着目したphysicochemical screeningによ る新規物 …モリブデン酸化(trost酸化)...
TRANSCRIPT
微生物二次代謝産物の物理化学的性質に着目したphysicochemical screeningによる新規物質の発掘とその実用化研究
北里大学北里生命科学研究所
創薬資源微生物学寄附講座特任准教授中島琢自
公益財団法人発酵研究所寄附講座助成2014.10〜2020.3
運営責任者:中島 琢自 特任准教授研究顧問:大村智北里大学特別栄誉教授コーディネーター:高橋 洋子 名誉教授稲橋佑起特任助教 (2015年〜2018年)松尾洋孝特任助教 (2015年〜2020年)須賀拓哉特任助教 (2016年〜2017年)
創薬資源微生物学寄附講座研究体制と構成メンバー
微生物機能研究室松本厚子
微生物資源研究センター
野中健一
微生物資源
微生物応用化学研究室
塩見和朗熱帯病研究センター
岩月正人
生物活性評価 化合物最適化全合成研究
創薬資源微生物学 寄附講座
北里生命科学研究所
菌株提供
大村創薬グループ
生物有機化学研究室砂塚敏明
生物活性評価
博士課程木村徹, 宮野怜修士課程伊豆田祥子, 鈴木祐輝学部田島綾乃,村松修平, 森下結衣,花牟礼有羽, 渋谷泰生, 須田将弘, 峠岡花奈, 林賢春
合成
Physicochemical (PC) screening による新規物質の探索の流れ
データベース検索(Dictionary of Natural Products)
微生物の培養
機器分析により二次代謝産物を解析
推定新規物質の精製・構造決定
0
20
40
60
80
100
240 260 280
m/z, Da
[M+H]+ 242.0771
MS spectrometer
-50
0
50
100
200 250 300 350 400
Inte
nsity
nm
NMRHPLC
No HITS
既知物質 推定新規物質
N+
CH3
CH3
12
3
5
6
7
89
10
11
12
13
14
15
16
a
b
c
d
Inte
nsity
0
24
6
8
1012
15 20 25
Inte
nsity
Retention time (min)
0
50
100
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Inte
nsity
(AU
)
Retention time (min)
アデノシン
ストレプトマイシン
O
HOOH
HONN
N
N
NH2
ストレプトビタシン
シクロヘキシミド類
NHO OH
O
OH
NHO OH
O
OH
OO
HO
O O
HO OH
OH
N
HO
HO
HN
HOO
H
H2N
NH2
NH2NH2
アクチフェノール
O NH
O
O
OH
推定新規物質m/z 242.1910
(C17H24N+)272 nm, 284 nm
m/z 582.2729C21H39N7O12
m/z 268.1040C10H13N5O4260 nm
m/z 340.1754C17H25NO6
m/z 282.1700C15H23NO
m/z 275.1230C15H17NO260 nm, 342 nm
新規物質
生物活性評価
抗菌活性
癌パネルアッセイ
レポーターアッセイ
上皮間葉転換
・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・
PC screening の手法の構築と発見した新規物質
1. 主成分分析(MarkerView)を用いた新規物質の探索
Iminimycin, Nanaomycin, Mumiamicin, Pyrizomicin, Sagamilactam, Pochoniolide など2.窒素ルールを用いた新規含窒素物質の探索
Trichothioneic acid, Cipralphelin, FKI-7498物質, KF-140物質など3.モリブデン触媒酸化(トロスト酸化)とLC/MSを利用した含硫黄物質の探索
FKI-7961物質, Thioporidiol4. 生体低分子修飾シリカを用いた新規物質の探索
Dipyrimicin, K16-0477B 物質, K16-0389A 物質
単離・構造決定
ü 化合物の物理化学的性状ü 構築した4手法の応用
↓新規推定物質の選択
北里微生物ライブラリー
XanthoquinodinStaurosporine
ActinohivinActofuniconeAggrecerideAndrastinsArisugacinsArgadinAtpeninAurantininCervinomycinCeruleninChlorogentisylquinone
CypemycinFunalenoneHydrantomycinHymeglusinIrumamycinKinamycinLactacystinLeucomycinLuminamicinLustromycin
PentenocinsPhthoxazolinPyripyropenePhthoramycinSetamycinTakanawaenesTerpendolesTriacsinVirustomycinK97-0239
AspochalasinsAvermectinAhpatininFudecaloneFuraquinocineGlucopiericidin6-Epi-5'-Hydroxy- mycosporuloneMacrosphelides, 10-NorparvurenoneOxetin, Phenopyrrozin
AggreticinAra-ADeoxyfrenolicinFuctumycinFrenolicin BHerquline
Phenatic acids
HitachimycinKarabemycinPepticinnaminTirandamycin!��
Cytosaminomycin
ClostomicinVineomycin
Takaokamycin
Nanaomycin
ZelkovamycinAzureomycin
HerbimycinPhthoxazolin
NeoxalineViridomycin F
A-40AAsukamycin
Setomimycin
Kurasoin
Prumycin
2'-Amino-2'- deoxyadenosineBeauvericins
GuadinominesSesquicillins
ArohynapeneErabulenolsMiyakamidesOxetin
HydroxyfungerinsSespendoleVerticipyroneVerticilide
EpohelminsSpylidone
