Cell culture

Lab. Biochemistry D.V.M. Jeong

Cell growth

• 세포의 크기나 구성물질의 증가만을 의미하는 것이 아니라 하나의 "mother" cell 이 cell reproduction 을 통해 2 개의 daughter cell 을 생성하는 증가 즉 , 세포분열을 동반한 세포의 수적 증가를 의미

Cell growth 요구 조건• - pH : 7.4 ~ 7.7 • - mixed gas : CO2(5%), O2 • - Osmolality : 260~320 mOSm/kg• - Temperature : 37℃• - viscosity• - 기타 : 수분 및 증식할 수 있는 충분한 공간

세포 성장 곡선

세포 성장 단계• ② lag phase(유도기 , induction phase)• - 세포를 새로운 배지에 접종, 배양할 때 그 배지에 적응하는 시기 • - 세포가 새로운 환경에서 증식하는데 필요한 각종 효소단백질을 생합성하는 시기 • - 세포의 크기가 커지고 호흡활성도가 높은 시기 • - 세포내의 RNA량은 현저하게 증가하고 효소단백질 합성이 왕성한 시기 • (DNA량은 변화하지 않음) •  • ③ logarithmic phase(대수기 , exponential phase) • - 세포가 대수적으로 증식하는 시기 • - 세대시간 , 세포의 크기가 일정한 시기 • - 세포질의 합성속도와 세포수의 증가는 비례 • - 증식속도는 배지의 영양 , pH, 온도 , 산소분압 등의 환경인자에 의해서 결정 • - 세포의 생리적 활성이 가장 강한 시기 • - 물리적 , 화학적 처리에 대해서 감수성이 높은 시기 •  • ④ stationary phase(정상기 , maximum phase) • - 살아있는 세포의 수는 일정하게 유지되지만 전세포수는 최대가 되는 시기 • - 일부 세포가 사멸하고 다른 일부의 세포는 증식하여 사멸수와 증식수가 거의 같다. • - 영양물질의 고갈, 대사생산물의 축적 , 배지 pH의 변화 , 산소공급의 부족 등 부적당한 • 환경이 되어 살아있는 세포수가 증가하지 않는다. •  • ⑤ death phase(사멸기 , phase of decline) • - 살아있는 세포의 수가 감소하는 시기

동물 세포 배양의 역사• 1907 년 Harrison 이 올챙이의 척색에서

취한 신경섬유세포를 개구리의 응고 림프액에 배양함으로써 시작

세포배양시 필요한 장치• 도립현미경 (Inverted Microscopy)• CO2 incubator• Clean bench• 초순수 물 제조장치• 배양 용기• 액체 질소 보존통

도립현미경• 배양기 안에서 배양하고 있는 세포를 관찰하기

위하여 광원이 위에 있고 , 대물렌즈가 아래에 위치

• 배율 : 40~200 배

CO2 incubator• 액상 배지의 한 성분인 NaHCO3와 CO2 기체와의 평형에 의해 배지의 pH

가 조절되므로 동물 세포 배양에는 CO2 incubator가 필수적

• 세포배양에 사용되는 CO2 incubator의 대부분은 water jacket 형으로서 문의 개폐에 따르는 온도변화가 작고 복귀속도도 빠르다 .

• Incubator 내부 가장 아래에는 배지의 습기 증발을 막기 위해서 가습 vat가 있어야 하며 늘 멸균수를 채워 넣어 내부 습도를 100%로 유지

• CO2 incubator는 고온다습하여 잡균의 오염가능성이 크기 때문에 무균 상태를 유지하도록 주의- Incubator의 내부는 1% SDS로 닦고 건조시킨 후 70% ethanol로 다시 한번 닦아냄- 가습용 vat의 물은 멸균수를 사용하고 방부제로 methyl p-hydroxyben-zoic acid를 적당한 양으로 첨가

Clean bench

• 무균조작을 위한 작업대• HEPA filter 및 송풍기를 사용하여 무균공기를 항상 내부로 보냄• Clean bench 내부에는 형광등과 자외선 살균등이 설치되어

