Universidade Federal do Rio de Janeiro Daniele Gabriel Costa

MELHORA DA DISFUNO VENTRICULAR INDUZIDA PELO INFARTO DO MIOCRDIO APS TRATAMENTO

COM 3,4 METILENODIOXIBENZOIL-2-TIENILHIDRAZONA (LASSBio-294)

Rio de Janeiro 2011

Daniele Gabriel Costa

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MELHORA DA DISFUNO VENTRICULAR INDUZIDA PELO INFARTO DO MIOCRDIO APS TRATAMENTO

COM 3,4 METILENODIOXIBENZOIL-2-TIENILHIDRAZONA (LASSBio-294)

Orientadores: Prof.a Dra. Gisele Zapata Sudo Prof. Dr. Roberto Takashi Sudo

Rio de Janeiro 2011

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Ps-graduao em Farmacologia e Qumica Medicinal do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Doutor em Cincias Biolgicas (Farmacologia e Qumica Medicinal).

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FICHA CATALOGRFICA

Costa, Daniele Gabriel. Melhora da disfuno ventricular induzida pelo infarto do miocrdio aps tratamento com 3,4 metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona (LASSBio-294) /Daniele Gabriel Costa 2011. 111 fl.: il

Tese (Doutorado em Farmacologia e Qumica Medicinal) Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Cincias Biomdicas, Rio de Janeiro, 2011.

Orientadores: Gisele Zapata Sudo e Roberto Takashi Sudo.

1. LASSBio-294 2. Infarto do miocrdio 3. Remodelamento cardaco 4. Fluxo de clcio intracelular

I. Zapata-Sudo, Gisele (Orient.). II. Sudo, Roberto Takashi (Orient.). III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Cincias Biomdicas, Programa de Ps-graduao em Farmacologia e Qumica Medicinal. IV. Ttulo.

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FOLHA DE APROVAO

Daniele Gabriel Costa

Melhora da disfuno ventricular induzida pelo infarto do miocrdio aps tratamento com 3,4 metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona (LASSBio-294)

Aprovada em: 22 de fevereiro de 2011.

_______________________________________________________________

Profa. Dra. Gisele Zapata Sudo, ICB/UFRJ (Orientadora)

_______________________________________________________________

Prof. Dr. Roberto Takashi Sudo, ICB/UFRJ (Orientador)

_______________________________________________________________

Prof. Dr. Carlos Alberto Manssour Fraga, Faculdade de Farmcia/UFRJ

_______________________________________________________________

Prof. Dr. Jos Hamilton Matheus Nascimento, IBCCF/UFRJ

_______________________________________________________________

Prof. Dr. Roberto Coury Pedrosa, HUCFF/UFRJ

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Profa. Dra. Valria do Monti Nascimento Cunha, ICB/UFRJ (Revisora)

_______________________________________________________________

Prof. Dr. Emiliano Medei, IBCCF/UFRJ (Suplente)

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Ps-graduao em Farmacologia e Qumica Medicinal do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Doutor em Cincias Biolgicas (Farmacologia e Qumica Medicinal).

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Este trabalho dedicado aos meus pais, Claudio Luiz Gabriel Costa e Tania Mara Gabriel Costa; Aos meus irmos, Diogo Gabriel Costa e Dbora Gabriel Costa; Daisy Ribas Carestiato; Ao Dr. Rogrio Pires de Mello Neto; Aos meus tios, primos e amigos que me acompanharam nesta caminhada.

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AGRADECIMENTOS:

minha famlia, em especial meus pais, irmos e tios; Aos meus orientadores: Profa Dra Gisele Zapata-Sudo e Roberto Takashi Sudo; revisora: Profa Dra Valria do Monti Nascimento Cunha; Aos membros da banca: Prof. Dr. Carlos Alberto Manssour Fraga, Prof. Dr. Jos

Hamilton Matheus Nascimento e Prof. Dr. Roberto Coury Pedrosa; Ao Prof. Dr. Celso Caruso-Neves; Aos amigos do laboratrio em especial MSc. Jaqueline Soares dos Santos; PhD.

Luana Braga Pontes; Profa. Dra. Fernanda Antunes; Profa Dra. Paula Lima do Carmo; As tcnicas do laboratrio Marly e Silvania; Aos meus amigos Dr. Rogrio Pires de Mello Neto, Daisy Carestiato, Dra. Tania Brum,

Prof. Dr. Fernando Monteiro Sabia Pompeu, Camile Costa Branco Pinheiro, Bruno Pinheiro, PhD. Luana Braga Pontes, Priscilla Martins Vidal, Profa. Dra. Andrea Deslandes, MSc. Thiago Lemos de Carvalho, Prof. Dr. Rodrigo Fortunato, MSc. Daniele Leo Igncio e Carlos Magno Ramos, Virgnia Lima, Tatiana Fasolari e Bruna Baffa.

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LISTA DE ABREVIATURAS

-actina subtipo alfa da actina ACh acetilcolina A(2) subtipo 2 do receptor de adenosina A(2A) subtipo 2A do receptor de adenosina A(2B) subtipo 2B do receptor de adenosina ACDA artria coronria descendente anterior ADP adenosina difosfato AHA American Heart Association AMPc adenosina monofosfato cclico ATP adenosina trifosfato Ca2+ - on clcio CaCl2 cloreto de clcio CAMKinase II - clcio calmodulina cinase do tipo II Cav1.2 canal de clcio tipo-L DMSO dimetilsulfxido dP/dt mx. relao da derivada da presso e derivada do tempo mxima diastlica dP/dtmin. relao da derivada da presso e derivada do tempo mxima diastlica ECA enzima conversora de angiotensina EDTA cido etilenodiaminotetraactico EGTA K2-etileno glicol-bis (2-amino-etil-ter)-N, N, N', N'- cido tetraactico FC frequncia cardaca FKBP-12.6 isoforma 12.6 da protena ligadora de imunossupressores FO falso-operado GAPDH gliceraldedo fosfato desidrogenase GDP guanosina difosfato GTP guanosina trifosfato HEPES cido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanolsulfnico IC insuficincia cardaca ip intraperitoneal IM infarto do miocrdio

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ICa corrente de influxo de clcio IfNa+ corrente de sdio de curta durao IL6 interleucina 6 IL10 interleucina 10 KACh canais de potssio dependentes de acetilcolina KATP canais de potssio dependentes de adenosina trifosfato K+ - on potssio LASSBio-294 3,4 metilenodioxibenzoil-2-tielnilhidrazona M2 subtipo 2 do receptor muscarnico MyBP-C protena ligadora de miosina do tipo C MLC2 subtipo 2 da cadeia leve da miosina MLP protenas LIM musculares NCX trocador sdio-clcio Na+ - on sdio Na+/K+ ATPase bomba de Na+/K+ NO xido ntrico iNOS enzima xido ntrico sintase induzvel NYHA New York Heart Association O2 tomo de oxignio PAS presso arterial sistlica PAD presso arterial diastlica PAM presso arterial mdia pCa potencial de clcio PDE fosfodiesterase PDE1 isoforma do tipo 1 da fosfodiesterase PDE3 isoforma do tipo 3 da fosfodiesterase PDE7 isoforma do tipo 7 da fosfodiesterase pH potencial de hidrognio PK protena cinase PKA protena cinase do tipo A PKC protena cinase do tipo C Pi fosfato inorgnico PLB fosfolamban PNA peptdeos natriurticos atriais

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PMCA- clcio ATPase da membrana plasmtica PMSF fluoreto de fenilmetilsufonila Protena G protena trimrica ligadora de guanosina trifosfato Protena Gi protena trimrica ligadora de guanosina trifosfato inibitria Protena Gs protena trimrica ligadora de guanosina trifosfato estimulatria PVSFE presso ventricular sistlica final esquerda PVDFE presso ventricular diastlica final esquerda R2 coeficiente de determinao RS retculo sarcoplasmtico Receptor 1A subtipo 1A do receptor alfa-adrenrgico Receptor 1B subtipo 1B do receptor alfa-adrenrgico Receptor 1D subtipo 1D do receptor alfa-adrenrgico Receptor 2A subtipo 2A do receptor alfa-adrenrgico Receptor 2B subtipo 2B do receptor alfa-adrenrgico Receptor 2C subtipo 2C do receptor alfa-adrenrgico Receptor 1 subtipo 1 do receptor beta-adrenrgico Receptor 2 subtipo 2 do receptor beta-adrenrgico Receptor 3 subtipo 3 do receptor beta-adrenrgico RyR receptor de rianodina RyR2 receptor de rianodina do tipo II RAA renina-angiotensina-aldosterona SERCA2a subtipo 2a da clcio ATPase do retculo sarcoplasmtico Soluo R soluo de relaxamento Soluo W soluo de lavagem TNF fator de necrose tumoral alfa TGF1 fator de crescimento transformador beta 1 Tris tris(hidroximetil)-aminometano VEGF fator de crescimento do endotlio vascular

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RESUMO

COSTA, Daniele Gabriel. Melhora da disfuno ventricular induzida pelo infarto do miocrdio aps tratamento com 3,4 metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona (LASSBio-294). Rio de Janeiro, 2011. Tese (Doutorado em Farmacologia e Qumica Medicinal) Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011.

O infarto do miocrdio (IM) normalmente associado hipertrofia cardaca, reduo da captao de Ca2+ pelo retculo sarcoplasmtico (RS) e ao comprometimento do relaxamento cardaco. Atualmente os tratamentos

disponveis ainda so insatisfatrios para impedir a evoluo das complicaes

decorrentes do IM. O objetivo desse trabalho foi investigar o processo de remodelamento cardaco e a funo ventricular de coraes submetidos ao IM

aps tratamento com uma nova tienilhidrazona: 3,4-metilenodioxibenzoil-2-

tienilhidrazona (LASSBio-294). LASSBio-294 aumenta significativamente a captao de Ca2+ em fibras cardacas desnudas, reduz a dor inflamatria e

promove vasodilatao na presena do endotlio ntegro em condies

controles. LASSBio-294 (2 mg/kg) ou veculo (dimetilsulfxido / DMSO - 100%) foi administrado diariamente por via intraperitoneal (ip) durante quatro semanas em ratos submetidos ao IM experimental e falso-operados. O volume de DMSO

administrado em todos os animais variou entre 50 e 80 l. O remodelamento

cardaco e a disfuno ventricular foram investigados atravs da anlise

histoqumica do tecido cardaco e da determinao da presso intraventricular

esquerda. A regulao de Ca2+ intracelular (captao e liberao) e a sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ foram avaliadas atravs da

determinao da resposta contrtil de fibras ventriculares desnudas

provenientes de coraes dos ratos infartados e falso-operados. A expresso

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protica da isoforma SERCA2a foi verificada aplicando a tcnica de western

blot. A hipertrofia cardaca que se desenvolveu quatro semanas aps o IM, de

4,5 0,2 para 7,1 0,3 mg/g, foi parcialmente revertida pelo tratamento com

LASSBio-294 para o valor de 5,7 0,3 mg/g. O tratamento com LASSBio-294

tambm reduziu a densidade nuclear de 7.369 1.086 para 3.061 255

ncleos/mm2 e a rea percentual de colgeno de 4,2 0,8 para 2,1 0,3% nos

ratos submetidos ao IM . A elevao da presso diastlica final do ventrculo

esquerdo induzida pelo IM de 8,9 1,6 para 16,4 2,5 mmHg foi revertida com

administrao ip do LASSBio-294 para 9,0 2,2 mmHg. O IM reduziu a

captao de Ca2+ pelo RS, mas no modificou a liberao de Ca2+ nem a

sensibilidade das miofibrilas a esse on. No entanto, LASSBio-294 restaurou a

atividade de captao de Ca2+ pelo RS e aumentou a sensibilidade das

protenas contrteis ao Ca2+. As modificaes observadas na captao de Ca2+

parecem estar relacionadas com alteraes na expresso da protena

SERCA2a, tanto em resposta ao IM quanto ao tratamento. LASSBio-294

parece ser um candidato promissor para a melhoria da regulao de Ca2+, a

preveno da disfuno cardaca e o potencial desenvolvimento de

insuficincia cardaca (IC) decorrente do IM.

