细菌内毒素检测技术与应用...2016/08/31 · 细菌内毒素检测技术与应用....

湛江安度斯生物有限公司

细菌内毒素检测技术与应用

熊向党冯聚锦韦群

2007 年 6 月第一稿


广东省湛江市人民大道中 38 号邮编：524022

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目录

一、细菌内毒素检测技术的应用与发展·························································2

二、细菌内毒素检查的基础理论 ···································································5

三、凝胶法细菌内毒素检查技术 ·································································12

四、光度法细菌内毒素检查技术 ·································································27

五、细菌内毒素检查的常见干扰及消除·······················································42

六、细菌内毒素检查法在药品生产质控的应用 ············································45

七、辅剂及相关产品的使用 ········································································50

八、细菌内毒素检查常用术语、符号及英文缩写 ·········································54


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一、细菌内毒素检测技术的应用与进展1、热原

2、历史回顾——鲎试剂与细菌内毒素检查

3、BET的发展趋势与特点

1、热原

–热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质

–Webster将热原定义为“致热剂”

1）早期的热原研究

– 静脉疗法的研究与热原的研究密切相关

– 在18、19世纪有很多关于静脉疗法的报道，所有病人在注射后都伴随有发热反应，当时的医生都深信发热对人体有益

– 1912年，Hort和Penfold阐明注射发热的真正本质，将细菌分为热原和非热原两种：

• 革兰氏阴性细菌为热原细菌

• 革兰氏阳性细菌为非热原细菌

– 他们推断出所有的注射发热都是由革兰氏阴性细菌产生的可滤过的、热稳定的物质导致的

2）热原的检测

– 1941年，美国USP、FDA和NIH（美国国家卫生研究所）邀请了14个制药厂商参与第一次热原的协作研究

– 1942年，美国药典第一次收载热原检查法

– 该方法是将一定量的供试品通过静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况来判定供试品中所含热原量是

否符合规定。

3）细菌内毒素检查（BET）

– 利用鲎试剂来检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，用以判断供试品中细菌内毒素含量是否符合规定

2、历史回顾——鲎试剂与细菌内毒素检查

1）国际

– 1956年，美国科学家Frederic Bang发表论文《鲎的一种细菌性疾病》，阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。随后，Bang

