centro de investigación en alimentación y desarrollo, a.c. · 2017. 7. 13. · a la dra. ana...
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Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C.
EVALUACIÓN Y SELECCION DE MARCADORES
MOLECULARES PARA LA TRAZABILIDAD DE LA CARNE DE
BOVINO
POR:
ROBERTO RODRIGUEZ RAMIREZ
TESIS APROBADA POR LA
COORDINACION DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTORADO EN CIENCIAS
HERMOSILLO, SONORA DICIEMBRE DEL 2010
ii
APROBACIÓN
Los miembros del comité designado para la revisión de tesis de Roberto
Rodríguez Ramírez, la han encontrado satisfactoria y recomiendan sea
aceptada como requisito parcial para obtener el grado de Doctor en Ciencias.
___________________________________ Dra. Belinda Vallejo Galland
Directora de Tesis
__________________________________
Dra. Ana María Arana Navarro
____________________________________ Dra. Armida Sánchez Escalante
__________________________________ Dra. María Isabel Guerrero
iii
DECLARACIÓN INSTITUCIONAL
Se permiten y agradecen citas breves del material contenido en esta
tesis sin permiso del autor, siempre y cuando se dé el crédito correspondiente.
Para la reproducción parcial o total de la tesis con fines académicos, se deberá
contar con la autorización escrita del Director General del Centro de
Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD, A.C).
La publicación en comunicaciones científicas o de divulgación popular
de datos en esta tesis, deberá dar los créditos al CIAD, A.C., previa aprobación
escrita del manuscrito en cuestión, de la Directora de tesis.
Dr. Ramón Pacheco Aguilar
Director General
iv
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional en Ciencia y Tecnología por permitirme y
apoyarme a realizar mis estudios de posgrado
Al centro de investigación en alimentación y desarrollo A.C. en especial
al laboratorio de autenticidad, calidad y trazabilidad de los alimentos,
simplemente por abrirme la puerta y darme la oportunidad de integrarme a un
gran laboratorio para que creciera en la ciencia de los alimentos.
A mi comité de tesis Dra. Belinda Vallejo, Dra. Ana Arana, Dra.
Armida Sánchez, Dra. Isabel Guerrero por sus valiosas aportaciones y
observaciones a este trabajo de investigación
A la coordinación de docencia por su poyo y profesionalismo
Una vez más a la vida misma, por seguirme siendo ser parte de ella
para que siga alcanzando y logrando ciertos fines que ni ella conoce.
A mi directora de tesis Dra. Belida Vallejo por mi formación doctoral la
amistad y sobre todo por confiar en mí en su grupo de trabajo al grado de
animarme y/o llamarme la atención como si fuera uno de sus hijos….jeje
Gracias.
Al cDr. Aarón González que desde un principio me ha mostrado su gran
amistad, profesionalismo y sobre todo que lo considero como un familiar mas.
Ni modo Aarón el chamaco será primero doctor jejeje, pero quizás no sin tu
valiosa ayuda y con esa tenacidad que te destaca, gracias
v
A la Dra. Ana Arana por brindarme un pedacito de su amistad, sus
conocimientos y dedicación hacia mi formación, pero sobre todo a liberarme de
una de mis grandes frustraciones y convertirla en una ilusión, solo aquellos que
sepan entenderán…. Muchas Gracias por todo Ana
A mis padres por darme la vida, a mi abuela Cecilia por todo su amor y
a mis tíos, Norma y Gilberto a quien quiero y aprecio mucho
A mis hermanos, a quienes todavía son la crítica y el impulso a alcanzar
nuevas metas
A esa personita que ha creído en mí, tanto en los logros y aun en mis
carencias y que ha sido más que un pilar en mi vida académica, gracias
Angélica.
A esas grandes amistades de la infancia y universidad: Samuel, Xavier,
Raúl, Zupo, Josué, de los cuales demuestran su amistad día a día
A mis amigos de posgrado y de la institución en especial a Willy, Ronald,
Toño, de los cuales son amistades que se alcanzan en cierta etapa de la vida,
pero con alta sinceridad, donde el orden no importa….. Verdad willy jajajjjaj.
Al personal de la biblioteca Luis, Fernando, pero muy en especial a Don
Gerardo por su valiosa ayuda.
Al grupo de investigación de lácteos, Dr. Adrian Hernández, M. en C.
Carmen estrada, Dr. Miguel Ángel Mazorra, Dra. María Jesús torres. En
especial a Carmen Estrada por su valioso apoyo técnico en el laboratorio y a
vi
María de Jesús Torres por el manejo de las muestras durante mi etapa
experimental
A mis compañeros del laboratorio de lácteos sin excepción alguna, en especial a
Lilia Beltrán, Adrian Hernández por su buena amistad, consejos y momentos
divertidos. Ya sé, no olvido las extracciones… jajaja, creo que el triangulo sigue
adrian, aunque estés en el otro continente, gracias
A mí querida pamplona, sobre todo a las amistades como Gabo, Mau, David,
Iñaki, y las chicas súper poderosas del laboratorio: Paula, Joanna, Nuria,
Maitea, Naiya y muchos más
A las personas que dijeron que pereza seguir estudiando y creemos que jamás
te vayas Europa para lograrlo, muchas gracias por ser una inspiración de que
fuera más tenaz para lograrlo
A la ciencia, que cada día nos sorprende más y sobre todo a los perseguidores
de ella.
A todas las personas que hicieron que este trabajo pudieras salir adelante y que
por una razón no se alcanzan a mencionar.
vii
DEDICATORIA
A mis padres, a quienes considero una de mis grandes aspiraciones
Y quizás ellos no lo sepan, Por que como padres no Solo me
regalaron la vida Si no han sabido a que la Preservará, con sus
atenciones Infinitas en todos los ámbitos.
GRACIAS POR TODO
Raúl y Rosario
A Roberto Uriel, donde quizás realmente no tenga que dedicarle
este trabajo, ya que simplemente es una razón para vivir y
sacar mucha cosas adelante, como lo haría con cualquier hijo.
A una de las personas que más admiro, quiero y que me ha
regalado un pedacito de su vida, como es la vida misma de mi
hijo, gracias por comprenderme y ayudarme, porque sin ti nada
hubiera sido posible, siempre te estaré agradecido,
Angélica
viii
INDICE
RESUMEN……………………………………………………………………………..ix
Capítulo 1. Integración general…………………………………………………….1
Capítulo 2. Review: Authentication and Traceability of Foods from Animal Origin
by PCR-Based Capillary Electrophoresis…………………………………………..19
Capítulo 3. Trazabilidad de la Carne de Bovino: Conceptos, Aspectos
Tecnológicos y Perspectivas para México…………………………………………47
Capítulo 4. Meat Molecular Traceability for Beef from Mexican Bovine Synthetic
Breeds………………………………………………………………………………….54
ix
RESUMEN
La trazabilidad de la carne se define como la capacidad de rastreo a lo largo de
toda la cadena productiva hasta el consumidor y viceversa. La ausencia de
trazabilidad provocó el colapso de la ganadería bovina en Europa ante la
presencia de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB). Derivado de esto, la
trazabilidad de la carne de bovino se convirtió en obligatoria para los mercados
internacionales. El objetivo de este trabajo fue desarrollar e implementar un
sistema de trazabilidad basado en marcadores moleculares para la carne
proveniente de razas sintéticas de Sonora. Para lo anterior se recolectaron
muestras de sangre y músculo de ganado bovino de dos ganaderías de Sonora
y de sus puntos de venta. Se extrajo el ADN de las muestras recolectadas y se
evaluaron 11 microsatélites, los cuales fueron analizados por electroforesis
capilar. Todos los marcadores resultaron ser polimórficos, con un número de
alelos entre 5 y 19. El contenido de información polimórfica (PIC) indicó que el
microsatélite menos polimórfico fue el BM1824 (PIC= 65.2), mientras que el
microsatélite mas polimórfico fue el BM2113 (PIC=84.2). Además, la
probabilidad de correspondencia (MP por sus siglas en inglés) obtenida para
los siete marcadores seleccionados (BM2113, TGLA53, INRA023, ETH225,
TGLA122, TGLA227, ETH3) fue de 10-8. Finalmente, el sistema de trazabilidad
molecular establecido demostró ser útil para determinar el origen de la carne.
Capítulo 1
Integración general
2
INTRODUCCION
Desde finales de la década de los ochentas, se ha visto con
preocupación una serie de crisis alimentarias originadas por la difusión de
enfermedades como la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) o mal de las
vacas locas, la encefalopatía espongiforme ovina, la fiebre aftosa y la peste
porcina clásica (Pettitt, 2001; Felmer et al., 2006). Aunado a lo anterior,
también se ha generado desconfianza en los consumidores por la presencia de
residuos de sustancias peligrosas en los alimentos, tales como las hormonas y
anabólicos (Estrada-Montoya et al., 2008), antibióticos (Sofos, 2008), pesticidas
(Sallam y Ali Morshedy, 2008) entre otros. Todo esto ha causado gran alarma
en muchos países, dada la facilidad con la que los problemas se diseminan
debido a la globalización de los mercados (Pettitt, 2001; Felmer et al., 2006).
Para rastrear a los alimentos problema implicados en crisis alimentarias
y responder rápidamente en la recuperación del producto, las empresas y
autoridades gubernamentales requieren de contar con herramientas suficientes
que les permita dar solución a la problemática con la finalidad de salvaguardar
la salud humana. Surge así la imperiosa necesidad de establecer políticas de
identificación y seguimiento individual de los animales destinados a la
3
producción de alimentos mediante la aplicación de tecnologías adaptadas a la
modernización y globalización de los intercambios comerciales. Con la
identificación de los animales destinados a la producción de alimentos para
consumo humano, empieza a tomar notoriedad el termino Trazabilidad
(Ammendrup y Füssel, 2001; Felmer et al., 2006).
La trazabilidad o rastreabilidad se define como “la posibilidad de
encontrar y seguir el rastro a través de todas las etapas de producción,
transformación y distribución de un alimento, de un pienso, de un animal
destinado a la producción de alimentos o una sustancia destinada a ser
incorporada en alimentos humanos o con probabilidad de serlo” (European
Commission, 2002).
De forma general, la trazabilidad es un conjunto de acciones, medidas y
procedimientos técnicos que permiten identificar y registrar cada alimento,
desde su origen hasta el final de la cadena de comercialización (Felmer et al.,
2006; Yordanov y Angelova, 2006)
Para el caso específico de la carne, la trazabilidad permite seguir el
rastro a un producto comenzando desde la identificación del animal en el
campo, continuando en el frigorífico y terminando con la identificación de los
productos y subproductos por medio del etiquetado en el punto de venta.
4
La identificación animal es una exigencia de los mercados externos, en
los que el consumidor espera que el producto sea inocuo y de calidad
diferenciada. También es imprescindible el rastreo del inventario nacional de
ganado para preservar el estatus que hoy ostenta México como país libre de
encefalopatía espongiforme bovina (BSE, por sus siglas en ingles) o “mal de las
vacas locas”.
Por otro lado, la trazabilidad de la carne no solo es importante para la
seguridad alimentaria, sino que también es importante para darle valor añadido
a los productos como los que ostentan denominación de origen, identificación
geográfica de procedencia o marcas de calidad diferenciada (Arana et al., 2002;
Dalvit et al., 2007). La autentificación de los productos con marcas de calidad
diferenciada es importante para evitar etiquetados fraudulentos y para certificar
el origen de los productos en el mercado. Por lo anterior, la autentificación de
alimentos que consiste en la identificación de sus componentes para verificar la
veracidad del etiquetado es parte de la trazabilidad.
A partir del 2005, la Unión Europea (UE) exige trazabilidad para todos los
alimentos importados y/o producidos en su territorio. No solo es necesario que
se etiqueten los productos con su fecha de envase, caducidad y composición,
también es necesario que se verifiquen todos los pasos seguidos en su
procesamiento y origen (Schwagele, 2005). Por otro lado, países miembros de
5
la UE y países asiáticos como Japón y Corea han aumentado sus exigencias,
al punto de requerir el rastreo o trazabilidad de los alimentos (Dalvit et al.,
2007).
Por otro lado, los países que quieren mantener un lugar competitivo en el
comercio mundial de la carne (Australia, Nueva Zelanda, Brasil, Argentina,
Uruguay y Chile) están instrumentando sistemas de trazabilidad en respuesta a
la demanda de los consumidores de alto poder adquisitivo (Smith et al., 2005).
En México, el Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad
Agroalimentaria (SENASICA) ha tomado acciones para darle valor a la cadena
de bovinos de carne, orientándola hacia la nueva realidad de los mercados
externos cada vez más estrictos en lo que respecta a sanidad, calidad e
inocuidad. Entre las acciones tomadas por la SENASICA está la instalación de
un sistema nacional de registro e identificación de animales denominado
SINIIGA (www.sagarpa.gob.mx).
Aunque todo sistema de trazabilidad para la carne comienza con la
identificación de los animales y continúa con el etiquetado del producto en
etapas posteriores de la cadena, la trazabilidad puede perderse con el sacrificio
o ser susceptible de adulteraciones. Por lo anterior, con el propósito de verificar
la trazabilidad de la carne, surge la trazabilidad molecular por medio del análisis
del ADN (Pettitt, 2001; Smith y Saunders, 2005). Un sistema de trazabilidad
6
verificable con la huella genética podría ser una buena alternativa para
empresas mexicanas exportadoras de carne que cuentan con un esquema de
comercialización integrado.
7
REFERENCIAS
Arana A, Soret B, Lasa I, Alfonso L (2002) Meat traceability using DNA
markers: application to the beef industry. Meat Sci. 61: 367-373
Ammendrup S y Füssel AE (2001) Legislative requirements for the
identification and traceability of farm animals within the European Union. Rev
Sci Tech. 20: 437-444
Dalvit C De Marchi, M Cassandro M (2007) Genetic traceability of
livestock products: A review. Meat Sci. 47: 437-449.
Estrada-Montoya MC, González-Córdova AF, Torrescano G, Camou JP,
Vallejo-Cordoba B (2008) Screening and Confirmatory Determination of
Clenbuterol Residues in Bovine Meat Marketed in the Northwest of Mexico.