있어야 하며 , 사용하지 않을 때에는 항상 살균등을 켜놓아야 함- 사용한 후에는 작업대를 70% ethanol 로 닦아야 함

• Clean bench 내에는 세포배양에 필요한 여러장비 , 즉 , au-topipettor, aspirator ( 배양액을 원심분리한 후 배양상청액을 흡취하는데 사용한다 ), forceps, micropipetter, burner, pipette (1ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, etc.) 등을 둠 - 일반적으로 burner 는 pipette 과 배지 병의 입구등을 화염멸균할 때 사용하지만 무균조작 자체를 신중히 하면 화염멸균이 반드시 필요한 것은 아님 .

배양 용기• 유리제

- 부유세포 : 문제 없음 . - 접착세포 : 유리제에 collagen, poly-D- lysine, fibronectin 등의 접착인자를 coat-ing 하는 전처리 과정 필요

• 플라스틱제 - 일반적으로 일회용- 세척 , 멸균 등의 작업이 필요없음

플라스틱제 배양용기 특징

액체 질소 보존통• 세포의 장기 보존을 위해 액체 질소 보존통 이용• 액체 질소 보존법

- 액체 질소 용액 내 보존 (-196°C)- 액체 질소 증기 내 보존 (-120°C) 이 있다 .

• 액체질소 용액 내 보존은 액체질소가 동결앰플 (ampule) 내에 침투할 경우 바이러스 등의 오염의 원인이 되고 , 해동시에는 앰플내의 액체질소가 기화하여 폭발할 위험이 있음 - 액체질소 용액 내에 보존을 할 경우 silicone rubber 에 packing 이 붙어 있는 플라스틱제의 cryotube 를 사용하거나 또는 유리앰플에 봉합하여 사용하는 것이 바람직

• 액체 질소 보존법은 거의 반영구적으로 보존이 가능하지만 일년에 한번은 해동하여 배양하고 다시 동결

• 액체질소는 기화하여 감소하기 때문에 정기적으로 보충할 필요가 있음

살균용 ethanol 의 농도• 무균 조작 시 사용하는 ethanol 의 농도는

70% 가 일반적이다 . 분무기에 미리 준비하여 사용하는 것이 좋으며 70% ethanol 을 뿌려 살균한 후에 남아있는 잔여물은 autoclaving 등으로 미리 무균화된 거즈로 닦아낸다 .

부착 세포 배양과 부유 세포 배양• 부착 세포 배양•  Extracellula Matrix (ECM)• 부유 세포 배양• Cell dissociation

부착세포 배양• 대부분의 고형 조직 유래의 세포는 단층으로 부착하여 증식

- 이러한 세포는 대부분 약한 음전하를 띤 유리 용기 또는 적당한 전하를 띄도록 처리된 polystyrene과 같은 플라스틱 용기에 부착하여 증식

• 세포의 부착은 extracellular matrix (ECM) protein 에 대한 specific cell surface receptor에 의해 매개 (ECM에 대하여 조사 )

• 부착 세포에는 fibroblast-like cell, endothelial cell, epithelial cell, mesenchymal cell등이 해당되고 어떤 경우에든 부착하기 전에 세포로부터ECM protein이 합성 및 분비되어야 하며 그렇지 않을 경우에는 표면이 ECM protein으로 처리된 substrate가 제공되어야 함

• cell-cell그리고 cell-substrate의 부착은 cell surface receptor와 ECM protein에 의해 이루어지며 이 과정에서 Ca2+ ion이 중요하게 작용- 계대 배양 시 protein의 분해와 Ca2+ chelation을 이용하는 경우가 많음 .

ECM

• cell-cell adhesion molecules- CAMs(cell adhesion molecules) (Ca2+-in-dependent), cadherins (Ca2+-dependent)

• Integrin

• transmembrane proteoglycan

부유세포 배양• Leukemia 와 murine ascite tumor cell들은

지속적으로 부유 상태로 증식• 부유 세포 배양은 세균과 유사하게 계대 배양함 .

