RnlA toxins. Mol. Microbiol. 83:669-681. Overgaard, M., J. Borch et K. Gerdes. 2009. RelB and RelE of Escherichia coli form a tight complex that represses transcription via the ribbon-helix-helix motif in RelB. J. Mol. Biol. 394:183-196. Overgaard, M., J. Borch, M. G. Jørgensen et K. Gerdes. 2008. Messenger RNA interferase RelE controls relBE transcription by conditional cooperativity. Mol. Microbiol. 69:841-857. Pandey, D. P. et K. Gerdes. 2005. Toxin-antitoxin loci are highly abundant in free-living but lost from host-associated prokaryotes. Nucleic Acids Res. 33:966-976. Panoff, J. M., S. Legrand, B. Thammavongs et D. Boutibonnes. 1994. The cold shock response in Lactococcus lactis subsp. lactis. Curr. Microbiol. 29:213-216. Parreira, R., S. D. Ehrlich et M. C. Chopin. 1996. Dramatic decay of phage transcripts in lactococcal cells carrying the abortive infection determinant AbiB. Mol. Microbiol. 19:221-230. Pedersen, K. et K. Gerdes. 1999. Multiple hok genes on the chromosome of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 32:1090-1102. Pell, L. G., G. M. Gasmi-Seabrook, M. Morais, P. Neudecker, V. Kanelis, D. Bona, L. W. Donaldson, A. M. Edwards, P. L. Howell, A. R. Davidson et K. L. Maxwell. 2010. The solution structure of the C-terminal Ig-like domain of the bacteriophage lambda tail tube protein. J. Mol. Biol. 403:468-479. Pérez, T., J. L. Balcázar, A. Peix, A. Valverde, E. Velázquez, I. de Blas et I. Ruiz-Zarzuela. 2011. Lactococcus lactis subsp. tructae subsp. nov. isolated from the intestinal mucus of brown trout (Salmo trutta) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 61:1894-1898. Pingoud, V., A. Sudina, H. Geyer, J. M. Bujnicki, R. Lurz, G. Lüder, R. Morgan, E. Kubareva et A. Pingoud. 2005. Specificity changes in the evolution of type II restriction endonucleases: a biochemical and bioinformatic analysis of restriction enzymes that recognize unrelated sequences. J. Biol. Chem. 280:4289-4298. Porter, K., B. E. Russ et M. L. Dyall-Smith. 2007. Virus-host interactions in salt lakes. Curr. Opin. Microbiol. 10:418-424. Potter, J., W. Zhang et J. Lee. 2003. Thermal stability and cDNA synthesis capability of SuperScript reverse transcriptase. Focus (Invitrogen) 25:19-24. Prescott, L., J. Harley et D. Klein. 2002. Microbiologie, 2ième édition française. (eds) de boeck. Prévots, F., M. Daloyau, O. Bonin, X. Dumont et S. Tolou. 1996. Cloning and sequencing of the novel abortive infection gene abiH of Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis S94. FEMS Microbiol. Lett. 142:295-299. Prévots, F., S. Tolou, B. Delpech, M. Kaghad et M. Daloyau. 1998. Nucleotide sequence and analysis of the new chromosomal abortive infection gene abiN of Lactococcus lactis subsp. cremoris S114. FEMS Microbiol. Lett. 159:331-336. Reeder, J., P. Steffen et R. Giegerich. 2007. pknotsRG: RNA pseudoknot folding including near-optimal structures and sliding windows. Nucleic Acids Res. 35:W320-324. Rice, G., K. Stedman, J. Snyder, B. Wiedenheft, D. Willits, S. Brumfield, T. McDermott et M. J. Young. 2001. Viruses from extreme thermal environments. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 98:13341-13345. Rince, A., M. Tangney et G. F. Fitzgerald. 2000. Identification of a DNA region from lactococcal phage sk1 protecting phage 712 from the abortive infection mechanism AbiF. FEMS Microbiol. Lett. 182:185-191.