Cien. Tecnol. Aliment. 6: 130-136.
European Commission (2002) Council Regulation (EC) No 178/2002 of
28 January 2002 laying down the general principles and requirements of food
law, establishing the European Food Safety Authority and laying down
procedures in matters of food safety. Off. J. Eur. Communities. L31: 1-24.
8
Felmer R, Chavez R, Catrileo A, Rojas C (2006) Arch Med Vet. 38:197-
206.
Pettitt RG (2001) Traceability in the food animal industry and supermarket
chains. Rev Sci Tech . 20: 584-597.
Sallam KI, Morshedy AEM (2008) Organochlorine pesticide residues in
camel, cattle and sheep carcasses slaughtered in Sharkia Province, Egypt.
Food Chem. 108: 154-164
Schwägele F (2005) Traceability from European perspective. Meat Sci.
71: 164-173
Smith GC, Tatum JD, Belk KE, Scanga JA, Grandin T, Sofos JN (2005)
Traceability from a US perspective. Meat Sci. 71: 174-193.
Smith GC, Saunders L (2005) International Identification, Traceability and
Verification: The Key Drivers and The Impact on the Global Food Industry.
International Livestock Congress Connections. Exploring Traceability and What
it Means to the Beef Industry. Houston, TX, March 2.
Sofos, JN. (2008) Challenges to the meat safety in the 21st century. Meat
Sci. 78: 3-13.
9
Yordanov D, Angelova G (2006) Identification and traceability of meat and
meat products. Biotechnol. Biotechnol. Equip. 20: 3-8.
10
HIPÓTESIS
La selección y evaluación de microsatélites específicos para ganado
bovino permitirá establecer un sistema molecular de trazabilidad para la carne
producida en el Estado de Sonora.
OBJETIVO GENERAL
Desarrollar un sistema de trazabilidad para la carne de bovino producida
en el Estado de Sonora utilizando microsatélites específicos como marcadores
moleculares
OBJETIVO ESPECIFICOS
1. Establecer la metodología para la extracción de ADN genómico (ADNg) en
tejido muscular y sangre del ganado bovino.
2. Establecer las condiciones de reacción para la amplificación de los
diferentes microsatélites.
3. Establecer la metodología basada en electroforesis capilar para la separación
y detección de los microsatélites.
11
4. Analizar estadísticamente los resultados de frecuencias alélicas, el grado de
polimorfismo en los locus empleados, heterocigosidad y probabilidad de
correspondencia.
12
JUSTIFICACION
Para rastrear a los productos ante una alerta o crisis alimentaria, las
organizaciones de productores y comercializadores, así como las dependencias
oficiales competentes, requieren de herramientas suficientes que les permita
identificar rápidamente el origen de los alimentos sospechosos. Ante este
escenario se requiere de un sistema de trazabilidad total que permita aumentar
la capacidad para determinar con precisión la fuente del problema, facilitar la
recuperación y retirada de los productos afectados, establecer
responsabilidades ante cualquier incidente, y finalmente reducir el impacto
económico negativo sobre los integrantes de la cadena productiva. Lo anterior
ha generado la urgente necesidad de establecer políticas de identificación y
seguimiento individual de los animales destinados al consumo, mediante la
aplicación de nuevas tecnologías adaptadas para dar respuestas en tiempos
cortos, acordes con la modernización y globalización de los intercambios
comerciales actuales. Lo anterior hace que hoy en día, el término trazabilidad,
sea parte del lenguaje común dentro de la cadena de producción,
industrialización y comercialización de los alimentos. Así la trazabilidad al tener
la capacidad de rastrear la cadena de producción, otorga a los productores la
posibilidad de colocar sus productos en mercados más rentables, que exigen
conocer con certeza el origen del alimento. En México, la trazabilidad de la
13
carne con la huella genética complementaría los esfuerzos realizados en
materia de trazabilidad como lo es la aplicación del SINIIGA, asegurando de
manera fehaciente la certificación de origen de la carne. Sin embargo, con el
sacrificio del animal y su posterior despiece, la trazabilidad se pierde. Por lo que
su complementación con un sistema de trazabilidad molecular (basada en ADN)
daría un valor agregado a la cadena de bovinos de carne, permitiendo ser más
competitivos en los mercados internacionales.
Aunque la trazabilidad molecular para la carne de bovino se ha
establecido en diferentes países, la mayoría de estos sistemas de trazabilidad
se ha desarrollado para razas puras. Sin embargo, la trazabilidad molecular no
ha sido reportada para razas sintéticas, como las que predominan en Sonora y
en general en todo México. Por lo anterior, se planteó el desarrollo e
implementación de un sistema de trazabilidad molecular considerando las razas
sintéticas de bovino utilizadas para la producción de carne en Sonora.
14
METODOLOGIA
En el capítulo 2 se presenta un artículo de revisión relacionado con la
autentificación y trazabilidad de los alimentos de origen animal utilizando
técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus
siglas en inglés) y electroforesis capilar. Dentro de esta revisión, destacan
aplicaciones de estas dos técnicas en la trazabilidad de la carne de bovino por
medio del uso de plataformas de secuenciación basadas en electroforesis
capilar. En capítulo 3 se presenta un artículo de revisión describiendo un
panorama general de conceptos, aspectos tecnológicos y normativa para la
trazabilidad de la carne de bovino. Además se describen los principales
métodos utilizados para la trazabilidad, incluyendo la selección y evaluación de
marcadores moleculares a utilizar en la trazabilidad molecular. Por último, se
presentan las perspectivas de la trazabilidad en diferentes países, enfatizando
el caso de México.
En el capítulo 4 se describe la metodología seguida para el sistema de
trazabilidad molecular propuesto para la carne de bovino proveniente de razas
sintéticas de Sonora. Primeramente, se establecieron los parámetros para la
amplificación de los marcadores moleculares por medio de PCR y las
condiciones de separación de los mismos por medio de electroforesis capilar
utilizando un secuenciador. Además se describe la probabilidad de
15
correspondencia, la heterocigosidad media y el contenido de información
polimórfica (PIC por su siglas en ingles) obtenidos para la población
muestreada. En base a estos parámetros, se seleccionaron los marcadores que
arrojaron mayor información para ser utilizados en la trazabilidad molecular.
Finalmente, se demostró la aplicabilidad del sistema para la trazabilidad
molecular de la carne de bovino de Sonora.
El sistema de trazabilidad molecular propuesto dentro de este trabajo de
investigación (Figura 1) consistió, de manera general, en tomar muestras de
sangre y tejido en el animal (al momento del sacrificio) como muestras de
referencia. Posteriormente se tomaron muestras en los puntos de venta en
donde se comercializó la carne de los animales muestreados en el sacrificio.
Las muestras así recolectadas fueron sometidas a la extracción del ADN para
obtener su huella genética mediante la amplificación de los microsatélites
seleccionados. Los resultados fueron interpretados de tal manera que se
obtuvieron perfiles alélicos para las muestras de referencia y las coleccionadas
en los puntos de venta o muestras problema. Para establecer el origen de la
carne, se compararon los perfiles alélicos de las muestras problema con los de
las muestras de referencia, para determinar si ambas huellas genéticas fueron
idénticas o no.
16
DNA
Tejido
DNA Sangre
Huella genética
muestras de musculo (carne)
Microsatélites
Figura 1.Esquema general del sistema de trazabilidad molecular
propuesto
17
CONCLUSIONES Y PERPECTIVAS
En este estudio se evaluaron 11 microsatélites en muestras de sangre y
músculo de bovino para ser evaluados por su poder de discriminación en un
sistema de trazabilidad molecular. Se obtuvieron entre 4 y 19 alelos con
tamaños de fragmentos en los rangos de pares de bases anteriormente
reportados para estos microsatélitles. Asímismo se encontró que las huellas
genéticas obtenidas de las muestras de carne en los puntos de venta y
matadero coincidieron para todos los marcadores propuestos en el estudio.
El marcador BM2113 mostró el mayor contenido de información
polimórfica (PIC) con un valor de 84.2. Por otro lado, el marcador BM1824
mostró el menor contenido de información con un valor de 65.2, por lo que fue
el marcador menos informativo para las razas sintéticas evaluadas. Además se
obtuvo una MP de 1.149X10-11 para los 11 marcadores evaluados. Aunque
todos los marcadores evaluados aportaron información útil para la
discriminación de las muestras, la trazabilidad molecular de la carne de bovino
de las razas bajo estudio podría llevarse a cabo con 7 marcadores
seleccionados (BM2113, TGLA53, INRA023, ETH225, TGLA122, TGLA227,
ETH3) en base a su mayor PIC (MP de 10-8 ).
18
Finalmente, el sistema de trazabilidad molecular establecido demostró
ser útil para determinar el origen de la carne. La verificación de la trazabilidad
por medio de la huella genética podría ser una herramienta muy útil para la
comercialización de la carne de Sonora con calidad diferenciada.
19
Capítulo 2
Review: Authentication and Traceability of Foods from Animal Origin by PCR-Based Capillary Electrophoresis
Articulo enviado y aceptado en la revista Analytica chimica Acta
20
Review: Authentication and Traceability of Foods from Animal Origin by 1
PCR-Based Capillary Electrophoresis 2
Roberto Rodríguez-Ramírez, Aarón F. González-Córdova & Belinda 3
Vallejo-Cordoba* 4
5
Laboratorio de Calidad, Autenticidad y Trazabilidad de los Alimentos 6
Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. (CIAD) 7
Carretera a La Victoria Km 0.6, Apartado 1735 8
Hermosillo, Sonora, 83304. Mexico 9
E-mail addresses: [email protected] [email protected] 10
Corresponding author: Belinda Vallejo-Cordoba 12
Phone: +52 (662) 289-2400 Local 303 13
Fax: +52 (662) 280-0421 14
E-mail address: [email protected] 15
16
Key words: food authentication and traceability, food DNA, capillary 17
electrophoresis 18
19
Manuscript submitted to the Editor of Analytica Chimica Acta for evaluation. 20
October, 2010 21
21
Abstract 22
This work presents an overview of the applicability of PCR-based capillary 23
electrophoresis (CE) in food authentication and traceability of foods from animal 24
origin. Analytical approaches for authenticating and tracing meat and meat 25
products and fish and seafood products are discussed. Particular emphasis will 26
be given to the usefulness of genotyping in food tracing by using CE-based 27
genetic analyzers. 28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
22
1.- Introduction 43
The strategic development of a food chain approach to food quality and safety 44
must be considered within a global context that is constantly evolving in terms of 45
normative and requirements. Particularly, food control has switched to a more 46
integrated and preventive approach demanded by food trade globalization [1]. In 47
this context, food traceability main drivers are food safety/risk management and 48
authentication to prevent fraudulent labeling and to certify the origin of products 49
in the market. 50
Traceability emerged as a “watch-word” for consumer and regulatory confidence 51
with respect to food quality and food safety along the supply chain from 52
production, processing and retailing from the point of origin to the point of sale 53
[2]. On the other hand, authenticity of a food product is essentially defined by 54
legally recognized descriptions that concern its characteristics (quality, origin, 55
process, etc.) [3]. Food authentication, which is part of food traceability, consists 56
in the identification of food components to verify compliance with food labeling to 57
prevent economic fraud. With respect to traceability along the full supply chain of 58
foods of animal origin, several aspects are of importance. They shall, if possible, 59
give information on animal species, origin, authenticity, composition, age and 60
production systems [4]. Consequently, it is necessary to have reliable methods, 61
which allow fast and unequivocal information related to these issues. 62
23
In recent years, growth in food authentication methods based on DNA analysis 63
was due to the public health concern associated with the BSE (bovine 64
spongiform encephalopathy) crisis [5]. The greatest amount of research on the 65
application of the polymerase chain reaction (PCR) for the authentication of food 66
samples involves the analysis of meat and meat-based products [5]. DNA-based 67
techniques are preferred since DNA is a persistent molecule during food 68
processing and can retain sequence specific information retrievable by a simple 69
amplification reaction [6]. In fact, an overview of PCR-based methods with 70
numerous applications for animal species identification was published in 2008; 71
however, most applications included conventional gel electrophoresis [7]. On the 72
other hand, the combined use of molecular techniques together with CE take 73
advantage of the high specificity and sensitivity of the former and the high 74
resolving power and automation of the later. 75
It has been in the last decade that applications of PCR-based capillary 76
electrophoresis (CE) in foods analysis have increased substantially. PCR-based 77
CE for meat species identification, food borne pathogens and genetically 78
modified organisms (GMO) were first reviewed in 2004 and 2005 [8,9]. Later, 79
updates on the analysis of DNA by CE were presented in reviews on the 80
application of capillary electromigration methods for the identification of 81
foodborne pathogens, GMO and wine authenticity [10-12]. Although in these 82
reviews [10-12], several applications of PCR-based CE methods were 83
24
addressed; their focus was mainly on foods of plant origin and foodborne 84
pathogens and not on foods of animal origin. Authenticity and traceability of 85
foods of animal origin such as meat and meat products and fish and seafood are 86
extremely important since these are highly priced foods that are often 87
susceptible to adulteration. Therefore, in this review, special emphasis will be 88
given to the analysis of authenticity and traceability issues dealing with food 89
products of animal origin by PCR-based CE methods. 90
91
2.- Authenticating and tracing particular foods 92
The first critical step in the development of PCR-based electrophoretic methods 93
relies on DNA extraction and purification from food samples since it requires 94
stringent protocols [13]. To this end, the influences of DNA extraction methods 95
and PCR inhibitors on efficient recovery of nucleic acids from foods were 96
reported [14, 15]. As a result, these studies highlighted the importance of 97
selecting appropriate extraction and purification strategies depending on food 98
composition before CE could be carried out. 99
The next critical step is PCR amplification which in its simplest form consists in 100
the amplification of one fragment followed by electrophoresis [7]. Other more 101
discriminatory techniques consist in the analysis of digested fragments by 102
restriction endonucleases (PCR-RFLP), fragment analysis by sequencing 103
technologies, simultaneous amplification of two or more fragments with primer 104
25