- 탈착 과정 (trypsin 처리 등 ) 을 필요로 하지 않으며 전체적으로 부착보다 시간이 더 적게 소요- 세포를 유지하기 위해서는 주로 배양 세포를 희석시킴으로서 , 또는 계대 배양없이 단순히 배지의 양을 증가시킴으로써 지속적으로 배양- 부유 배양에서는 배양액의 희석을 지속적으로 하여 세포 농도가 항상 일정하도록 유지할 수 있다면 세포 증식의 steady state 에

Cell dissociation

세포의 동결 보존• 세포 배양시 보통 10000:1 의 비율로 돌연변이체가 생기며 장기간에 걸쳐 계대 배양을

계속하게 되면 본래의 세포 집단과는 전혀 다른 세포 집단으로 변질- 유전적 변이를 최소화하고 노화와 형질전환 등을 방지하기 위하여 동결 보존 필요

• 세포의 동결 보존시 세포에 내동성을 부여하기 위해서 dimethyl sulfoxide (DMSO) 또는 glycerol 을 첨가하는데 , glycerol 보다 DMSO 가 더 효과가 있는 것으로 알려짐 . - Freezing medium 에 포함된 DMSO 는 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로 동결 조작은 신속하게 진행해야 함 .

• (glycerol 과 DMSO 의 내동성 부여 방법 ???)

• 동결 보존할 세포는 보존 전에 오염 여부를 확인하여야 하고 대수 증식기 (log phase) 에 있는 활성적인 세포를 이용

• 동결 시 감온 속도는 세포에 따라 다르며 보통 -1°C/min 속도로 동결

• Programmed cooler 를 이용하거나 또는 솜을 채운 ice box 에 저장할 세포가 포함된 vial 을 넣고 -70 ~ -90°C 의 deep-freezer 에 정치한 후 액체 질소로 옮김으로써 동결 보존 완료

동결 보존된 세포의 배양• 동결된 세포는 저온과 DMSO 에 의한 장해를 피하기 위해서

신속히 조작- 액체 질소에 저장 상태인 동결 세포 vial 은 액체 질소에서 외부로 나오는 즉시 37 - 40°C 정도의 수조에서 신속히 해동하고 , 미리 준비한 배지에 세포 현탁액을 넣어줌- DMSO 나 glycerol 을 제거하고자 할 경우에는 80 xg 에서 2 - 3 분간 원심하여 상청액을 버리고 새로운 배지에 세포를 현탁한 후 배양 용기에서 배양- 이때 보통의 계대 배양 때보다 높은 세포 접종 밀도로 배양을 시작하고 다음날 반드시 배지 교환

• 부착 세포의 경우 (37°C 에서 배양하는 세포의 경우 )• 부유 세포의 경우 (37°C 에서 배양하는 세포의 경우 )

subculture( 계대배양 )• - 세포들은 일정량의 영양성분을 일정 공간 내에서 공급받으며 증식하고

contact inhibition의 특징을 가지고 있기 때문에 무한정 배양이 불가능하다 . 따라서 세포들을 계속 증식시키기 위해 세포 일부를 배양용기에서 떼어내어 새로운 배양접시에 넣고 배 양을 하는 subculture를 필요로 한다 .

•  - 대부분의 세포는 분열횟수가 증가함에 따라 세포노화 (culture senes-cence)현상이 나타나 고 세포의 성질이 시간에 따라 변화하기 때문에 일정 횟수만큼만 subculture를 할 수 있다 . 하지만 돌연변이에 의해 세포 성질이 변하여 장기간 subculture가 가능해진 세포 가 있을 수 있는데 이를 cell strain, 무한정 subculture가 가능해진 세포를 cell line이라 고 한다 .

•  - subculture는 배양액의 pH, 세포밀도 , 세포형태나 색소 ·기포형성 등을 관찰하여 그 시기 를 결정한다 .