99
Roberts, R. J., M. Belfort, T. Bestor, A. S. Bhagwat, T. A. Bickle, J. Bitinaite, R. M. Blumenthal, S. Degtyarev, D. T. Dryden, K. Dybvig, K. Firman, E. S. Gromova, R. I. Gumport, S. E. Halford, S. Hattman, J. Heitman, D. P. Hornby, A. Janulaitis, A. Jeltsch, J. Josephsen, A. Kiss, T. R. Klaenhammer, I. Kobayashi, H. Kong, D. H. Krüger, S. Lacks, M. G. Marinus, M. Miyahara, R. D. Morgan, N. E. Murray, V. Nagaraja, A. Piekarowicz, A. Pingoud, E. Raleigh, D. N. Rao, N. Reich, V. E. Repin, E. U. Selker, P. C. Shaw, D. C. Stein, B. L. Stoddard, W. Szybalski, T. A. Trautner, J. L. Van Etten, J. M. Vitor, G. G. Wilson et S. Y. Xu. 2003. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res. 31:1805-1812. Roberts, R. J., T. Vincze, J. Posfai et D. Macelis. 2010. REBASE--a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res. 38:D234-236. Ross, W., K. K. Gosink, J. Salomon, K. Igarashi, C. Zou, A. Ishihama, K. Severinov et R. L. Gourse. 1993. A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the alpha subunit of RNA polymerase. Science 262:1407-1413. Rousseau, G. M. et S. Moineau. 2009. Evolution of Lactococcus lactis phages within a cheese factory. Appl. Environ. Microbiol. 75:5336-5344. Sambrook, J. et D. W. Russel. 2001. Molecular Cloning: A laboratory manual, Third Edition. (eds) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Samson, J. E., M. Bélanger et S. Moineau. 2013a. Effect of the abortive infection mechanism and type III toxin/antitoxin system AbiQ on the lytic cycle of Lactococcus lactis phages. J. Bacteriol. 195:3947-3956. Samson, J. E., A. H. Magadán, M. Sabri et S. Moineau. 2013b. Revenge of the phages: defeating bacterial defences. Nat. Rev. Microbiol. 11:675-687. Samson, J. E., S. Spinelli, C. Cambillau et S. Moineau. 2013c. Structure and activity of AbiQ, a lactococcal endoribonuclease belonging to the type III toxin-antitoxin system. Mol. Microbiol. 87:756-768. Sanger, F., G. M. Air, B. G. Barrell, N. L. Brown, A. R. Coulson, C. A. Fiddes, C. A. Hutchison, P. M. Slocombe et M. Smith. 1977. Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA. Nature 265:687-695. Sanger, F., A. R. Coulson, G. F. Hong, D. F. Hill et G. B. Petersen. 1982. Nucleotide sequence of bacteriophage lambda DNA. J. Mol. Biol. 162:729-773. Satwika, D., R. Klassen et F. Meinhardt. 2012. Anticodon nuclease encoding virus-like elements in yeast. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96:345-356. Sberro, H., A. Leavitt, R. Kiro, E. Koh, Y. Peleg, U. Qimron et R. Sorek. 2013. Discovery of functional toxin/antitoxin systems in bacteria by shotgun cloning. Mol. Cell 50:136-148. Scaltriti, E., S. Moineau, H. Launay, J. Y. Masson, C. Rivetti, R. Ramoni, V. Campanacci, M. Tegoni et C. Cambillau. 2010. Deciphering the function of lactococcal phage ul36 Sak domains. J. Struct. Biol. 170:462-469. Schliefer, K. H., J. Kraus, C. Dvorak, R. Kilpper-Bälz, M. D. Collins et W. Fischer. 1985. Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the genus Lactococcus gen. nov. Syst. Appl. Microbiol. 6:183-195. Schmitt, C. K., P. Kemp et I. J. Molineux. 1991. Genes 1.2 and 10 of bacteriophages T3 and T7 determine the permeability lesions observed in infected cells of Escherichia coli expressing the F plasmid gene pifA. J. Bacteriol. 173:6507-6514. Scholl, D., S. Adhya et C. Merril. 2005. Escherichia coli K1's capsule is a barrier to bacteriophage T7. Appl. Environ. Microbiol. 71:4872-4874. Schultz, S. J. et J. J. Champoux. 2008. RNase H activity: structure, specificity, and function in reverse transcription. Virus Res. 134:86-103. Sciara, G., C. Bebeacua, P. Bron, D. Tremblay, M. Ortiz-Lombardia, J. Lichière, M. van Heel, V. Campanacci, S. Moineau et C. Cambillau. 2010. Structure of lactococcal phage p2 baseplate and its mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107:6852-6857. Seed, K. D., D. W. Lazinski, S. B. Calderwood et A. Camilli. 2013. A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity. Nature 494:489-491.