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ABSTRACT

COSTA, Daniele Gabriel. Melhora da disfuno ventricular induzida pelo infarto do miocrdio aps tratamento com 3,4 metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona (LASSBio-294). Rio de Janeiro, 2011. Tese (Doutorado em Farmacologia e Qumica Medicinal) Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011.

Myocardial infarction (MI) is usually associated with cardiac hypertrophy, reduced Ca2+ uptake by the sarcoplasmic reticulum (SR) and impairment of cardiac relaxation. Currently, the available treatments are still unsatisfactory to

prevent the development of the MI complications. The aim of this study was to

investigate the process of cardiac remodeling and ventricular function of hearts

subjected to MI after treatment with a new thienylhydrazone: 3,4-methylenedioxybenzoyl-2- thienylhydrazone (LASSBio-294). LASSBio-294 significantly increases Ca2+ uptake in denuded cardiac fibers, reduces

inflammatory pain and promotes vasodilation in the presence of intact

endothelium in control conditions. LASSBio-294 (2 mg/kg) or vehicle (dimethylsulfoxide/DMSO - 100%) was administered intraperitoneally (ip) every day during four weeks in rats subjected to experimental MI and sham-operated. The volume of DMSO administered in all animals ranged between 50 and 80 l.

The cardiac remodeling and ventricular dysfunction were investigated by

histochemistry analysis of cardiac tissue and determination of the left

intraventricular pressure. The intracellular Ca2+ regulation (uptake and release) and the sensitivity of contractile proteins to Ca2+ were evaluated by determining

the contractile response of denuded ventricular fibers from hearts of infarcted

and sham-operated rats. Protein expression of SERCA2a isoform was verified

by western analysis. Cardiac hypertrophy which developed four weeks after MI

from 4.5 0.2 to 7.1 0.3 mg/g was partially reversed by treatment with

13

LASSBio-294 to 5.7 0.3 mg/g. The treatment with LASSBio-294 also reduced

the nuclear density from 7,369 1.086 to 3.061 255 nuclei/mm2 and the

percent collagen area from 4.2 0,8 to 2.1 0.3% in rats submitted to MI . The

increase in end diastolic pressure of left ventricle induced by MI from de 8.9

1.6 to 16.4 2.5 mmHg was reversed with ip administration of LASSBio-294 to

9.0 2.2 mmHg. MI reduced the uptake of Ca2+ by the SR but did not modify

the Ca2+ or the sensitivity by myofibrils to this ion. However, LASSBio-294

restored the activity of Ca2+ uptake by SR and increased the sensitivity of

contractile proteins to this ion. The changes observed in Ca2+ uptake seem to

be related to alterations in SERCA2a expression in response to MI and

treatment. LASSBio-294 seems to be a promising candidate for improving the

regulation of Ca2+, prevention of cardiac dysfunction and the potential

development of heart failure (HF) due to MI.

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SUMRIO

1 INTRODUO 16 1.1 FISIOLOGIA CARDACA 18 1.1.1 Estrutura e anatomia das clulas cardacas e do corao 18 1.1.1.1 Protenas contrteis e estruturais 18 1.1.1.2 Organelas celulares 23 1.1.1.3 Organizao macroscpica do tecido cardaco 25 1.1.2 Acoplamento excitao-contrao do msculo cardaco 31 1.1.3 Relaxamento do msculo cardaco 36 1.1.4 Modulao da atividade contrtil cardaca 37 1.1.5 Insuficincia cardaca 41 1.1.5.1 Definio e classificao da insuficincia cardaca 41 1.1.5.2 Mecanismo envolvidos no desenvolvimento da insuficincia cardaca decorrente do infarto do miocrdio

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1.2 TRATAMENTO FARMACOLGICO DA INSUFICINCIA CARDACA 52 1.3 ATIVIDADES FARMACOLGICAS E MECANISMO DE AO DE 3,4 METILENODIOXIBENZOIL-2-TIENILHIDRAZONA (LASSBIO-294)

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1.4 OBJETIVOS 57 1.4.1 Objetivo geral 57 1.4.2 Objetivos especficos 57 2 MATERIAIS E MTODOS 58 2.1 ANIMAIS 59 2.2 FRMACOS E REAGENTES 59 2.3 DESENHO EXPERIMENTAL 61 2.4 MODELO EXPERIMENTAL DE INFARTO DO MIOCRDIO 61 2.5 AVALIAO DA HIPERTROFIA CARDACA 62 2.6 AVALIAO HISTOQUMICA 62 2.6.1 Processamento e seco do material 62 2.6.2 Colorao do material 63 2.6.3 Mensurao da densidade nuclear e da rea percentual de fibrose

64

2.7 AVALIAO DA REGULAO DE Ca2+ INTRACELULAR 65 2.7.1 Captao e liberao de Ca2+ pelo RS 66

15

2.7.2 Sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ 69 2.8 AVALIAO DA EXPRESSO DE SERCA2a NO TECIDO CARDACO

70

2.8.1 Preparao dos homogeneizados 70 2.8.2 Anlise da expresso protica por western blot 70 2.9 AVALIAO DOS PARMETROS HEMODINMICOS 71 2.10 ANLISE ESTATSTICA 73 3 RESULTADOS 74 3.1 HIPERTROFIA CARDACA 75 3.2 DENSIDADE NUCLEAR E VOLUME DE COLGENO INTERSTICIAL

76

3.3 CONTRATILIDADE CARDACA E MOBILIZAO DE Ca2+ INTRACELULAR

79

3.3.1 Regulao da captao e liberao de Ca2+ do RS 79 3.3.2 Relao da sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ 82 3.4 EXPRESSODE SERCA2a NO TECIDO CARDACO 84 3.5 PARMETROS HEMODINMICOS 86 4 DISCUSSO 88 5 CONCLUSO 99 6 REFERNCIAS 101

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1 IntroduoIntroduoIntroduoIntroduo

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As doenas cardiovasculares esto entre as principais causas de morte nos Estados Unidos da Amrica (EUA) e em todo mundo. A epidemia que se alastra a cada ano ocorre principalmente devido ao aumento da incidncia dos fatores de riscos envolvidos na gnese dessas doenas como: o tabagismo, a obesidade, o sedentarismo, o diabetes melitus e a sndrome metablica (http://www.americanheart.org/statistics). Somente nos EUA, um em cada trs americanos possui algum tipo de doena cardiovascular, totalizando 80 milhes de portadores (http://www.americanheart.org/statistics). Dentre as disfunes mais proeminentes esto a insuficincia cardaca (IC), acometendo 5,7 milhes de habitantes e o infarto do miocrdio (IM) acometendo 7,9 milhes de norte-americanos (http://www.americanheart.org/statistics). A mortalidade decorrente das doenas cardiovasculares bastante elevada. S no ano de 2005 nos EUA, aproximadamente 450 mil pessoas morreram devido ao infarto do miocrdio (ADAMS et al., 2008). Esta situao vem sendo melhorada devido a polticas preventivas implementadas pelo governo, principalmente no que diz respeito a alimentao infantil. No entanto, esses nmeros ainda encontram-se longe do valor ideal. Entre latinos e hispnicos, a incidncia de novos eventos cardacos foi de 610 mil no ano de 2009 e de infartos recorrentes de 325 mil (http://www.americanheart.org/statistics) com taxa de mortalidade em 2005 de 118 indivduos para cada 100 mil habitantes (http://www.americanheart.org/statistics).

Esses dados ratificam a preocupao da Organizao Mundial de Sade com o tratamento e principalmente com a preveno dessas doenas. O custo com internaes hospitalares, bem como, com o tratamento farmacolgico e intervenes cirrgicas cada vez maior. O gasto estimado pelo governo americano no ano de 2009 foi de cerca de 166 bilhes de dlares para o tratamento das doenas coronarianas. Esse gasto para pessoas com IC girou em torno 33 bilhes de dolres no mesmo perodo. Inmeros esforos tm sido empregados na tentativa de desenvolver novas terapias que simplifiquem o tratamento das pessoas acometidas por doenas cardiovasculares, bem como, na preveno das mesmas. Nesse sentido, equipes multidisciplinares trabalham para desenvolver e modificar os hbitos populacionais

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contemporneos, que se caracterizam pelo consumo de alimentos com altos ndices calricos, a ingesto excessiva de lcool, o sedentarismo e o tabagismo. O tratamento farmacolgico dos pacientes que sofreram IM e desenvolveram IC feito atravs de um esquema teraputico amplo, que envolve a administrao de vrios frmacos. Isso se deve ao fato do desenvolvimento da doena e o aparecimento dos seus sintomas serem promovidos por uma srie de disfunes de processos fisiolgicos importantes no organismo. Assim, dependendo da intensidade do evento, do grau de acometimento que o mesmo gera no sistema cardiovascular, e dos tipos de sintomas apresentados, diferentes estratgias teraputicas podem ser implementadas. Atualmente, as pesquisas farmacolgicas esto voltadas para o desenvolvimento de novas substncias que possam apresentar maior eficcia no tratamento simultneo de diferentes sintomas, reduzindo a necessidade do uso de inmeros frmacos. Essa condio permite uma maior adeso do paciente ao tratamento e reduz o seu custo, tornando-o portanto mais eficaz.

Diferentes frmacos vm sendo apresentados como novas alternativas para o tratamento da IC. Atualmente, o levosimendam e a espirolactona so frmacos que apresentam maior destaque no mercado para o tratamento da queda da contrtilidade cardaca induzida pela IC, apresentada por alguns pacientes e para inibio do remodelamento cardaco, respectivamente (LI et al. 2009; BERGH et al., 2010). Seguindo essa proposta, esse trabalho testou o efeito de uma nova substncia com propriedades inotrpica e lusitrpica positivas como possvel alternativa futura para o tratamento dos efeitos deletrios induzidos pelo IM. Esse trabalho foi desenvolvido com intuito de se observar as consequncias relacionadas administrao diria prolongada dessa substncia em ratos submetidos ao IM experimental e observar a sua eficcia no tratamento dos sintomas apresentados.

1.1 FISIOLOGIA CARDACA 1.1.1 Estrutura e anatomia das clulas cardacas e do corao

1.1.1.1 Protenas contrteis e estruturais

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O tecido muscular cardaco formado por protenas contrteis, que organizadas do origem a unidade funcional contrtil da clula conhecida como sarcmero. O mesmo constitudo pelos filamentos grosso e fino, sendo o primeiro composto por molculas de miosina e o segundo por troponina, tropomiosina e actina (Figura 1).

Figura 1. Esquema ilustrativo dos filamentos grosso e fino que compem o sarcmero e suas protenas representadas. Compondo o filamento fino encontram-se a actina, troponina, tropomiosina e compondo o filamento grosso observa-se a miosina. Retirado de http://panatpat.unicamp.brmusnormal.html/ Acessado em 21 de janeiro, 2011.