pairs (multiplex PCR) and the analysis of single strand conformation 105
polymorphisms (PCR-SSCP), random amplified polymorphic DNA (RAPD) and 106
single sequence repeats (SSR), also known as microsatellites [7]. Also, several 107
food DNA-based analyses were carried out in microchips with the purpose of 108
making the analysis automated [16]. 109
Finally, because DNA fragments of different sizes have constant charge to mass 110
ratios, separations by CE have been carried out in uncoated capillaries with 111
different water soluble polymers used in run buffers for providing a sieving effect 112
and laser induced fluorescence (LIF) detection [17]. 113
114
2.1.- Foods of animal origin 115
2.1.1.- Meat and meat products 116
Consumer concerns over food safety issues such as traceability of animal origin 117
and authenticity of meat products are driving the requirement for reliable 118
analytical methods [18]. DNA-based techniques offer the greatest potential 119
because DNA is stable and not tissue dependent [18]. In 2005, a review on 120
analytical developments on meat authentication reported only two PCR CE-121
based applications [17]. Therefore, although the potential of CE in food analysis 122
and food authentication was recognized, its application to meat and meat 123
products was limited [17]. Today, PCR-based CE analytical methods of meat 124
and meat products are scarce, with greatest increase shown on meat 125
26
authentication [19-24] and meat traceability using CE-based sequencers [25, 27-126
29]. 127
The first important issue to be addressed in the analytical process is the quality 128
and quantity of DNA since cooking, storing and processing of meat and meat 129
products may affect its integrity. Therefore, the quality and quantity of DNA 130
isolated from samples cooked with temperatures ranging from 75 to 100 °C was 131
studied [18]. Cooking meat to high temperatures resulted in a reduced overall 132
DNA yield and probable fragmentation of DNA to sizes lower than 800 bp. In this 133
work, nuclear DNA fragments of sizes larger than 150 bp from muscle samples 134
cooked to internal temperatures of up to 100 ºC were successfully amplified. 135
This test was promising for traceability applications in cooked meat by 136
examining nuclear microsatellites and other markers. According to these 137
authors, this might permit traceability of cooked meat to the individual animal 138
level, which was not possible with mitochondrial DNA sequences [18]. 139
On the other hand, most researchers focused on mitochondrial DNA PCR 140
assays for meat authentication since it was easier to amplify mitochondrial 141
genes from degraded DNA samples because of their greater copy number [18]. 142
However, species-specific primers could not be designed when species were 143
very closely related. In these cases, it was advisable to apply techniques such 144
as PCR-RFLP which were based on the analysis of single species-specific 145
mutations (site of diagnosis). To this end, the use of mitochondrial universal 146
27
cytochrome b (cyt b)-targeted primers in PCR-RFLP assays revealed the 147
existence of a complex restriction pattern in three genetically-unrelated Iberian 148
cows, this being due to the simultaneous co-amplification of two 359 bp cyt b 149
fragments. The new co-amplified fragment was sequenced and exhibited a high 150
homology with mitochondrial sequences previously described for other cattle 151
specimens [19]. Therefore, the results of this work showed that food 152
authentication studies by PCR-RFLP analysis might be complicated in the case 153
of cattle since there was co-amplification of two different cyt b fragments [19]. 154
Also, the suitability of terminal restriction fragment length polymorphism (T-155
RFLP) for identifying meat animal species was assessed [20]. In this study, the 156
mitochondrial 12S rRNA gene was PCR amplified with fluorescent-labeled 157
primers in 12 common economically important animal species (pig, cattle, goat, 158
sheep, horse, chicken, salmon, deer, buffalo, sturgeon, turkey and dog). PCR 159
products were digested with restriction endonucleases and only the terminal 160
restriction fragment containing a labeled primer with a fluorescent dye was 161
detected on a CE system ABI 3130 [20]. 162
In T-RFLP analysis, the fluorescent-labeled terminal fragments were separated 163
on a high-resolution CE system using a 50 cm capillary and the POP6TM polymer 164
from Applied Biosystems. The sizes of the fluorescent-labeled terminal 165
fragments were assessed using a size standard and a specific software [20]. 166
These automated systems could provide a digital output that yielded more 167
28
accurate and objective results than PCR-RFLP. Furthermore, T-RFLP usually 168
analyzed one or two band(s) patterns since only fluorescent-labeled terminal 169
fragments could be detected. In contrast, PCR-RFLP produced a multiple band 170
pattern that might lead to variable results [20]. According to these authors, the 171
main limitation of PCR-RFLP was the difficulty in accurately estimating the 172
fragment length due to the limited resolving power of gel electrophoresis and the 173
DNA markers commonly used. However by using CE sequencers this problem 174
was avoided [20]. 175
Although PCR-RFLP was useful for meat species identification purposes and its 176
applicability had gone from the gel to the capillary format [20], to meet the 177
demands for miniaturization of analytical instruments, the microchip-based CE 178
technology was also tested for this purpose [21]. In consequence, a lab-on-chip 179
technology was established by assembling and adapting previous PCR-RFLP 180
techniques developed on the mitochondrial 12S rRNA gene for the identification 181
of different game and domestic meat species [21]. 182
A conserved fragment of approximately 720 bp from genomic DNA was 183
amplified from meats of red deer, fallow deer, roe deer, chamois, mouflon, 184
pyrenean ibex, goat, sheep, cattle and swine species, and subsequent 185
enzymatic digestions of the amplicons were carried out for meat differentiation. 186
The visualization of fragment profiles was carried out using a DNA 1000 187
LabChip with the Agilent 2100 lab-on-a-chip system. The DNA1000 LabChip 188
29
allowed good discrimination of DNA fragments ranging from 25 to 1000 bp, 189
which were detected using a fluorescent DNA-binding dye and laser-induced 190
fluorescence; fragment sizing was achieved by comparison to DNA size 191
markers. These authors showed that identification of the ten game and domestic 192
meats studied using the Agilent 2100 Bioanalyzer was feasible and provided an 193
improvement on PCR-RFLP fragment resolution and detection in comparison 194
with the conventional method using agarose gels [21]. Furthermore, by using the 195
DNA1000 LabChip, up to 12 samples could be tested in a single run, taking 1-2 196
h from start to finish [21]. 197
For closely related species and when several species have to be differentiated 198
simultaneously, the use of many restriction enzymes and analysis of more than 199
one diagnosis site make PCR-RFLP difficult to automate. Therefore, other 200
techniques such as sequencing were suggested. An assay for species 201
identification of game meats from roe and red deer, steinbock and chamois was 202
developed based on a minisequencing reaction and capillary electrophoresis of 203
a conserved fragment from the mtDNA cyt b gene [22]. The minisequencing test 204
was as precise and reliable as the sequencing test; moreover, it had the 205
advantage of being quicker allowing immediate interpretation of results. 206
The main benefit of the minisequencing strategy was the use of a mutation 207
analysis protocol based on a common procedure, irrespective of the mutations 208
involved. The assay was also intended to enable the differentiation between 209
30
these wild meats and those from buffalo, sheep, goat, cattle and swine domestic 210
species, which could be sold in place of more expensive venison meat [22]. 211
Accordingly, minisequencing products were electrokinetically injected and 212
electrophoresed in a 47 cm length capillary column using the POP-4 polymer 213
from Applied Biosystems in a CE-based sequencer ABI 310 Genetic Analyzer 214
and all results from the multiplex PCR test were confirmed by fragment 215
sequencing. As an example of the high resolving power of this technique, 216
species-specific patterns observed for the different nine species showing six 217
peaks for red deer, roe deer, steinbock, chamois, goat and sheep, five peaks for 218
buffalo and three peaks for swine and bovine were shown in Figure 1. The 219
assay allowed the possibility of discriminating nine species at the same time 220
[22]. 221
Although, the application of the above test was simple and straightforward for 222
the analysis of animal tissues, the analysis of meat mixtures was problematic. In 223
contrast, the non-coding mtDNA control region (CR), also called d-loop region in 224
vertebrates had a higher mutations rate than the other mitochondrial coding 225
regions. Therefore, sequence data from the CR were more effective than cyt b 226
and other mitochondrial coding regions for the identification of closely related 227
species [23]. Therefore, the analysis of mtDNA CR length polymorphism was 228
applied to the molecular identification of mammalian species when the DNA of 229
several species was present in a mixture. In this study, the DNA from 18 species 230
31
of mammals was experimentally combined in order to produce templates with 231
mixtures of two or three species [23]. A single universal primer pair was then 232
used to amplify a portion of the left domain of the CR and the size of the 233
resulting PCR products were compared with the expected sizes of homologous 234
DNA sequences from reference databases [23]. Amplicons were separated and 235
visualized either on agarose gels or using CE in a Genetic Analyzer ABI Prism 236
310 capillary system. However, CE was more appropriate for resolving such 237
complex mixtures, since its higher sensitivity allowed detection of minor 238
components within the mixtures that were not visible on agarose gels [23]. 239
In addition to animal species identification, to discriminate between Japanese 240
(domestic) and Australian (imported) beef, DNA markers were analyzed by 241
PCR-RFLP [24]. According to these authors, the probability of identifying 242
Australian beef was 0.93 and the probability of misjudgment was 0.017 using six 243
selected markers [24]. 244
Finally, perhaps the most important application of PCR-based CE methods for 245
meat and meat products authentication was related to tracing a particular meat 246
product back to the animal from where it came from. Traceability systems 247
usually revolved around devices that were attached to an animal such as ear 248
tags or to a piece of meat such as labels. However, because DNA was unique to 249
an individual, it was a useful tool for proof of identity and/or audit in meat 250
traceability systems [25]. Matching between the DNA profiles of the two 251
32
samples meant that the declared origin of the meat was correct or not [25]. Any 252
DNA-based traceability system required that reference samples were available 253
from any animal for which traceability might be required, and that these 254
reference samples were stored in a way that they could be easily accessed. 255
When a DNA sample was taken from a test item, the test and reference samples 256
were assayed for a set of genetic markers [25]. The simplest relationship to test 257
was that the samples were from the same individual i.e., a test for identity [25]. 258
For this purpose, usually microsatellite or short tandem repeats (STR) were 259
analyzed by capillary electrophoresis-based genetic analyzers either one 260
capillary or multi-capillary systems [26-28]. 261
Analysis for meat traceability started with DNA extraction from the meat of 262
individual animals by different isolation protocols [26-29]. Then, PCR products of 263
microsatellite markers, which were those recommended by the International 264
Society for Animal Genetics (ISAG) for cattle parentage testing, were analyzed 265
by capillary electrophoresis-based genetic analyzers and the resulting profiles 266
were interpreted by a software available with the instrument [26-28]. Also, 267
genetic traceability of European wild boars and Iberian and Duroc pigs based on 268
the identification of mitochondrial markers was carried out by a capillary 269
electrophoresis-based genetic analyzer [29]. 270
One of the microsatellite primers was labeled with a fluorescent dye that 271
enabled detection of the resulting PCR product following amplification. PCR 272
33
products were separated by size and dye color using electrophoresis followed 273
by laser-induced fluorescence with multiwavelength detection. An internal 274
standard, containing DNA fragments of known size and labeled with a different 275
dye color, was typically electrophoresed with each sample to calibrate sizes 276
from run to run and separations were carried out with commercially available 277
polymers such as POP-4 as a sieving matrix [30]. 278
Cattle meat traceability studies mainly differed on the number of microsatellites 279
used, optimization of PCR conditions aiming at carrying out multiplex reactions 280
and sample type [26-28]. In general, the DNA marker system used should be 281
powerful enough so that matching a test to a reference sample from an 282
individual other than its correct source is rare. In fact, the best panel of 283
microsatellites might differ according to the breed [26]. In one study, 21 284
microsatellites were tested for breed identification in four native Italian beef 285
breeds with the purpose of assigning individuals to the breed of origin for quality 286
certification of livestock production [27]. The marker sets with the highest gene 287
diversity were shown to perform best and only 52.5% of the genotypes were 288
correctly allocated. As a result, the same group evaluated 12 microsatellites in 289
six Italian cattle breeds aiming at reducing the costs of the analysis but 290
considering genetic differentiation among them [28]. These authors found that a 291
set of 8 microsatellites showed reliable results [28]. Moreover, microsatellite 292
genotyping was also useful as a potential tool for DNA-based tracing ground 293
34
beef mixtures prepared from less than 10 individuals [25]. These authors 294
concluded that genotyping of mixtures became less effective as the number of 295
individuals represented in the mixture increased [25]. 296
297
2.1.2.- Fish and seafood products 298
There is an increasing requirement for traceability of fish and fish products, both 299
for consumer protection and for regulatory enforcement, in particular with 300
respect to illegal, unreported and unregulated (IUU) fishing [31]. Also, the illegal 301
mislabeling of fish and seafood species can have detrimental effects on both the 302
industry and the consumer. To prevent these problems, which include economic 303
fraud and health hazards, a research priority has been the development of fish 304
species authentication methods that are reliable and rapid [32]. Consequently, a 305
