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牙龈卟啉单胞菌—脂多糖对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

郭世杰 *，王林，吴存瑾

摘要

目的：观察牙龈卟啉单胞菌 - 脂多糖（P.g-LPS）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖和凋亡的影响。

方法：在体外将 P.g-LPS 与 HUVEC 共培养，根据 P.g-LPS 浓度分为空白对照组、50 pg/ml 组、100 pg/ml 组、

1ng/ml 组及 10 ng/ml 组。培养 36 h 后采用甲基噻唑基四唑（MTT）法及流式细胞仪分别测定细胞增殖活力及凋亡情况，

并通过免疫印迹标记法（Western blot）检测 caspase-3 激活情况。

结果：经 P.g-LPS 处理后，HUVEC 增殖活力较空白对照组明显下降（P<0.01），且随着 P.g-LPS 浓度增加，

HUVEC 增殖活力也逐渐下降（P<0.01），而细胞发生凋亡及 caspase-3 激活情况却随之增加。

结论：P.g-LPS 可抑制内皮细胞增殖活力，caspase-3 激活从而诱导内皮细胞产生凋亡。

关键词 牙龈卟啉单胞菌；脂多糖；人脐静脉内皮细胞；增殖；凋亡；caspase-3

·临床研究·

作者单位：300211 天津市，天津医科大学第二医院 干部保健科作者简介：郭世杰 博士研究生 主要从事心血管病临床与基础研究 * 现在天津医科大学心血管临床学院 泰达国际心血管病医院 心内二科 **Now working at TEDA International Cardiovascular Hospital, Tianjin Email:gsj03102089@163.com 通讯作者 : 王林 Email : wanglin@- medmail.com.cn中图分类号：R541 文献标识码：A 文章编号：1000-3614（2013）08-0614-04 doi: 10.3969/j.issn.1000-3614.2013.08.015

Effect of Porphyromonasgingivalis Lipopolysaccharide on Proliferation and Apoptosis

in Human Umbilical Vein Endothelial Cells in vitroGUO Shi-jie**, WANG Lin, WU Cun-jin.

Healthcare Department, The Second Hospital of Tianjin Medical University,

Tianjin (300211), China

Corresponding Author: WANG Lin, Email: wanglin@- medmail.com.cn

AbstractObjective: To study the effect of porphyromonasgingivalis lipopolysaccharide (P.g-LPS) on proliferation and apoptosis in

human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) in vitro.

Methods: The HUVEC were cultured with different concentrations of P.g-LPS as P.g-LPS 0 pg/ml (Control group) and

P.g-LPS 50pg/ml, 100pg/ml, 1ng/ml and 10ng/ml groups respectively. After 36 hours incubation, the cell proliferation viability

and apoptosis were detected by MTT method and flow cytometry assay, the caspase-3 activation was examined by Western blot

analysis.

Results: Compared with Control group, the P.g-LPS treated HUVEC showed obviously decreased proliferation viability,

P<0.01. While with the increased P.g-LPS concentrations, the cell proliferation viability decreased accordingly, P<0.01, and

the cell apoptosis and caspase-3 activation were increased accordingly.

Conclusion: P.g-LPS may inhibit endothelial cell proliferation viability, promote caspase-3 activation and therefore,

inducing cell apoptosis in vitro.

Key words Porphyromonasgingivalis; Lipopolysaccharide; Human umbilical vein endothelial cell; Proliferation; Apoptosis;

Caspase-3

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:614.)