O filamento fino se une a estruturas conhecidas como linha Z (filamentos de -actina) que delimitam os sarcmeros. Molculas de actina-G (globular) alinham-se para formar uma estrutura filamentar conhecida como actina-F. Duas dessas estruturas se entrelaam, assumindo um formato de -hlice. Essa estrutura bifilamentar envolta, ainda, pelas molculas de tropomiosina e troponina, que, por sua vez, composta por trs unidades: troponina C, troponina I e troponina T. A primeira possui alta afinidade com ons clcio (Ca2+), a segunda encontra-se ligada ao filamento de actina e a ltima ligada tropomiosina. Acredita-se que a tropomiosina no estado de repouso, onde a concentrao de Ca2+ intracelular baixa, encubra os stios ativos presentes nas molculas de actina, impedindo o processo de contrao e mantendo o msculo relaxado. A presena da tropomiosina em seu estado conformacional de repouso inibe a ligao entre a miosina e actina, evento essencial para ativao da contrao muscular.

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O filamento grosso formado principalmente por molculas de miosina, a mesma, por sua vez, composta por duas cadeias pesadas e quatro cadeias leves. As cadeias pesadas assumem o formato de -hlice, dando origem cauda da molcula, e na parte terminal se dividem para formar a parte da estrutura da cabea da miosina (Figura 2A). As cadeias leves, divididas em duas cadeias reguladoras (MLC2) e duas essenciais, encontram-se na parte terminal das cadeias pesadas e juntamente com essas formam a cabea da miosina (Figura 2A).

A cadeia pesada apresenta atividade ATPsica necessria para ativar o processo contrtil exatamente no bolso onde a estrutura helicoidal se desfaz para dar origem cabea, regio essa denominada de bolso de ATP (BRAUNWALD et al., 2001). Existem duas isoformas das cadeias pesadas de miosina: 1. , predominante no tecido cardaco humano; 2. , predominante no tecido cardaco de roedores (BRAUNWALD et al., 2001). . Doenas como a IC podem levar a mudana no padro de expresso dessas isoformas, aumentando consideravelmente a sntese da isoforma , que apresenta atividade ATPsica mais lenta em relao isoforma (BARRY et al., 2008), o que poderia em parte justificar a reduzida contratilidade observada em coraes de roedores. No entanto, outros mecanismos esto envolvidos nesse processo e a importncia dessa mudana para a reduo da fora contrtil ainda no est totalmente estabelecida. Parte do corpo e da cabea da molcula de miosina formam, as chamadas pontes cruzadas, que conectadas actina e ativadas com energia fornecida pela clivagem do ATP so capazes de se encurtarem atravs da movimentao de pontos conhecidos como dobradias (Figura 2B).

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A

B

Figura 2. Esquema ilustrativo da molcula de miosina. (A) Estrutura molecular das cadeias leves e pesadas que compem a molcula de miosina. Retirado de Guyton e Hall, 2006. (B) Pontos de flexo da molcula denominados dobradias, essenciais para movimentao da molcula e encurtamento do sarcmero. Adaptado de http://www.scienceinschool.org/2007/issue4/motors/portuguese, Acessado em 21 de Janeiro, 2011.

Outras protenas estruturais que no fazem parte do processo de contrao tambm compem o sarcmero como: a titina, a protena C ligadora de miosina (MyBP-C) e a prpria -actina. Essas protenas, apesar de no

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possurem participao direta na contrao muscular exercem um papel importante na manuteno da estrutura da clula e sua unidade contrtil, podendo tambm indiretamente influenciar na contratilidade do msculo atravs da modulao da sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ e da sntese protica (WALKER et al., 2009). A titina uma protena que une o filamento grosso linha z e possui um papel fundamental na manuteno da estrutura do sarcmero e da tenso passiva gerada pela contrao (Figura 3A). Acredita-se que o estiramento excessivo dessa estrutura decorrente de uma desorganizao estrutural do tecido pode levar ativao e modificao no padro de expresso protica dos cardiomicitos atravs da estimulao das protenas LIM musculares (MLP: lin-11 e mec-3), ativadoras do crescimento dos micitos. A energia potencial gerada com o estiramento da titina tambm parece contribuir para o aumento da gerao de fora observado no mecanismo de Frank-Starling (BRAUNWALD et al., 2001). A MyBP-C responsvel principalmente pela manuteno do alinhamento vertical dos filamentos fino e grosso. A mesma envolve verticalmente os dois filamentos, formando a zona C regio onde ocorre a sobreposio dos trs filamentos (Figura 3B). A fosforilao da MyBP-C pode ainda modificar a taxa de expresso protica, gerando mudanas nos parmetros contrteis e elevando a cintica do desenvolvimento de fora das clulas cardacas, provavelmente atravs do aumento da atividade ATPsica (STELZER et al., 2007). Alm dessas estruturas, a clula cardaca ainda formada por protenas do citoesqueleto membranar que tambm atuam na manuteno de sua forma e na modulao da expresso protica.

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A

B

Figura 3. Esquema ilustrativo das protenas estruturais que compem o sarcmero. (A) Filamento de titina que liga a o filamento grosso linha Z. Retirado de Braunwald, 2001. (B) Protena C ligadora de miosina (MyBP-C) que envolve verticalmente os filamentos fino e grosso formando a zona c. Modificado de Oakley e outros, 2004.

1.1.1.2 Organelas celulares

A clula cardaca composta por diferentes organelas e protenas responsveis pelo controle dos processos de contrao e relaxamento da clula como, por exemplo, as mitocndrias e o retculo sarcoplasmtico (RS). A

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organela envolvida na sntese de energia no processo de contrao do msculo cardaco a mitocndria. Esta para gerar ATP requer a presena do oxignio (O2) como aceptor final de eltrons na formao de gua. O principal substrato responsvel pela gerao de energia no corao so os cidos graxos provenientes das fontes lipdicas (KATZ, 2001, p.71). Os glicdios e seus derivados, como o lactato, tambm servem como fontes de energia para contrao muscular, mas em menor grau (BROOKS; FAHEY; BALDWIN, 2005). As mitocndrias se distribuem paralelamente aos sarcmeros, permitindo a disponibilizao instantnea de ATP miosina. A produo de espcies reativas de O2 durante a sntese de ATP pela mitocndria gera a ativao de mecanismos que podem induzir o remodelamento das clulas cardacas e gerar problemas no funcionamento do corao. Essa disfuno pode ser observada em diversas doenas cardacas como na IC aps IM.

O RS uma organela envolvida nos processos de contrao e relaxamento do msculo. Sua principal funo servir de reservatrio intracelular dos ons Ca2+ para ativao da contrao muscular. No msculo cardaco, a principal fonte de ativao da contrao proveniente do Ca2+ contido no RS, porm para que haja liberao a partir desse reservatrio (RS), necessrio que o Ca2+ do meio extracelular se difunda para citoplasma e ative diretamente o receptor de rianodina (RyR). Essa difuso s possvel devido ao gradiente eletroqumico mantido entre o meio extracelular e intracelular (BRAUNWALD et al., 2001). Portanto, qualquer dano no processo que envolve a captao e/ou liberao de Ca2+, modificando suas concentraes, tanto luminal (RS) quanto citoplasmtica, pode acarretar modificaes no processo contrtil muscular, prejudicando a ejeo sanguinea pelo corao. O RS forma uma rede de sarcotbulos que envolvem os sarcmeros rodeando as miofibrilas (protenas contrteis). As partes terminais do RS formam cisternas que se justapem com invaginaes da membrana plasmtica denominadas de tbulos-T. A estrutura dupla formada por um tbulo-T e uma cisterna do RS conhecida como dade e possui uma grande importncia no processo contrtil (Figura 4).

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Figura 4. Esquema ilustrativo da dade cardaca e o microdomnio de membrana formado entre o tbulo-T e a cisterna terminal do RS. Os crculos em azul claro representam molculas de CA(2)+.

A organizao espacial dessa estrutura permite que o acoplamento excitao-contrao do msculo ocorra de maneira eficiente e econmica. Por serem bem estreitas e por isso permitirem a justaposio das protenas envolvidas no transporte de Ca2+, as fendas entre o tbulo-T e o RS possibilitam que pequenas quantidades de Ca2+ sejam suficientes para ativao do processo, e por sua vez, que menos energia seja gasta para sua desativao. Quando essas estruturas se desorganizam impedindo a justaposio entre as protenas envolvidas na liberao e captao do Ca2+ pelo RS, so observadas disfunes nos processos de contrao e/ou relaxamento cardaco.

1.1.1.3 Organizao macroscpica do tecido cardaco

Tbulo- T

RSCanal deCa 2+ Tipo -L

RyR2

Ca2+

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As clulas musculares cardacas diferentemente das esquelticas possuem intercomunicaes (canais juncionais) que permitem o fluxo de ons e pequenas molculas (at 1 KDa) as clulas vizinhas. A excitao de uma clula anterior induz a despolarizao da clula seguinte com a qual possui junes intercomunicantes e discos intercalares. A presena dessas estruturas confere ao tecido cardaco a caracterstica de um sinccio funcional (Figura 5). Essa caracterstica viabiliza a ativao rpida do tecido com um gasto energtico mais baixo.

Figura 5. Esquema ilustrativo do msculo cardaco, salientando a presena dos discos intercalares, estriaes formadas pelas miofibrilas e junes intercomunicantes. Retirado de Guyton e Hall, 2006.

O corao possui quatro cavidades, duas superiores denominadas de trios e duas inferiores chamadas de ventrculos. Os trios e ventrculos so separados por vlvulas que permitem a passagem do sangue na direo trio-ventricular e impedem o seu refluxo durante a contrao dos ventrculos. A vlvula que separa o trio direito do ventrculo direito conhecida como tricspide. No mesmo nvel, encontra-se a vlvula mitral, separando o trio e o ventrculo esquerdos. Dando suporte a essas estruturas fibrosas esto os msculos papilares, presentes tanto no ventrculo direito quanto no esquerdo,

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essenciais para manuteno da forma e da funo das vlvulas. A vlvula pulmonar separa o ventrculo direito da artria pulmonar e a vlvula artica separa o ventrculo esquerdo da artria aorta. Ambas possuem uma estrutura anatmica diferente das vlvulas trios-ventriculares, mas funes idnticas (Figura 6). Entre o lado esquerdo e direito dos ventrculos encontra-se o septo ventricular, uma parede muscular grossa no qual o impulso eltrico proveniente do trio direito conduzido at os ventrculos. Em condies normais o septo se comporta funcionalmente como parte integrante do ventrculo esquerdo, entretanto, em casos onde a presso ventricular esquerda encontra-se aumentada, este passa a atuar como parte do ventrculo direito, prejudicando o bombeamento de sangue para circulao sistmica (KATZ, 2001, p.5).

Figura 6. Esquema ilustrativo do corao, demonstrando as cavidades trios-ventriculares, as vlvulas cardacas e ainda os msculos papilares. Retirado de http://www.infoescola.com/biologia/sistema-circulatorio/. Acessado em 21 de janeiro, 2011.

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As fibras musculares cardacas possuem caractersticas diferentes dependendo da regio onde se encontram. Os cardiomicitos da regio do nodo sinoatrial se caracterizam por serem auto-despolarizantes devido ampla presena de canais com baixo limiar de ativao que permite a ativao de correntes de influxo de sdio (Na+) de curta durao IfNa+. Essas correntes permitem que pequenas trocas inicas produzam potenciais de ao peridicos que mantm a atividade marca-passo do corao em funcionamento (GUYTON; HALL, 2006, p. 98). Outro conjunto de clulas encontra-se no nodo trio-ventricular. A caracterstica principal desses cardiomicitos a presena reduzida dos discos intercalares e das junes intercomunicantes (KATZ, 2001, p. 17). A funo dessas clulas retardar em alguns milissegundos o impulso eltrico gerado no nodo sino-atrial antes que o mesmo atinja os ventrculos, permitindo que os trios se contraiam antes que os mesmos. As clulas do sistema de Purkinje, por sua vez, so mais calibrosas e se organizam formando feixes (Feixe de His), responsveis pela rpida conduo eltrica e contrao simultnea dos ventrculos aps a passagem do impulso pelo nodo trio-ventricular (KATZ, 2001, p.4).