CitridonesStemphonesYaequinolones
Adechlorin
AmidepsinesMonordens
LanopylinsLariatinsLouisianinsMadindolinesMalolactomycinsNafuredinOligomycin GPanosialinsPhenazynomycin
Phenochalasins PhosalacinePurpactinPyridindolo�sRoselipinsThiotetromycin
AlbocyclineAmphistinAntimycin A9ArgifinBeauveriolide IIIChloropeptinChlorothreonineChlovalicinCladospolide DDeacetylravidomycin MDiazaquinomycinDihydrobisdechlorogeodinDiolmycinFerroverdinsGlisopreninJietacin
���
����
��� �
����
����
�����
Microbispora�
Nonomuraea�
Sphaerisporangium�Planotetraspora�
Actinocorallia�Streptosporangium�
Actinoallomurus�Actinomadura�
Actinoplanes�Asanoa�Catellatospora�
Catenuloplanes�Dactylosporangium�
Hamadaea�Micromonospora�Polymorphospora�Phytohabitans�
Rhizocola�Verrucosispora�Amycolatopsis�Kibderosporangium�
Kutzuneria�Pseudonocardia�Nocardia�Kribbella�
Agromyces�Lechevalieria�Lentzea�
Streptomyces�
Microtetraspora�
Acrocarpospora�
Kitasatospora�
1� 2� 5� 8�11�
3� 6� 9�12� 14�
4�7� 10� 13� 15� 16� 17� 18� 19� 20� 21� 22������
����� �������� ���
������������� �%�,&.$�������������'�����������������������%� ���(#�/&2$����������'��� "�������(#�3&4$��������������'�"���!������(#�,+$������������'���"��������������(#�,,$���� ����'���������� �����$������ ��#��(#�,-$����������'�����"��(#�,.$��� ��!�� &��������'�������������(#�,/$������'�����������������(#�,0$�����������'��������������������(#�,1$���������!��#�,2&,3$����� ���������������������#�,4&-+$����� ������������������#�-,$���������������������,� �#�--$���������������������0� ���
Phytohabitans+flavus+sp.$nov.$�
Phytohabitans+hou/uyneae$sp.$nov.$�Phytohabitans+suffusucus+gen.$nov.,$sp.$nov.$�
Phytohabitans+rumicis$sp.$nov.$�
Isolate$(%
)�
Genus�
Source�
Rhizocola+hellebori+gen.$nov.,$sp.$nov.$�Ac9noallomurus+radicium+sp.$nov.�
Ac9noallomurus+vinaceus+sp.$nov.$Ac9noallomurus+liliacearum+sp.$nov.�
Streptosporangium+oxazolinicum+sp.$nov.$�
Two novel genera and 7 novel species of actinomycetes isolated from plant roots 1) Geographical distribution of samples from which new
bioactive compound-producing microorganisms were isolated at the Kitasato Institute 2)
新鮮分離株:25,000 株, 物質生産保存株:1,000 株
1) Matsumoto A, Takahashi Y. J Antibiot 70, 514-519, 20172) Ōmura S. et al., Fifth Edition, Splendid gifts from microorganisms
青:放線由来, 黒:糸状菌由来新規物質
PC screening で得られた新規物質
N
OHO
OHO
NH
O
OH
OOH
N
O
NO
OOH H
N
O
OH
O OH
N
OOHO
OH
OH
OHO
OH
O
Cl
OH
HO
O
OHOH
OHOH
O
HO
OO HOHO
OH
N N
HO
O
OHO
HN
HN
O
O
OH
OH
O
O OHH
HOH
O
O
NNH
N+
O O-S
N
NHO
O
HN
OO
O
OH
OH
S OH
O
HN
O
CH3
NH
OHN
ONH
O HN
ONH
HN
O
ONH
ONH2
O
HO CH3
H3CCH3
HO
HOO
HOOHOHO
O
OH O
OOH
O
OH
OH
O
OOH
OOH
O
O
HOO
O
OS
NH
O
OH
O
OH
HN
OH
O
OO
HO
OHOHOH
OHHO
HOOH
O
O
O
OH OHO
SOH
NH
OO
OH
O
O
O
OH OHO
SOH
NH
O
NH
O
O
OHHO
OHOH
O
O
O
OH OH
OH
O
S
N
HN
COON
NH
O
H
H
H
H
HO
OH
OHN N
SHO
O
NHO
OHO
O
O
OOH
HO
O
O
O
OH
O
OOH
HO
OH
O
O
O
OH
O
OOH
HO
OH
O
O
O
OH
O
HO
OO HOHO
OH
N N
HO
O
NH2O
HN OH
O
HN
O
O
OH
H
N
N
SHOOC