近年来冠心病已经成为严重影响我国人民健

康的主要公共卫生问题 [1]，其发病危险因素错综复

杂 [2]，并且其具体发病机制还不十分清楚。有学

者提出慢性牙周炎不仅可造成局部牙周组织功能

的缺陷 , 而且与冠心病的发生与发展之间还存在潜

在的关联 [3]。内皮细胞凋亡已经被证明存在于动

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CO2 培养箱中培养 2 h。轻轻吸去上清液，每孔加入

二甲基亚砜 150 μl，震荡至不溶物完全溶解。溶液

变成蓝紫色后，用酶标仪测定在波长为 490 nm 处各

孔的光密度（OD）值，每组实验重复 5 次。

Annexin V-FITC/PI 双标记流式细胞仪检测细

胞凋亡：取对数期生长的第 4 代 HUVEC，在 37℃、

5% CO2 培养箱中孵育至细胞单层铺满 80% 孔底后，

按上述实验分组处理 36 h，诱导细胞凋亡。同时设

立死亡对照（70% 乙醇处理 10 min）和早期凋亡对照

（42℃处理 10 min）。胰酶消化后收集细胞，转移至

1.5 ml 离心管中，12000 r/min 离心 5 min，弃去上

清液，并用 PBS 溶液洗涤细胞 2 次，再次离心，弃

去上清液。用 500 μl×Binding Buffer 将收集的细胞

制成细胞悬液。避光条件下，在死亡对照细胞中加

入 5 μl PI 标记液；在早期凋亡对照细胞中加入 10 μl

Annexin V-FITC 标记液；在待测样品中先加入 10 μl

Annexin V-FITC 标记液混匀后再加入 5 μl PI 标记

液混匀；调零细胞不加任何荧光标记液。室温避光

反应 5 min，用流式细胞仪检测待测细胞凋亡情况

（Ex=488 nm；Em=530 nm），每组实验重复 3 次。

Westen blot 检测细胞中 Casepase-3 激活情况：

将第 4 代 HUVEC 接种于 25 cm2 培养瓶中，提取细

胞总蛋白，用二喹林甲酸（BCA）法测定总蛋白浓度。

取 40 μg 蛋白样品上样，聚丙稀铣胺凝胶电泳（SDS-

PAGE），电转移 90 min 至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）的

膜上，5% 脱脂奶粉封闭 2 h 后与 1:3000 稀释的兔

抗人 Casepase-3 一抗 4 ℃孵育过夜。与 1:2000 稀释

的二抗室温孵育 1 h 后，再与化学发光试剂（ECL）

室温作用 3 min，后曝光、显影和定影，每组实验重

复 3 次。

统计学方法：运用 SPSS 17.0 软件进行统计学分

析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比

较用 LSD-t 检验，以 P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

P.g-LPS 对 HUVEC 增殖活力的影响：光密度

值 在 空 白 对 照 组 为 0.413±0.007， 经 P.g-LPS 处

理后光密度值分别为 0.309±0.006（50 pg/ml 组 ）、

0.291±0.006（100 pg/ml组）、0.267±0.004（1 ng/ml组 ）、

0.242±0.008（10 ng/ml 组 ）；可见各组 HUVEC 增殖

活力明显低于空白对照组（P<0.01），并且随着 P.g-

LPS 浓度增加，HUVEC 增殖活力也逐渐降低，各组

间比较差异均有统计学意义（P<0.01）。

P.g-LPS 对 HUVEC 凋 亡 的 影 响：研 究 结 果

脉粥样硬化形成过程中，而细菌脂多糖（又叫内毒

素 ）具有诱导内皮细胞凋亡的作用。牙龈卟啉单胞

菌（Porphyromonasgingivalis，P.g）是目前公认的慢

性牙周炎的主要致病菌之一，已有研究显示，在

动脉粥样硬化斑块中可以检测到 P.g[4]，其脂多糖

(Lipopolysaccharide, LPS) 是否可以诱导内皮细胞发生

凋亡，从而导致动脉粥样硬化病变形成，目前尚未

完全明确。本文通过研究 P.g-LPS 对人脐静脉内皮

细胞 (Human umbilical vein endothelial cells , HUVEC)