As fibras musculares cardacas e o corao so envolvidos por tecidos fibroso e seroso que auxiliam em sua manuteno estrutural. Essa organizao anatmica importante para a integrao dos mecanismos de acoplamento excitao-contrao, assim como, para a manuteno das propriedades elsticas e mecnicas do tecido. A parte interna da parede cardaca denominada de endocrdio. O corao circundado por uma membrana fibrosa na parte mais externa e serosa na parte mais interna, conhecidas como pericrdio fibroso e seroso, respectivamente. O pericrdio seroso dividido em duas lminas, o visceral (ou epicrdio) e parietal (na parte externa). Entre essas lminas est a cavidade parietal que contm um lquido que permite fluidez entre essas duas estruturas (GUYTON; HALL, 2006, p. 115). O pericrdio fibroso se liga ao diafragma na parte inferior e continua nas paredes das artrias e veias que se ligam as cavidades cardacas (Figura 7).

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Figura 7. Ilustrao das estruturas fibrosas e musculares que se encontram dispostas em camadas no corao. Retirado de http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/corpo-humano-sistema-cardiovascular/coracao-5.php. Acessado em 21 de janeiro, 2011.

A principal funo do corao bombear sangue rico em O2 e nutrientes para os tecidos perifricos e em seguida levar o sangue rico em gs carbnico e catablitos para serem eliminados pelos pulmes. Outras funes do sangue so: o transporte de substncias como hormnios e frmacos para todo organismo, participao na manuteno do equilbrio cido-base do corpo e ainda no processo de coagulao e cicatrizao de tecidos entre outros (GUYTON; HALL, 2006, p. 130). O sangue proveniente dos tecidos chega ao trio direito atravs das veias cavas superior e inferior, ao atingir o trio direito com uma presso diastlica final em torno de -5 a 0 mmHg o mesmo bombeado para o ventrculo direito e em seguida para artria pulmonar at chegar aos capilares alveolares onde ocorrem as trocas gasosas (GUYTON; HALL, 2006, p. 144). Em seguida, atinge o trio e o ventrculo esquerdos, produzindo neste uma presso ao final da distole em torno de 5 mmHg. Sob uma presso de 120 mmHg o sangue ejetado atravs da artria aorta para ento ser distribudo para todo o organismo. Durante a distole ventricular esquerda, o sangue flui atravs das artrias coronrias para irrigar o prprio

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tecido cardaco. Esta irrigao feita principalmente atravs de quatro artrias coronrias: artria circunflexa, coronria direita, coronria esquerda e coronria descente anterior (ACDA) (Figura 8). A maior parte do ventrculo esquerdo irrigada pela ACDA. A obstruo desses vasos pode gerar isquemia e morte das clulas cardacas, fenmeno esse conhecido como IM. O tecido subendocrdico apresenta maior suscetibilidade de enfrentar eventos isqumicos por se tratar da parte mais interna do corao, tal fato se intensifica em condies onde a presso interna das cavidades aumenta, gerando maior estresse da parede e dificultando o fluxo sanguineo pelas artrias coronrias (KATZ, 2001, p. 402). Portanto, em casos onde ocorre o entupimento da artria ACDA geralmente grande parte do ventrculo esquerdo no recebe o aporte de O2 necessrio, causando um infarto transmural (toda espessura da parede do miocrdio) de grande extenso e comprometendo o bombeamento de sangue para o organismo. Essa condio ativa mecanismos compensatrios para restaurao do dbito cardaco e da presso arterial (FUKUTA; LITTLE, 2008). Esses mecanismos vo desde a ativao de sistemas neuro-humorais, reprogramao de genes inativos, alterao da expresso protica e ativao do sistema imunolgico, gerando em um primeiro momento adaptaes benficas que em seguida sobrecarregam o sistema cardiovascular e induzem o processo de IC (LEHNART; MAIER 2009).

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Figura 8. Ilustrao das principais artrias coronrias responsveis pela irrigao do tecido cardaco. Retirado de http://www.misodor.com/CORACAO.php. Acessado em 21 de janeiro, 2011.

1.1.2 Acoplamento excitao-contrao do msculo cardaco

Os eventos que vo desde a despolarizao do sarcolema dos cardiomicitos at o encurtamento dos sarcmeros e a contrao muscular so designados como processo de acoplamento excitao-contrao do msculo cardaco. Como salientado na seo anterior, a despolarizao das clulas cardacas tem incio nas clulas do nodo sino-atrial que possuem atividade marca-passo, para em seguida induzirem a contrao dos trios e ventrculos. O processo de gerao de potencial de ao de uma clula cardaca se inicia atravs da abertura de canais de sdio voltagem-dependente presentes na membrana plasmtica (GUYTON; HALL, 2006, p. 98). Esses canais so responsveis pela passagem seletiva dos ons sdio (Na+), e por possurem uma cintica de ativao rpida, so responsveis pela fase rpida do potencial de ao cardaco (fase I). A despolarizao da membrana ativa outro

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grupo de canais voltagem-dependentes. Esses canais possuem uma cintica de ativao mais lenta em comparao aos canais de Na+ e so seletivos aos ons Ca2+ e, em menor grau, aos ons Na+ (GUYTON; HALL, 2006, p.98). Os mesmos so conhecidos como canais de Ca2+ tipo-L ou receptores de dihidropiridina (Cav1.2) por serem antagonizados por substncias dessa classe qumica. Estes canais so responsveis pela gerao de um plat no potencial de ao atravs da manuteno do potencial positivo no interior da clula (fase II). Os canais voltagem-dependentes permeveis ao K+ e, de cintica ainda mais lenta, tambm so ativados durante a despolarizao da clula muscular cardaca. No entanto, a comporta de ativao desse canal presente na parte intracelular da membrana, se abre tardiamente, quando ambos os canais de Na+ e Ca2+ j se encontram inativados. O efluxo dos ons K+ durante essa fase permite a repolarizao da membrana celular (fase III), e a manuteno desse estado aberto promove a hiperpolarizao da clula, quando o potencial vai a valores mais negativos que o potencial de repouso (fase IV). A abertura dos canais de Ca2+ tipo-L permite que alguma quantidade de Ca2+ seja transportada passivamente para o interior da clula cardaca, devido diferena no gradiente eletroqumico existente entre o meio intracelular e extracelular dos cardiomicitos. Esse pequeno influxo de Ca2+ no citosol (ICa) suficiente para alcanar as cisternas do RS justapostas ao tbulo-T, ativando os RyR (BERRIDGE et al., 2000). Segundo Lehnart e Maier (2009), a fenda entre a juno do RS e o tbulo-T, que possui aproximadamente 12 nm de largura, funciona como microdomnio que compartimentaliza trocas inicas e facilitam o processo de acoplamento excitao-contrao. Os RyR so protenas presentes na membrana do RS. No corao a isoforma do receptor de rianodina predominante a do tipo II (RyR2). Os RyR2 respondem a uma srie de moduladores qumicos, como a rianodina, a cafena, o Ca2+, protenas cinases (PK) e a imunofilina FKBP-12.6 (12.6 kDa). Essa imunofilina responsvel pela estabilizao do canal na conformao fechada. Segundo Priori e Napolitano (2005), RyR2 uma das maiores protenas do organismo, possuindo um total de 4967 aminocidos e um peso molecular de 565 kDa. Alm de estar sujeito a modulao na sua parte externa, na qual se encontra a maior parte dos aminocidos que fazem parte da estrutura do canal, o mesmo est sujeito modulao interna, principalmente pelo Ca2+ presente no lmem

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do RS. Outras protenas presentes no lmem do RS, como calsequestrina, calreticulina, triadina e junctina tambm influenciam a abertura do RyR2 (BLAYNEY; LAI, 2009). Portanto, modificaes na expresso dessas protenas provocadas por doenas podem gerar distrbios na cintica do canal, causando problemas no ciclo contrao-relaxamento celular (BLAYNEY; LAI, 2009). A elevada concentrao do Ca2+ na parte interna do RS aumenta a probabilidade de abertura do RyR2 (LUKYANENKO et al., 1996; SITSAPESAN; WILLIAMS, 1997; GYORKE,I; GYORKE,S, 1998). Na ausncia de calsequestrina essa probabilidade aumenta, possibilitando o vazamento de Ca2+ durante a distole (BLAYNEY; LAI, 2009). A mudana conformacional do RyR2 em resposta ao aumento do Ca2+ na regio das dades abre um poro no centro do receptor permitindo o efluxo de Ca2+, que est contido em altas concentraes no RS, para o citoplasma da clula. O mecanismo no qual o Ca2+ extracelular ativa a liberao do Ca2+ contido no RS, foi descrito por Fabiato, A. e Fabiato, F. (1979) em ensaios com fibras desnudas, e conhecido como mecanismo de Ca2+ induz a liberao de Ca2+ (Figura 9). A modulao do canal atravs desse mecanismo s ocorre em concentraes intermedirias de Ca2+ (10-7 > [Ca2+]i < 10-5), ou seja, o RyR2 encontra-se inativado tanto em baixas (< 10-8) quanto em altas concentraes de Ca2+ (> 10-2) (MEISSNER, 2002).

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Figura 9. Ilustrao do processo do fluxo de Ca2+ durante a contrao muscular. Modificado de Blayney e Lai, 2009. SERCA (Ca2+ ATPase do RS, PLB (fosfolamban), NCX (trocador Na+/ Ca2+), LCC (canal de Ca2+ tipo-L), RyR2 (receptor de rianodina tipo 2)

A abertura de RyR2 aumenta consideravelmente a concentrao intracelular de Ca2+ e permite que o mesmo se ligue s molculas de troponina C presentes nos filamentos finos dos sarcmeros. Essa ligao promove uma mudana conformacional no complexo da troponina alterando as posies da troponina I e T. Essa ltima ligada a tropomiosina desloca e libera os stios ativos da actina antes encobertos pela tropomiosina no estado de repouso. Segundo Braunwald e outros (2001), em baixas concentraes de Ca2+, as pontes cruzadas encontram-se desligadas ou em estado de baixa ativao. Aps a liberao dos stios ativos da actina mediado pelo o aumento da concentrao citoslica de Ca2+, as cabeas da miosina entram em contato com os stios da actina e a clivagem do ATP na cabea da miosina ativada, gerando um estado de ligao mais forte das pontes cruzadas. Aps a induo

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do estado de ligao forte pela atividade ATPsica da cadeia pesada da miosina, a adenosina difosfato (ADP) e o fosfato inorgnico se desligam do stio cataltico e em seguida ocorre a movimentao da cabea da miosina, gerando fora e encurtamento dos sarcmeros. A introduo de uma nova molcula de ATP na fenda cataltica, por sua vez, induz o retorno do estado original de ligao fraca das pontes cruzadas, permitindo que um novo ciclo de encurtamento seja desenvolvido (Figura 10).

Figura 10. Esquema Ilustrativo dos mecanismos moleculares de um ciclo de contrao. Retirado de http://faculty.irsc.edu/FACULTY/TFischer/AP1/cross%20bridge%20cycle.jpg. ATP (adenosina trifosfato), Pi (fosfato inorgnico), ADP (adenosina difosfato). Acessado, 21, janeiro, 2011.