variety of DNA-based techniques were developed, including multiplex PCR, 306
PCR-RFLP, PCR-RAPD, PCR-AFLP, PCR-SSCP and FINS (Forensically 307
informative nucleotide sequencing), which were based on genetic 308
polymorphisms in the genetic codes of different species [32]. Most DNA-based 309
methods for fish species identification consisted in the amplification of 310
mitochondrial DNA, although nuclear DNA markers were also examined, with 311
the most prominent being the mitochondrial gene cyt b [7, 31-35]. 312
Authentication of fish and seafood species by DNA-based techniques was the 313
topic of various reviews [7, 32-35]. According to a 2009 review on molecular 314
35
identification methods of fish species identification, most of the 153 studies 315
reported mainly focused on three methods: PCR-RFLP, PCR-sequencing and 316
PCR-specific primers, while PCR-SSCP, PCR-RAPD, PCR-DGGE, PCR-AFLP, 317
and cloning and sequencing had barely been used [35]. While most of these 318
methods used conventional gel electrophoresis, among PCR-sequencing 319
methods, PCR-based CE was used the most for fish and seafood species 320
identification [36-44]. Reports related to this subject previous to 2005 were 321
reviewed by others [7, 32-34], thus this overview only includes from 2005 to 322
date. Another format of PCR-based CE used for fish species authentication was 323
using lab-on-a-chip technology [45-46]. 324
The most direct means of obtaining information from PCR products was 325
by sequencing [34]. Therefore, information obtained had been used to identify 326
various fish [36-42] and mollusks [43-44]. A multiplex primer-extension (PER) 327
assay for the differentiation of the five major tuna species (Thunnus alalunga, 328
Thunnus albacares, Thunnus obesus, Thunnus thynnus and Katsuwonus 329
pelamis) was developed. This technique was based on the simultaneous 330
analysis of four diagnosis sites included in a fragment of mtDNA-cyt b amplified 331
by PCR. Then, fluorescently labeled primers with different dyes allowed the 332
identification of the specific diagnosis sites by using a CE-based genetic 333
analyzer equipped with a 47-cm capillary column and using POP 4 polymer as 334
the run buffer [36]. A species specific patterns observed in five raw tuna 335
36
samples is presented in Figure 2. The applicability of the multiplex PER assay to 336
commercial canned tuna samples was demonstrated. In fact, it was possible to 337
confirm the species indicated in the label for eleven samples as well as to 338
establish the fish species for the nineteen samples whose label brought the 339
general indication “tuna”. All of the results of the multiplex PER test were 340
confirmed by fragment sequencing [36]. 341
Forensically informative nucleotide sequencing (FINS) was carried out by 342
amplifying a specific gene fragment from mitochondrial cyt b, its nucleotide 343
sequence was determined by a CE-based genetic analyzer and the sequence 344
was compared to related sequences in a database using phylogenetic analysis. 345
CE conditions for FINS were those recommended by the genetic analyzer 346
manufacturer which for most cases was Applied Biosystems. To this end, seven 347
species of the genus Lophius or anglerfish were successfully identified by FINS 348
[37]. Also, a method for the authentication of scombroid products, from fresh fish 349
to canned products was developed by means of FINS. This technique was used 350
as a routine method for the detection of mislabeling in the marketing of 351
scombroid species and was also suitable for the assessment of seafood 352
traceability of these products [38]. In this sense, FINS was tested on all kinds of 353
processed products, including those undergoing intensive processes of 354
transformation such as salmon, trout and bream [38] or hake species [39]. 355
37
While sequencing techniques were considered the most direct way for 356
obtaining a large amount of information, they suffer from a limited number of 357
reference sequences for comparisons. Two decades after the development of 358
FINS, improved technology such as barcoding resulted in faster and more 359
affordable sequencing capabilities. The major goal of barcoding was to provide 360
molecular identification of organisms using a standardized short highly variable 361
DNA region (barcode) and to create a special database that would be more 362
taxonomically accurate [32, 35]. Recently, DNA barcoding gained support as a 363
rapid, cost-effective and broadly applicable molecular diagnostic technique and 364
was tested against real market samples in North American seafood. The 365
database generated was able to provide matches of > 97% sequence similarity 366
and to show 25% of the samples as potentially mislabeled [41]. Similarly, a DNA 367
barcoding approach used for identifying species substitutions cases in shark 368
species allowed the recognition of commercial frauds in the trade of “palombo” 369
(that is referred to the triakiids Mustelus mustelus and Mustelus asterias for the 370
Italian regulation) [42]. 371
Finally, other DNA-technologies such as microfluidic-based lab-on-a-chip 372
from the Agilent 2100 Bioanalyser that incorporated conventional CE was used 373
for fish species identification by simplifying an existing PCR-RFLP approach 374
[45]. The Labchips used by the system were small (3 cm2), disposable, single-375
use units containing etched capillaries attached directly to sample loading wells. 376
38
DNA fragments were separated by CE and detected using laser-induced 377
fluorescence by the Bioanalyzer. The use of this system allowed the 378
simultaneous post-digest analysis of 12 samples in less than 40 min, which was 379
a considerable time reduction compared to conventional gel-based methods. 380
Using DNA admixtures, the discrimination of 5% salmon DNA in trout DNA was 381
readily achieved. [45]. Moreover, the identification of ten species of white fishes, 382
was achieved using PCR-RFLP of the mitochondrial cyt b gene. End-point 383
analysis enabled accurate sizing of DNA fragments and identification of fish 384
species at a level of 5% (w/w) in a fish admixture [46]. 385
386
3.- Concluding remarks and future outlook 387
Although DNA-based methods for traceability and authentication of foods from 388
animal origin have been constantly explored and there were many reports of 389
their applications on meat and meat products and fish and seafood products, 390
there were not as many developments using capillary electrophoresis, except for 391
those using CE-based genetic analyzers and microchips. Since traceability and 392
most authentication issues related to foods of animal origin are complex and 393
there is an increasing demand for testing, mainly for food safety reasons, it is 394
anticipated that more and more lab-on-a-chip platforms and the use of capillary 395
array electrophoresis-based genetic analyzers may gain popularity. 396
397
39
4.- Acknowledgements 398
The technical assistance of Maria del Carmen Estrada Montoya and Alfonso 399
Aguilar Valenzuela were gratefully acknowledge. 400
401
402
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418
40
5.- References 419
[1] Turci, M.L.S. Sardaro, G. Visioli, E. Maestri, M. Marmiroli, N. Marmiroli, Food 420
Control, 21 (2010) 143. 421
[2] A. Furness, K.A. Osman, in: M. Lees (Ed.), Food Authenticity and 422
Traceability, CRC Press, Boca Raton, FL, 2003, pp. 473-479. 423
[3] G. Le Gall, I.J. Colquhoun, in: M. Lees (Ed.), Food Authenticity and 424
Traceability, CRC Press, Boca Raton, FL, 2003, pp. 131-155. 425
[4] F. Schwägele, Meat Sci., 71 (2005) 164. 426
[5] L.M. Reid, C.P. O'Donnell, G. Downey, Trends Food Sci. Tech., 17 (2006) 427
344. 428
[6] A. Pirondini, U. Bonas, E. Maestri, G. Visioli, M. Marmiroli, N. Marmiroli, Food 429
Control, 21 (2010) 663. 430
[7] I. Mafra, I. Ferreira, M. Oliveira, Eur. Food Res. Technol., 227 (2008) 649. 431
[8] V. García-Cañas, R. González, A. Cifuentes, Trac-Trend Anal. Chem., 23 432
(2004) 637. 433
[9] F. Kvasnicka, J. Sep. Sci., 28 (2005) 813. 434
[10] V. García-Cañas and A. Cifuentes, Electrophoresis 28 (2007) 4013. 435
[11] V. García-Cañas, A. Cifuentes, Electrophoresis, 29 (2008) 294. 436
[12] M. Herrero, V. García-Cañas, C. Simo, A. Cifuentes, Electrophoresis, 31 437
(2010) 205. 438
41
[13] B. Vallejo-Cordoba, M.G. Vargas Martínez, in: J.P. Landers, (Ed.) 439
Handbook of Capillary and Microchip Electrophoresis and Associated 440
Microtechniques, CRC Press, Boca Raton, FL, 2008, pp 853-912. 441
[14] A. D. Pinto, V. Forte, M. C. Guastadisegni, C. Martino, F. P. Schena and G. 442
Tantillo, Food Control 18 (2007) 76. 443
[15] T. Demeke, G. Jenkins, Anal. Bioanal. Chem., 396 (2009) 1977. 444
[16] A. Escarpa, M.C. González, M.A.L. Gil, A.G. Crevillén, M. Hervás, M. 445
García, Electrophoresis, 29 (2008) 4852. 446
[17] B. Vallejo-Cordoba, A.F. González-Córdova, M.A. Mazorra-Manzano, R. 447
Rodríguez-Ramírez, J. Sep. Sci., 28 (2005) 826. 448
[18] O. Aslan, R.M. Hamill, T. Sweeney, W. Reardon, A.M. Mullen, J. Anim. Sci., 449
87 (2009) 57. 450
[19] M. Prado, P. Calo-Mata, T.G. Villa, A. Cepeda, J. Barros-Velázquez, Food 451
Chemistry, 105 (2007) 436. 452
[20] Q. Wang, X. Zhang, H.-Y. Zhang, J. Zhang, G.-Q. Chen, D.-H. Zhao, H.-P. 453
Ma, W.-J. Liao, Meat Sci. 85 (2010) 265. 454
[21] V. Fajardo, I. González, J. Dooley, S. Garret, H.M. Brown, T. García, R. 455
Martín, J. Sci. Food Agr., 89 (2009) 843. 456
[22] F. La Neve, T. Civera, N. Mucci, M.T. Bottero, Meat Sci. 80 (2008) 216. 457
[23] K.-M. Pun, C. Albrecht, V. Castella, L. Fumagalli, Electrophoresis, 30 (2009) 458
1008. 459
42
[24] S. Sasazaki, H. Mutoh, K. Tsurifune, H. Mannen, Meat Sci. 77 (2007) 161. 460
[25] G.H. Shackell, H.C. Mathias, V.M. Cave, K.G. Dodds, Meat Sci. 70 (2005) 461
337. 462
[26] L. Orrú, F. Napolitano, G. Catillo, B. Moioli, Meat Sci. 72 (2006) 312. 463
[27] C. Dalvit, M. De Marchi, R. Dal Zotto, M. Gervaso, T. Meuwissen, M. 464
Cassandro, Meat Sci. 80 (2008) 389. 465
[28] C. Dalvit, M. De Marchi, C. Targhetta, M. Gervaso, M. Cassandro, Food 466
Res. Int., 41 (2008) 301. 467
[29] E. Alves, A.I. Fernández, A. Fernández-Rodríguez, D. Pérez-Montarelo, R. 468
Benitez, C. Ovilo, C. Rodríguez, L. Silió, Animal, 3 (2009) 1216. 469
[30] J.M. Butler, E. Buel, F. Crivellente, B.R. McCord, Electrophoresis, 25 (2004) 470
1397. 471
[31] R. Ogden, Fish Fish., 9 (2008) 462. 472
[32] R.S. Rasmussen, M.T. Morrissey, Compr. Rev. Food Sci. F., 7 (2008) 280. 473
[33] R.S. Rasmussen, M.T. Morrissey, Compr. Rev. Food Sci. F., 8 (2009) 154. 474
[34] L. Asensio Gil, Trends Food Sci. Tech., 18 (2007) 558. 475
[35] F. Teletchea, Revi. Fish Biol. Fisher., 19 (2009) 265. 476
[36] M.T. Bottero, A. Dalmasso, M. Cappelletti, C. Secchi, T. Civera, J. 477
Biotechnol., 129 (2007) 575. 478
[37] M. Espiñeira, N. González-Lavín, J.M. Vieites, F.J. Santaclara, J. Agr. Food 479
Chem., 56 (2008) 10594. 480
43
[38] M. Espiñeira, N. Gonzalez-Lavín, J.M. Vieites, F.J. Santaclara, Food 481
Chem., 117 (2009) 698. 482
[39] M. Espiñeira, J. Vieites, F. Santaclara, Eur. Food Res. Technol., 229 (2009) 483
785. 484
[40] M. Pelarez, P. Presa, J. Agr. Food Chem., 56 (2008) 10865. 485
[41] E.H.K. Wong, R.H. Hanner, Food Res. Int., 41 (2008) 828. 486
[42] M. Barbuto, A. Galimberti, E. Ferri, M. Labra, R. Malandra, P. Galli, M. 487
Casiraghi, Food Res. Int., 43 (2010) 376. 488
[43] F.J. Santaclara, M. Espiñeira, A.G. Cabado, A. Aldasoro, N. Gonzalez-489
Lavin, J.M. Vieites, J. Agr. Food Chem., 54 (2006) 8461. 490
[44] M. Espiñeira, N. Gonzalez-Lavin, J.M. Vieites, F.J. Santaclara, J. Agr. Food 491
Chem., 57 (2009) 495. 492
[45] J.J. Dooley, H.D. Sage, H.M. Brown, S.D. Garrett, Food Control, 16 (2005) 493
601. 494
[46] J.J. Dooley, H.D. Sage, M.-A.L. Clarke, H.M. Brown, S.D. Garrett, J. Agr. 495
Food Chem., 53 (2005) 3348. 496
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498
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500
501
44
Figure Captions 502
503
Figure 1.- Species-specific patterns observed in nine meat samples using a 504
minisequencing reaction and capillary electrophoresis: A) red deer, B) steinbock, 505
C) chamois, D) goat, E) roe deer, F) sheep, G) cattle, H) swine and I) buffalo. 506
Redrawn from [22]. 507
508
Figure 2.- Species-specific patterns observed in five raw tuna samples using a 509
multiplex primer-extension (PER) assay and capillary electrophoresis: A) 510
Tunnus alalunga, B) Tunnus albacores, C) Tunnus obesus, D) Katsuwonus 511
pelamis and E) Tunnus thynnus. Redrawn from [35]. 512
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Capítulo 3
TRAZABILIDAD DE LA CARNE DE BOVINO: CONCEPTOS, ASPECTOS TECNOLÓGICOS Y PERSPECTIVAS PARA MÉXICO
Artículo publicado en la revista INTERCIENCIA OCT 2010, VOL. 35 Nº 10
48
TRAZABILIDAD DE LA CARNE DE BOVINO:
CONCEPTOS, ASPECTOS TECNOLÓGICOS Y
PERSPECTIVAS PARA MÉXICO
ROBERTO RODRÍGUEZ-RAMÍREZ, AARÓN F. GONZÁLEZ-CÓRDOVA, ANA
ARANA, ARMIDA SÁNCHEZ-ESCALANTE y BELINDA VALLEJO-CORDOBA
RESUMEN
La trazabilidad de la carne de bovino es de gran importancia para la seguridad alimentaria, ya que garantiza su identidad y rastreabilidad desde el origen hasta la comercialización. La traz- abilidad comienza con la identificación de los animales; sin em- bargo, los marcadores clásicos, aunque necesarios, son removi- dos durante el sacrificio. Por otro lado, los métodos que utilizan marcadores moleculares, basados en el perfil del ADN, son per- manentes y únicos. Por ello, en un sistema de trazabilidad para
la carne es conveniente que ambos métodos se complementen para asegurar el seguimiento del producto en toda la cadena productiva. En esta revisión se plantea un panorama general de conceptos y aspectos tecnológicos de la trazabilidad de la carne de bovino, se describen los principales métodos utilizados para la trazabilidad, incluyendo la selección y evaluación de marca- dores moleculares, y se presentan las perspectivas de la trazabi- lidad en diferentes países, enfatizando el caso de México.
as distintas crisis relacio- nadas con alimentos ocu- rridas en las últimas dos
décadas han despertado una preocupación generalizada en las condiciones de produc- ción y comercialización de los alimentos. En el caso particular de la carne (Pettitt, 2001; Felmer et al., 2006), la posible vincu- lación de enfermedades fatales en el hom- bre como la encefalopatía espongiforme bo- vina (EEB), también conocida como “mal de las vacas locas”, la encefalopatía espon- giforme ovina (scrapie por sus siglas en in- glés), la fiebre aftosa (bovinos, porcinos, caprinos y ovinos), la peste porcina clásica
(PPC), y en fechas recientes la influenza porcina, han generado la mayor crisis de desconfianza registrada en la historia de la industria cárnica. Aunado a esto, dichas cri- sis podrían ser intensificadas debido a la presencia de residuos de sustancias peligro- sas en los productos cárnicos, tales como hormonas y agentes anabolizantes (Estrada- Montoya et al., 2008), antibióticos (Sofos, 2008) y pesticidas (Sallam y Ali Morshedy, 2008), entre otros. Debido a la facilidad con la que estos problemas se han diseminado entre países, y a la complejidad para esta- blecer sistemas de control y/o prevención (Pettitt, 2001; Felmer et al., 2006), se ha
generado una gran alarma en los consumi- dores que esperan obtener productos de ca- lidad e inocuos para la salud.