O O
Nanaomycin F (2015) Nanaomycin G (2015)
Nanaomycin H (2017)EMT inhibitor
Nanaomycin I (2018)EMT inhibitor
Nanaomycin J (2018)EMT inhibitor
Nanaomycin K (2019)EMT inhibitor
Chaetochiversin C (2020)Anti-oxidant
Bisoxazolomycin (2017)Anti-bacterial
Hamuramixin A (2018)Anti-bacterial
Hamuramixin B (2018)Anti-bacterial
Sarcopodinol A (2018)Cytotoxicity
Virantmycin B (2019)Anti-virus
Virantmycin C (2019)Anti-virus
Mumiamicin (2018)Anti-oxidant
Dipyrimicin A (2018)Anti-bacterial ,cytotoxicity
Dipyrimicin B (2018)Anti-bacterial ,cytotoxicity
Cipralphelin (2019)Anti-oxidant
Thioporidiol A (2019)Anti-bacterial
Trichothioneic acid (2020)Anti-oxidant
Sarpeptin A (2019)
Sagamilactam (2016)Anti-trypanosomal
Iminimycin A (2016)Cytotoxicity
Iminimycin B (2016)Anti-microbial
N
N
SHOOC
O O
Pyrizomicin A (2018)Cytotoxicity
Pyrizomicin B (2018)Cytotoxicity
Pochoniolide A (2018)Anti-oxidant Pochoniolide B (2018)
Anti-oxidant
Pochoniolide C (2019)Acrylamide inhibitor
OH
OH
OHO
Sarcopodinol B (2018)Cytotoxicity新規物質 83 化合物
投稿準備中 10 化合物および構造解析中 4 化合物を含む
1. 主成分分析(MakerView)を用いた新規物質の探索その1
Defatted wheat germ (DWG) medium 2% soluble starch, 0.5% glycerol, 1% defatted wheat germSoybean meal (SM) medium 3.3% nutrient broth, 3.3% soybean meal, 2.2% glycerolCorn steep (CS) medium 0.5% glucose, 0.5% corn steep powder, 1% oatmeal, 1% pharmamediaStarch-meat extract (SE) medium 2.4% starch, 0.1% glucose, 0.3% peptone, 0.3% meat extract
0
10
20
30
40
50
60
70
80
10 15 20 25 30 35
Inte
nsity
(AU
)�
Retention time (min)�
4種類の生産培地のHPLCチャート(254 nm)
DWG
SM
CS
SE
Sample No.
MarkerViewを用いた主成分分析(1,200 培養液抽出物)
↓Streptomyces griseus OS-3601 が生産する化合物の物理化学的性状
情報を収集
↓天然物データベースで検索
↓新規物質と推定
↓精製・構造決定
242.1910
推定新規化合物(OS-3601A)
OS-3601Aの物理化学的性状
m/z 242.1910 (calcd. for C17H24N+)UV λmax = 272, 284
↓新規物質と推定
Iminimycin A の構造決定
-6-5-4-3-2-101
200 250 300 350 400
Δε
nm
ー: ECD スペクトル(実験)ー: ECD スペクトル(計算)
* ECD, 円偏光二色性
m/z 242.1910 (C17H24N+)
N+
CH3
CH3
12
3
56
7
89
10
11
12
13
14
15
16
a
b
c
d
1682 cm-1
Key ROESY and NOE correlations (bold arrows) and coupling constants (dotted arrows) of OS-3601A
N+
CH3
CH3
1 23 S
RS
イミニウムイオン
Iminimycin ANakashima T., et. al., J. Antibiot., 69, 611-615 (2016).
COSYHMBC (2J or 3J)
in CD2OD
Iminimycinの生物活性
Iminimycin A 1)
N+
CH3
CH3
S
NH
CH3
OHO
O
S
S
R1 23
2'R
Iminimycin B 2)
N+
CH3
CH3
1 23
SR
S
Tested microorganismsIminimycins
A (µg/disk) B (µg/disk)50 100 50 100
Bacillus subtilis ATCC 6633 10 12 - -Kocuria rhizophila ATCC 9341 - 10 - -Escherichia coli NIHJ - - - -Xanthomonas campestris KB-88 - 10 - 9Candida albicans ATCC 64548 - - - -Mucor racemosus IFO4581 - - - -
mm
0
50
100
150
1 10 100
Viab
ility
(% o
f con
trol)
Concentration (µM)
Iminimycin A
Iminimycin B
Iminimycin Aはイミニウムイオンを持つ微生物代謝産物初の報告Iminimycin Bはピリジニウムイオンを持つ放線菌代謝産物初の報告生産菌S. griseus OS-3601 は、streptomycin 生産菌として長期保存(43 年間)されてきた菌株
1) Nakashima T., et. al., J. Antibiot., 69, 611-615 (2016), 2) Nakashima T., et. al., Tetrahedron Lett., 57, 3284-3286 (2016)