A gerao de fora muscular depende, portanto, do nmero de pontes cruzadas que so recrutadas durante a contrao e nada tem a ver com a velocidade de contrao que influenciada pela atividade ATPsica da miosina

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(BRAUNWALD et al., 2001). . Portanto, o conceito de contratilidade ou estado contrtil do corao, que engloba as valncias: fora e velocidade de contrao, influenciado tanto pelo nmero de interaes de pontes cruzadas quanto pela isoforma miosina ATPase presente no msculo. Assim, conclui-se que a contratilidade reduzida tanto pela perda de protenas contrteis quanto pela modificao da atividade enzimtica das cadeias pesadas de miosina do msculo cardaco, entre outros fatores.

1.1.3 Relaxamento do msculo cardaco

Os processos de ativao das pontes cruzadas e gerao de fora ocorrem durante a sstole cardaca. Nessa fase, o aumento da presso gerado pela contrao promove a ejeo de sangue presente nas cavidades do corao. Para que o bombeamento ocorra de maneira eficiente, necessrio que haja o relaxamento dos cardiomicitos, permitindo o preenchimento das cmaras antes da ejeo. Esse processo se inicia com a reduo da concentrao de Ca2+ do citosol que, por sua vez, desativa o complexo troponina, bloqueando o mecanismo contrtil descrito acima. A diminuio de Ca2+ do citoplasma cardaco obtida atravs do transporte ativo e com gasto energtico, necessrio para vencer os gradientes eletroqumicos existentes entre o interior da clula, RS e o meio extracelular.

Diferentes protenas so responsveis por esse processo, cada qual com um percentual diferente de contribuio. A Ca2+-ATPase da membrana plasmtica (PMCA) uma bomba de Ca2+ de alta afinidade e baixa capacidade responsvel pela extruso de uma pequena parte do Ca2+ intracelular. Por ser uma bomba de alta afinidade mais sensvel a ativao pelo Ca2+ intracelular. A outra Ca2+-ATPase encontra-se presente na membrana do RS e denominada de Ca2+-ATPase do RS ou SERCA. A SERCA tambm um transportador de Ca2+ de alta afinidade e baixa capacidade, que capaz de bombear grande parte do Ca2+ citoplasmtico para o lmem do RS. Uma protena ligada a SERCA conhecida como fosfolamban (PLB) responsvel pela modulao da atividade enzimtica dessa bomba de Ca2+ (BERS, 2002). A fosforilao de PLB por PK promovem o aumento da atividade da Ca2+-ATPase e elevam a velocidade de relaxamento do msculo, efeito conhecido

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como lusitrpico positivo. Algumas doenas como a IC, cardiomiopatias dilatadas e hipertrficas reduzem tanto a expresso, quanto a atividade de SERCA2a (isoforma cardaca). Tal fato prejudica o relaxamento muscular e aumenta a sobrecarga do sistema cardiovascular (LEHNART; MAIER, 2009; MACKIEWICZ et al., 2009). O trocador Na+/ Ca2+ (NCX) outra protena presente no sarcolema que tambm auxilia no processo de relaxamento da clula cardaca, funcionando atravs do mecanismo de contra-transporte. O sistema de trocas inicas do NCX se caracteriza por ser um contra-transporte de Na+ e Ca2+ modulado pela atividade da protena Na+/K+ ATPase (bomba de Na+/K+). O NCX transporta simultaneamente trs ons Na+ e um on Ca2+ para faces opostas. Ao final da sstole quando a concentrao de Ca2+ encontra-se elevada no interior da clula, o NCX carreia concomitantemente um on Ca2+ para o meio extracelular e trs ons Na+ para o citoplasma, gerando uma pequena despolarizao da membrana da clula cardaca. O restabelecimento da concentrao de Na+ no meio intracelular feito pela Na+/K+ ATPase presente na membrana plasmtica, que tambm contribui para o retorno do gradiente eletroqumico do Na+. A funo dessa bomba tambm manter estvel o ciclo contrao-relaxamento da clula, j que como mencionado acima, direciona a atividade do trocador durante o relaxamento. A utilizao de frmacos que inibem Na+/K+ ATPase como os glicosdeos digitlicos induzem o inotropismo positivo, pois promovem a ativao inversa do NCX (KATZ, 2001, p. 234). Distrbios eletrolticos causados por algumas doenas podem induzir o mesmo efeito (GILMAN et al., 2005). No entanto, em condies fisiolgicas normais a funo do NCX reduzir a concentrao de Ca2+ intracelular (Figura 9).

1.1.4 Modulao da atividade contrtil cardaca

A atividade marca-passo das clulas cardacas responsvel pela gerao dos impulsos eltricos que mantm o corao em constante funcionamento. No entanto, algumas situaes exigem o ajuste tanto da freqncia quanto na fora de contrao para que a demanda de fluxo sanguneo do organismo seja suprida. O sistema nervoso autnomo responsvel por esse ajuste. As terminaes nervosas simpticas aumentam o

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inotropismo, lusitropismo e cronotropismo cardacos. O sistema parassimptico, atravs das terminaes vagais, promovem efeitos inversos. Essas respostas so alcanadas atravs de receptores metabotrpicos presentes na membrana das clulas cardacas. O sistema simptico atua atravs da liberao principalmente de norepinefrina dos neurnios ps-ganglionares e ativa os receptores acoplados a protena G. Esses receptores possuem vrias isoformas e esto relacionados com a amplificao da resposta advinda do exterior para o interior da clula cardaca atravs de molculas denominadas de segundos-mensageiros (ALBERTS et al., 2009). No caso do sistema simptico, os receptores denominados adrenrgicos que esto acoplados protena G promovem principalmente o aumento da fora contrtil quando ativados pela norepinefrina. Esses so divididos em duas classes: os receptores adrenrgicos e . Os receptores -adrenrgicos, que podem ainda ser subdivididos nos subtipos 1A, 1B, 1D 2A, 2B e 2C, no possuem grande importncia no processo contrtil do msculo cardaco, sendo mais relevantes na modulao da funo contrtil do msculo liso vascular. J os receptores -adrenrgicos, que tambm podem ser subdivididos em receptores 1, 2 e 3, so mais expressos no tecido cardaco quando comparados com os receptores -adrenrgicos. Enquanto, 1 e 2 esto relacionados com o aumento da atividade contrtil muscular, o ltimo 3 parece estar envolvido na reduo da contratilidade cardaca (ALBERTS et al., 2009). Em condies normais a expresso dos receptores 1 nos ventrculos bem maior que a dos receptores 2 (cerca de 4x), demonstrando que em indivduos sadios, o receptor 1 parece ser o principal responsvel pela resposta simptica contrtil do tecido. No entanto, em condies como na IC, o excesso da atividade neuro-humoral simptica pode causar um desequilbrio dessa proporo (BRODDE; MICHEL, 1999). Os receptores 1 sofrem "down regulation" e a expresso de 2 elevada para tentar compensar a perda da sensibilidade resposta neuro-humoral (BRODDE; MICHEL, 1999). Os receptores adrenrgicos e so acoplados a protena G que possui 3 subunidades que se mantm unidas na ausncia do ligante do receptor: , , . A unidade possui um stio de ligao para o GDP que aps a ativao do receptor pelo ligante sofre uma mudana conformacional ligando-se a uma molcula de GTP no lugar da anterior. Isso promove a dissociao dessa subunidade das

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subunidades e , que atuam como subunidade regulatria do receptor (ALBERTS et al., 2009). A protena G dependendo do subtipo do receptor adrenrgico, ativa ou inativa enzimas que so responsveis pela sntese dos segundos-mensageiros. No caso dos receptores 1 e 2 a protena G na qual eles se acoplam a Gs (estimulatria). Essa ativa a enzima adenilato ciclase presente nos microdomnios da membrana cardaca, elevando a sntese de adenosina monofosfato cclico (AMPc). Essa molcula mensageira modula atividade de protena cinase A (PKA) e ativa a fosforilao de uma srie de protenas intracelulares que participam do processo acoplamento excitao-contrao do msculo cardaco. Os principais alvos da PKA so os canais de Ca2+ tipo-L cardacos, RyR2, PLB, PMCA e protenas contrteis como a troponina I. Todos esses processos resultam no aumento das atividades inotrpica, lusitrpica e cronotrpica positivas. A fosforilao dos canais de Ca2+ do tipo-L e RyR2 geram aumento da concentrao de Ca2+ intracelular e da fora contrtil. J a fosforilao de PLB, PMCA e troponina I induzem aumento do relaxamento da clula (BRAUNWALD et al., 2001). . Como j citado em sees anteriores, algumas protenas tambm sofrem fosforilao pela PKA, modificando alguns padres da atividade contrtil como: MCL2 e MyBP-C. No entanto, seus papis so mais estudados em condies patolgicas.

A resposta ao aumento do ritmo de contrao, da fora muscular e do relaxamento cardaco contraposta pelo sistema parassimptico atravs da liberao de acetilcolina (ACh) pelas terminaes nervosas vagais. No corao, as terminaes do nervo vago encontram-se principalmente no nodo sino-atrial, mas os trios e ventrculos tambm recebem sua inervao. A ACh reduz a freqncia cardaca (FC) e a fora de contrao atravs da ativao de receptores muscarnicos. Esses receptores possuem cinco subtipos, sendo o muscarnico do tipo 2 (M2) mais expresso no tecido cardaco e responsvel pela resposta observada na ativao parassimptica. O receptor M2 tambm um receptor acoplado protena G, no entanto isoforma Gi ou inibitria. Ao ser ativado, o receptor dissocia a sua unidade e esta inibe a adenilato ciclase, reduzindo o efeito da estimulao adrenrgica. Alm disso, os canais de potssio dependentes de ACh (KACh) e de ATP (KATP) so estimulados por Gi e esse efeito gera uma reduo da voltagem intracelular, diminuindo a freqncia

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de despolarizaes e logo a FC. Segundo Braunwald e outros (2001), os receptores M2 ainda estimulam a produo de GMPc no tecido cardaco, possuindo certo grau de efeito cronotrpico negativo, e ainda estimulam a liberao de ACh e inibem a liberao de norepinefrina dos terminais parassimpticos e simpticos, respectivamente. Dessa forma, M2 possui um duplo mecanismo de ao em resposta a estimulao do nervo vago.

Existem outras substncias endgenas produzidas tanto localmente quanto sistemicamente que possuem ao no tecido cardaco e podem de certa forma modular a contrao. A adenosina sintetizada a partir do metabolismo da molcula de ATP que promove principalmente uma resposta cardioinotrpica negativa (ASAKURA et al., 2007). Segundo Headrick e Laslie (2009), adenosina estimula da protena Gi acoplada ao seu receptor do subtipo I (A(1)), expresso no msculo cardaco e ainda o subtipo A(2), presente principalmente nos vasos sanguneos, gerando um efeito vasodilatador. Ambas as respostas permitem elevao do suprimento de O2 para o msculo cardaco, sendo, portanto, a estimulao da sntese de adenosina um mecanismo cardioprotetor importante durante eventos isqumicos (HEADRICK E LASLIE, 2009). A bradicinina e os opiides possuem efeito semelhante ao da adenosina podendo apresentar alguma funo cardioprotetora (KATZ, 2001, p. 292). O xido ntrico (NO) tambm possui papel modulador principalmente do cronotropismo cardaco. O NO produzido em diferentes tecidos do organismo responsvel pela reduo do ritmo de despolarizao das clulas cardacas atravs da ativao da guanilato ciclase tanto nas clulas do corao quanto nos nervos vagos. Nesse ltimo o NO aumenta a liberao de ACh intensificando o efeito do sistema parassimptico. No tecido cardaco, NO principalmente produzido em situaes de choque cardiognico e sptico atravs da isoenzima NO sintase induzvel (iNOS), tornando-se um grande aliado para proteo contra doenas coronarianas devido a seu papel na reduo da demanda e aumento do suprimento de O2 para as clulas do corao (Brauwald et al., 2001).