增殖和凋亡的影响，探讨 P.g-LPS 在促进动脉粥样

硬化病变形成和发展中的作用。

1 材料和方法

实 验 材 料：HUVEC 系 购 自 美 国 ATCC 公 司，

Porphyromonasgingivalis LPS 购 自 美 国 Invivo Gen 公

司，DMEM 培 养 基 购 自 美 国 Gibco 公 司， 四 甲 基

噻唑氮蓝 (MTT)、兔抗人 Caspase-3 抗体、Annexin

V-FITC/PI 凋 亡 检 测 试 剂 盒、BCA 蛋 白 定 量 试 剂

盒均购自美国 Sigma 公司，鼠抗兔二抗购自美国 A

bmort 公司。

HUVEC 培养与分组：本实验从 -80℃冰箱中取

冻存的 1-2 代 HUVEC，迅速投入 37℃恒温水浴箱中，

冻存液融化后，在超净工作台中，将 HUVEC 悬液转

移至 15 ml 离心管中， 800 r/min 离心 3 min，弃去上清

液，重新加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，

制成 HUVEC 悬液，按 1×106/L 浓度接种于 25 cm2

的塑料培养瓶中，置于 37℃、5% CO2 培养箱中。

24~48 h 后换液，待细胞达到 80% 融合时，用 0.25%

胰酶依地酸二钠（EDTA）液传代培养。实验用第 4 代

细胞，分组如下：空白对照组：细胞中只加入含 10%

胎 FBS 的 DMEM 培养液 3 ml；不同 P.g -LPS 剂量细

胞在加入上述培养液的基础上再分为 4 组，即分别

加入不同浓度 P.g -LPS，并将其浓度调整为 50 pg/ml

组、100 pg/ml 组、1 ng/ml 组及 10 ng/ml 组。

MTT 法检测细胞的增殖活性：取对数期生长的

第 4 代 HUVEC 制成细胞悬液，调整细胞浓度，以

2500/ 孔密度加入 96 孔板中，以上 4 组每组设 5 个

复孔，边缘孔用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）溶液填

充。在 37℃、5% CO2 培养箱中孵育至细胞单层铺

满 80% 孔底后，按上述实验分组处理，并设立空白

调零孔。将 96 孔板重新放入 37℃、5% CO2 培养箱

中孵育 36 h。轻轻吸出 96 孔板中培养液，重新加入

不含 LPS 的含血清培养液，并在避光条件下，每孔

中加入 1 mg/ml MTT 溶液 20 μl，继续置于 37℃、5%

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显 示：在 P.g-LPS 作 用 下，50 pg/ml 组、100 pg/ml

组、1 ng/ml 组、10 ng/ml 组 HUVEC 凋亡程度明显

高于空白对照组，并且随着 P.g-LPS 浓度的增加，

HUVEC 发生凋亡程度逐渐增加。（图 1）

注：图 1-1 空白对照组 图 1-2 50 pg/ml 组 图 1-3 100 pg/ml 组 图 1-4 1 ng/ml 组 图 1-5 10 ng/ml 组。图 1 中实验结果显示的四个象限：

各图中左上象限（B1）代表死亡细胞；右上象限 (B2) 代表晚期凋亡细胞；左下象限 (B3) 代表正常细胞；右下象限 (B4) 代表早期凋亡细胞。B4 区域中点越密集代

表发生早期凋亡的细胞数越多（每组实验重复 3 次） 图 2 Caspase-3 被激活后将裂解为 2 个片段，分子量分别为 22 kD 和 11 kD，这 2 个片段含量越多，代表

Caspase-3 激活程度越高。图中 Caspase-3 激活程度在 50 pg/ml 组和空白对照组之间无明显差异；而在 100 pg/ml 组、1 ng/ml 组和 10 ng/ml 组中，Caspase-3 激活程

度明显高于空白对照组，并且随着 P.g-LPS 浓度增加，Caspase-3 激活程度也呈现出逐渐增加的趋势（每组实验重复 3 次）

图 1 流式细胞仪检测不同浓度牙龈卟啉单胞菌 - 脂多糖（P.g-LPS）处理 36 h 后人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡变化

图 2 不同浓度牙龈卟啉单胞菌 - 脂多糖处理 36 h 后人脐静脉内皮细胞 caspase-3 活性变化

图 1-2图 1-1

103

B1 B2

B3 B4

102

101PI

100

103102101100

AV5-FITC

103102101100

图 1-3 图 1-4

图 1-5 图 2

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P.g-LPS 对 HUVEC 中 Casepase-3 激活的影响：

