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皮膚細胞が乳酸菌を取り込むと

多能性細胞になる

熊本大学大学院生命科学研究部

准教授太田訓正

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幹細胞とは

人間では一つの受精卵から、２００種類以上、約六〇兆個の細胞が作られ

る。多種多様な細胞にも、もとをたどると親の細胞に行き当たり、それを幹細胞

（stem cell）と呼び、体性幹細胞、ES細胞、iPS細胞がある。

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従来の幹細胞の特徴とその問題点

細胞体性幹細胞 ES細胞 iPS細胞

作製法体中に存在胚を壊して作製遺伝子を導入して作製

移植時の拒絶自己細胞を利用すれ

ば拒絶が起きない

移植の際に免疫拒絶

の可能性がある

自己細胞を利用するの

で拒絶が起きない？

腫瘍化の恐れ可能性は低い可能性がある可能性がある

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新技術の特徴・従来技術との比較

• 従来からの問題点であった、腫瘍形成の危険がない多能

性細胞を作製することに成功した。

• 従来は生きた乳酸菌を用いたことで限られていたが、乳酸

菌由来リプログラム因子を用いれば、大量に多能性細胞を

作製することが可能となる。

• 本技術の適用により、乳酸菌は無限に増殖させることがで

きるため、コストを大幅に削減できることが期待される。

5 （Science ZERO）

真核細胞誕生のモデル古細菌真正細菌（乳酸菌など）

真正細菌の古細菌への感染

共生関係 Endosymbiotic theory (Margulis L., 1970)

遺伝子

真正細菌の遺伝子移動

核

ミトコンドリア

核の出現 DNA の増幅

真核細胞の誕生２０億年前

eubacteria （真正細菌）

archaebacteria （古細菌）

eucaryotes （真核細胞）３５億年前

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私達のからだの細胞数: 60 兆個 (6 x 1013)

腸における腸内細菌数: 1,000 兆個 (1 x 1015)、1,000種類以上の腸内細菌が棲息.

１８５７年、パスツール博士が世界で最初に乳酸菌を発見

現在までに、約280 種類の乳酸菌が同定されている

乳酸菌 [Lactic Acid Bacteria (LAB)]のバックグラウンド

Lactobacillus Lactococcus Streptococcus Enterococcus

Bifidobacterium

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乳酸菌が細胞に直接作用し、どのような影響を持つかはほとんど

研究されていない乳酸菌と細胞の研究は価値有り！

ロシアの生物学者イリヤ・メチニコフ（1845-1916年）「ヨーグルト不老長寿説」老化とは、腸内細菌の生成する腐敗物質による自家中毒

ヨーグルトに含まれる乳酸菌で腸内環境を改善すれば良い

インフルエンザ、ピロリ菌の撃退、癌、アレルギー、睡眠、ダイエット、etc…

(PNAS 2011)

腸内細菌は現代医療のトップランナー

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バクテリアが宿主細胞の遺伝子発現を制御する

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3 cmシャーレ (5 x 105 / 2ml)

0.1% Trypsin 1mM EDTA

乳酸菌ヒト皮膚細胞 (Cell Applications社)

皮膚細胞用培養液 (Cell Applications社)

乳酸菌による細胞塊形成

(直径: 100 ~ 500 µm ~30 spheres / 5 x 105)

アルカリフォスファターゼ染色

300 µm

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取り込まれた乳酸菌はヒト皮膚細胞の細胞質に局在する

核小胞体

細胞間隙 vacuole 細胞膜 caveolar 乳酸菌

ミトコンドリア

16S ribosomal RNA

LAB-incorporated (LAB-in) cells 抗ー細胞壁抗体 DAPI

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解離

LAB-in cellsは自己増殖を持たない

Dissociation Medium for ES cells Trypsin, 10 mg/ml Collagenase IV, KSR, 1M CaCl2 37℃, 5~20 min

ES細胞やiPS細胞は無限の増殖能を持つ腫瘍化？

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LAB-in cellsの多能性マーカー発現

RT-PCR

Quantative-PCR

ICC

LAB-in iPS LAB-in iPS LAB-in iPS

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シャーレ内における細胞分化誘導– (1)

α-fetoprotein Tuj1

vimentin desmin

100µm

α-fetoprotein: (内胚葉)