100
Short, F. L., X. Y. Pei, T. R. Blower, S. L. Ong, P. C. Fineran, B. F. Luisi et G. P. Salmond. 2013. Selectivity and self-assembly in the control of a bacterial toxin by an antitoxic noncoding RNA pseudoknot. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 110:E241-249. Siezen, R. J., J. Bayjanov, B. Renckens, M. Wels, S. A. van Hijum, D. Molenaar et J. E. van Hylckama Vlieg. 2010. Complete genome sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis KF147, a plant-associated lactic acid bacterium. J. Bacteriol. 192:2649-2650. Sigrell, J. A. 2001. Scientific poster: Purification of GST fusion proteins, on column cleavage and sample clean-up. GST Gene Fusion System, Handbook. Amersham Biosciences AB. Silvaggi, J. M., J. B. Perkins et R. Losick. 2005. Small untranslated RNA antitoxin in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 187:6641-6650. Simon, D. M. et S. Zimmerly. 2008. A diversity of uncharacterized reverse transcriptases in bacteria. Nucleic Acids Res. 36:7219-7229. Smit, B. A., W. J. Engels et G. Smit. 2009. Branched chain aldehydes: production and breakdown pathways and relevance for flavour in foods. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:987-999. Smit, G., B. A. Smit et W. J. Engels. 2005. Flavour formation by lactic acid bacteria and biochemical flavour profiling of cheese products. FEMS Microbiol. Rev. 29:591-610. Smith, D. B. et K. S. Johnson. 1988. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67:31-40. Snyder, L. 1995. Phage-exclusion enzymes: a bonanza of biochemical and cell biology reagents? Mol. Microbiol. 15:415-420. Spinelli, S., A. Desmyter, C. T. Verrips, H. J. de Haard, S. Moineau et C. Cambillau. 2006. Lactococcal bacteriophage p2 receptor-binding protein structure suggests a common ancestor gene with bacterial and mammalian viruses. Nat. Struct. Mol. Biol. 13:85-89. Studier, F. W. et B. A. Moffatt. 1986. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189:113-130. Su, P., M. Harvey, H. J. Im et N. W. Dunn. 1997. Isolation, cloning and characterisation of the abiI gene from Lactococcus lactis subsp. lactis M138 encoding abortive phage infection. J. Biotechnol. 54:95-104. Sussman, D., J. C. Nix et C. Wilson. 2000. The structural basis for molecular recognition by the vitamin B 12 RNA aptamer. Nat. Struct. Biol. 7:53-57. Sutherland, I. W., K. A. Hughes, L. C. Skillman et K. Tait. 2004. The interaction of phage and biofilms. FEMS Microbiol. Lett. 232:1-6. Suttle, C. A. 1994. The significance of viruses to mortality in aquatic microbial communities. Microb. Ecol. 28:237-243. Suttle, C. A. 2005. Viruses in the sea. Nature 437:356-361. Suttle, C. A. 2007. Marine viruses--major players in the global ecosystem. Nat. Rev. Microbiol. 5:801-812. Tan, Q., N. Awano et M. Inouye. 2011. YeeV is an Escherichia coli toxin that inhibits cell division by targeting the cytoskeleton proteins, FtsZ and MreB. Mol. Microbiol. 79:109-118. Tangney, M. et G. F. Fitzgerald. 2002a. AbiA, a lactococcal abortive infection mechanism functioning in Streptococcus thermophilus. Appl. Environ. Microbiol. 68:6388-6391. Tangney, M. et G. F. Fitzgerald. 2002b. Effectiveness of the lactococcal abortive infection systems AbiA, AbiE, AbiF and AbiG against P335 type phages. FEMS Microbiol. Lett. 210:67-72. Terns, M. P. et R. M. Terns. 2011. CRISPR-based adaptive immune systems. Curr. Opin. Microbiol. 14:321-327. Terpe, K. 2006. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:211-222. Teuber, M. 1995. The genus Lactococcus. Dans: The genera of lactic acid bacteria. B. J. B. Wood et W. H. Holzapfel. (eds) Springer. 2: 173-234. Thisted, T. et K. Gerdes. 1992. Mechanism of post-segregational killing by the hok/sok system of plasmid R1. Sok antisense RNA regulates hok gene expression indirectly through the overlapping mok gene. J. Mol. Biol. 223:41-54. Thisted, T., N. S. Sørensen, E. G. Wagner et K. Gerdes. 1994. Mechanism of post-segregational killing: Sok antisense RNA interacts with Hok mRNA via its 5'-end single-stranded leader and competes