Caspase-3 激活是凋亡过程中的关键步骤，其活化后

将分裂成 2 个片段，分子量分别为 22 kD 和 11 kD。

本研究结果显示：在 P.g-LPS 作用下，50 pg/ml 组、

100 pg/ml 组、1 ng/ml 组、10 ng/ml 组的 HUVEC

caspase-3 激活程度明显高于空白对照组，随着 P.g-

LPS 浓度的增加，HUVEC caspase-3 激活程度也逐

渐增加。（图 2）

3 讨论

细菌 LPS 又叫内毒素，是革兰氏阴性菌的主要

毒力因子之一。细菌 LPS 均由核心多糖、O- 多糖

侧链和脂质 A 三部分组成，并且脂质 A 均是 LPS 生

物活性的主要核心成分，但是研究发现不同种系细

菌 LPS 的脂质 A 的化学结构不是完全一致的，并且

脂质 A 化学结构的这种不均一性导致不同种系细菌

LPS 的毒性作用也不完全相同。基于细菌脂多糖核

心功能基团脂质 A 的结构在不同种属细菌中非同质

性的特点，用其他种属细菌的 LPS 设为阳性对照组

意义并不大，因此，在本研究中未设立阳性对照。

P.g 菌是引起牙周炎主要致病菌之一，这是目前公认

的，作为一种革兰氏阴性菌，脂多糖是其最主要的

毒力因子之一，并且其理化性质相对稳定，不易被

破坏，能对机体产生持续的损害。凋亡是一种以高

特异性蛋白酶 Caspase 激活并引起细胞内大量蛋白

降解为生物化学特征的细胞主动死亡形式。Caspase

家族激活是凋亡的特征性标志之一。动物注射内毒

素后，脱落的内皮细胞中 Caspase 3 激活增加 [5]，并

且此过程不需要新基因表达产物的辅助。有研究报

道，P.g-LPS 可以诱导多种细胞产生凋亡 [6-8]，但目

前文献中尚少有其是否可以诱导 HUVEC 发生凋亡

的相关研究报道。

本 研 究 通 过 应 用 不 同 浓 度 的 P.g-LPS 处 理

HUVEC 36 h 后，观察 HUVEC 的增殖活力和凋亡

情况，结果显示，经 P.g-LPS 处理后，HUVEC 的

增殖活性较空白对照组明显降低，并且随 P.g 菌

LPS 浓度的增加，HUVEC 的增殖活性逐渐降低，而

HUVEC 发生凋亡的比例却逐渐增加，提示 P.g-LPS

能以浓度依赖的方式诱导 HUVEC 产生凋亡，同时

抑制其增殖能力。本研究同时通过 Westen blot 法观

察 了 Caspase-3 激 活 在 P.g-LPS 诱 导 HUVEC 凋 亡

中的作用，结果显示，随着 HUVEC 凋亡率的增加，

Caspase-3 活化片段的量也逐渐增加，并且明显高

于空白对照组，提示 Caspase-3 活化可能在 P.g-LPS

诱导 HUVEC 细胞凋亡中具有重要作用。本文虽然

只是观察了实验现象，但是发现了这种有意义的现

象才有可能进行深入的研究，并且这个现象也在一

定程度上验证了我们的推测：牙周炎致病菌毒力因

子可以直接引起血管内皮的损伤。

本研究的不足之处：①本研究内容相对单一，

尚未涉及到深层次的机理探讨，只是系列研究的起

始，有待进一步研究。②至于引起牙周炎的其他致

病菌，或 P.g 菌的其他毒力因子对内皮细胞的损害

程度如何，也是有待进一步研究的。

综上所述，牙周病致病菌 P.g 菌可能是透过其

代谢产物 LPS 抑制内皮细胞增殖活力，caspase-3 激

活诱导细胞凋亡，直接引起血管内皮损伤，破坏血

管内膜完整性，从而促进动脉粥样硬化性疾病发生

和发展的。

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（收稿日期 : 2013-04-17）

（编辑 : 梅平 ）