Tuj1: (外胚葉)

vimentin: (外胚葉)

desmin: (中胚葉)

浮遊状態

DMEM/F12 containing 1% FCS 5 ng/ml basic FGF

2 週間 2 週間

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α-SMA: (中胚葉)

Desmin: (中胚葉)

Tuj1: (外胚葉)

GFAP: (外胚葉)

接着状態 (laminin+PLL)

DMEM/F12 containing 1% FCS 5 ng/ml basic FGF

シャーレ内における細胞分化誘導– (２)

2 週間 2 週間

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軟骨細胞骨細胞脂肪細胞

LAB-in cells clusters were cultured for 3 weeks in STEMPRO Adipogenesis,

Chondrogenesis, or Osteogenesis Differentiation Medium (GIBCO).

脂肪細胞: Oil Red O 染色

骨細胞: Alizarin Red 染色

軟骨細胞: Alcian Blue 染色

2 週間 3 週間 cho ost adi

シャーレ内における細胞分化誘導– (3)

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control

LAB-in cells

(5 x 105 / 20 µl)

免疫不全マウス精巣解析３ヶ月後

control LAB-in cells

LAB-in cellsを移植しても腫瘍は形成されない

ES細胞やiPS細胞は腫瘍を形成

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α-fetoprotein: (内胚葉)

NF: (外胚葉)

α-SMA: (中胚葉)

LAB-in cellsの生体内における細胞分化誘導

LAB-in cellsはin vivo & in vitroにおいて、三胚葉由来の細胞に分化できる。

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25,909 遺伝子 Whole Human Genome Microarray 4 x 44K (Agilent)

(A) (B)

多能性に関わる３７遺伝子

NANOG x7.6

OCT3/4 x2.9

SOX2 x2.9

KLF4 x1.0

c-Myc x1.7

遺伝子発現プロファイルの比較

ヒト皮膚細胞 &

ヒト皮膚細胞＋乳酸菌

125 遺伝子 > 30 倍 156 遺伝子 < 30 倍

ヒト皮膚細胞 &

ヒト皮膚細胞＋乳酸菌

4,099 遺伝子 > 2 倍 3,481 遺伝子 < 2 倍

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LAB-in cellsではHOX遺伝子の発現が劇的に減少する • 156 遺伝子 < 30 倍 • 発生に関わる遺伝子：43 遺伝子 • 21/43 遺伝子が HOX 遺伝子

HOX 遺伝子群 cho.6

cho.11

cho.15

cho.2

乳酸菌を取り込んだ細胞は、位置情報を失い、多能性を獲得する

no ProbeName UniGeneID GeneSymbol GeneName Description Fold change

[Bala-HGF]vs[C-HGF] Regulation

[Bala-HGF]vs[C-HGF]

1 A_24_P124558 HOXC8 Hs.664500 homeobox C8 Homo sapiens homeobox C8 (HOXC8), mRNA [NM_022658]

594.18225 down

2 A_23_P500998 HOXA9 Hs.659350 homeobox A9 Homo sapiens homeobox A9 (HOXA9), mRNA [NM_152739]

592.35516 down


547.446 down

4 A_23_P363316 HOXB5 Hs.654456 homeobox B5 Homo sapiens homeobox B5 (HOXB5), mRNA [NM_002147]

489.89343 down


385.91574 down

6 A_33_P3300965 HOXC6 Hs.549040 homeobox C6 Homo sapiens homeobox C6 (HOXC6), transcript variant 2, mRNA [NM_153693]

247.46118 down

7 A_24_P77904 HOXA10 Hs.110637 homeobox A10 Homo sapiens homeobox A10 (HOXA10), transcript variant 1, mRNA [NM_018951]

212.5776 down

8 A_23_P7313 SPP1 Hs.313 secreted phosphoprotein 1 Homo sapiens secreted phosphoprotein 1 (SPP1), transcript variant 1, mRNA [NM_001040058]

170.12749 down

9 A_23_P374695 TEK Hs.89640 TEK tyrosine kinase, endothelial Homo sapiens TEK tyrosine kinase, endothelial (TEK), mRNA [NM_000459]