和Levin发明了鲎试剂

– 1980年，FDA发表使用鲎试剂检查人用和兽用注射药终成品内毒素的准则；美国药典20版（USPXX）收载BET法

– 1989年英国药典收载BET法

– 1991年日本药局方收载BET法

– 1999年，USPXXIV版规定670种药品用BET法检查，保留热原检查的药品约20种

– 2000年，国际调和委员会使USP、EP和JP达成《BET的国际调和案》，统一的BET法收载于USPXXIV版NF19的第二增补

本中，并于2001年1月1日生效

2）国内

–1983年，由11个单位参加的卫生部鲎试剂研究协作组的成立

–1988年，卫生部颁布《细菌内毒素检查法》和鲎试剂标准

–1991年，卫生部部颁标准规定4种药品可使用细菌内毒素检查法

–1993年，中国药典（CP）九零版第二增补本收载BET法

–1995年版CP规定13个品种使用BET法

–2000年，CP2000版细菌内毒素检查品种增至69种；附录《细菌内毒素检查法应用指导原则》中收录了BET定量法

–2005年，CP2005版细菌内毒素检查品种增至168种;BET法正式收载光度测定法


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3、BET发展趋势与特点

1）BET技术的发展趋势

（1）细菌内毒素检查取代热原检查

– 自19世纪80年代FDA批准鲎试验的应用以来，BET法所具有的优点：快速、灵敏、可标准化等，表明它比热原检查法更适应

现代制药工业的发展

– 各国药典规定的BET检查品种都经历了从无到有，从少到多的过程

– BET取代热原检查已成为趋势

（2）走向统一的BET法

–在初期各国颁布的BET法不尽相同，不利于药品的全球流通

–WHO实现了内毒素的国际标准品（IS）的效价（IU）与各国内毒素标准品的效价（EU）的统一，即1IU=1EU

–国际调和委员会综合USP、EP、JP的BET法，达成一个国际协调案— — 统一的BET法，于2001年实施

–中国药典2005年版的BET法基本参照统一的BET法

2） BET技术及应用发展的特点

（1）BET方法呈多样化

–凝胶法

–比浊法

- 动态比浊法

- 终点比浊法

–比色法

- 动态比色法

- 终点比色法

（2）BET趋向自动化

– 凝胶法

• 恒温设备方面，干式恒温仪器逐步取代水浴恒温箱

– 定量BET

• 试管式定量检测仪

• 酶标板式定量检测仪

• 全自动的BET系统

• 专用的数据软件

（3）湛江安度斯在BET方法学及技术上的发展

– 专利1：同体系模型法

– 专利2：动态终点法

– 专利3、细菌内毒素快速检测

– TAL-40型试管恒温仪（凝胶法）

– BET专用软件— — 生物探针-2002

3）BET试剂的发展

– 鲎试剂的灵敏度越来越高

• 凝胶法最高达0.0075EU/ml，商品试剂0.015EU/ml

• 定量法高达0.001EU/ml

— 湛江安度斯公司

– 湛江安度斯是国内唯一能批量生产高灵敏

度鲎试剂的厂家

– 权威的研究报告表明：安度斯公司的鲎试剂

具有较强的抗干扰性能

生物探针-2002


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– 鲎试剂抗干扰性能更强

• 干扰BET的因素：pH值、离子浓度、干扰物质

– 鲎试剂特异性更好

• 试剂特异性的重要性

• 相关法规对试剂特异性的要求

• 特异性试剂的种类

– BET辅剂的应用

• 缓冲剂：调节pH值

• 稀释剂：补充二价阳离子

• 抗增液：增强抗β-葡聚糖的能力

4）高技术的产物---便携式生物检测系统（PTS）

– 快捷、方便的检测仪

– 第一代产品可作快速、定量的BET（7~15分钟）

– 发展方向

• 特异性强的BET

• β葡聚糖检测

• 革兰氏细菌快速鉴别——取代传统的染色法

• 微量蛋白的快速测定

– 应用领域：制药、医学、食品卫生、环保

5）BET应用的领域越来越广

– 药品检验

– 药品生产过程质控

中美两国鲎试剂应用比较

中国美国

终成品检查(%) 70 30

生产质控(%) 30 70

– 临床应用：辅助诊断

– 其它领域：食品卫生，环境保护


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二、细菌内毒素检查的基础理论1、细菌内毒素

2、鲎试剂

3、BET检查用水

4、BET检查程序

5、2005年版细菌内毒素检查法

6、相关参数的计算

7、试验相关知识

1、细菌内毒素

1）化学成分及特性

– 革兰氏阴性细菌细胞壁的产物

– 是高分子量脂多糖复合物（LPS）

• 单体分子量介于10，000至20，000道尔顿

• 典型地以100，000至500，000道尔顿的聚合体形式存在

（1）特性

除上述性质外，LPS还有许多其它的生物活性

（2）化学结构

– 含有3个截然不同的区域

• O-特异侧链

• 核心多糖

• 类脂A

2）细菌内毒素与热原的关系

– 内毒素是热原之一种

– 医药工业接受的观点是,内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原,控制内毒素污染就等于控制热

原污染

3）标准内毒素与环境内毒素

– 标准内毒素

致热性

耐热性

酸碱性

鲎反应性

分子极性

需要在250摄氏度干热30分钟才能彻底灭活

多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性，在水中呈不均匀分布

内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原，再刺激下丘脑体温调节中枢，

引起发热反应

能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶

与强酸强碱水解反应


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• 经人工精制并经生物效价测定的细菌内毒素,作为BET检查的参考品或对照品

• 标准内毒素分内毒素标准参考品(RSE)和内毒素工作标准品(CSE)

• CSE的效价必须用RSE来标化。目前CSE的效价有两种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际）

– 环境内毒素

• 天然产生的内毒素,普遍存在于水、空气及各种原料中,成份除了脂多糖外还含有蛋白质、多糖和其它杂质,其两极活性不

明显,致热性较弱。BET的对象是环境内毒素。

4）标准内毒素溶液的制备

– 中国药典2005年版BET法要求,将细菌内毒素国家标准品用BET检查用水溶解后,需在旋涡混合器上混匀15分

钟,以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。其他国家的BET法也有类似的要求。

– 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布

2、鲎试剂

1）鲎试剂的分类

– 根据鲎的种类分类：

• 美洲鲎试剂（LAL）

• 中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL）

– 根据检查方法分类：

• 凝胶法鲎试剂

• 光度法鲎试剂

– 根据鲎试剂的反应特异性分类：

• 普通鲎试剂

• 特异性鲎试剂

2）鲎试剂的规格

– 一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量试剂）

– 把自身的包装容器作为反应试管的试剂成为单次试验试剂，在国内使用的0.1ml/支的鲎试剂就属于单次试验试

剂。

– 多次试验试剂有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用时应先用相应量的溶解液复溶鲎试剂

3）鲎试剂的质量标准

– 灵敏度

• 定义：在细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生凝集的标准内毒素的最低浓度，单位为EU/mL。