101
with the 3'-end of Hok mRNA for binding to the mok translational initiation region. EMBO J. 13:1960-1968. Tian, Q. B., T. Hayashi, T. Murata et Y. Terawaki. 1996. Gene product identification and promoter analysis of hig locus of plasmid Rts1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 225:679-684. Tremblay, D. M., M. Tegoni, S. Spinelli, V. Campanacci, S. Blangy, C. Huyghe, A. Desmyter, S. Labrie, S. Moineau et C. Cambillau. 2006. Receptor-binding protein of Lactococcus lactis phages: identification and characterization of the saccharide receptor-binding site. J. Bacteriol. 188:2400-2410. Tuerk, C., S. MacDougal et L. Gold. 1992. RNA pseudoknots that inhibit human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 89:6988-6992. Twomey, D. P., P. J. De Urraza, L. L. McKay et D. J. O'Sullivan. 2000. Characterization of AbiR, a novel multicomponent abortive infection mechanism encoded by plasmid pKR223 of Lactococcus lactis subsp. lactis KR2. Appl. Environ. Microbiol. 66:2647-2651. Uhl, M. A. et J. F. Miller. 1996. Integration of multiple domains in a two-component sensor protein: the Bordetella pertussis BvgAS phosphorelay. EMBO J. 15:1028-1036. Unterholzner, S. J., B. Poppenberger et W. Rozhon. 2013. Toxin-antitoxin systems: Biology, identification, and application. Mob. Genet. Elements 3:e26219. Uzan, M. et E. S. Miller. 2010. Post-transcriptional control by bacteriophage T4: mRNA decay and inhibition of translation initiation. Virol. J. 7:360. van den Berg, S., P. A. Löfdahl, T. Härd et H. Berglund. 2006. Improved solubility of TEV protease by directed evolution. J. Biotechnol. 121:291-298. Vedamuthu, E. R., B. A. Hauser, D. R. Henning, W. E. Sandine et P. E. Elliker. 1966. Flavor and texture in Cheddar cheese. I. Role of mixed strain lactic stater cultures. J. Dairy Sci. 49:144-150. Vera, A., N. González-Montalbán, A. Arís et A. Villaverde. 2007. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol. Bioeng. 96:1101-1106. Verdier-Metz, I., G. Gagne, S. Bornes, F. Monsallier, P. Veisseire, C. Delbès-Paus et M. C. Montel. 2012. Cow teat skin, a potential source of diverse microbial populations for cheese production. Appl. Environ. Microbiol. 78:326-333. Vincentelli, R., S. Canaan, V. Campanacci, C. Valencia, D. Maurin, F. Frassinetti, L. Scappucini-Calvo, Y. Bourne, C. Cambillau et C. Bignon. 2004. High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies. Protein Sci. 13:2782-2792. Vogel, J., L. Argaman, E. G. Wagner et S. Altuvia. 2004. The small RNA IstR inhibits synthesis of an SOS-induced toxic peptide. Curr. Biol. 14:2271-2276. Vojdani, F. 1996. Solubility. Dans: Methods of Testing Protein Functionality. G. M. Hall. (eds) Blackie Academic & Professional. p. 11-60. Von Wright, A. 2012. Genus Lactococcus, Dans: Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functionnal Aspects, Fourth Edition. S. Lahtinen, A. C. Ouwehand, S. Salminen et A. Von Wright. (eds) CRC Press. p. 63-76. Walhout, A. J., G. F. Temple, M. A. Brasch, J. L. Hartley, M. A. Lorson, S. van den Heuvel et M. Vidal. 2000. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328:575-592. Walkinshaw, M. D. 2002. Structure of Ocr from bacteriophage T7, a protein that mimics B-form DNA. Mol. Cell 9:187-194. Wang, C., M. Villion, C. Semper, C. Coros, S. Moineau et S. Zimmerly. 