• contact inhibition ?• - cell population이 너무 커져서 cell과 cell 이 조밀하게 맞닿을 경우

cell 성질에 변화를 주고 성장이 방해 받는 현상

부착 세포의 경우(37°C에서 배양하는 세포의 경우 )

• 1 .37°C 수조에서 배지를 미리 항온한다 . • 2 . 동결 보존 세포를 포함한 vial 을 액체 질소에서 꺼내는 즉시

37°C 항온 수조에서 재빨리 해동시킨다 . • 3.DMSO 나 glycerol 을 제거하고자 할 경우에는 80 xg 에서 2 -

3 분간 원심하여 상청액을 버리고새로운 배지에 세포를현탁한다 . - DMSO 나 glycerol 을 제거하지 않아도 될 경우에는 원심하지 않고 새로운 배지에 세포를 현탁한다 .

• 4 . 배양 용기에서 배양한다 . • 5 . 다음날 새로운 배지로 교환한다 . • 6 . 현미경으로 세포를 관찰하며 2 - 3 일마다 새로운 배지로 교체해주고 세포가 배양 용기를 꽉 채우게 되면 계대 배양한다 .

부유 세포의 경우(37°C 에서 배양하는 세포의 경우 )

• 1 .37°C 수조에서 배지를 미리 항온한다 . • 2 . 동결 보존 세포를 포함한 vial 을 액체 질소에서 꺼내는 즉시37°C

항온 수조에서 재빨리 해동시킨다 . • 3 .DMSO 나 glycerol 을 제거하고자 할 경우에는 80 xg 에서 2-3

분간 원심하여 상층액을 버리고 새로운 배지에 세포를 현탁한다 . - DMSO 나 glycerol 을 제거하지 않아도 될 경우에는 원심하지 않고 새로운 배지에 세포를 현탁한다 .

• 4 . 배양 용기에서 배양한다 . • 5 . 다음날 새로운 배지로 교환한다 .

- 이때는 원심하여 배양액을 버리고 새로운 배지로 세포 침전을 현탁하여 배양용기에서 배양한다 .

• 6. 현미경으로 세포를 관찰하며 2 - 3 일마다 새로운 배지로 교체해주고 세포의 개수를 측정하여 일정 수준 이상이 되면 계대 배양한다 .

부착 세포의 계대 배양• 1. 배양 배지를 제거한다 . • 2. Ca2+ 와 Mg2+ 가 포함되지 않은 D-PBS (JBI, Cat. No. LB 001-02) 또는 HBSS

(JBI, Cat. No. LB 003-03 또는 LB 003-04) 로 세포층을 씻어 낸다 . • 3. Cell dissociation reagent (i.e. trypsin 또는 trypsin-EDTA, EDTA soluton) 를

처리한다 . • 4. Cell dissociation reagent 를 제거하고 , 배양 용기에서 세포가 탈착 될때까지 상온

또는 37°C 에서 2 - 10 분간 정치한다 . • 5. 현미경으로 세포의 탈착을 확인한 후 새로운 배지로 세포를 현탁한다 .

- 이때 새로운 배지에 혈청이 포함되어 있다면 위의 trypsin 을 완전히 제거할 필요가 없지만 serum-free media 나 protein-free media 를 사용할 경우에는 trypsin in-hibitor 를 사용하거나 balance salt solution 으로 여러 번 세척하여 trypsin 을 제거한 후 새로운 배지로 현탁한다 .

• 6. 세포수를 측정한다 . • 7. 적절한 세포 밀도가 형성되도록 세포 현탁액을 취하여 새로운 배지로 희석한 후 배양한

다 . • 8. 더 이상 배양할 필요가 없을 때 동결 보존한다 .

- 세포의 동결 보존시에는 세포에 내동성을 주기 위해서 DMSO 나 glycerol 을 5 - 10% 첨가하는데 glycerol 보다 DMSO 가 더 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 일반적으로 동결 배지에 포함된 DMSO 는 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로 조작을 신속하게 해야한다 .- 세포는 -1°C/min 속도로 동결하며 최종적으로는 액체 질소에 저장한다 .