Os efeitos moduladores do sistema nervoso autnomo, bem como o de hormnios e de fatores locais necessitam de regulao para que sejam cessados. No caso dos nucleotdeos cclicos, esse efeito obtido atravs da ao de fosfodiesterases (PDE) que so responsveis pela clivagem dos

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mesmos e inibio de suas respostas, como por exemplo, a reduo da resposta contrtil cardaca, quando essa PDE clivar o AMPc. Existem diferentes isoformas de PDE com afinidade por um nucleotdeo especfico. No tecido cardaco a isoforma predominante a PDE3 (BERS, 2002), mas a PDE1 e a PDE7 tambm so expressas (DAS et al., 2005). As PDE tambm so alvo de modulao farmacolgica, e assim como outras enzimas e receptores podem servir de alvos teraputicos para o tratamento de doenas cardiovasculares. A inibio de PDE3 aumenta a atividade contrtil das clulas cardacas, j que essa enzima seletiva ao AMPc, portanto um inibidor dessa enzima, como a milrinona, promove um efeito cardiotnico similar quele observado durante a estimulao simptica.

1.1.5 Insuficincia cardaca

1.1.5.1 Definio e classificao da insuficincia cardaca

A maioria das doenas do sistema cardiovascular evoluem para o desenvolvimento da IC. Trata-se de uma sndrome complexa de causas multifatoriais, que apresenta uma variedade de sintomas, reduzem a qualidade de vida de um indivduo e podem muitas vezes levar ao bito. Por se estabelecer no estgio final de vrias doenas cardiovasculares, e pela caracterstica de desenvolvimento lento e progressivo, a IC apresenta maior prevalncia e incidncia na populao de idade mais avanada.

Segundo Fukuta e Little (2008), a IC pode ser designada como a condio onde o corao de um indivduo no consegue manter o dbito cardaco suficiente para suprir as demandas exigidas pelo organismo, ou faz-lo s custas de grandes presses de enchimento. Assim, muitas vezes o ndivduo desenvolve a doena sem necessariamente apresentar reduo da frao de ejeo. Alguns tipos de condies, como por exemplo, a hipertenso arterial e a estenose da vvula artica levam ao desenvolvimento de um fentipo da doena onde o sistema cardiovascular encontra-se extremamente sobrecarregado, mas no apresenta queda no suprimento de sangue (FUKUTA; LITTLE, 2008). No entanto, mesmo sob essas condies se a doena no for tratada e controlada com eficincia pode evoluir at o estgio

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onde o corao no suporta a demanda exigida, levando queda do dbito cardaco. A New York Heart Association (NYHA) classifica a IC em quatro classes funcionais (Tabela 1): a primeira ou classe I aquela que engloba os indivduos que vivem sob influncia dos fatores de risco mesmo sem apresentar qualquer sintoma ou alterao da funo cardaca; a segunda ou classe II aquela em que os indviduos apresentam alteraes morfolgicas e/ou hemodinmicas e ainda dispnia durante a atividade fsica; a terceira ou classe III se caracteriza pelo desenvolvimento dos sintomas anteriores e ainda pela reduo da capacidade de realizar atividades fsicas rotineiras; e por fim, a ltima a fase ou classe IV aquela na qual as alteraes da funo cardaca encontram-se bastante avanadas e os indivduos apresentam os sintomas de dispnia, fadiga e palpitao durante o repouso.

Tabela 1. Classificao funcional da insuficincia cardaca (NYHA) Classes Funcionais Pacientes

I - Assintomticos em suas atividades fsicas habituais.

II - Assintomticos em repouso. Sintomas so desencadeados pela atividade fsica habitual.

III - Assintomticos em repouso. Atividade menor que a habitual causa sintomas.

IV - Sintomticos (dispnia, palpitaes e fadiga), ocorrendo s menores atividades fsicas e mesmo em repouso.

NYHA: New York Heart Association. Modificado de Braunwald e outros, 2001.

Entretanto, a IC recebe vrios outros tipos de designaes para diferir a gnese da doena, o funcionamento da atividade contrtil cardaca, a fase da doena e as modificaes estruturais presentes no tecido. Os termos mais comuns usados para diferir os estgios da IC so eles: agudo e crnico (MA et al., 2010). Utiliza-se a classificao de IC antergrada e retrgrada para diferir a evoluo dos sintomas, por exemplo, quando a IC decorrente de uma sobrecarga de volume, causando congesto pulmonar ou sobrecarga pressrica, levando reduo do dbito cardaco e ativao do SRAA. Atualmente essa classificao vlida apenas para distino dos sintomas e

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pode ser usada como guia de tratamento, pois na verdade a IC danifica todo sistema cardiovascular, promovendo em estgio avanado ambos os sintomas includos nas classificaes antergrada e retrgrada (corao, artrias e veias) (KATZ, 2001, p. 660). A IC antergrada se caracterizaria pelo aumento da ps-carga que induz a hipertrofia cardaca concntrica (deposio das protenas em paralelo) e ativao o sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAA), j a retrgrada se caracterizaria por aumento do estresse da parede, aumento da presso de enchimento e hipertrofia dilatada (deposio das protenas em srie). Outra forma de classificao usada IC de baixo ou alto dbito, que especifica se a doena gera queda do dbito cardaco ou manuteno/aumento do mesmo (MEHTA; DUBREY, 2009). Ainda so usados os termos IC direita e esquerda para designar o ventrculo acometido (KATZ, 2001, p. 663; HONG et al., 2010) e, por ltimo, para distinguir algumas modificaes da arquitetura tecidual e da funcionalidade cardaca aplicam-se os termos IC diastlica e sistlica. Suas caractersticas se encontram na Tabela 2 (FUKUTA; LITTLE, 2008).

Tabela 2. Classificao baseada nas mudanas estruturais da insuficincia cardaca

Classificao Caractersticas IC sistlica (1) Dilatao ventricular;

(2) Hipertrofia excntrica; (3) Funo diastlica e sistlica comprometidas

IC diastlica (1) Manuteno ou reduo do dimetro ventricular; (2) Hipertrofia concntrica; (3) Funo diastlica comprometida e frao de ejeo normal

IC: Insuficincia cardaca. Adaptado de Fukuta e Little, 2008.

Essas diferentes classificaes demonstram a complexidade da doena e a dificuldade de entendimento dos mecanismos envolvidos na sua gnese.

Dentre as causas mais comuns da IC esto: o IM, a insuficincia valvar, a hipertenso arterial, a estenose artica, a cardiomiopatia hipertrfica, a hipertenso pulmonar e o diabetes mellitus. No caso do IM, ocorrem mudanas especficas tanto na estrutura tecidual, quanto nos parmetros hemodinmicos, levando a queda do dbito sistlico. No modelo experimental de ocluso da ACDA de roedores, as modificaes teciduais comeam a aparecer logo aps a leso e a necrose celular. O extravasamento do contedo intracelular recruta

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clulas do sistema imunolgico que induz a sntese de tecido cicatricial no local do infarto (WEBER, 2004). Em humanos, a expanso da rea de IM ocorre em mdia at duas semanas aps a ocluso da coronria e a alterao da parede ventricular se prolonga durante um maior tempo e se estabiliza apenas aps quatro semanas (SAKAI et al., 2000). A perda de massa muscular reduz de maneira absoluta a gerao de presso sistlica e impe uma elevada carga pressrica na parede ventricular, que aliada ativao de mediadores locais e centrais induz a hipertrofia das clulas cardacas no infartadas. A hipertrofia cardaca um mecanismo compensatrio, que tem como objetivo principal restabelecer a frao de ejeo que se encontra comprometida aps o IM. Esse processo pode ser evidenciado a partir da terceira ou quarta semana do mesmo (MACKIEWICZ et al., 2009). No entanto, a perda global de tecido cardaco aliada ao aumento da resistncia vascular perifrica induz a queda da funo sistlica e do dbito cardaco logo aps a primeira semana de IM (MACKIEWICZ et al., 2009). Segundo Mackiewicz e outros (2009), essa perda no consegue ser compensada pelo aumento da fora contrtil individual das clulas promovida pela ativao do sistema simptico ou pela hipertrofia quando o IM extenso.

1.1.5.2 Mecanismos envolvidos no desenvolvimento da insuficincia cardaca decorrente do infarto do miocrdio

O IM uma condio onde ocorre necrose das clulas cardacas devido reduo do seu aporte de O2 e nutrientes para gerar energia. O tecido cardaco altamente dependente do metabolismo oxidativo (principalmente da oxidao de lipdios) para a sntese de ATP e com isso sua funo bastante sensvel concentrao desse gs no sangue arteriolar (BROOKS; FAHEY. BALDWIN, 2005). Quando o aumento da demanda devido elevao do trabalho cardaco no suprida pelo aporte de O2 necessrio, os cardiomicitos acumulam metablitos e o pH intracelular aumenta. Se esta situao se estende por perodo prolongado, as clulas acabam morrendo por falta de O2. As causas mais freqentes envolvidas com os eventos isqumicos so algumas doenas vasculares como: a ateroesclorese que reduz a luz das artrias coronrias, causando o seu entupimento.

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A primeira conseqncia da morte celular a reduo do dbito cardaco devido perda da massa contrtil e s arritmias geradas em conseqncia do desequilbrio qumico e eltrico gerados aps a lise dos cardiomicitos. Esta condio pode levar a morte do indivduo, dependendo da extenso da leso que normalmente irreversvel, com consequente reduo da quantidade total de clulas cardacas. Inmeros estudos relacionam a extenso do IM com a funo sistlica e diastlica apresentada pelos pacientes e por animais submetidos ao IM em condies experimentais (PFEFFER et al., 1979, RAYA et al., 1988, MINICUCCI et al., 2010). Essa extenso tambm possui relao com o prognstico da doena e com a taxa de mortalidade (MIURA; MIKI, 2008). Quando o IM no leva ao bito, algumas reaes orgnicas compensatrias so ativadas para que ocorra a manuteno do funcionamento de rgos vitais como o crebro, o pulmo e tambm o prprio corao. Essas alteraes imediatas normalmente restabelecem a queda do dbito e a presso arterial induzidos por morte celular significativa e, portanto, so consideradas como benficas. Essas alteraes so mantidas ao longo prazo, mas ao contrrio da fase aguda, em sua fase crnica essas mudanas promovem adaptaes que geram maior sobrecarga no sistema cardiovascular. A intensificao da sobrecarga no sistema, por sua vez, mantm a ativao dos mecanismos compensatrios que levam queda progressiva da eficincia do bombeamento de sangue pelo corao (PFEFFER et al., 1979; MACKIEWICZ et al., 2009). Esse ciclo contnuo progride durante o desenvolvimento da doena at causar danos irreversveis funo cardaca.

A primeira resposta reduo do dbito sistlico proveniente de uma caracterstica intrnseca do tecido cardaco conhecida como lei de Frank-Starling (BRAUNWALD et al., 2001). . Essa lei descreve a relao entre o desenvolvimento de presso sistlica e a pr-carga ou volume diastlico final, e estabelece que at certo ponto de estiramento, as clulas cardacas so capazes de gerar maior fora contrtil, aps esse ponto essa habilidade reduz com o aumento progressivo do volume ventricular (Figura 11).

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Pres

so

Volume

Figura 11. Curva presso x volume do ventrculo esquerdo, demonstrando o aumento do desempenho cardaco promovido pela elevao volume intraventricular at certo ponto e queda do desempenho posteriormente (Mecanismo de Frank-Starling). Adaptado de Katz, 2001.