●: HeLa S3○: Jurkat
0
10
20
30
40
50
60
15 20 25 30生産培地(54 medium)Soluble Starch 2%, Glycerol 0.5%, Defatted Wheat Germ 1%Meat extract 0.3%,Dry yeast 0.3%, CaCO3 0.3%
推定新規物質(nanaomycin H)[M+H]+ = 805.2307UV max = 233, 270 nm
Nanaomycin E
min
1. 主成分分析(MarkerView)を用いた新規物質の探索その2
Nanaomycin D
Nanaomycin A 1)
(ナナフロシン)
1) Ōmura S. et al., J Antibiot, 27, 363-365 (1974)
ナナオマイシン油剤あすかあすかアニマルヘルス株式会社
Streptomyces rosa subsp. notoensis OS-3966
O
CH3
COOH
OH O
O
推定新規物質 Nanaomycin H の構造決定
COSYHMBC (2J or 3J)
ROESY or differential NOE
O
O
OS
NH
O
OH
O
CH3OH
1
34
4a55a
6
7
8
99a 10
11
1'
2'
3'
5'
6'
1213
NH
OH
CH3
O
O
OH
HO
1''
2''
3''
4''
5''6''
1'''2'''
3'''
4'''5'''
6'''
O
HO OH
OH
HO
HO
HO
O
O
OS
NH
O
OH
O
CH3OH
1
344a
55a
6
7
8
99a 10
11
1'
2'
3'
5'
6'
1213
HN1'' 2''
3''
4''5''
6''
1'''2'''
3'''
4'''5'''
6'''
OHOH
O
HO
O
HO OH
HOH
OH
CH3
O
HH
H
H
OH
HHO
H
H
H
H HH
N-acetylcysteine
myo-inositol
α-glucosamine
mycothiol
in CHOD3 Nakashima T, et al., J Biosci Bioeng., 123, 765-770 (2017)
これまでに見いだされた Nanaomycin類縁体
O
O
O
OH
O
OH
Nanaomycin A
O
O
O
OH
O
OH
OH
H
Nanaomycin B
O
O
O
OH
O
NH2
Nanaomycin C
O
O
O
OH
OO
Nanaomycin D
O
O
O
OH
O
OHO
Nanaomycin E
O
O
O
OH
O
OH
OH
OH
Nanaomycin F
OHOO HO
O
OCH3OHO
Nanaomycin G
O
O
O
OH OHO
SOH
NH
O
NH
O
O
OHHO
OHO
HO OH
OHOH
HO
Nanaomycin H
O
O
O
OH OHO
SOH
NH
OO
Nanaomycin I
OH
O
O
O
OH OHO
SOH
NH
O
NH
O
O
OHHO
OHOH
Nanaomycin J
O
O
O
OH OH
OH
O
S
N
HN
COON
Nanaomycin K
抗菌活性で発見された nanaomycin類 (1970年代)
PC screening で発見した新規 nanaomycin類 (本寄附講座)
0
0.1
0.2
A H
Absorban
ceat4
50nm
Nanaomycin H の抗菌活性 2)
Tested strains MIC (μg/ml)A H
Staphylococcus aureus ATCC 6538p 0.25 >16Bacillus subtilis ATCC 6633 2 >16Kocuria rhizophila ATCC 9341 0.13 >16Escherichia coli NIHJ >16 >16Proteus vulgaris IFO 3167 16 >16Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 >16 >16Pseudomonas aeruginosa NBRC 12582 >16 >16Acoleplasma laidlawii PG8 <0.016 >16Candida albicans ATCC 64548 2 >16Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 2 >16Aspergillus niger ATCC 6275 1 >16Trichophyton mentagrophytes T-5 0.25 >16
Nanaomycin A と H の抗菌スペクトル
NanaomycinsWST-1による nanaomycin A と H の活性酸素生産量の比較
1) Hayashi M, et al., J Antibiot., 35, 1078-1085 (1982)2) Nakashima T, et al., J Biosci Bioeng., 123, 765-770 (2017)
O
CH3
O
OH
OH O
OH
O
CH3
O
OH
OH OH
OH
O
CH3
O
OH
OH O
O
⇄red.
ox.⇄red.
ox.
キノン セミキノンラジカル ハイドロキノン O
OOHHO
HO
HOHO
NH
OH
OH
OH
O
O
O
OH
O
CH3OHOH
O
HN
O
CH3S
10a4a
Nanaomycin Hは4a位と10a位が飽和され、ラジカルを発生しない
Nanaomycin Aのラジカル生産メカニズム 1)
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
1 65 124 113 102 98 147 13 15V
iabi
lity
(% o
f con
trol
)
Compounds (natural products)
生存率
細胞数の違いによる nanaomycin H の細胞毒性
コンフルエント (20,000 cells/well)細胞移動しにくい状態
薄まき (2,000 cells/well)細胞移動しやすい状態
TGF-βcultured for 1 day
生存率
生存率
TGF-βcultured for 1 day
化合物 (50 µg/ml)#1, DMSO; #2, nanaomycin H
1) Jean Paul Thiery, Nature Reviews Cancer 2: 442-454 (2002)