168.16338 down


135.72766 down

11 A_33_P3300975 HOXC4 Hs.549040 homeobox C4 Homo sapiens homeobox C4 (HOXC4), transcript variant 1, mRNA [NM_014620]

131.16129 down

12 A_24_P264943 COMP Hs.1584 cartilage oligomeric matrix protein Homo sapiens cartilage oligomeric matrix protein (COMP), mRNA [NM_000095]

126.96592 down


122.49983 down


116.495 down


98.938225 down

16 A_33_P3421243 AFP Hs.518808 alpha-fetoprotein Homo sapiens alpha-fetoprotein (AFP), mRNA [NM_001134]

91.343994 down


76.56639 down

18 A_23_P65757 CCNB2 Hs.194698 cyclin B2 Homo sapiens cyclin B2 (CCNB2), mRNA [NM_004701]

71.749176 down

19 A_33_P3288159 ASPM Hs.121028 asp (abnormal spindle) homolog, microcephaly associated (Drosophila)

Homo sapiens asp (abnormal spindle) homolog, microcephaly associated (Drosophila) (ASPM), mRNA [NM_018136]

71.65447 down

20 A_23_P215634 IGFBP3 Hs.450230 insulin-like growth factor binding protein 3 Homo sapiens insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP3), transcript variant 1, mRNA [NM_001013398]

67.36516 down


65.995636 down

22 A_23_P52017 ASPM Hs.121028 asp (abnormal spindle) homolog, microcephaly associated (Drosophila)

Homo sapiens asp (abnormal spindle) homolog, microcephaly associated (Drosophila) (ASPM), mRNA [NM_018136]

65.810745 down


60.374454 down


57.784496 down

25 A_23_P212844 TACC3 Hs.104019 transforming, acidic coiled-coil containing protein 3

Homo sapiens transforming, acidic coiled-coil containing protein 3 (TACC3), mRNA [NM_006342]

53.95437 down

26 A_23_P210176 ITGA6 Hs.133397 integrin, alpha 6 Homo sapiens integrin, alpha 6 (ITGA6), transcript variant 2, mRNA [NM_000210]

53.341675 down

27 A_23_P423237 SGCG Hs.37167 sarcoglycan, gamma (35kDa dystrophin-associated glycoprotein)

Homo sapiens sarcoglycan, gamma (35kDa dystrophin-associated glycoprotein) (SGCG), mRNA [NM_000231]

50.23103 down

28 A_23_P24129 DKK1 Hs.40499 dickkopf homolog 1 (Xenopus laevis) Homo sapiens dickkopf homolog 1 (Xenopus laevis) (DKK1), mRNA [NM_012242]

49.39177 down

29 A_23_P163567 SMPD3 Hs.368421 sphingomyelin phosphodiesterase 3, neutral membrane (neutral sphingomyelinase II)

Homo sapiens sphingomyelin phosphodiesterase 3, neutral membrane (neutral sphingomyelinase II) (SMPD3), mRNA [NM_018667]

49.283035 down


48.990253 down

31 A_33_P3330149 PAX6 Hs.270303 paired box 6 Homo sapiens paired box 6 (PAX6), transcript variant 1, mRNA [NM_000280]

46.525337 down

32 A_24_P30557 TBX5 Hs.381715 T-box 5 Homo sapiens T-box 5 (TBX5), transcript variant 1, mRNA [NM_000192]

45.041744 down

33 A_23_P146274 STMN2 Hs.521651 stathmin-like 2 Homo sapiens stathmin-like 2 (STMN2), mRNA [NM_007029]

43.262432 down

34 A_23_P122197 CCNB1 Hs.23960 cyclin B1 Homo sapiens cyclin B1 (CCNB1), mRNA [NM_031966]

42.742027 down

35 A_23_P100127 CASC5 Hs.181855 cancer susceptibility candidate 5 Homo sapiens cancer susceptibility candidate 5 (CASC5), transcript variant 1, mRNA [NM_170589]

42.700485 down

36 A_23_P373521 HAND2 Hs.388245 heart and neural crest derivatives expressed 2

Homo sapiens heart and neural crest derivatives expressed 2 (HAND2), mRNA [NM_021973]

41.600903 down

37 A_23_P167159 SCRG1 Hs.7122 stimulator of chondrogenesis 1 Homo sapiens stimulator of chondrogenesis 1 (SCRG1), mRNA [NM_007281]