2011. A reverse transcriptase-related protein mediates phage resistance and polymerizes untemplated DNA in vitro. Nucleic Acids Res. 39:7620-7629. Wang, W. F., X. Cheng et I. J. Molineux. 1999. Isolation and identification of fxsA, an Escherichia coli gene that can suppress F exclusion of bacteriophage T7. J. Mol. Biol. 292:485-499. Wang, X., D. M. Lord, H. Y. Cheng, D. O. Osbourne, S. H. Hong, V. Sanchez-Torres, C. Quiroga, K. Zheng, T. Herrmann, W. Peti, M. J. Benedik, R. Page et T. K. Wood. 2012. A new type V toxin-antitoxin system where mRNA for toxin GhoT is cleaved by antitoxin GhoS. Nat. Chem. Biol. 8:855-861. Wang, X., D. M. Lord, S. H. Hong, W. Peti, M. J. Benedik, R. Page et T. K. Wood. 2013. Type II toxin/antitoxin MqsR/MqsA controls type V toxin/antitoxin GhoT/GhoS. Environ. Microbiol. 15:1734-1744.
102
Wang, X. et T. K. Wood. 2011. Toxin-antitoxin systems influence biofilm and persister cell formation and the general stress response. Appl. Environ. Microbiol. 77:5577-5583. Wegmann, U., M. O'Connell-Motherway, A. Zomer, G. Buist, C. Shearman, C. Canchaya, M. Ventura, A. Goesmann, M. J. Gasson, O. P. Kuipers, D. van Sinderen et J. Kok. 2007. Complete genome sequence of the prototype lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. J. Bacteriol. 189:3256-3270. Wiedenheft, B., S. H. Sternberg et J. A. Doudna. 2012. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 482:331-338. Wilson, G. G. et N. E. Murray. 1991. Restriction and modification systems. Annu. Rev. Genet. 25:585-627. Wilson, K. S. et P. H. von Hippel. 1995. Transcription termination at intrinsic terminators: the role of the RNA hairpin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92:8793-8797. Winther, K. S. et K. Gerdes. 2011. Enteric virulence associated protein VapC inhibits translation by cleavage of initiator tRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 108:7403-7407. Wommack, K. E. et R. R. Colwell. 2000. Virioplankton: viruses in aquatic ecosystems. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64:69-114. Yamaguchi, Y. et M. Inouye. 2009. mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 85:467-500. Yamaguchi, Y., J. H. Park et M. Inouye. 2011. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea. Annu. Rev. Genet. 45:61-79. Yamamoto, T. A., K. Gerdes et A. Tunnacliffe. 2002. Bacterial toxin RelE induces apoptosis in human cells. FEBS Lett. 519:191-194. Yang, J. M., P. J. Deurraza, N. Matvienko et D. J. O'Sullivan. 2006. Involvement of the LlaKR2I methylase in expression of the AbiR bacteriophage defense system in Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis KR2. J. Bacteriol. 188:1920-1928. Yang, X., Y. Wang et G. Huo. 2013. Complete genome sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis KLDS4.0325. Genome Announc. 1:e00962-00913. Yu, Y. T. et L. Snyder. 1994. Translation elongation factor Tu cleaved by a phage-exclusion system. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 91:802-806. Zavriev, S. K. et M. F. Shemyakin. 1982. RNA polymerase-dependent mechanism for the stepwise T7 phage DNA transport from the virion into E. coli. Nucleic Acids Res. 10:1635-1652. Zhang, Y., J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing et M. Inouye. 2003. MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 12:913-923. Zielenkiewicz, U., M. Kowalewska, C. Kaczor et P. Ceglowski. 2009. In vivo interactions between toxin-antitoxin proteins epsilon and zeta of streptococcal plasmid pSM19035 in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 191:3677-3684.