正常な上皮系 アデノーマ(腺腫) カルシノーマ(腫瘍)浸潤ガン 血管内進入
血管外漏出
MET
EMT EMT
EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition) , 上皮間葉転換 1)
コンフルエント
薄まき
他の化合物はコンフルエントおよび薄巻きで活性強度は変わらない
EMT 誘導細胞に対する nanaomycin H の影響
光応答基盤を用いたEMT評価系
PEGhv
365 nm
【光応答基盤法】
■, 非照射部分
細胞
■, 光照射部分 ■, 光照射部分
0 h 22 h 30 h
150 µm
0 h 5 h 10 h 15 h
A
B
C
A, DMSO; B, Nanaomycin H; C, Pyrizomicin (IC50 = 10 µM)
最終濃度 (50 µg/ml), 死細胞
一次照射 二次照射
物質材料研・中西淳先生との共同研究Nakanishi J. et. al. Analytical Sciences, 35, 65-69 (2019)
Nanaomycin Hはコロニーの周辺の細胞(リーダー細胞)に対し殺効果を示した
↓EMT が誘導された細胞に対して殺活性を示すこと
が示唆された↓
がんの転移抑制効果が期待できる
浸潤性膀胱癌細胞(T24)に対するnanaomycin類縁体の in vitroの効果
EMTを誘導したT24細胞に対する nanaomycin類縁体の影響
0
0.5
1
1.5
2
0h 24h 48h 72h 96h
増殖率(%)
時間(時)0 24 48 72 96
200
150
100
50
0
◆: DMSO■: Nanaomycin I▲: Nanaomycin H●: Nanaomycin K
Nanaomycin I Nanaomycin HNanaomycin K
S
NHO
NH
OOHO
HO OH
O
HO
HO OH
OH
OHS
N
HN
COO
N
O
O
O
OHOH
O
ROH
S
NH
O
O
OH
0%
100%
200%
300%
1 3 5 7 9 11
腫瘍径(
%)
時間(日)
300
200
100
0 1 3 5 7 9
DMSO
0.5 mg1 mg
T24細胞 (1×106)
腫瘍長径10 mm
Nanaomycin K
腫瘍長径の計測
T24細胞に対する nanaomycin Kの in vivo の効果
4a
神戸大学・重村克己先生との共同研究Cancer Res. (Submitted)
類縁体のうちnanaomycin Kが強力な活性を示した
殺さないけど増やさない
N-アセチルシステイン エルゴチオネイン マイコチオール
2.窒素ルールを用いた新規含窒素物質の探索
医薬品の 8 割以上が含窒素物質である
・網羅的に含窒素物質を探索することで医薬品への応用が期待できる・既存の含窒素物質の探索方法ニンヒドリン反応、ドラーゲンドルフ反応など TLC を用いた呈色反応を利用した探索
方法が行われてきたが、微量成分などは見逃されてきた可能性がある
網羅的な含窒素物質の簡便な探索方法が必要窒素ルール:分子量が奇数の場合、奇数個の窒素原子を含有
含有元素 件数 割合
医薬品全体 7365 100%
含窒素医薬品 6241 85%
含硫黄医薬品 1805 25%
KEGG MEDICUSーDRUG検索 低分子医薬品(分子量100ー1000以下)
窒素ルールおよび主成分分析を用いた新規含窒素の探索系
北里微生物資源ライブラリーの長期保存株、新鮮分離株、計 101 株を 4 種類の生産培地で培養後、培養物抽出液を LC/MS で測定
選択した化合物の物理化学的性状情報をデータベースで検索し、推定新規含窒素化合物を探索
主成分分析ソフトウェア
(MarkerViewTM) で解析し、 m/zが偶数 (分子量が奇数) でかつ1つの培養液にしか含まれていない化合物を選択
横軸:培養液の種類 (404サンプル)
縦軸:化合物の検出強度
様々な培養液に含まれている化合物を選択した例
1つの培養液にしか含まれていない化合物を選択した例
新規含窒素物質trichothioneic acidの構造と生物活性
(in CD3OD)
: 1H-1H COSY
: 1H-13C HMBC
既知物質の heptelidic acid と ergothioneine が結合した新規含窒素物質
カップリングコンスタントおよび ROESY 相関により相対立体、ECDより絶対立体構造を決定Ergothioneine 部分はRaney-Nickel 試薬による脱硫反応により生じた hercynineの比旋光度より決定
Miyano R, et al., J Biosci Bioeng., 129, 508-513 (2020)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0.0125 0.025 0.05 0.1 0.1
MD
PO-O
H (μ
M)
0
1
2
3
4
5
0.125 0.25 0.5 1 2.5
Spin
con
c. (μ
M)
Trichothioneic acid (mM) Quercetin(mM)
Trichothioneic acid (mM) NaN3 (mM)
Trichothioneic acidはヒドロキシラジカルおよび一重項酸素に対し抗酸化作用を示した。
3.モリブデン触媒酸化(トロスト酸化)とLC/MSを利用した含硫黄物質の探索
含有元素 件数 割合
医薬品全体 7365 100%
含窒素医薬品 6241 85%
含硫黄医薬品 1805 25%
KEGG MEDICUSーDRUG検索 低分子医薬品(分子量100ー1000以下)
これまでの含硫黄物質の探索方法硝酸銀、ニトロプルシドなどを用いたTLCの呈色反応や
超高分解能質量分析を用いた方法が報告されている
しかし、TLC は感度が悪く、超高分解能質量分析は汎用的でない
モリブデン酸化 (Trost酸化) と LC/MS を組み合わせた含硫黄物質探索系 (MoS-screening) を構築した1)
1) Matsuo H, et al. Molecules., 25, 240 (2020)
MoS-screening
02000400060008000
100001200014000
0 5 10 15 20 25 30 35
②酸化剤添加および酸化剤非添加サンプルのクロマト比較 (LC/MS)
含硫黄物質 A 含硫黄物質 A のスルフォニル体
Inte
nsity
含硫黄物質 A のスルフォニル体 (m/z = M+16 or 32)
酸化剤添加サンプル
酸化剤非添加サンプル