• 常用鲎试剂的灵敏度

– 0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml

– 自身凝集


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• 部颁标准，鲎试剂的阴性对照在37度4小时不产生凝集反应

– 缓冲能力

– 干燥失重

– 无菌：中国标准无此项要求

4）鲎试剂与内毒素的反应机理

3、BET用水

– 2000年版药典要求，BET用水应为与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37℃±1℃条件下24小时不产生

凝聚反应的灭菌注射用水。

– 2005年版药典要求，凝胶法BET用水应为内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法用的BET用水

内毒素含量应少于0.005EU/ml。

– 美国药典要求的BET用水是指与所使用的鲎试剂不发生反应的灭菌注射用水或其它水。

4、BET程序

1）验证实验

– 凝胶法

• 灵敏度复核试验

• 干扰试验

– 光度测定法

• 标准曲线可靠性试验

• 干扰试验

2）检查法

– 凝胶法

• 凝胶限量试验

• 凝胶半定量试验

– 光度测定法

• 动态法

- 动态比浊法试验

- 动态比色法试验

405nm测吸光度值

pNA（对硝基苯胺，黄色）AC-Ile-Glu-Ala-Arg-OH

AC-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA（酶作用物）

凝固酶

活化B因子 B因子

活化C因子 C因子

内毒素

凝固蛋白原凝固蛋白（凝胶）

G因子

β葡聚糖或LAL-RM

凝胶法、比浊法显色法

旁路反应

活化G因子

凝固酶原

• 终点法

- 终点比色法试验

• 动态终点法：湛江安度斯公司创造的新方法


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5、《中国药典》2005年版细菌内毒素检查法

1）综述部分

– 细菌内毒素检查法的定义及BET方法学分类

– 内毒素标准品及检查用水

– BET器具的要求

– 供试品溶液的要求

– 内毒素限值的确定

– 最大有效稀释倍数的计算

2）实验部分

（1）凝胶法

– 鲎试剂灵敏度复核试验

– 干扰试验

– 检查法

• 凝胶限量试验

• 凝胶半定量试验

（2）光度测定法

– 标准曲线的可靠性试验

– 干扰试验

– 检查法

3）2005年版药典BET法实验部分主要内容

终点显色终点浊度动态显色动态浊度

① | |≥0.980

② 50%≤R≤200%

③TD＞TC

① B、C阳性

② D阴性

有效条件

A、B、C、D各平行2管(共12管)A、B、C、D各平行2管(共8管)检查法

① | |≥0.980

② 50%≤R≤200%

③TD＞TC

①A、D阴性

② 0.5≤Es≤2

0.5Es≤Et≤2Es

无干扰条

件

干扰试验干扰试验预试验2

① | |≥0.980

② TD＞TC

①D阴性

②0.5≤c≤2

有效条件

标准曲线验证试验

各浓度平行3管，阴性对照2管

灵敏度复核试验

各浓度平行4管, 阴性对照2管

预试验1

以标准曲线最低浓度表示以标示灵敏度表示灵敏度

终点法动态法半定量法限量法

光度测定法凝胶法

鲎试验方法


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6、相关参数的计算

1）内毒素限值

（1）药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：

L=K/M

L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；

K为人每公斤体重每小时可接受的最大内毒素剂量，以EU/（kg•h）表示，注射剂K=5 EU/（kg•h），放射性药品注射剂K=2.5

EU/（kg•h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg•h）；

M为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg•h）、mg/（kg•h）或U/（kg•h）表示，人均体重按60kg计算，注

射时间若不足1小时，按1小时计算。

（2）内毒素限值计算举例

–注射用头孢曲松钠舒巴坦钠，成人最大剂量为1500mg/次

–注射用人头孢孟多酯钠，成人每日剂量为2.0~8.0g，分3~4次给药，一日最高剂量不超过12g

–对于大输液（LVP），美国药典（USP）通常都取L值为0.5EU/ml

2）最大有效稀释倍数

– 供试品最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算：

MVD=cL/λ

C为供试品溶液的浓度，其中当L以EU/ml表示时，c为1.0ml/ml；当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位为mg/ml或U/ml。