De las experiencias ad- quiridas a partir de los brotes de EEB en la Unión Europea (UE) y en los EEUU en 1986 y 2003, respectivamente; así como de la detección de E. coli cepa O157:H7 ente- ro-hemorrágica en carne molida en los EEUU en 1982 (Sofos, 2008), solo por ci- tar algunos ejemplos, se evidenció la impe- riosa necesidad de establecer procedimien- tos de identificación y seguimiento indivi- dual de los animales destinados al consu- mo humano, para así rastrear este tipo de
PALABRAS CLAVE / ADN / Huella Genética / Identificación Animal / Marcadores Moleculares / Trazabilidad /
Recibido: 21/01/2010. Modificado: 18/09/2010. Aceptado: 20/09/2010.
Roberto Rodríguez Ramírez. Químico Biólogo en Tecnología de Alimentos, Universidad de
Sonora, México. Maestro en Ciencia y Candidato a Doctor en Ciencias, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C.
(CIAD), México.
Aarón Fernando González-Córdova. Ingeniero Bioquímico en Alimentos, Instituto Tecnológico
de Monterrey, México. Candidato a Doctor en Ciencias en Alimentos, Instituto Tecnológico de Veracruz, México. Profesor Investiga-
dor, CIAD, México.
María Arana Navarro. Doctora en Genética y Mejora Animal, Universidad de Zaragoza, Es-
paña. Catedrática, Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos, Universidad Pública de Navarra, España.
Armida Sánchez-Escalante. Química Bióloga en Tecnología de Alimentos, Universidad de So-
nora, México. Doctora en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Universidad de Zaragoza, España. Maestra en Ciencias, CIAD, Méxi-
co. Profesora Investigadora, CIAD, México.
Belinda Vallejo-Cordoba. Química, Universidad Iberoamericana, México. Doctora en Ciencia de los Ali-
mentos, University of British Columbia, Canadá. Profesora Investigadora, CIAD, México. Dirección: Laboratorio de Calidad, Autenticidad y Tra-
zabilidad de los Alimentos, CIAD. Carretera a La Victoria Km. 0.6; Apartado 1735, Hermosillo, Sonora, 83000, México. e mail: [email protected]
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incidentes en la cadena de producción de alimentos. Para ello, las autoridades guber- namentales requieren de sistemas eficientes que les permitan identificar rápidamente y de forma confiable el origen de los alimen- tos implicados o sospechosos.
Estos procedimientos de- ben ser realizados mediante la aplicación de nuevas tecnologías adaptadas para dar respuestas en tiempos cortos, acordes a la modernización y globalización de los inter- cambios comerciales actuales. Lo anterior ha traído como consecuencia que hoy en día el término “trazabilidad” sea parte del lenguaje común en la cadena de produc- ción, industrialización y comercialización de los alimentos (Felmer et al., 2006).
Aunado a lo anterior, ac- tualmente los consumidores están prestando mayor atención a los aspectos de inocui- dad al momento de seleccionar o adquirir sus alimentos. De aquí que poder conocer la procedencia u origen de estos, sea rele- vante. Asimismo, la trazabilidad es indis- pensable para la comercialización de ali- mentos con valor añadido, como los que ostentan denominación de origen, identifi- cación geográfica de procedencia o marcas de calidad diferenciada (Arana et al., 2002; Dalvit et al., 2007).
Trazabilidad alimentaria
De acuerdo con la UE
(European Commission, 2002), la trazabili- dad o rastreabilidad se define como la posi- bilidad de encontrar y seguir el rastro, a través de todas las etapas de producción, transformación y distribución, de un ali- mento, pienso, animal destinado a la pro- ducción de alimentos o una sustancia, des- tinada a ser incorporada en alimentos o piensos, o con probabilidad de serlo.
De forma general, la tra- zabilidad es un conjunto de acciones, medi- das y procedimientos técnicos que permi- ten identificar y registrar cada alimento, desde su origen hasta el final de la cadena de comercialización. Así la trazabilidad fa- culta rastrear la cadena de producción y otorga a los productores la posibilidad de colocar sus productos en mercados más rentables, que exigen la certeza del origen y de las distintas etapas del proceso pro- ductivo (Felmer et al., 2006; Yordanov y Angelova, 2006). Todo esto indica que las empresas deben disponer de un sistema de gestión de calidad documentada que permi- ta identificar y realizar un seguimiento de los productos que entran, permanecen y sa- len de la empresa, de una manera ágil, rá- pida y eficaz, con la finalidad de que ante una crisis, puedan tomarse las medidas ne- cesarias; para dar respuesta, la empresa ali- mentaria dispone de una herramienta que es su sistema de trazabilidad.
Importancia de los sistemas de trazabilidad
Un buen sistema de traza- bilidad no solo es importante para la segu- ridad alimentaria y para la protección de la salud de los consumidores, sino que adicio- nalmente aporta beneficios a la industria procesadora que lo aplica. Es decir, sirve como un instrumento para lograr un eleva- do grado de protección de la vida y la sa- lud de los consumidores y facilita, dentro de la empresa, el control de procesos y los sistemas de gestión de calidad. Finalmente, brinda una oportunidad comercial para la diferenciación de productos por calidad asociada a marcas y/o denominaciones de origen (valor añadido) frente a los competi- dores (Arana et al., 2002; Dalvit et al., 2007). Orígenes de la trazabilidad
En la década de los no- venta, la trazabilidad surgió por primera vez en la Unión Europea con el objetivo principal de otorgar certeza y seguridad a los consumidores ante los problemas causa- dos, fundamentalmente, por la aparición de la EEB. Si bien la trazabilidad como un nuevo concepto de seguridad, surgió con mayor fuerza a partir de esta crisis, ya existían desde 1994, en el Reino Unido, sis- temas de aseguramiento de calidad cuyo objetivo era el de certificar que la carne producida en dicho país, se obtuviera bajo condiciones seguras, resguardando el bien- estar animal y la protección del medio am- biente (Schwägele, 2005).
En los EEUU, la trazabi- lidad surgió ante la necesidad de promocio- nar el consumo de carnes rojas, que había perdido terreno en los últimos años ante las crisis presentadas, y esto se hizo mediante la certificación de procesos de producción (Smith et al., 2005). En México, el interés se ha centrado en proteger la credibilidad hasta ahora ganada, frente a los comprado- res externos de carne de bovino. Normatividad y legislación de la trazabilidad para bovinos en la uE
Para lograr incrementar la transparencia de las condiciones de produc- ción y comercialización de la carne de bo- vino en la UE fue necesario aplicar y cum- plir irrestrictamente las normas en materia de identificación de animales destinados al consumo humano. La revisión de las direc- tivas de la UE realizada en 1997 estableció que cada uno de los países miembros de la Unión debería identificar individualmente a los animales por medio de aretes, así como llevar registros de las exportaciones, por medio del uso de pasaportes individuales
(European Commission, 1997). A partir de esta fecha también se estableció que los países miembros desarrollarían bases de datos con la información individualizada de los animales cuyo destino final fuera el consumo. Además, se adoptaron nuevas disposiciones relativas a la obligatoriedad de etiquetar y rastrear la carne (Reglamen- to EC/1760/2000) a lo largo de toda su ca- dena de distribución. Estas acciones tuvie- ron como objetivo primordial, recuperar la confianza de los consumidores por el con- sumo de carne y sus derivados (European Commission, 2000).
En el 2000, el llamado “Libro Blanco” sobre la seguridad alimen- taria de la Comisión Europea fue revisado. Derivado de esta revisión se concretaron los principios que regirían a la legislación alimentaría de la UE, para lograr elevados niveles de seguridad y la protección que los consumidores requerían (EC/178/2002; Eu- ropean Commission, 2002). El Libro Blan- co propuso un enfoque integral abarcando, “desde la granja hasta el consumidor”, con- siderando que la seguridad de los alimentos comienza por los animales y los alimentos que estos consumen. También se consideró la necesidad de establecer sistemas de tra- zabilidad que incluyeran la identificación de animales como uno de los requisitos princi- pales (Felmer et al., 2006; Dalvit et al., 2007).
En el Regla mento 176 0 /2000 de la UE (European Commis- sion, 2000) se estableció un sistema para la identificación y registro de los bovinos, y para el etiquetado de la carne de éstos y sus productos derivados. En este sistema se exigió que todo el ganado bovino y carnes frescas o congeladas derivadas fueran eti- quetados con un código de referencia que vinculara la carne con los animales de ori- gen, el país de sacrificio y de procesamien- to (sacrificio y/o despiece), así como los números de aprobación de los rastros y plantas de procesamiento (Felmer et al., 2006; Dalvit et al., 2007). El artículo 3 del EC/1760/2000 establece que un sistema de identificación y registro de bovinos debe contar con los siguientes elementos: a) are- tes o crotales para identificar a los anima- les individualmente; b) una base de datos computarizada; c) pasaportes para los ani- males; y d) registros individuales de cada operación (European Commission, 2000).
En enero de 2002 se pu- blicó el reglamento 178/2002, mediante el cual la UE estableció los principios y re- quisitos generales de la legislación alimen- taría, y dio lugar a la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaría (European Com- mission, 2002). En ese mismo año entró en vigencia la segunda fase de esta normativa, la cual exigía que el etiquetado proporcio- nara información del país de nacimiento
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del animal y de los lugares por los que este hubiera transitado. Además, se exigieron re- gistros actualizados de: vacunas, alimenta- ción y enfermedades, entre otros.
Aunque originalmente la legislación europea se enfocó solo al gana- do bovino, actualmente se está prestando atención a otro tipo de animales de consu- mo como ovejas y cabras, así como a otros sistemas alimentarios a los que es necesa- rio dar seguimiento bajo un esquema de trazabilidad alimentaría (European Com- mission, 2002). Cabe señalar que a partir de enero del 2005 y de acuerdo a la legis- lación contenida en el Libro Blanco de la Seguridad Alimentaria, la trazabilidad es de observancia obligatoria para la Unión Europea (Schwägele, 2005; Dalvit et al., 2007).
La trazabilidad de la carne de bovino en un contexto internacional
La mayoría de países que
exportan ganado bovino han adoptado un sistema de trazabilidad en respuesta, sobre todo, a las exigentes normas impuestas por la UE y Japón (Dalvit et al., 2007) para la importación de cortes de res. Así, la cade- na bovinos-carne ha sido el principal eje de las acciones de trazabilidad propiciadas por el intercambio comercial entre diferentes países (Smith et al., 2005). De esta mane- ra, no solamente la UE ha establecido siste- mas de trazabilidad para sus alimentos, sino que también otros países han imple- mentado sistemas de trazabilidad empezan- do con la identificación de animales desti- nados al consumo.
Australia inició trabajos en trazabilidad en 1999, con un sistema de cumplimiento voluntario que incluyó el uso de aretes para la identificación de ganado, etiquetas con códigos de barras para los ani- males sacrificados, así como la recolección de muestras de sangre de estos animales para obtener su huella genética a partir del ADN. Los resultados del análisis de las hue- llas de ADN fueron pieza fundamental para establecer la capacidad de rastreo e identifi- cación de los animales destinados al consu- mo, con el enfoque global “de la granja a la mesa” (Smith y Saunders, 2005). Actual- mente, la trazabilidad para bovinos desde el nacimiento hasta el sacrifico, es de carácter obligatorio en Australia.
En Canadá se establecie- ron sistemas de trazabilidad basados en la identificación de los animales por medio de registros electrónicos y manuales. Hoy en día la trazabilidad solo es obligatoria para la provincia de Quebec. Para países como Uruguay, Brasil, Argentina, Chile y México, donde el mercado de exportación de carne de bovino es importante, la traza- bilidad es obligatoria hasta el sacrifico de
los animales, mientras que para los EEUU, la trazabilidad es de carácter voluntario (Smith et al., 2005).
Por otro lado, en países del continente asiático como Japón y Co- rea, los sistemas de trazabilidad para la carne de bovino son muy estrictos, e inclu- yen el análisis del ADN para corroborar el rastreo del producto. En Japón se utiliza la identificación genética con muestras de ADN para confirmar la información de las bases de datos. En Corea enfatizan la “transparencia de la trazabilidad” también usando pruebas basadas en el ADN y con la instalación de kioscos electrónicos en los supermercados, que permiten a los consu- midores utilizar computadoras en las cuales pueden ingresar el código de barras del pa- quete del corte de carne, para conocer toda la información relacionada con el programa de trazabilidad (Smith y Saunders, 2005). Importancia de establecer sistemas de trazabilidad en México
El sector bovinos-carne de México genera anualmente alrededor de 1,5×106ton de carne, con las que se abaste- ce el mercado interno y se cumple con los compromisos de exportación. A nivel na- cional, los cinco principales estados pro- ductores de carne de bovino (58,7% del to- tal de la producción) son Veracruz, Jalisco, Chiapas, Sonora y Chihuahua (Luna Martí- nez y Albarrán Díaz, 2006). De éstos, el estado de Sonora se distingue por la cali- dad de sus cortes de carne, calidad que es inspeccionada y avalada por la Comisión Estatal de la Carne (CEC), organismo del gobierno del estado.