① モリブデン酸化
( min )
モリブデン酸化により
硫黄原子1つあたり酸素が1つまたは2つ結合する
(NH4)6Mo7O24·4H2OH2O2
MeOH
含硫黄物質 A (m/z = M)
このような関係にあるピークは含硫黄物質であると推定できる(UVスペクトルは変化しないため、特定が容易である)
微生物培養液中に含硫黄物質が存在すれば、モリブデン酸化により酸化され、反応前のLC/MSクロマトグラムと比較することで含硫黄物質を特定する方法
基本的に、元の物質より極性が高くなる
MoS-screening による微生物培養液のスクリーニングIn
tens
ity
���5 6 97 8
�
�����
�����
����
��� ��� ���
7.11 minm/z = 402.1103
����������������
�����
��� ��� ���
7.48 minm/z = 434.1018
�� ����������� ����
�������� ����
Kitasetaline 1)
1) Aroonsri A. et al. J. Biosci. Bioeng., 114, 56-58 (2012)
放線菌培養液より kitasetalineを同定含硫黄物質の探索に成功
Kitasetalineスルフォニル体
糸状菌 Trichoderma polypori FKI-7382株が生産する新規含硫黄物質
COSY HMBC
OH
OH
SHN
OH
O
O
1
3 5 7 9 11 13 1´2´3´
4´5´
a b c d eOH
OH
SHN
OH
O
O
a b c d e
A B
Thioporidiol A Thioporidiol B
Thioporidiol A ジオール部位の相対立体は MPA ジエステル化後、25度およびマイナス 30度における 1H-NMR の差より決定し、N-アセチルシステイン部位はRaney-Nickel 試薬による脱硫反応および加水分解により生じたアラニンを改良マーフィー法にて L-アラニンと決定した。
OH
OH
S OH
O
HN
O
Thioporidiol A
S*S*
R
Thioporidiol A および B の抗腫瘍、抗マラリア、抗菌活性を評価した結果、thioporidiol B のみ、Candida albicans に対して弱い抗菌活性を示した。
MoS-screening により、糸状菌培養液から新規含硫黄物質の取得に成功
Matsuo H, et al. Antibiotics., (in press)
エルゴステロールH
H3C
OH
H3CH3C
H3CH3C
H
H
H3C
S
H
H3C
OH
H3CH3C
H3CH3C
H
H
H3C
S
富士シリシアとの共同研究
エルゴステロール修飾シリカ(ES silica)
4. 生体低分子修飾シリカを用いた新規物質の探索
Si OO SiSiOSi OO SiSi
S SSH
OH OH
シリカゲル
アンホテリシン実験例
-20020406080100120140
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Intensity�
Reten3on3me(min)�
-20020406080100120140
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Intensity�
Reten3on3me(min)�
-20020406080100120140
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Intensity�
Reten3on3me(min)�
素通り画分
水洗画分
メタノール溶出画分
LC conditionInetsil ODS-4 (3 x 250 mm)5%→100% MeOH in 0.1% formic acid (0→30 min)100 % MeOH in 0.1% formic acid (30→40 min)Detection, 400 nm
Amphotericin B (Amph-B)
Amph-B
O
O
OH OH OH OH O
OHOH
OH
OH
O
O
HO
O
OH
NH2
HO
Streptomyces sp. K04-0037(Amph-B 生産菌)50% EtOH extract (1 ml)
100 mg ES silica
素通り
水洗浄液
メタノール溶出液
ES silica
ES silica
4 ml で洗浄
4 ml メタノールで溶出
Amph-BはESシリカに結合し、メタノールで溶出される
840 放線菌培養液抽出物
ES silica MeOH溶出液
300 mg ES シリカ4 mL H2O で洗浄3 mL MeOH で溶出濃縮
既知化合物 (93 化合物)推定新規化合物 (27 化合物)
LC/UVで吸着・溶出物を確認
197 ピーク
LC/MSで化合物同定データベースで既知物質検索
既知物質 (93 化合物): 80% (75/93)が含窒素化合物
ES silica を用いたスクリーニング
O
O
OH OH OH OH O
OHOH
OH
OH
O
O
HO
O
OH
NH2
HOAmphotericin B
Filipin
O
OHOHOHOHOH OH
OH
HO
OHHO
Salinamide B
NH
ONHO
OH
OO
O
OH2C
HN
O
HOCl
O
NH
OON
ONH
HO
ONH
NO
O
NH
N O
S
Maremycin G
Streptazolin
NO
OH
O
Naphthisoxazole ANH
O
O
HN
OO
SO
HO
HO
HO
O
O
OH
NH
O
OH
O
Naphthomycin analogs
HO
OOH
O
ONH
NH2
O
O
O
O
O
O
OH
OH O
OO
OHO
O Lobophorin D
BE 54238 A
O
OHO
N
OH
O
OH
OHO
O
OH
OO
HO
NH2
OO
OH
O
HO
HO
OO ON
O
OHO
O
Respinomycin D
O
OHN O
HO
HO
Catuabine G
Cinnabaramide B
OH
HNHOO
O
H2N
ONH2
H2NNN
N N
HOOH
OH
O
Sinefungin
0
500
1000
1500
0 10 20 30 40
Inte
nsity
Retention time (min)
050
100150200250
0 10 20 30 40
Inte
nsity
Retention time (min)
K16-0194 B