凝胶法中，λ为鲎试剂的灵敏度

光度测定法中，λ为标准曲线最低点浓度

– 如使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴坦钠（浓度为10mg/ml，L=0.25EU/mg）的最大有

效稀释倍数为：

3）最低有效浓度（MVC）

– MVC=λ/L

– 如使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴坦钠的最低有效浓度为：

4）样品稀释过程中加液量的计算

– 稀释过程中,假设从溶液S1取（x）ml溶液稀释（n）倍至S2，加液量为（y），则满足

Y=（n-1）× x

– 如从溶液S1取0.5ml稀释3.8倍至S2，则加液量为：

Y=（3.8-1）× 0.5=1.4（ml）

即 0.5ml 的 S1 加 1.4ml 稀释液即得 S1 的 3.8 倍稀释液 S2

5EU/ （kg•h）

1500mg/（60kg•h）=0.20EU/mgL=

5EU/ （kg•h）

（12000mg/3）/（60kg•h）=0.075EU/mgL=

10mg/ml×0.2EU/mg

0.25EU/ml=8（倍）MVD=

0.25EU/ml

0.20EU/mg=1.25mg/mlMVC=


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7、试验相关知识

1）内毒素标准品的使用

（1）复溶

– 复溶2ml安瓿装的内毒素标准品，为了避免溶液在混合时溢出安瓿，我们建议在安瓿颈部上方开口加液。

– 复溶液的体积一般为1.0ml，或根据使用说明书加液。

（2）效价

– 厂家必须向用户提供一份效价分析证书（Certificate of Analysis，CoA），

– 效价分析证书上应注明：RSE/CSE ？ EU/ng；？ ng/瓶

2）鲎试剂的使用

– 使用前，应将鲎试剂置于室温环境下使其达到室温温度后再复溶使用

– 复溶鲎试剂后，应避免强烈振动产生泡沫

– 由于鲎试剂与内毒素凝集反应的不可逆性，反应过程中必须避免反应试管的振动造成假阴性

3）内毒素的清除

（1）冲洗

– 适用于器械组件、塞子等

– 可用加热等方法提高清除效率

（2）蒸馏

折流系统和地心引力阻止大分子量的LPS转变为蒸汽状态逸出

（3）反渗透

（4）超滤

（5）活性炭吸附

4）内毒素的灭活

（1）酸/碱水解

（2）氧化

– H2O2

（3）干热

– 250℃，>30分钟的干烤

开口部位


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三、凝胶法细菌内毒素检查技术

1、凝胶法BET试验程序

2、试验器具

3、鲎试剂灵敏度复核

4、干扰初筛试验

5、干扰试验

6、检查法

7、相关知识及技巧

1、凝胶法BET的实验程序

1）试验准备

2）确定供试品的内毒素限值

3）选择鲎试剂

4）计算最大有效稀释倍数或最低有效浓度

5）鲎试剂灵敏度复核

6）干扰初筛试验

7）干扰试验

8）日常检查

2、试验器具

1）器具的要求及处理

–玻璃器皿需经除热原处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用方法是玻璃器皿经清洗后>250℃至少干烤1