39.337242 down

38 A_23_P215454 ELN Hs.647061 elastin Homo sapiens elastin (ELN), transcript variant 1, mRNA [NM_000501]

37.867306 down

39 A_23_P157136 SCIN Hs.655515 scinderin Homo sapiens scinderin (SCIN), transcript variant 2, mRNA [NM_033128]

35.781925 down

40 A_23_P58321 CCNA2 Hs.58974 cyclin A2 Homo sapiens cyclin A2 (CCNA2), mRNA [NM_001237]

33.80436 down

41 A_23_P501538 HOXA3 Hs.659337 homeobox A3 Homo sapiens homeobox A3 (HOXA3), transcript variant 2, mRNA [NM_153631]

33.353687 down


31.19959 down

43 A_23_P96158 KRT17 Hs.2785 keratin 17 Homo sapiens keratin 17 (KRT17), mRNA [NM_000422]

30.959732 down

HOXC8 : 594 倍

HOXB2 : 31 倍

1

43

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ほんまか？ほんまや！

(Cell, 152, 51-67, 2013)

Trypsin EDTA

乳酸菌ヒト皮膚細胞

外胚葉

中胚葉

内胚葉

(Ohta et al., PLoS ONE 2012)

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500 µm

乳酸菌由来リプログラム因子による細胞塊形成

(5 x 105 / 2ml)

0.1% Trypsin 1mM EDTA

ヒト皮膚細胞

皮膚細胞用培養液

乳酸菌由来リプログラム因子 ?

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脂肪細胞骨細胞軟骨細胞

(A)

(B) (C) (D)

乳酸菌由来因子によるヒト皮膚細胞のリプログラミング

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A549細胞 A549細胞＋

乳酸菌成分２週間

肺がん細胞 A549

Trypsin EDTA

乳酸菌由来リプログラム因子

乳酸菌由来因子による肺がん細胞のリプログラミング−１

Oct

3/4

Oct

3/4

Sox

2

Sox

2

β-ac

tin

β-ac

tin

Nan

og

Nan

og

A549細胞 A549細胞 + 乳酸菌成分 G

DF-

3 R

ex1

EC

AT

FGF4

p1

5 p1

6 A

RF

GD

F-3

Rex

1 E

CAT

FG

F4

p15

p16

AR

F

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A549細胞 A549細胞＋

乳酸菌成分２週間 Trypsin

EDTA



乳酸菌由来因子による肺がん細胞のリプログラミング−２

骨細胞脂肪細胞

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DAPI merge α-fetoprotein

DAPI merge Neurofilament

乳酸菌由来因子による肺がん細胞のリプログラミング−３

Trypsin EDTA



接着状態 (laminin+PLL)

DMEM/F12 containing 1% FCS bFGF (5 ng/ml )

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２週間 Trypsin EDTA

肝がん細胞 HepG2


乳酸菌由来因子による肝がん細胞のリプログラミング

HepG2細胞 HepG2細胞＋乳酸菌成分

脂肪細胞骨細胞

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２週間 Trypsin EDTA

乳がん細胞 MCF7


乳酸菌由来因子による乳がん細胞のリプログラミング

MCF7細胞 MCF7細胞＋乳酸菌成分

脂肪細胞骨細胞

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想定される用途

• 本技術の特徴を、癌化しない多能性細胞の作製に適用できる。

• 乳酸菌由来リプログラム因子を癌細胞に作用することにより、細胞増殖が抑えられることから、安全・安心な抗がん剤の開発に展開することも可能と思われる。

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実用化に向けた課題 • 乳酸菌由来リプログラム因子の同定について、HPLCによるピークが同定できたが、個々の分子同定が未解決。

細胞塊形成活性

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企業への期待 • 未解決の乳酸菌由来リプログラム因子の同定については、マススペクトロ解析の技術により克服できると考えている。

• 抗がん剤として、動物試験による評価（毒性試験・有効性）の技術を持つ、企業との共同研究を希望。

• また、癌制御因子の探索を考えている企業には、本乳酸菌由来リプログラム因子の導入が有効と思われる。

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本技術に関する知的財産権

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産学連携の経歴

2013年７月現在、民間３社と共同研究に向けて、

研究内容等を検討中。

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お問い合わせ先熊本大学

コーディネーター松本泰彦

ＴＥＬ 096－342 － 3209

ＦＡＸ 096－342 － 3239

e-mail [email protected]

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