Portanto, a reduo repentina da fora contrtil gerada pela necrose celular reduz imediatamente o volume sistlico final de uma contrao, aumentando com isso o volume diastlico final do ciclo cardaco seguinte. Esse aumento estira as clulas cardacas que permaneceram em perfeito estado e levam as mesmas a gerar mais fora durante a contrao. O aumento da fora em funo volume visto no mecanismo de Frank-Starling explicado pela elevao da sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ provocada pelo estiramento das clulas cardacas (BRAUNWALD et al., 2001). .

O mecanismo de Frank-Starling, porm, no suficiente para manuteno da perfuso sanguinea adequada dos rgos. Outros mecanismos so ativados para auxiliar nessa funo. O sistema nervoso simptico responde rapidamente queda de presso, promovendo o aumento da fora contrtil cardaca, permitindo que o ventrculo relaxe mais rapidamente e elevando o seu enchimento. Os nervos simpticos ps-ganglionares responsveis pela regulao do fluxo sanguineo da pele e das extremidades induzem vasoconstrico, direcionando o fluxo sanguineo para reas vitais (PINA et al., 2003). Sua ao ainda promove venoconstrico, gerando um maior retorno venoso e aumento da presso de enchimento (KATZ, 2001, p. 667; PINA et al., 2003). Todos esses fatores juntos induzem a melhora da capacidade de bombeamento sanguineo pelo corao e promove os ajustes dos distrbios

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hemodinmicos causados pelo IM. Esses efeitos so basicamente obtidos atravs da ativao dos mecanismos de transduo envolvendo segundos mensageiros, como o AMPc , Ca2+, as PK que promovem a fosforilao das protenas SERCA, RyR2, os canais de Ca2+ tipo-L, entre outras. Mecanismos humorais tambm so ativados na tentativa de compensar os distrbios hemodinmicos causados pelo IM. A liberao de renina pelo crtex adrenal e a ativao do sistema RAA permite a reteno hdrica e de Na+, elevando a volemia e presso arterial (CHIONG; CHEUNG, 2010). Alm disso, o efeito vasoconstrictor da angiotensina II auxilia o sistema nervoso simptico na elevao da presso de enchimento. A ativao do eixo RAA se d tanto pela reduo do fluxo renal decorrente da queda do dbito cardaco, quanto pela ativao simptica diretamente no crtex adrenal. J a liberao de epinefrina pela medula adrenal induz o inotropismo positivo (GUYTON; HALL, 2006, p.101). Todos esses efeitos agudos em conjunto reduzem os malefcios causados pela necrose das clulas e mantm a perfuso e o funcionamento de rgos vitais como o crebro, corao, pulmo.

Como o efeito da perda das clulas cardacas aps o IM irreversvel e hiperplasia celular j no ocorre nesse estgio (KATZ, 2001, p. 313), os mecanismos compensatrios relatados acima permanecem sendo ativados na tentativa de manter os efeitos benficos causados na fase aguda. Entretanto, a manuteno da ativao desses processos leva a adaptaes que induzem cada vez mais queda da capacidade contrtil e sobrecarga progressiva do sistema cardiovascular.

A ativao crnica dos receptores adrenrgicos atravs do sistema nervoso autnomo e da ao hormonal influencia no s a atividade das protenas celulares envolvidas no processo de contrao e relaxamento celular, mas tambm a sua expresso atravs da modulao das vias de sinalizao responsveis pela sua regulao. Alm da quantidade de protenas expressas, a qualidade tambm alterada, a modificao da isoforma das protenas permite a alterao do funcionamento das atividades enzimticas intracelulares (SWYNGHEDAUW, 1999). Essas mudanas podem entre outros fatores serem causadas pela ao da angiotensina II sintetizada localmente nos cardiomicitos, ou a partir da ativao do sistema RAA (ZHANG et al., 2010). Outro fator indutor da sntese protica importante a ativao do sistema

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imunolgico. A necrose e a liberao do contedo citoplasmtico no meio extracelular levam a ativao do sistema imune. O recrutamento de clulas imunolgicas constituintes desse sistema vai promover liberao de fatores inflamatrios como citocinas, que modificaro a expresso protica das clulas e principalmente levaro a formao de colgeno e desenvolvimento de tecido fibroso (cicatricial) no local do IM (BOLGER et al., 2002; ANKER; VON HAEHLING, 2004). As citocinas e fatores de crescimento comumente mais envolvidos na transcrio gnica so: fator de necrose tumoral alfa (TNF-), fator de transformao de crescimento (TGF-1), fator de crescimento do endotlio vascular (VEFG), interleucina 6 (IL-6), interleucina 10 (IL-10) (ONO et al., 1998). Outro mediador responsvel pelas mudanas no padro de expresso protica o Ca2+, que alm de estar em altas concentraes nas clulas adjacentes ao IM liberado em grande quantidade durante a lise celular. Alm de participar da regulao da expresso protica, a liberao de macia de Ca2+ pode gerar cardiotoxicidade, induzindo a ativao de apoptose celular e ainda causar arritmias cardacas fatais (MACGOWAN, 2009).

Essas mudanas no padro da expresso de protenas tanto intracelulares quanto extracelulares induzem o processo de remodelamento cardaco, onde ocorrem a hipertrofia dos cardiomicitos remanescentes, o desenvolvimento de fibrose intersticial e a reorganizao estrutural do tecido cardaco (SWYNGHEDAUW, 1999). O remodelamento cardaco ocorre tambm pela ativao de protenas estruturais presentes no interior da clula que fazem parte do seu esqueleto e que mantm conexes com outras protenas extracelulares, permitindo a ativao de vias que regulam a expresso protica de toda uma regio tecidual. Dentre algumas dessas protenas esto as caderinas, integrinas, titinas, e as molculas de adeso que agem em conjunto com as primeiras, induzindo a transduo dos sinais (KATZ, 2001, p. 337). O remodelamento cardaco no IM promove a hipertrofia muscular em srie (os sarcmeros sendo depositados longitudinalmente), gerando um alongamento das fibras cardacas (FUKUTA; LITTLE, 2008). Esse alongamento produz um aumento exacerbado do dimetro do ventrculo esquerdo e afinamento de sua parede, o que produz um maior estresse sobre a sua superfcie (estresse da parede), segundo a lei de LaPlace. A lei de LaPlace que indica que o estresse da parede diretamente proporcional ao raio do

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ventrculo e inversamente proporcional a espessura do mesmo (KATZ, 2001, p. 401). Portanto, o aumento do estresse eleva a presso ventricular diastlica final, dificultando o enchimento do ventrculo e aumentando ainda mais os sinais induzidos pela deformao das clulas cardacas. Alm disso, aumenta o consumo energtico e o requerimento de O2, podendo gerar novos eventos isqumicos. Esse tipo de hipertrofia denominada dilatada, difere da hipertrofia fisiolgica gerada pelo exerccio, pelo desenvolvimento do estreitamento da parede e a presena de tecido fibroso que contribui para a reduo da elasticidade do corao, o relaxamento e o enchimento ventricular (KATZ, 2001, p.677). A hipertrofia fisiolgica no induz apoptose celular e muito menos sobrecarrega o sistema cardiovascular.

O remodelamento pode tambm causar danos no processo de acoplamento excitao-contrao. A formao do tecido fibroso, bem como, a modificao das protenas do citoesqueleto e a ruptura tecidual decorrente do remodelamento promovem o desacoplamento do processo excitao-contrao atravs da modificao da estrutura dos microdomnios na regio onde se encontram as dades. Isso altera o posicionamento e alinhamento de estruturas proticas envolvidas no processo contrtil que, por sua vez, so essenciais para eficincia desse processo (SCHAPER et al., 1991; SONG et al., 2006). Alm do dano na arquitetura tecidual, ocorrem mudanas na expresso e no funcionamento dessas protenas. Uma das primeiras modificaes em curso temporal que podem ser observadas a reduo da expresso de SERCA (MACKIEWICZ et al., 2009). Yamaguchi e outros (1997) utilizaram fibras desnudas de ratos submetidos a oito semanas de IM e observaram reduo da tenso isomtrica gerada por uma concentrao fixa de Ca2+ em diferentes tempos de carregamento, sugerindo que este processo encontra-se ineficiente aps o IM. Mackiewicz e outros (2009), demonstraram que a partir de quatro semanas de IM os animais j apresentavam reduo da expresso de SERCA e da captao de Ca2+. Outros estudos realizados em fraes microssomais de RS demonstraram a mesma reposta (AFZAL; DHALLA, 1992; HOLT et al., 1998; NEARY et al., 2002; SHAO et al., 2005; MACKIEWICZ et al., 2009). A reduo da capacidade de captao de Ca2+ pelo RS retarda o tempo de relaxamento (lusitropismo negativo) e contribui ainda mais para reduo do enchimento ventricular e aumento da presso diastlica final. Esse um

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distrbio hemodinmico progressivo que agrava os sintomas da IC (FERREIRA-MARTINS; LEITE-MOREIRA, 2010). A expresso da bomba de Ca2+ de membrana PMCA tambm reduzida aps o IM no modelo de ocluso da ACDA (MACKIEWICZ et al., 2009). A diminuio da captao de Ca2+ pelo RS e da extruso desse on pela PMCA, eleva a sua concentrao intracelular e intensifica o funcionamento do NCX (LEHNART; MAIER, 2009). O aumento da concentrao de Ca2+ intracelular ainda promove a ativao da enzima Ca2+- calmodulina cinase do tipo II (CAMkinase II). A CAMkinase II e a ativao -adrenrgica promovem a hiperfosforilao de protenas envolvidas no processo de contrao (CURRAN et al., 2007). Segundo Wu e outros (2004), os canais de CA2+tipo-L se encontram fosforilados nos tecidos cardacos de pacientes transplantados e essa hiperfosforilao aumenta a probabilidade de abertura do canal, tornando mais eficiente o mecanismo de Ca2+ induz a liberao de Ca2+. Outra protena de extrema importncia para o processo contrtil e que se encontra hiperfosforilada em vrios modelos de IC a RyR2 (BLAYNEY; LAI, 2009). A hiperfosforilao de RyR2 resulta em uma mudana do estado de ativao do receptor que permite o vazamento de Ca2+ durante a distole. Alm de contribuir para o a reduo do lusitropismo cardaco, o aumento de sua concentrao intracelular pode induzir taquiarritmias severas, causando muitas vezes morte sbita (BLAYNEY; LAI, 2009). Essas modificaes aliadas ao aumento da funo, bem como, da expresso do NCX reduz os estoques globais de Ca2+, contribuindo ainda mais para a reduo da fora contrtil. Segundo Pieske e outros (1995), a queda da funo contrtil est relacionada com a variao global da concentrao de Ca2+ (transiente de Ca2+), portanto, quanto menor for o transiente de Ca2+ da clula menor ser a reserva desse on para ativao da contrao muscular. O resultado final dessas alteraes so a perda da eficincia contrtil da clula e ainda sobrecarga do msculo cardaco, as quais resultam em um acometimento progressivo da doena. Alteraes nas protenas contrteis tambm so observadas em vrios modelos de IC (BODOR et al., 1997; LI et al., 1997; LAM et al., 2010). Walker e outros (2009) demonstraram que MLC2, MyBP-C e troponina I esto hipofosforiladas logo aps da induo do IM (dois dias) e que essa reduo parece ocorrer na tentativa de aumentar a sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+ e, portanto, de restabelecer a frao de ejeo.