小时

–塑料器械应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械

–首选硼硅酸盐玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具

2）孵育反应仪器

– 恒温水浴箱

– 干式恒温仪

–孵育反应温度是鲎试验的重要条件参数之一

–现行法规对反应温度的要求较宽松（37±1℃）

–严格的实验条件是实验室水平的重要标志之一

–80年代发达国家已使用干式恒温仪取代水浴箱

–2000年版《中国药典》BET法开始接受干式恒温仪

TAL-40型试管恒温仪的特点

– 温控精确：37±0.2℃

– 发热均匀：<0.1℃

– 可定时及提示：0~90分钟可设定时

蜂鸣提示

– 试管免封口

– 使用方便


3、鲎试剂标示灵敏度的复核

1）实验目的

– 验证实验室的条件是否满足BET实验的要求

– 验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求

– 验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET检查用水等）是否满足BET实验的要求

2）实验步骤

– 恒温仪器的预热

– C溶液（标准内毒素溶液）的制备

– 鲎试剂的准备

– 加样及恒温反应

– 结果判断

– 数据处理

3）操作步骤示意图

4）灵敏度复核试验举例

（1）试剂

稀释为2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒素标准溶液（C溶液）

多次管：反应试管

轻轻转动瓶壁摇匀

每步稀释于旋涡混合器混合30秒

旋涡混合器混合15min 混匀混匀

BET水复溶BET水复溶

内毒素RSE或CSE 鲎试剂TAL

3

试剂名称

TAL

内毒素标准品（CSE）

BET水（W）

0.1mlTAL＋0.1mlCSE(RSE)，平行4管

NC：0.1mlTAL＋0.1mlBET水，平行2管

7℃±1℃，孵育60min±2min

混匀（水浴恒温需封口）

厂家规格标示效价

安度斯 0.1ml/支 0.25EU/m

安度斯 10ng/瓶 10EU/n

安度斯 50ml/瓶 <0.003EU

单次管：原安瓿

数

l

g

/ml

- 12 -

量

18

1

1


- 13 -

（2）C溶液的制备

（3）鲎试剂的准备

取0.1ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂18支，在安瓿颈部折断，按照阴性对照溶液D两支，标准内毒素溶液

每浓度平行4管排列：

用精确移液器准确吸取0.1mlBET水分别加入每支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解

（4）加样

用精确移液器分别吸取0.1ml的0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml的标准内毒素溶液，加入已复

溶的鲎试剂中，每浓度平行4管，吸取0.1mlBET用水（D溶液）加入另外两支鲎试剂内，作为阴性对照。

（5）恒温反应

– 将加样完的鲎试剂混合液轻轻摇匀（避免产生气泡），放入37±1℃的恒温器中孵育60±2分钟（孵育过程中

0.25EU/ml

30s30s

1EU/ml

30s30s

2.0ml

100EU/ml

0.4ml

BET水

1.0ml

10EU/ml

0.4ml

3.6ml

0.5EU/ml

2.0ml

3.6ml 2.0ml 2.0ml

0.125EU/ml

30s

2.0ml

2.0ml

0.06EU/ml

30s

2.0ml

2.0ml

阴性对照溶液D

0.06EU/ml

0.25EU/ml

0.125EU/ml

0.5EU/ml

CSE

TAL

0.1ml

0.5EU/ml

0.1ml

0.1ml

0.25EU/ml

0.1ml

0.1ml

0.125EU/ml

0.1ml

0.1ml

0.06EU/ml

0.1ml

0.1ml

NC

0.1ml

加样顺序一般从低浓度到高浓度

混合5分钟


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避免振动影响凝胶形成）。

– 若恒温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污染。

（6）结果判断

将反应试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180℃，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳

性，记录为“＋”；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为“-”。

（7）数据处理

内毒素标准溶液浓度(EU/ml)平行管

0.5 0.25 0.125 0.0625

NC反应终点浓度

X

（lg 反应终点浓度）

1 + + + — 0.125 -0.903

2 + + — ——

0.25 -0.602

3 + + — — 0.25 -0.602

4 + + — ——

0.25 -0.602

λc =lg-1（ΣX/4）

=lg-1{[(－0.903)＋(－0.602)＋(－0. 602)＋(－0. 602)]/4}

= 0.210EU/ml

即在本批号鲎试剂的复核灵敏度（λc）为 0.21EU/mL

药典要求：当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵

敏度值。

结论：本批TAL的灵敏度标示值符合规定。

4、干扰初筛试验

1）目的及原理

– 本试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验，通过对一系列含2λ内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应，初步筛选出对鲎试验

无干扰的浓度

– 本试验可减少干扰试验的盲目性

2）试验步骤

• 供试品限值的确定

• 供试品最大有效稀释倍数的确定

＋＋＋＋－－－－

阳性阴性

结果判断：反应管缓缓倒转180º

阳性(+)：凝胶不变形，不从管壁滑脱者

阴性(-)：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者

试验符合要求的基本条件：

NC管全部阴性（－－）

2λ管全部阳性（＋＋＋＋）

0.25λ管全部阴性（－－－－）


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• 试剂的选择

• 反应溶液的制备

• 加样及反应

• 结果判断

3）干扰初筛试验举例

（1）供试品限值

– 硫酸庆大霉素，100ml/瓶，20000U/ml；

– 药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.5EU/1000U

（2）最大有效稀释倍数的确定

– 最大有效稀释倍数MVD=cL/λ

– 使用λ=0.5EU/mL 灵敏度的鲎试剂时， MVD0.5=

– 由此可计算出使用不同λ时所对应的 MVD：

（3）试剂

为了方便试验，干扰初筛试验中一般选择灵敏度较低的鲎试剂作试验

（4）各反应溶液的制备

溶液C的制备:

0.5EU/ml

20000U/ml × 0.5EU/1000U

灵敏度λ（EU/mL） 0.5 0.25 0.125 0.06 0.03

对应的MVD（倍） 20 40 80 160 320

试剂名称厂家规格标示效价数量

TAL 安度斯 0.1ml/支 0.25EU/ml 24

内毒素标准品（CSE）安度斯 10ng/瓶 10EU/ng 1

BET水（W）安度斯 50ml/瓶 <0.003EU/ml 1

溶液编号 A D

溶液内容 S20 S40 S80 S160 S320 W

平

行

管

溶液编号 B C

溶液内容 S20E 2λ S40E 2λ S80E 2λ S160E 2λ S320E 2λ E 2λ

平

行

管

E100

0.4ml

3.6ml WE10

0.4mlE1

0.5mlE0.5

溶液C： E2λ

=20（倍）


- 16 -

溶液A的制备：

溶液B的制备：

注意事项：制备溶液C和B时，每一步的混合液需在旋涡混合器上混合至少30秒。

（5）加样及反应

• 用移液器准确吸取0.1ml BET水将鲎试剂复溶

• 取0.1ml相应溶液C、B、A加入鲎试剂反应管，每浓度平行2管

• 另外取0.1ml BET水作为阴性对照溶液D加入鲎试剂反应管

（6）结果判断

• 当溶液A、D均为阴性；溶液C均为阳性时，试验有效。

• 溶液B系列中，第一个出现阳性结果的浓度即初步将其判断为样品的无干扰浓度。本试验中的样品无干扰浓度为≤S40 。

3.6ml W 0.5ml W

S原液

0.4ml

3.6ml W

1.4ml

1.4ml W

S20

1.4ml

1.4ml W

S40

1.4ml

1.4ml W

S80

1.4ml

1.4ml W

S160

1ml

1ml WS320

S10

溶液A

E1

S10 0.5ml

0.5ml

S20 E0.5

E1

S20 0.5ml

0.5ml

S40 E0.5

E1

S40 0.5ml

0.5ml

S80 E0.5

溶液B： SE2λ

溶液编号 A D

溶液内容 S20 S40 S80 S160 S320 W

平

行

管

溶液编号 B C

溶液内容 S20E 2λ S40E 2λ S80E 2λ S160E 2λ S320E 2λ E 2λ

平

行

管

E1

S80 0.5ml

0.5ml

S160 E0.5

E1

S160 0.5ml

0.5ml

S320 E0.5


- 17 -

5、干扰试验

– 通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查

有干扰。

– 至少对3批样品进行干扰试验。

1）试验步骤

• 供试品限值的确定

• 鲎试剂的选择

• 最大有效稀释倍数的确定

• 反应溶液的制备

• 加样及反应

• 结果判断

（1）供试品限值

– 硫酸庆大霉素，20000U/ml；药典要求内毒素限值L=0.5EU/1000U

（2）试剂选择

– 根据干扰初筛试验的结果，供试品在 40 倍稀释（对应鲎试剂灵敏度为 0.25EU/ml）时无干扰

– 一般不选择第一个出现阳性结果的供试品浓度作干扰试验。本试验我们选择灵敏度为 0.125EU/ml 的鲎试剂进行干扰验证

试验。

（3）最大有效稀释倍数的计算

MVD=cL/λ=80（倍）

（4）各反应溶液的制备

试剂名称厂家规格标示效价数量


内毒素标准品（CSE）安度斯 10ng/瓶 10EU/ng（CoA） 1


溶液编号 C D

溶液内容 E0.25 E0.125 E0.06 E0.03 W

平

行

管

溶液编号 B A

溶液内容 S80E0.25 S80E0.125 S80E0.06 S80E0.03 S80

平

行

管


溶液C的制备：

CSE (E4λ )、E2λ 、 Eλ、 E0.5λ、 E0.25λ

（即E0.5 、E0.２5 E0.125、 E0.06、 E0.03）

溶液A

溶液B的

（5）加

稀释

0.4ml

BET水1.0ml

1.8ml1.8ml1.8ml

1.8ml 1.8ml3.6ml 1.8ml

0.4ml

3.6ml

1.8ml

1.8ml

1.8ml

1.8ml

硫

E0.5

S4

0.25(

S8

(S

E0.1

S

混合5分钟

的制备：

制备

样及反应

30s

100

CSE

10(EU/ml)

酸庆大霉素

S

0.3ml

S

2

0 0.5ml

0.5ml

S80 E0.25

EU/ml2λ)

0.125EU/ml(λ)