K16-0194 A K16-0194 B
ES シリカ水で洗浄メタノールで溶出
培養液抽出物
020406080
100
240 250 260 270 280In
tens
itym/z, Da
020406080
100
240 250 260 270 280
Inte
nsity
m/z, Da
0
50
100
150
200 300 400 500
Inre
nsity
Wavelength (nm)
050
100150200
200 300 400 500
Inre
nsity
Wavelength (nm)
m/z 247.0618
m/z 246.0771
[M+Na]+ 268.0714
240
320
240
320
C12H10N2O4
C12H10N3O3
K16-0194 A
K16-0194 B
メタノール溶出液
27 の推定新規物質↓
Amycolatopsis sp. K16-0194株を選択
ES silica を用いた推定新規物質の選択
NN
OH
O
O
NH2
H3C
5’4’
3’
2’2
34
5
6NN
OH
O
O
OH
H3C
4’
3’
2’2
34
6
5
5’
6’7’
NN
O
OH
H3C
O
OH
2
5
62’
3’
4’5’
6’7’
3
4
NN
O
OH
H3C
O
NH2
2
5
62’
3’
4’5’
6’7’
3
4
1H-15N HMBC(in DMSO-d6)Dipyrimicin A
(K16-0194 A)Dipyrimicin B(K16-0194 B)
1H-1H COSY1H-13C HMBC(in DMSO-d6)
ES シリカに結合する
K16-0194 (dipyrimicin)類の構造決定
Tested microorganismsDipyrimicin A Dipyrimicin B
100 µg 30 µg 100 µg 30 µgCandida albicans ATCC 64548 11* - - -Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 26 16 - -Aspergillus niger ATCC 6275 - - - -Mucor racemosus IFO 4581 18 - - -Kocuria rhizophila ATCC 9341 27 18 - -Bacillus subtilis ATCC 6633 22 19 - -Escherichia coli NIHJ 23 16 12 -Xanthomonas campestris pv. oryzae KB 88 27 21 - -*Numbers represent clear zone (mm) of growth inhibition (paper disk, φ 6 mm)
Antimicrobial activity
Cell lines (origin) Dipyrimicin A (1) Dipyrimicin B (2)HeLa 3S 5.1 ± 0.5** 24.6 ± 13.9HT29 6.2 ± 0.3 72.1 ± 27.0A549 4.3 ± 0.2 >100H1299 9.2 ± 0.5 6.8 ± 3.3Panc1 9.4 ± 3.5 >100THP-1 4.3 ± 0.6 >100Jurkat 4.4 ± 0.5 >100HL-60 3.9 ± 0.7 >100
Cytotoxic activity
**IC50 values (μM)
Dipyrimicin類の生物活性
Izuta, S. et al., J. Antibiot, 71, 535-537 (2018)
Trehangelin
1. 大村ら, 特願 2014-532813.新規光線過敏症抑制剤トレハンジェリン物質及びその製造法 (2013)2. Nakashima T et al. Trehangelins A, B and C, novel photo-oxidative hemolysis inhibitors produced
by an endophytic actinomycete, Polymorphospora rubra K07-0510. J Antibiot., 66, 311-7 (2013)3. 神谷ら,新規トレハロース化合物 trehangelinの抗老化機能に関する研究. 第136年会日本薬学会大会 (2016)
4. 松熊ら, 特願 2014-066664. 化粧料または皮膚外用剤 (2014)5. 大村ら, 特願 2017-038868. トレハンジェリンの製造法 (2017)
Trehangelinの実用化に向けた取り組み
2013年 PC screening により trehangelin を発見2013年 物質特許を出願 1)
光線過敏症抑制作用 2)
2014年 応用に向けた共同研究開始(企業)コラーゲン産生促進 3)
2015年 用途特許を出願 4) (化粧品原料)2017年 生産性向上に向けた共同研究開始(企業)
(生産量100倍以上に向上)2018年 製造特許を出願 5)
2021年 化粧品発売予定
↓データベース検索
(新規物質と推定)↓
化合物の精製・構造決定
30
PC screening による trehangelinの発見
放線菌K07-0510株の4種類の培養液抽出物のHPLCチャート
V8SM
DWG
200 220 240 260 280 300 nm
216 nm
450 470 490 510 530 550 m/z
Positive
[M+H]+=507.2087(507.2078 for C22H35O13)
[M+NH4]+
[M+H-H20]+
Polymorphospora rubra K07-0510
放線菌K07-0510株はキンギン草の根から分離された。採取場所:西表島 CS
フィラグリン
合成促進2)
Trehangelinの期待できる有効性
O
OH
HO
HOOO
HO
OOH
HO
OO
CH3H3C
O
H3C
CH3
1)神谷ら(ファンケル) 「新規トレハロース化合物 trehangelinの抗老化機能に関する研究」第136回日本薬学会大会(2016年)2)小坂ら(長瀬産業)「トレハンジェリンAはSirt1活性化を介してオートファジーを誘導する」2017年度日本農芸化学大会
オートファジー
AMPK Sirt1
NAD+/NADH↑
LKB1
Positive feedback
loop
O
OH
HO
HOOO
HO
OOH
HO
OO
CH3H3C
O
H3C
CH3
UVO
OH
HO
HOOO
HO
OOH
HO
OO
CH3H3C
O
H3C
CH3
脂質酸化