Por otro lado, al estar México inmerso en un mercado globaliza- do, no está excluido de las nuevas tenden- cias internacionales, ni de las preferencias de los consumidores e incluso de las alter- nativas de producción que tendrán que ir desarrollándose en mayor volumen. Ejem- plos de estos son la producción con trazabi- lidad o rastreabilidad, que den certeza de calidad e información al consumidor (Luna Martínez y Albarrán Díaz, 2006).
Desde el año 2004, las exportaciones de carne mexicana a Japón se incrementaron en ~300% (SAGARPA, 2006a), debido a que ese año, como hasta hoy, la carne de México está libre de fiebre aftosa y de encefalopatía espongiforme bo- vina (EEB), enfermedades que han afecta- do a los hatos ganaderos de otros países (SAGARPA, 2006b). La carne mexicana ha alcanzado un posicionamiento importante en los países asiáticos, gracias a su calidad e inocuidad. Sin embargo, no hay que per- der de vista que dichos países verifican la trazabilidad genética de la carne por medio del análisis del ADN, por lo que la carne
proveniente de otros países, entre ellos la de México, podría ser sometida, en el corto plazo, al mismo requerimiento.
Ante este escenario de apertura comercial globalizado, en el 2003, el gobierno de México inició el Sistema Nacional de Identificación Individual de Ganado (SINIIGA), el cual establece que la identificación del ganado se realizará me- diante la colocación de aretes que deberán permitir una identificación única y perma- nente del animal a lo largo de toda su vida (www.sagarpa.gob.mx). El objetivo del SI- NIIGA fue establecer la identificación indi- vidual y permanente del ganado en México y conformar una base de datos que permi- tiera tomar acciones integrales para elevar los estándares sanitarios y de competitivi- dad de la ganadería mexicana. El SINIIGA consta de dos componentes: el componente físico que incluye la identificación indivi- dual del animal por medio de la colocación de dos aretes y el componente de informa- ción que consiste en diseñar e implementar un sistema (base de datos nacional y regio- nal), para operar el SINIIGA. En este siste- ma quedan registrados los datos del pro- ductor, de la unidad de producción pecuaria (UPP) y del animal; así como las notifica- ciones del nacimiento, importación, ingreso o salida de un animal a una UPP por cual- quier causa, además del sacrificio del ani- mal en el rastro (www.sagarpa.gob.mx).
Aunque México cuenta con el SINIIGA, durante el sacrificio del animal y su posterior despiece, la capaci- dad de rastreo se pierde, por lo que es ne- cesario que además se implemente un siste- ma de trazabilidad que verifique la identi- dad del animal y de los productos hasta llegar al consumidor. En particular, un sis- tema de trazabilidad verificable con la hue- lla genética podría ser una buena alternati- va para empresas mexicanas exportadoras de carne que cuentan con un esquema de comercialización integrado. La trazabilidad respaldada por el código basado en el ADN o huella genética para identificar al animal y sus productos, permitiría la trazabilidad con una mayor exactitud (Smith y Saun- ders, 2005). Tecnologías para trazabilidad e identificación de ganado
Uno de los principales re- quisitos en la trazabilidad de bovinos es la implementación de un sistema que permita su identificación. Si bien existe una gran va- riedad de métodos para la identificación de animales y sus derivados, en términos gene- rales estos métodos se han clasificado en: no biométricos o clásicos, y biométricos. Entre los métodos no biométricos se encuentran los tatuajes, crotales o aretes, y los dispositivos electrónicos (Felmer et al., 2006).
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Entre los marcadores bio- métricos se encuentran la huella nasal, las imágenes digitales de iris/retina y el análi- sis de ADN, conocido como huella genética (DNA fingerprinting). Estos métodos se han considerado como una solución no in- vasiva para la identificación individual de animales (Felmer et al., 2006). El principio de la identificación animal a través de la huella genética del ADN se basa en que, a excepción de los gemelos monocigotos y de los clones, todos los individuos de una po- blación animal difieren entre sí a nivel de su ADN. De esta manera es posible utilizar marcadores genéticos moleculares, para es- tablecer dichas diferencias o polimorfismos (Cunningham y Meghen, 2001; Schwägele, 2005).
Trazabilidad de la carne de bovino
La trazabilidad de la car-
ne consiste en darle seguimiento durante toda la cadena productiva, es decir, desde el nacimiento del animal en la granja, hasta su venta al detalle en los puntos de venta (Pettitt, 2001; Dalvit et al., 2007). En todo este proceso se debe asegurar la identidad y calidad del producto. Así, ante cualquier problema o conflicto de identidad, debe ser posible rastrear el origen. Algunos de los métodos de trazabilidad clásicos, como are- tes o crotales, y algunos otros, no son sufi- cientes debido a que pueden ser removidos o alterados durante el sacrificio y despiece de los animales. Para evitar este inconve- niente, en varios países se están desarro- llando métodos de respaldo que puedan asegurar totalmente la trazabilidad (Smith y Saunders, 2005). Uno de estos métodos de respaldo es la denominada trazabilidad genética o molecular, la cual se basa espe- cíficamente en el estudio de marcadores moleculares del ADN (Stanford et al., 2001; Schwägele, 2005).
Trazabilidad genética por marcadores moleculares
Los marcadores molecu-
lares son fragmentos de ADN que sirven de referencia para seguir la transmisión de la información genética, de una generación a otra. En el sentido más estricto, un mar- cador molecular es una entidad genética que manifiesta polimorfismo (variabilidad en la composición de su ADN). El interés por detectar variaciones genéticas para di- versas aplicaciones ha conducido al incre- mento en el tipo y número de marcadores disponibles para el análisis del ADN (Ca- ñon y Dunner, 2003).
Los tipos de marcadores moleculares que se han utilizado son: RAPD (de random amplification of po- lymorphic DNA) o polimorfismos de ADN
amplificados al azar, RFLP (de restriction fragment length polymorphisms) o polimor- fismo de longitud de fragmentos de restric- ción, AFLP (de amplified fragment length polymorphism) o polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados, STR (de short tandem repeat) o microsatélites y SNP (de single nucleotide polymorphism) o polimor- fismos de un solo nucleótido (Buntjer et al., 2002; Ratón, 2004; Mburu y Hanotte, 2005).
Aunque existen diferentes marcadores moleculares disponibles que podrían hacer posible la trazabilidad de la carne de bovino, la necesidad de conjugar eficacia biológica y económica restringe el tipo de marcadores a solo dos: los STR o microsatélites y los SNP o polimorfismos de un solo nucleótido. Estos últimos pre- sentan un futuro muy promisorio, aunque por ahora los microsatélites han sido los marcadores de elección (Cunningham y Meghen, 2001; Cañon y Dunner, 2003).
Los microsatélites fueron identificados en 1989, al descubrirse que existían zonas del ADN no codificante (que no contiene información para producir una proteína) que contenían repeticiones de: di, tri, o tetranucleotidos (de adenina (A), gua- nina (G), citocina (C), timina (T) compo- nentes del ADN) en un número variable de veces (entre 10 y 20 en promedio). Debido a esto, los microsatélites se llamaron ini- cialmente VNTR (de variable number of tandem repeats), porque la unidad repetible está presente un número variable de veces. Sin embargo, el término VNTR también incluía los minisatélites cuya unidad de re- petición es más larga (de 100 a varios cien- tos de nucleótidos). La nomenclatura termi- nó dejando el término microsatélites o STR para los más cortos, y minisatélites o VNTR para el resto. (Cunningham y Meg- hen, 2001; Cañon y Dunner, 2003; Mburu y Hanotte, 2005).
En la actualidad, los mi- crosatélites son considerados como la he- rramienta más poderosa de discriminación genética entre animales, por lo que la So- ciedad Internacional de Genética Animal (ISAG, por sus siglas en ingles) ha recopi- lado y recomendado a aquellos microsatéli- tes que proporcionan la mayor información y que sirven como marcadores estándares para la comparación entre distintas razas bovinas (Orru et al., 2006; Sifuentes Rin- cón et al., 2006; Riojas et al., 2006).
La técnica para discrimi- nar entre animales se basa en la amplifi- cación del ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, de poly- merase chain reaction) de las regiones que contiene las secuencias repetidas de interés. Así, el polimorfismo o las dife- rencias del ADN son observadas por me- dio del tamaño de los productos que fue-
ron obtenidos por PCR después de su se- paración en geles o en sistemas automati- zados, como es el caso de los secuencia- dores para ADN (Mburu y Hanotte, 2005).
Por otra parte, los SNP son producidos por un cambio único de los nucleótidos que componen el ADN (A, G, C, T) en un individuo. Aunque proveen me- nos información que los microsatélites, los SNP tienen la ventaja de presentar menos mutaciones o cambios, ya que son genética- mente estables y muy fácilmente adaptables para el análisis automatizado con secuencia- dores (Cañon y Dunner, 2003). Otra ventaja es que facilitan y agilizan su detección con el uso de nuevas tecnologías para el análisis del ADN (microarreglos o microchips) que permiten una gran cantidad de reacciones diarias, con costos relativamente bajos (Cunningham y Meghen, 2001; Mburu y Hanotte, 2005; Yordanov y Angelova, 2006). Sistema de trazabilidad integral para carne de bovino
En la práctica, un sistema de trazabilidad integral funciona de la si- guiente forma: cada vez que un animal es sacrificado, se colecta una muestra biológi- ca del animal antes de que se pierda la identidad del mismo (por ejemplo, antes de la pérdida de los crotales) y se guarda con la identificación completa como muestra de referencia. Las muestras de referencia pue- den ser sangre, semen, carne/tejido o pelo. Esta muestra se almacena por un período no inferior a la “vida útil” del producto, y después de este período la muestra puede ser descartada. Posteriormente, en el caso de que sea necesario establecer el origen del producto en cualquier punto de la cade- na, se toma la muestra (problema) para obtener la huella genética del ADN, y este perfil se compara con la muestra o mues- tras de referencia, para determinar si ambas huellas genéticas son idénticas o no. Si las huellas son diferentes, esto significa que la muestra problema analizada no proviene del animal con el que fue comparado (Cunningham y Meghen, 2001). De hecho de esta manera se puede comprobar si una muestra de carne que viene de un supuesto animal es en realidad de este y no de un sustituto, comparándola con la muestra de referencia” favor de cambiar por “De tal manera que se puede comprobar si una muestra de carne que viene de un supuesto animal es en realidad de este y no de un sustituto, cuando se comprara con la mues- tra de referencia. De cualquier manera, el sistema requiere de trazabilidad documenta- da, es decir, conocer al menos los posibles lotes o procesadores y las fechas para las muestras de referencia y las muestras pro- blema. En algunos casos, el etiquetado po-
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dría indicar de qué animal proviene la muestra de carne, por lo que solo se com- pararía con las muestras de referencia co-
pudieron estimar, dentro de un estrecho lí- mite, la proporción ancestral de las razas Holstein y Gir, en individuos de la raza Gi-
Conclusiones
Un sistema de trazabili-
rrespondientes. En general, hay tres posi-
rolyo. Además, sugirieron que estos micro- satélites podrían ser utilizados para estimar
dad para carne de bovino debe ser verifica- ble por medio de la trazabilidad molecular.
bilidades cuando se hace una prueba de identificación (probabilidad de correspon- dencia) para la carne: i) que la huella gené- tica de la muestra problema no resulte igual a las huellas genéticas de las muestras de referencia, ii) que la huella genética de la muestra problema corresponda a una de las huellas genéticas de las muestras de refe- rencia o iii) que la huella genética de la muestra problema corresponda a la huella genética de más de una de las muestras de referencia. Si la muestra problema solo es igual a una muestra de referencia, se puede decir que es del mismo individuo; sin em- bargo, si es igual a más de una muestra de referencia, esto significa que es necesario seleccionar nuevos marcadores moleculares con mejor poder de discriminación (Shac- kell y Dodds, 2008). Sin embargo, el grupo de marcadores adecuado dependerá de la raza de los animales y del tamaño de la población (Orru et al., 2006).
Por lo anterior y a fin de simplificar los sistemas de trazabilidad y disminuir los costos de análisis para la tra- zabilidad genética, se han llevado a cabo diferentes investigaciones basadas en la evaluación y selección de diferentes marca- dores moleculares. Orru et al. (2006) eva- luaron 13 microsatélites, nueve de ellos re- comendados por la ISAG, para realizar pruebas de trazabilidad molecular en carne de bovino de cuatro razas italianas de ga- nado. Los autores implementaron PCR múltiples para disminuir los costos de aná- lisis. Los microsatélites analizados presen- taron diferentes grados de polimorfismo entre las diferentes razas, ya que estas pre- sentaron diferentes estructuras genéticas.
Algunos otros estudios de trazabilidad molecular han sido realizados con la finalidad de certificar cortes de carne de acuerdo a su origen o procedencia geo- gráfica. Por ejemplo, el caso de la “ternera de Navarra”, carne fresca procedente de ter- neros de las razas Pirenaica, Blonde de Aquitania, Parda Alpina, Charolais, y sus cruzas, que son nacidos, criados y sacrifica- dos en la región de Navarra, España. Arana et al. (2002) evaluaron 10 microsatélites para garantizar que los cortes comercializa- dos bajo esta denominación, realmente co- rrespondieran a las razas permitidas para la denominación “ternera de Navarra”.
Bicalho et al. (2006) rea- lizaron un estudio utilizando nueve micro- satélites de los recomendados por el ISAG, para evaluar la estimación ancestral de la raza Girolyo, entre las razas Gir y Holstein, las cuales derivan de entrecruzamiento en- tre Bos Taurus y Bos Indicus. Los autores
las proporciones de origen de las razas B. Taurus y B. Indicus en productos cárnicos comerciales.