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Eles ainda observaram que aps dois meses de IM a troponina I encontra-se hiperfosforilada, sugerindo que a hipofosforilao observada na fase aguda pode decorrer de uma tentativa rpida para o ajuste da frao de ejeo. De fato, Jideama e outros (2006), demonstraram que a hipofosforilao de troponina I aumenta a sensibilidade das protenas contrteis ao Ca2+, podendo ento aumentar a gerao de fora da clula.

Outros fatores decorrentes do IM so de grande importncia para o desenvolvimento da sndrome da IC. O desacoplamento energtico e distrbios na funo metablica das clulas cardacas observados aps o evento isqumico induz a sntese de espcies reativas de O2. Essas, por sua vez, promovem a nitrosilao de diversas protenas, causando distrbios em sua funo e levando a apoptose celular (FRANGOGIANNIS et al., 2002). Alm da expresso protica do tecido cardaco e da matriz celular, as citocinas liberadas sistemicamente por clulas imunolgicas, as sintetizadas pelas clulas recrutadas, e aquelas produzidas pelo prprio tecido cardaco (FRANGOGIANNIS et al., 2002) induzem, a ruptura das clulas cardacas atravs da estimulao de metaloproteinases que so responsveis pela degradao da matriz celular, desorganizando ainda mais a arquitetura celular cardaca (GALLAGHER et al., 2006).

O remodelamento ainda envolve a reativao do programa de genes fetais que entre outros fatores causam a expresso da isoforma da cadeia pesada da miosina que apresenta a atividade ATPsica mais lenta. No tecido cardaco humano essa a isoforma predominante, portanto a modificao do padro da expresso protica no altera a funo contrtil das clulas. No entanto, no corao de roedores a isoforma predominante a , que possui atividade ATPsica rpida. Apesar da alterao das cadeias pesadas sugerir a ocorrncia de uma reduo da contratilidade do msculo cardaco de ratos, no se sabe ao certo o quanto a reprogramao dos genes fetais pode interferir na velocidade mxima da ATPase da miosina e, portanto, na atividade contrtil do corao desses animais.

Por ltimo, outra alterao importante na expresso protica ocorrida aps o IM o aumento da sntese de peptdeos natriurticos atriais (PNA). Acredita-se que a liberao de PNA pelas clulas atriais pode ser atribuda a tentativa de proteger as clulas cardacas aps o IM, j que esses peptdeos

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promovem o relaxamento da clula cardaca e das artrias, evitando o aumento da extenso da rea de IM (KISHIMOTO et al., 2009). A concentrao srica dos PNA correlacionada com a extenso da leso causada por isquemia, e por isso, atualmente os nveis sricos desses peptdeos vm sendo usados como marcadores do IM (ASAKURA et al., 2004). No entanto, o exato propsito do aumento da sntese de PNA ps IM ainda precisa ser completamente elucidado.

1.2 TRATAMENTO FARMACOLGICO DA INSUFICINCIA CARDACA

Por se tratar de uma doena multifatorial que acomete diferentes rgos do corpo progressivamente, a abordagem teraputica da IC bem ampla, sendo tratamento feito simultaneamente com diferentes frmacos. As associaes utilizadas, bem como, a escolha do tipo de frmaco variam com o diagnstico, com o estgio no qual a doena se apresenta e o seu prognstico. As principais substncias usadas no tratamento da IC so: diurticos de ala e tiazdicos, nitrovasodilatadores, hidralazina, antagonistas dos receptores de aldosterona, betabloqueadores, inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA), antagonistas dos receptores de angiotensina, agonistas adrenrgicos, glicosdeos cardacos, inibidores de fosfodiesterases entre outros (GILMAN et al., 2005).

Dependendo do estgio no qual o paciente se encontra os objetivos principais do tratamento so diferentes. Assim, com os pacientes da classe I, os principais objetivos so prevenir ou reverter a progresso do remodelamento e dos sintomas. Com os pacientes da classe II alm desse objetivo, visa-se melhorar a capacidade funcional, contra as hospitalizaes, incapacidades e a mortalidade. Na classe III e na classe IV os objetivos so os mesmos com a principal preocupao da reduo da mortalidade dos pacientes (BRAUNWALD et al., 2001).

Na classe I, a tentativa de reduzir o remodelamento se alcana atravs da reduo dos fatores precursores da IC, como por exemplo, o tratamento da angina pectoris, hipertenso arterial, diabetes mellitus, etc. Tais efeitos so obtidos com o uso dos inibidores de ECA e betabloqueadores principalmente

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(BRAUNWALD et al., 2001). . No entanto, alguns trabalhos vm investigando a utilizao dos bloqueadores do receptor de aldosterona, no qual seu representante principal a espirolactona, e tem encontrado bons resultados no que diz respeito reduo da fibrose e hipertrofia (BING, 2001). Os diurticos tambm so eficazes na reduo da hipertenso arterial, podendo reduzir o fator precipitante da IC.

No estgio II, os inibidores da ECA e os betabloqueadores so os frmacos mais utilizados na tentativa de reduzir a mortalidade. Alguns antagonistas do receptor de angiotensina como valsartano promoveram o aumento da mortalidade quando aliado administrao dos inibidores da ECA e os betabloqueadores. Esse efeito no foi observado com o uso do candesartano (BRAUNWALD et al., 2001). Esses resultados salientam a peculiaridade de cada frmaco integrante das classes e demonstraram que esses podem apresentar respostas teraputicas diferentes, reafirmando a complexidade da sndrome da IC e do seu tratamento. Esses dados tambm chamam a ateno no cuidado que se deve ter ao associar frmacos no esquema teraputico. Alguns frmacos inotrpicos positivos como a digoxina so eficazes em aumentar a capacidade funcional do paciente e podem ser utilizadas durante esse estgio. Porm, ao mesmo tempo, aumentam o risco de ocorrncia de arritmias taquiventriculares, requerendo maiores cuidados na sua administrao (GILMAN et al., 2005). Os diurticos e a restrio da ingesto de sdio tambm so bastante eficazes nesses casos. No caso, os antagonistas do receptor de aldosterona agem, evitando a hipopotassemia que poderia agravar o quadro da IC, e ainda reduzem a formao de fibrose cardaca.

Nos pacientes da classe III o ndice de internaes, bem como, a mortalidade se acentuam drasticamente, e o tratamento visa principalmente reduzir esses ndices. Nesse caso, os diferentes inibidores do sistema RAA se mostraram bem mais eficazes que os bloqueadores -adrenrgicos. A associao de um diurtico tiazdico com um poupador de potssio tambm muitas vezes utilizada para controle da reteno hdrica (KALRA et al., 2010). A utilizao da hidralazina (vasodilatador arterial), associada ao dinitrato de isossorbida (nitrovasodilatador no-seletivo) parece ser benfica, permitindo a reduo da mortalidade.

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Por ltimo, os pacientes do estgio IV possuem a funo contrtil bastante comprometida, assim a reduo do avano do remodelamento j mais difcil. Portanto, a utilizao dos bloqueadores -adrenrgicos j no quase mais necessria, porm, os inibidores do sistema RAA ainda apresentam alguma eficcia embora ainda que reduzida. Os tratamentos farmacolgicos nesse caso so apenas paliativos e visam resguardar a funo contrtil cardaca do paciente at que haja a possibilidade da realizao do transplante cardaco. Nesse sentido, os cardiotnicos administrados que vm demonstrando bons resultados so a dobutamina (agonista -adrenrgico), dopamina (agonista dopaminrgico), milrinona, enoximona (inibidores de PDE3), e o levosimendan que considerado tanto um sensibilizador de Ca2+ quanto um fraco inibidor de PDE3 (BRAUNWALD et al., 2001; GILMAN et al., 2005).

Alguns frmacos auxiliares tambm podem ser utilizados na tentativa de reduzir sintomas importantes decorrentes da IC. As arritmias podem ser tratadas com alguns bloqueadores de canais de Ca2+, a amiodarona (bloqueador dos canais de K+ voltagem-dependentes) e o sotalol (antagonista -adrenrgico), (MANSON, 1993; DOVAL et al., 1994). Outro sintoma importante a ser tratado a tromboembolia, sendo nesse caso a varfarina, um anticoagulante oral, o frmaco de escolha porque reduz significativamente o risco de tromboembolias. Portanto, a varfarina um coadjuvante importante, principalmente na IC decorrente de cardiomiopatias no isqumicas.

Alguns alvos farmacolgicos importantes para o desenvolvimento da IC vm sendo investigados em animais experimentais. Os antagonistas dos canais de Ca2+, so um exemplo. Sandmann e outros (2001), observaram que verapamil, amlodipina e mibefradil reduziram o desenvolvimento do remodelamento cardaco no mesmo modelo de IM com ocluso ACDA. Outro exemplo pode ser observado com agonistas dos receptores A(2), usando o mesmo modelo de IM. Segundo Nekooeian e Trabrizchi (1998), a administrao aguda de CGS 21680 (agonista A(2A)) reduziu a progresso dos efeitos deletrios hemodinmicos em ratos desenvolvidos oito semanas aps o IM. Esses estudos confirmam a preocupao de pesquisadores com a busca de novos alvos teraputicos que possam servir como alternativa para o tratamento da IC.

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1.3 ATIVIDADES FARMACOLGICAS E MECANISMO DE AO DE 3,4 METILENODIOXIBENZOIL-2-TIENILHIDRAZONA (LASSBio-294)

A molcula 3,4 metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona designada como LASSBio-294 (Figura 12) foi desenvolvida pelo Laboratrio de Sntese de Substncias Bioativas (LASSBio) da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, a partir de um esforo inicial para se obter novas substncias cardioativas que pudessem ser utilizadas no tratamento da insuficincia cardaca.

O

O

O

NN S

H

Benzodioxol

(Safrol)

N-acilidrazona

Tiofenol

Figura 12. Representao estrutural do LASSBio-294. Retirado de Barreiro, 2002.

Atravs de estratgias de simplificao molecular, obtiveram-se compostos com a subunidade N-acilidraznica em suas estruturas, dentre elas o LASSBio-294. A utilizao dessa subunidade (N-acilidrazona) na estrutura das molculas se deveu ao fato desta ser muito similar a estrutura dos frmacos inibidores de PDE3 (BARREIRO, 2002). LASSBio-294 tem como base a estrutura benzodioxola proveniente do safrol, componente qumico do leo de Sassafrs, e a presena do substituinte 2-tiofnico na insaturao imnica da funo N-acilidrazona, caractersticas que conferiram a substncia algumas propriedades bioativas especficas e importantes. Silva e outros (2002), descreveram ao vasodilatadora dependente do endotlio em anis de aorta. J Sudo e outros (2001), demonstraram que essa substncia

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apresenta atividade inotrpica positiva decorrente de um mecanismo diferente do apresentado pelos digitlicos. Utilizando o modelo de fibras quimicamente desnudas, eles observaram que LASSBio-294 aumentava a fora isomtrica das fibras cardacas atravs da elevao da captao de Ca2+ pelo RS, o que em tese seria uma grande vantagem para o tratamento da IC, pois promoveria o aumento do inotropismo positivo e melhoraria da funo diastlica cardaca. Tal mecanismo, at aquele momento, no havia sido descrito ainda para nenhuma substncia que apresentasse atividade inotrpica positiva. Essa caracterstica peculiar gerou o depsito de uma patente na USA Patent (SUDO et al. No 7,091,238) na data 15 de agosto de 2006. A investigao toxicolgica de LASSBio-294 ratificou a segurana da substncia, no demonstrando alteraes significativas promovidas pela mesma em doses bem a cima da dose teraputica (SUDO et al., USA Patent, No 7,091,238, 2006). Tal fato conferiu mais uma vantagem ao LASSBio-294 perante os outros inotrpicos pos