0.0

0 E0.25

80E2λ)S80 E0.125

(S80Eλ)S(S

25

40 0.5ml

0.5ml

S80 E0.06

0.12

30s30s

0.5 0. 25

30s

1.0

30s

10

.7 ml

1.0ml

3.0 ml

溶液A：S80

BET水

0.6ml

0.6 ml

S40

6EU/ml(½ λ)

0.03EU/ml(¼ λ)

BET水

80 E0.06

80E½ λ)S80 E0.03

(S80E¼ λ)S80

E0.25

S40 0.5ml

0.5ml

S80 E0.125

25

E0.0625

S40 0.5ml

0.5ml

S80 E0.03

5 0. 06

30s 30s

0. 03

溶液C

- 18 -

125


- 19 -

– 36支鲎试剂，先用0.1ml BET复溶,再加相应的溶液0.1ml

– 37 ±1℃ 反应60±2分钟

（6）结果判断

• 反应结果

• 结果计算及判断

• 药典要求：

当溶液 A 和阴性对照溶液 D 的所有平行管都为阴性，且 0.5λ≦Es ≦2λ 时，试验有效。

当 0.5 Es ≦ Et ≦ 2 Es 时，供试品在该浓度下无干扰。

本试验： 1）0.5λ=0.06 ，2λ=0.25

Es=0.125，0.5λ< Es < 2λ，有效!