Otra aplicación de los mi- crosatélites ha sido su utilización para la trazabilidad en mezclas de carne de dife- rentes animales o carne molida. Shackell et al. (2005) emplearon un método basado en microsatélites para la detección de mezclas de carne en diferentes lotes. Sus hallazgos mostraron que fue posible identificar las proporciones de la carne de cada animal cuando ésta es mezclada tanto en cantida- des iguales como en proporciones distintas. Sin embargo, la utilización de este método estuvo limitada a lotes de carne molida proveniente de no más de diez animales.
Dalvit et al. (2008) eva- luaron la utilización de 12 microsatélites para la trazabilidad en seis razas de ganado bovino de una región de Italia. Así, repor- taron que la probabilidad de corresponden- cia entre dos individuos no emparentados (compartir la misma huella genética) fue de cinco en un millón. Sin embargo, conside- raron que utilizar 12 microsatélites elevaba el costo del análisis.
De acuerdo a lo anterior, los métodos para la trazabilidad genética en la identificación de animales en forma indi- vidual (obtención de huella genética) utili- zan principalmente microsatélites. Los pun- tos focales de estos métodos de trazabilidad han sido el de tratar de minimizar el nú- mero de microsatélites o utilizarlos en con- junto (PCR múltiple) para tratar de reducir el costo por análisis, así como la selección de un buen método de muestreo que sea práctico en la industria cárnica (Arana et al., 2002; Shackell et al., 2005).
En el estudio de Negrini et al. (2008) fueron utilizados 90 SNPs para clasificar 24 razas diferentes de gana- do europeo. El uso de los SNPs junto con estadística Bayesiana permitió clasificar a los individuos en diferentes grupos confor- mados por las diferentes razas. Sin embar- go, los autores concluyeron que es necesa- rio contar con un grupo suficiente de indi- viduos como referencia, para conformar la información completa. De manera similar, Orru et al. (2008) probaron 63 SNPs en seis razas de ganado europeo, de los cuales seleccionaron 18. Con este conjunto de 18 marcadores fue posible corroborar la proce- dencia de muestras de carne en el comer- cio, con los animales sacrificados. Sin em- bargo, la principal limitante para que los SNP sean implementados en los laborato- rios de control continua siendo el costo del análisis (Negrini et al., 2008).
Sin embargo, la trazabilidad molecular debe estar basada en una adecuada selección de marcadores moleculares. Hasta ahora, los microsatélites han sido los marcadores más útiles para la trazabilidad de carne de bovi- no, y han sido evaluados y seleccionados de acuerdo al tipo de ganado bajo estudio. Como resultado de las crisis alimentarias, en la mayoría de los países se ha implemen- tado algún tipo de sistema de trazabilidad, en algunos solo han consistido en la identi- ficación de animales, mientras que en otros se han implementado sistemas de trazabili- dad molecular como un sistema de verifica- ción. Aquellos países que verifican la traza- bilidad de la carne por medio de la huella genética tienen la ventaja de poder respaldar su sistema de trazabilidad documental en caso de una alerta alimentaria. En particu- lar México, como exportador de carne hacia mercados muy exigentes, tendría una venta- ja competitiva al verificar su sistema de identificación de animales con un sistema de trazabilidad molecular.
REFERENCIAS
Arana A, Soret B, Lasa I, Alfonso L (2002) Meat
traceability using DNA markers: application to the beef industry. Meat Sci. 61: 367-373
Bicalho HMS, Pimenta CG, Mendes IKP, Pena HB, Queiroz EM, Pena SDJ (2006) Determi- nation of ancestral proportions in synthetic bo- vine breeds using commonly employed micro- satellite markers. Genet. Mol. Res. 5: 432-437
Buntjer JB, Otsen M, Nijman IJ, Kuiper MTR, Lenstra JA (2001) Phylogeny of bovine species based on AFLP fingerprinting. Heredity 88: 46-51
Cañon J, Dunner S (2003) Técnicas de genética molecular en laboratorios de producción ani- mal. VIII Simposium Anual de AVEDILA. León, España. 23-24/10/2003.
Cunningham EP, Meghen CM (2001) Biological identification systems: genetic markers. Rev. Sci. Technol. Off. Int. Epiz. 20: 491-499.
Dalvit C, De Marchi M, Cassandro M (2007) Ge- netic traceability of livestock products: A re- view. Meat Sci. 47: 437-449.
Dalvit C, De Marchi M, Targhetta C, Gervaso M, Cassandro M (2008) Genetic traceability of meat using microsatellites markers. Food Res. Int. 41: 301-307.
Estrada-Montoya MC, González-Córdova AF, Tor- rescano G, Camou JP, Vallejo-Cordoba B (2008) Screening and confirmatory determina- tion of Clenbuterol residues in bovine meat marketed in the Northwest of Mexico. Cien. Tecnol. Alim. 6: 130-136.
European Commission (1997) Laying down de- tailed rules for the implementation of Council Regulation (EC) Nº 820/97 as regards eartags, holding registers and passports in the frame- work of the system for the identification and registration of bovine animals. Off. J. Eur. Commun. L354: 19-22.
European Commission (2000) Regulation EC Nº 1760/2000 of the European Parliament and of
53
the Council of 17 July 2000 establishing a system for the identification and registration of bovine animals and regarding the labelling of beef and beef products and repealing Council Regulation (EC) Nº 820/97. Off. J. Eur. Com- mun. L 204: 1-10.
European Commission (2002) Council Regulation (EC) Nº 178/2002 of 28 January 2002 laying down the general principles and requirements of food law, establishing the European Food Safety Authority and laying down procedures in matters of food safety. Off. J. Eur. Com- mun. L31: 1-24.
Felmer R, Chávez R, Catrileo A, Rojas C (2006) Tecnologías actuales y emergentes para la iden- tificación animal y su aplicación en la trazabil- idad animal. Arch. Med. Vet. 38: 197-206.
Luna Martínez E, Albarrán Diaz M (2006) Situ- ación Actual y Perspectiva de la Producción de Carne de Bovino en México. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pes- ca y Alimentación. www.sagarpa.gob.mx
Mburu D, Hanotte O (2005) A practical approach to microsatellite genotyping with special refer- ence to livestock population genetics. A manu- al prepared for the IAEA/ILRI training course on molecular characterisation of small rumi- nant genetic resources of Asia. Oct.-Dec. 2005. ILRI. Nairobi, Kenya.
Negrini R, Nicoloso L, Crepaldi P, Milanesi E, Marino R, Perini D, Pariset L, Dunner S, Le- veziel H, Williams JL, Ajmone Marsan P (2008) Traceability of four European Protec- ted Geographic Indication (PGI) beef products
using Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) and Bayesian statistics. Meat Sci. 8: 1212-1217.
Orru L, Napolitano F, Catillo G, Moioli B (2006) Meat molecular traceability: How to choose the best set of microsatellites. Meat Sci. 72: 312-317.
Orru L, Catillo G, Napolitano F, De Matteis G, Sca- ta MC, Signorelli F, Moioli B (2008) Characte- rization of a SNPs panel for meat traceability in six cattle breeds. Food Control 20: 856-860
Pettitt RG (2001) Traceability in the food animal industry and supermarket chains. Rev. Sci. Tech. 20: 584-597.
Ratón TO (2004) Métodos moleculares de identifi- cación de levaduras de interés biotecnológico. Rev. Iberoam. Micol. 21: 15-19.
Riojas VVM, Gómez DFJC, Salinas MJA, Montes de Oca LR, Wong GA (2006) Confiabilidad del análisis de ADN en pruebas de paternidad para bovinos Brahman y Brangus en México. Ciencia UANL. IX: 41-50.
SAGARPA (2006a) Crecen en 300 por ciento las exportaciones de carne bovina Mexicana a Japón en 2005. Nº 084/06. Secretaría de Ag- ricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación. www.sagarpa.gob.mx
SAGARPA (2006b) Prevén exportar este año más de 12 mil toneladas de carne de bovino en cortes finos a Japón. Nº 254/06. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pes- ca y Alimentación. www.sagarpa.gob.mx
Sallam KI, Morshedy AEM (2008) Organochlorine pesticide residues in camel, cattle and sheep carcasses slaughtered in Sharkia Province, Egypt. Food Chem. 108: 154-164.
Schwägele F (2005) Traceability from European perspective. Meat Sci. 71: 164-173.
Shackell GH, Dodds KG (2008) DNA-based traceability of meat. En Toldra F (Ed.) Meat Biotechnology. Springer. Nueva York, USA. pp. 61-88.
Shackell GH, Mathias HC, Cave VM, Dodds KG (2005) Evaluation of microsatellites as a po- tential tool for product tracing of ground beef mixtures. Meat Sci. 70: 337-345.
Sifuentes-Rincón AM, Parra BPGM. De la Rosa RXF, Sánchez VA, Serrano MF, Rosales AJ (2006) Importancia de las pruebas de pater- nidad basadas en microsatélites para la eval- uación genética de ganado de carne en em- padre múltiple. Téc. Pecu. Méx. 44: 389-398.
Smith GC, Saunders L (2005) International Iden- tification, Traceability and Verification: The Key Drivers and The Impact on the Global Food Industry. International Livestock Con- gress Connections. Exploring Traceability and What it Means to the Beef Industry. 02/03/2005. Houston, TX, EEUU.
Smith GC, Tatum JD, Belk KE, Scanga JA, Grandin T, Sofos JN (2005) Traceability from a US perspective. Meat Sci. 71: 174- 193.
Sofos JN (2008) Challenges to the meat safety in the 21st century. Meat Sci. 78: 3-13.
Stanford K, Stitt J, Kellar JA, McAllister TA (2001) Traceability in cattle and small rumi- nants in Canada. Rev Sci Tech. 20: 510-522.
Yordanov D, Angelova G (2006) Identification and traceability of meat and meat products. Biotechnol. Biotechnol. Equip. 20: 3-8.
TRACEABILITY OF BOVINE MEAT: CONCEPTS, TECHNOLOGICAL ASPECTS AND PERSPECTIVES FOR MEXICO
Roberto Rodríguez-Ramírez, Aarón F. González-Córdova, Ana Arana, Armida Sánchez-Escalante and Belinda Vallejo-Cordoba
SUMMARY
Bovine meat traceability is of great importance as a tool for food safety since it ensures product identity and the possibil- ity to follow it up from its origin until commercialization. Meat traceability starts with animal identification; however, traditional markers, although necessary, are removed at slaughter. On the other hand, methods that use molecular markers, based on DNA fingerprinting, are permanent and unique. Therefore, it is impor- tant that a meat traceability system combines both methods so
that the product could be traced along the production chain to ensure consumer safety in case of a food crisis. In this review, a general overview of bovine meat traceability concepts and tech- nological aspects are presented. Also, methods used for meat traceability, including the selection and evaluation of molecular markers are discussed. Finally, the status of bovine meat trace- ability in different countries, with special emphasis on Mexico is addressed.
TRAÇABILIDADE DA CARNE DE BOVINO: CONCEITOS, ASPECTOS TECNOLÓGICOS E PERSPECTIVAS PARA O MÉXICO
Roberto Rodríguez-Ramírez, Aarón F. González-Córdova, Ana Arana, Armida Sánchez-Escalante e Belinda
Vallejo-Cordoba
RESUMO
A traçabilidade da carne de bovino é de grande importân- cia para a segurança alimentar, ja que garante sua identidade e rastreabilidade desde a origem até a comercialização. A tra- çabilidade começa com a identificação dos animais; no entanto, os marcadores clássicos, ainda que necessários, são removidos durante o sacrifício. Por outro lado, os métodos que utilizam marcadores moleculares, baseados no perfil do ADN, são perma- nentes e únicos. Por isto, em um sistema de traçabilidade para a carne é conveniente que ambos métodos se complementem para assegurar o acompanhamento do produto em toda a ca- deia produtiva. Nesta revisão se sugere um panorama geral de conceitos e aspectos tecnológicos da traçabilidade da carne de bovino, se descrevem os principais métodos utilizados para a traçabilidade, incluindo a seleção e avaliação de marcadores moleculares, e se apresentam as perspectivas da traçabilidade em diferentes países, enfatizando o caso do México.
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Capítulo 4
Meat Molecular Traceability for Beef from Mexican
Bovine Synthetic Breeds
Articulo enviado y preparado conforme al formato de la revista Genetics
and Molecular Research
55
Your article “Meat Molecular Traceability for Beef from Mexican Bovine Synthetic Breeds” was received as a submission for publication in Genetics and Molecular Research (GMR). It has been assigned manuscript number GMR 1186. Please use this number for any future correspondence.
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Sincerely,
Francisco A. de Moura Duarte Editor - Genetics and Molecular Research www.funpecrp.com.br/gmr Phone: 55(16) 3620.1251 fax: 55(16) 3621.1991
56
Meat Molecular Traceability for Beef from Mexican Bovine Synthetic Breeds
Running Title: Meat Molecular Traceability for Beef
Rodríguez-Ramírez, R1, A. Arana
2, L. Alfonso
2, A. F. González–Córdova
1, G. Torrescano
3,
B. Vallejo-Cordoba*1
.
1.-Laboratorio de Calidad, Autenticidad y Trazabilidad de los Alimentos
3.-Laboratorio de
Ciencia de la Carne. Coordinación de Tecnología de Alimentos de Origen Animal. Centro de
Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C. (CIAD) Carretera a La Victoria K.m.0.6
Apartado 1735, Hermosillo Sonora México, C.P.83304.
2.- Departamento de Producción Agraria. Universidad Pública de Navarra, Campus de Arrosadía.
Pamplona, España C.P. 31006
* Corresponding author: [email protected]
Tel.- +52(662)289-2400 Local 365; Fax.- +52(662)280-0421
Manuscript submitted to the Editor of Genetics and Molecular Research for evaluation.
December, 2010
57
ABSTRACT
Traceability ensures a link among the carcass, quarters, or pieces of beef, and the individual
animal or the group of animals from which they are derived. Meat traceability is an essential tool
for the successful identification and recall of contaminated products from the market during a
food crisis. Additionally, meat traceability is also extremely important for the protection and
value enhancement of good quality brands. Molecular meat traceability would allow the
verification of conventional methods used to implement beef traceability in Mexican synthetic
bovine breeds. Thus, a set of eleven microsatellites was evaluated for their ability in the
identification of animals belonging to these synthetic breeds. The use of at least seven
microsatellite markers allowed gathering enough information for sample discrimination with a
match probability (MP), defined as the probability of finding two individuals sharing by chance
the same genotypic profile, of 10-8
. Also, the practical application of the marker set was evaluated
by testing samples from carcasses and pieces of meat at the slaughterhouse and the point of sale.