皮膚バリアー機能改善や炎症性皮膚炎等に対する改善効果が期待される
2021年秋、商品化決定
Type I collagen↑1)
まとめ
PC screening 手法の構築
放線菌・糸状菌の培養液から新規 81 化合物を発見
1. 主成分分析(MarkerView)を用いた新規物質の探索2.窒素ルールを用いた新規含窒素の探索3.モリブデン触媒酸化(トロスト酸化)とLC/MSを利用した含硫黄物質の探索(MoS-screening)
4. 生体低分子修飾シリカを用いた新規物質の探索
Iminimycin類:Streptomyces griseus OS-3601株から微生物初となる新規化合物Nanaomycin類:膀胱癌モデル動物実験で効果を確認Sagamilactam:部分構造にデカリンを有するラクタム骨格最大となる34員環Dipyrimicin:ESシリカスクリーニングで発見できたジピリジン骨格を有する新規物質Trichothioneic acid:エルゴチオネインを部分構造に持つ新規物質Pochoniolide:部分構造にムコノラクトンを有する新規物質Thioporidiol: MoS-screening による糸状菌由来N-アセチルシステイン含有新規物質
実用化
Trehangelin:化粧品原料として開発(ファンケル株式会社と長瀬産業との共同研究)ESシリカ:新規分離剤として開発(富士シリシア株式会社との共同研究)
北里大学創薬資源微生物学寄附講座業績
【学術論文43報】Analytical Sciences (1); Antibiotics (1); Applied Biochemistry and Biotechnology (1); Biological and Pharmaceutical Bulletin (1); Bioscience, Biotechnology and Biochemistry (1); ChemBioChem (1); Chiang Mai Journal of Science (1); European Journal of Medicinal Chemistry (1); Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (1); Journal of Antibiotics; (15); Journal of Bioscience and Bioengineering (6); Journal of General and Applied Microbiology (4); Journal of Natural Products; (2); Molecules (1); Organic Letters (1); PLoS ONE (2); Scientific Reports (1); Tetrahedron(1); Tetrahedron Letters (1) (論文数)
【総説3報】1) Takahashi, Y., Nakashima, T. Actinomycetes, an inexhaustible source of naturally occurring antibiotics. Antibiotics (Basel), 7, pii: E45, 2018. Correction: Antibiotics (Basel), 7, pii: E74, 2018.2) 高橋洋子,中島琢自. 微生物は新規天然物の宝庫. The Japanese Journal of Antibiotics, 71, 99-112, 2018.3) Nakashima, T., Takahashi, Y., Ōmura, S. Search for new compounds from Kitasato microbial library by physicochemical screening. Biochemical Pharmacology, 134, 42-55, 2017.
【特許5件】1) 大村智, 高橋洋子, 中島琢自, 松尾洋孝, 野中健一, 坂戸久子. 新規ポコニオライド化合物及びその使用, 特願2019-506301, 出願日: 2018.3.16.2) 大村智, 高橋洋子, 中島琢自, 松本厚子, 中西淳, 松尾洋孝. 上皮間葉転換誘導細胞阻害剤, 特願2018-540354, 出願日: 2017.9.26.3) 大村智, 中島琢自, 高橋洋子, 河合真, 高坂尚平, 本田博文. エルゴステロール修飾担体、抗真菌剤の候補物質のスクリーニング方法、及び抗真菌剤の原料の精製方法, 特願2016-136127, 出願日: 2016.7.8, 登録番号: 特許66506304) 大村智, 高橋洋子, 中島琢自, 稲橋佑起. トレハンジェリンの製造法, 特願2017-038868, 出願日: 2017.3.2.5) 大村智, 高橋洋子, 中島琢自, 塩見和朗, 浅見行弘, 松本厚子, 岩月正人. 新規サガミラクタム物質およびその製造法, 特願2015-060446, 出願日: 2015.3.24
本研究は、公益財団法人 発酵研究所の寄付講座助成で行われました。
【共同研究】(年代順)(敬称略)☆NanaomycinのEMT関連評価物質・材料研究機構 中西淳神戸大学医学部 重村克巳
☆Trehangelinの生合成東京大学 葛山智久
☆Iminimycinの生合成東京大学 大西康夫、勝山陽平、堤隼馬
☆Mangromicinの生合成広島大学 荒川賢治
☆新規物質の抗酸化活性東北大学 庭野𠮷己(現秀明大学) 、目代貴之
☆新規物質のバイオフィルム阻害就実大学 塩田澄子、山田陽一
☆二次代謝産物のラマン検出早稲田大学 竹山春子、安藤正浩
☆糸状菌生産化合物の生合成筑波大学 萩原大祐、浦山俊一、二宮章洋
【企業との共同研究】☆新規物質の生物活性Meiji Seika ファルマ株式会社、株式会社BFアグロ☆ESシリカ富士シリシア化学株式会社、第一三共ノバーレ株式会社
☆Trehangelinの開発ファンケル株式会社、長瀬産業株式会社
☆成分分析天野エンザイム株式会社、株式会社村田製作所
【研究推進】☆北里生命科学研究所(現大村智記念研究所)☆大村智北里大学特別栄誉教授☆大村創薬グループの皆様
☆新規物質の抗ウイルス活性神戸大学 亀岡正典、靱千恵
☆Trehangelinの生物活性昭和大学 田中和生、石川裕樹
☆新規物質の生物活性
岩手大学 木村賢一
謝辞
【その他】文部科学省化学療法基盤支援活動知財活用支援事業大学等知財基盤強化支援(権利化支援)科研費(19K15758, 17K08342, 17K15250, 17K15469, 15K18888, 16H07167)笹川科学研究助成 (2019-3025)