The DNA profiles of the two samples obtained at different points in the production-
commercialization chain proceed from the same animal.
Key words: meat traceability, microsatellite markers, synthetic breeds.
58
Introduction
Food safety and food quality have become a priority for consumers and meat producers. To
guarantee both quality and safety, it must be possible to follow the path of a specified piece of
meat back to any point the supply chain (Vázquez et al., 2004). The meat industry has responded
globally to a series of crises such as bovine spongiform encephalopathy, labeling scandals and
outbreaks of enterohemorrhagic Escherichia coli infections. As a consequence, considerable
effort has been expended to develop meat traceability schemes that document the origin and
movement of animals and their parts along all or part of the food supply chain. Such schemes are
now required by regulations in the European Union (EU) and Japan (Vetharaniam et al., 2009).
Likewise, in Latin American countries such as Uruguay, Brasil, Argentina, Chile and México,
where the beef export market is important, animal identification was introduced as a first step in
the implementation of a meat traceability system (Rodríguez-Ramírez et al. 2010).
Internationally, the USA is lagging behind many countries in developing traceability systems for
food in general and especially for livestock (Smith et al., 2005).
Traceability is critical for the successful identification and recall of contaminated products from
the market during a food crisis and as a support for quality assurance. Additionally, traceability is
also extremely important for the protection and value enhancement of brands, especially in niche
markets (Vetharaniam et al., 2009). For example, a label such as Ternera de Navarra (Beef of
Navarra), a protected geographical indication (PGI) in the North of Spain, is certified by using
DNA markers (Arana et al., 2002). The concept of traceability throughout the food supply chain
is recognized within the European Union with the regulation (EC) No. 178/2002, in which
traceability is defined as the ability to trace and follow food, feed and ingredients through all
stages of production, processing and distribution (Orru et al., 2006). These regulations seek to
guarantee a traceability system that ensures a link among the carcass, quarters, or pieces of beef,
and the individual animal or the group of animals from which they are derived. Therefore,
traceability is achieved by making use of identification labels attached to live animals and meat
products throughout the production commercialization chain (Vazquez et al., 2004).
As a consequence, traceability requires systems for animal identification and registration and for
labeling animal products. Such information is normally obtained by ear tagging the animals, by
labeling food and feed placed on the market and by producing documents that allow the
identification of all parts in the operation. However, with these methods frauds are not fully
avoided (Orru et al, 2006). On the contrary, DNA-based traceability systems or molecular
traceability offer a unequivocal verification tool (Arana et al., 2002). Meat traceability studies
differing in the number of microsatellites used, optimization of PCR conditions aiming at carrying out
multiplex reactions and cattle breeds were recently reviewed [Rodríguez-Ramírez et al, 2010]. While
in one study, eight microsatellites were used for the certification of Ternera de Navarra (Beef of
59
Navarra) from the Pirenaica breed [Arana et al., 2002], others evaluated a larger number of
microsatellites in several Italian cattle breeds [Orru et al., 2006; Dalvit et al., 2008 a,b]. In one
study, 21 microsatellites were tested for breed identification in four native Italian cattle breeds
[Dalvit et al., 2008a]; the marker sets with the highest gene diversity were shown to perform
best. As a result, the same group evaluated 12 microsatellites in six Italian cattle breeds aiming at
reducing the costs of the analysis but considering genetic differentiation among them and found
that a set of 8 microsatellites showed reliable results [Dalvit et al., 2008b]. In all these studies pure
cattle breeds were evaluated. However, in México beef derives from synthetic bovine breeds such as
Brangus, Brahman (Méndez et al 2009) and Charolais. Synthetic breeds were developed by crossing
zebu and taurine cattle and were claimed to have both high resistance to heat characteristic of Indian cattle
and high productivity characteristic of European cattle (Bicalho et al., 2006). Thus, the objective of this
study was to select a subset of microsatellite markers from a panel of eleven for the establishment
of meat molecular traceability for beef from Mexican synthetic bovine breeds. Additionally, the
practical application of the traceability system was tested with samples collected from the retail
market.
Materials and Methods
Population studied. Seventy eight animals of synthetic cattle breeds from two different
slaughterhouses were included in the study. Additionally, four meat samples were collected from
the local market where these beef is commercialized. Blood and muscle tissue samples were
frozen at – 20 °C until DNA extraction was carried out.
DNA analysis. Muscle tissue (100 mg) were homogenized in 680 µL lysis buffer (50mM Tris-
HCl, 100mM NaCl, 100mM EDTA, 1% SDS). Then, 20 µL de proteinase K were added and the
homogeneate was incubated at 62 °C for 90 min. DNA purification was carried out by the
chroroform-isoamylic alcohol standard protocol. DNA from blood samples (100 µL) was
extracted using a commercial kit (Wizard Genomic, Promega, Wisconsin, USA). DNA from each
individual was independently typed for eleven microsatellites (Table 1). From the microsatellites
evaluated, nine were those recommended by the International marker set of ISAG. The primer
sequence of the microsatellites can be found in a webpage
(www.isag.org.uk/journal/comparisonguide). PCR reactions were carried out by using a
commercial kit of fluorescent primers following the manufacturer´s instructions (Stock Marks,
Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR reactions were carried out using a
thermocycler (9700 Applied Biosystems, San Diego, CA) with the following conditions: initial
denaturation step of 15 min at 95 °C; 31 cycles as follows: 45 s at 94 °C, 45 s at 61 °C with a 30 s
ramp, 60 s at 72 °C with a 30 s ramp, 1 cycle of 60 min at 72°C and 1 cycle of 2 h at 25°C. PCR
products were analyzed using an ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, San
Diego, CA). Sequencing profiles were analyzed by using a Genescan and Genotyper software
(Applied Biosystems).
Statistical analysis. Genetic variability of markers were analyzed aiming to validate the selected
microsatellites. Average heterozygocity (H) and average polymorphism information content
(PIC) were calculated with the sofware Molkin 3.0 (Gutiérrez et al., 2005). Values of match
probability (MP), defined as the probability of finding two individuals sharing by chance the
60
same genotypic profile, were calculated according to Weir (1996) and Arana et al (2002). Match
probability values were calculated using different marker sets, starting with the most polymorphic
marker and adding sequentially the next most polymorphic.
Results and Discussion
Allele frecuencies, H and PIC for the markers analyzed in the Mexican synthetic bovine breed are
shown in Table 2. All evaluated microsatellites were polymorphic and contained between five
and 19 alleles. PIC and H data showed that the least polymorphic marker was BM1824, with
values of 65.2 and 70.1, respectively. On the other hand, the most polymorphic marker was
BM2113, with values of 84.2 and 85.8 for PIC and H, respectively. Other authors also reported
very low values for marker BM1824 (PIC = 55.9) in cattle from pure Italian Chianina breed
(Orru et al., 2006). On the other hand, BM1824 was not the least polymorphic when it was
evaluated in beef from Pirenaica breed (Arana et al., 2002) and Asturiana de los Valles and
Asturiana de la Montaña breeds (Vázquez et al., 2004).
MP with different number of markers for the population under study is shown in Figure 1. The
MP value for the most polymorphic marker (BM2113) was 3.66. On the other hand, the MP
value for the 11 markers was 1.149X10-11
. These results were similar to those reported by other
authors for Spaniard (Vázquez et al., 2004) and Italian breeds (Orru et al., 2006; Dalvit et al.,
2008a,b). As expected, MP diminishes with an increasing number of markers, down to a
probability of 10-11
. Results showed that the probability of two different animals sharing the same
allelic profile (MP) was 9.96X10-8
with a set of seven markers. Similarly, other studies showed an
MP of 10-8
when eight markers were used (Dalvit et al., 2008b; Arana et al., 2002). Although,
others reported the use of six markers with an MP of 10-4
with the purpose of saving testing cost
(Vázquez et al., 2004). In this study a set consisting of seven markers was found to be suitable for
meat traceability studies. To test the reliability of the marker set for meat traceability, the task
consisted in determining whether or not two samples obtained at different points along the
production-commercialization chain proceed from the same animal. To solve this task, allelic
profiles obtained from samples collected from the point of sale and the slaughterhouse were
compared. A typical allelic profile showing that a sample collected in the slaughterhouse (Figure
2A) and the point of sale (Figure 2B) coincided in all alleles is presented in Figure 2. Thus, it was
concluded that the meat samples collected from the point of sale corresponded to the tested
animal at the slaughterhouse.
Conclusions
The verification of meat traceability in synthetic bovine Mexican breeds may be reliably carried out with a
subset of seven microsatellite markers from the eleven markers evaluated. Additionally, the usefulness
of molecular traceability was shown by comparing samples collected from different locations of
the production-commercialization chain.
Acknowledgements
61
This research was supported by grant 122204 “Apoyos Complementarios para la Actualización
de Equipo Científico 2009” from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT). The
technical assistance of Lilia María Beltrán-Barrientos and María de Jesús Torres-Llanez is
gratefully recognized.
References
Arana, A, Soret, B, Lasa I, Alfonso L (2002). Meat traceability using DNA markers: application
to the beef industry. Meat Sci. 61: 367-373.
Bicalho, HMS, Pimenta, CG, Mendes, IKP, Pena, HB, et al. (2006). Determination of ancestral
proportions in synthetic bovine breeds using commonly employed microsatellite markers. Genet.
Mol. Res. 5:432-437.
Dalvit, C, De Marchi, M, Dal Sotto, R, Gervaso, M, et al. (2008a).Breed assignment test in four
Italian beef cattle breeds. Meat Sci. 80:389-395.
Dalvit, C, De Marchi M, Targhetta C, Gervaso M, et al. (2008b). Genetic traceability of meat
using microsatellites markers. Food Res Int. 41: 301-307
Gutiérrez, JP, Royo, LJ, Álvarez I, Goyache F (2005). MolKin v2.0: a computer program for
genetic analysis of populations using molecular coancestry information. Journal of Heredity, 96:
718-721.
Méndez RD, Meza C O, Berruecos, J. M., Garcés, P, et al. (2009). A survey of beef carcass
quality and quantity attributes in Mexico. J Anim Sci. 87:3782-3790.
Orru L, Napolitano F, Catillo G, & Moioli B (2006). Meat molecular traceability: How to choose
the best set of microsatellites Meat Sci. 72:312–317.
Rodriguez-Ramírez, R, González-Córdova, AF & Vallejo-Cordoba, B. (2010). Authentication
and traceability of foods from animal origin by PCR-based capillary electrophoresis. Analytica
Chimica Acta
Smith, GC, Tatum, JD, Belk, KE, Scanga, JA, et al. (2005). Traceability from a US perspective.
Meat Sci. tica Chimica Acta. In press.71:174-193.
Vázquez JF, Pérez T, Ureña F, Gudín E (2004). Practical Application of DNA Fingerprinting To
Trace Beef. Journal of Food Protection, 67: 972–979.
Vetharaniam, I., Shackell, GH. & Upsdell, M. (2009). A statistical approach to identifying the
batch of origin of mixed-meat products using DNA profiles. J. Food Protection 72:1948-1957.
62
Weir, BS (1996). Genetic data analysis II. Methods for discrete population genetic data.
Sunderland, MA, Sinauer Associates. Inc. Publishers.
Table 1. Microsatellites evaluated in Mexican synthetic bovine breed.
Tabla 2. Allele frequencies (mean) of markers evaluated in the Mexican synthetic bovine
population
Figure 1. Probability of two samples matching by chance as a function of number of
microsatellite markers evaluated.
Figure 2. Allelic profiles of microsatellite markers obtained from samples collected from the
production-commercialization chain. A) A sample collected from the slaughterhouse; B) A
sample collected from the point of sale.
63
Marker Chromosome Fragment size (bp)
TGLA227 18 74-104
BM2113 2 125-143
TGLA53 16 144-190
ETH10 4 210-226
SPS115 15 240-262
TGLA126 20 109-127
TGLA122 21 130-164
INRA23 3 197-223
ETH3 19 117-129
ETH225 9 140-156
BM1824 1 178-190
64
Alleles amplified
Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15-16 17 18 19 H PIC
ETH3 0.028 0.007 0.025 0.361 0.160 0.076 0.007 0.208 0.014 0.014 77.8 74.8
ETH225 0.146 0.007 0.076 0.049 0.208 0.264 0.021 0.146 0.076 0.007 83.0 80.9
BM1824 0.132 0.257 0.431 0.007 0.174 70.1 65.2
TGLA126 0.007 0.389 0.250 0.056 0.056 0.194 0.007 0.028 0.014 74.1 70.2
TGLA122 0.028 0.021 0.007 0.007 0.333 0.014 0.014 0.063 0.229 0.083 0.007 0.014 0.090 0.021 0.021 0.007 0.014 0.007 81.4 79.4
INRA023 0.007 0.021 0.021 0.083 0.035 0.042 0.181 0.111 0.076 0.097 0.313 0.014 83.1 81.4
TGLA227 0.364 0.053 0.174 0.182 0.030 0.023 0.091 0.045 0.008 0.015 0.015 78.9 76.4
BM2113 0.067 0.144 0.008 0.197 0.159 0.076 0.061 0.159 0.136 85.8 84.2
TGLA53 0.143 0.014 0.279 0.121 0.079 0.014 0.157 0.057 0.064 0.043 0.007 0.007 0.007 0.007 84.7 83.0
ETH10 0.007 0.132 0.042 0.063 0.069 0.493 0.049 0.097 0.049 71.5 69.3
SPS115 0.014 0.072 0.464 0.130 0.145 0.051 0.036 0.087 73.0 70.4
H, average heterozygosity
PIC, polymorphism information content
65
Number of Markers
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Matc
h p
rob
ab
ilit
y (
log
scale
)
1e-12
1e-11
1e-10
1e-9
1e-8
1e-7
1e-6
1e-5
1e-4
1e-3
1e-2
1e-1
1e+0
1e+1
66