2）0.5Es=0.06，2Es=0.25

Et=0.104，0.5 Es < Et < 2 Es ，无干扰！

• 结论：使用灵敏度λ=0.125EU/ml 的鲎试剂对样品(S)的 80 倍稀释液(S80)作 BET，无干扰。

6、检查法

1) 凝胶法限量试验

（1）反应项目设置

溶液编号 B A

溶液内容 S80E0.25 S80E0.125 S80E0.06 S160E0.03 S80

平

行

管

溶液编号 C D

溶液内容 E 0.25 E 0.125 E0.06 E0.03 W

平

行

管

ES=lg-1

4

(lg0.125) ×4= 0.125 EU/ml

Et=lg-1 = 0.104 EU/ml(lg0.06) +(lg0.125) ×3

4

溶液编号 A B C D

溶液内容 S SE2λ E2λ W

平

行

管


- 20 -

（2）试剂

–根据干扰试验结果，供试品在 80 倍稀释，使用鲎试剂灵敏度为 0.125EU/ml 条件下，对 BET 无干扰

–本试验选择 TAL 灵敏度为 0.125EU/ml，供试品稀释 80 倍检查

（3）反应溶液制备

溶液 C：

溶液 A：

溶液 B：

（4）加样及反应

• 8支鲎试剂，先加0.1mlBET水复溶；

• 再加入相应的溶液，每浓度平行2管

（5）结果判断溶液编号 A B C D

溶液内容 S80 S80E0. 5 E0. 5 W

试验有效

合格

不合格

需复检

复检合格

复检不合格

试剂名称厂家规格灵敏度或效价数量


CSE 安度斯 10ng/支 10EU/ng 1


硫酸庆大霉素（S） — — 100ml/支 20000U/ml 1

S原液

0.3ml

2.7ml W

S10

0.6ml

1.8ml W

0.6ml

0.6ml WS80

E100

0.4ml

3.6ml WE10

0.4ml

3.6ml WE1

1.6ml

1.6ml WE0.5

S40

0.6ml

0.6ml W

E0.25

溶液C

溶液A

溶液B

E0.5

S400.6ml

0.6ml

S80 E0.25

溶液D（NC，0.1mlW）

溶液C（ E0.25 ）

溶液A（ S80 ）

溶液B（ S80 E0.25 ）


- 21 -

– 当需要复检时，A溶液平行4管，若所有平行管均为阴性，则供试品合格；否则不合格。

2）凝胶法半定量试验

（1）反应项目设置

注：A 为不超过 MVD 并且通过干扰实验的供试品溶液，从通过干扰试验的稀释倍数

开始用检查用水稀释成 1 倍，2 倍，4 倍，8 倍，最后的稀释倍数不得超过 MVD。

B 为 2λ 浓度标准内毒素的溶液 A（供试品阳性对照）

C 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列

D 为阴性对照

（2）凝胶半定量试验举例

i. 试剂

– 凝胶半定量法一般选用灵敏度较高的鲎试剂

ii. 各溶液的制备

i）溶液 C 的制备

–将 CSE 稀释成 E0.125, E0.06, E0.03, E0.015 浓度溶液

编

号

内毒素浓度/加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数

A 无/供试品溶液检查用水 1

2

4

8

— —— —— —— —

2

2

2

2

B 2λ/供试品溶液 1 2λ 2

C 2λ/检查用水检查用水 1

2

4

8

2λ

1λ

0.5λ

0.25λ

2

2

2

2

D 无/检查用水 — — — — — — 2

鲎试剂（TAL） 0.06EU/ml

内毒素（CSE） 10ng/瓶；10EU/ng

BET水（W） 50ml/瓶

供试品(生理盐水） L=0.5EU/ml

E0.125

1.8ml

1.8ml WE0.06

1.8ml

1.8ml W

E0.03

1.8ml

1.8ml WE0.015E1.25

0.4ml

3.6ml W


- 22 -

ii）溶液 A 的制备

–将供试品（S1）稀释至 2 倍、4 倍、8 倍

iii）溶液 B 的制备

iii. 加样及反应

iv. 结果判断

–试验有效条件：

溶液 D：－－

溶液 B：＋＋

溶液 C：E0.125＋＋且 E0.015－－（即 0.5λ≤λc≤ 2λ ）

v. 结果计算

– 所有平行管的反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[CE=Lg-1（∑X/2）]：

溶

液

A B C D

S1 S2 S4 S8 S1E0.125 E0.125 E0.06 E0.03 E0.015 W

平

行

管

S1

1.8ml

1.8ml WS2

1.8ml

1.8ml WS4

1.8ml

1.8ml WS8

E1.25

S11.8ml

0.2ml

S1 E0.125近似稀释法

溶

液

A B C D

S1 S2 S4 S8 S1E0.125 E0.125 E0.06 E0.03 E0.015 W

平

行

管

A 反应终点倍数反应终点浓度

（EU/ml)S1 S2 S4 S8

平行管 2 2×0.06=0.125

1 1×0.06=0.06

lg-1 lg0.125+lg0.06


- 23 -

供试品内毒素浓度（CE）=

– 当溶液 A 所有平行管均为阴性时，供试品溶液的内毒素浓度小于 λ 乘以初始稀释倍数（本试验初始稀释倍数为 1）；当溶液 A

所有平行管均为阳性时，供试品溶液内毒素浓度大于或等于 λ 乘以最大稀释倍数（本试验最大稀释倍数为 8）

7、相关知识及实验技巧

1）关于 pH 值的要求

–CP2005 年版 BET 法要求“一般要求供试品的 pH 值在 6.0~8.0 范围”

–USP 的 BET 法要求是供试品与鲎试剂的混合液的 pH 值在 6.0~8.0；

–推荐的做法：

在验证试验时，测定供试品溶液与鲎试剂的混合液的 pH 值，如果满足要求（pH 值在 6.0~8.0），则在日常检查试验中无需调节

pH 值。如果不满足要求，那么需进行 pH 的调节，且日常检查试验时，也必须进行同样的调节。

2）溶液B的制备方法

如需制备S4E0.25（供试品4倍稀释液，其中含有0.25EU/ml的内毒素浓度）

（1）50/50法

该法不能制备 S1E2λ

（2）近似法

3）一步法制备溶液C系列

如要制备E0.5，E0.25，E0.125及E0.06：

2=0.08(EU/ml)

E0.5

S20.8ml

0.8ml

S4 E0.25

E2.5

S41.8ml

0.2ml

S4 E0.25

E0.5

0.8ml

0.8mlE0.25

E0.125

E0.06

0.8ml

2.4ml

0.4ml

2.8ml


四、光度测定法细菌内毒素检查技术

1、光度测定法方法学分类

2、光度测定法原理

3、动态比浊法BET

4、终点比色法BET

1、光度测定法方法学分类

2、光度测定法原理

1) 光电转换原理

–光度测定法是利用鲎试剂与内毒素的混合物在反应过程的透光度变化与内毒素浓度的关系来定量检测内毒素的一种方法。

–当一束光线进入如下光电转换装置时，该装置将产生电流 I，我们称 I 为透光强度。

设：初始时的透光强度为 Is，某时刻的透光强度为 It，

定义 1：透光度（Rt）：

Rt=It/Is(%)

初始时 It=Is，Rt=100%，Rt 曲线变化趋势由高

定义 2：吸光度(OD)：

OD= -lg(It/Is)

初始时 It=Is，OD=0，OD 曲线变化趋势由低

选择不同的参数（Rt 或 OD）将得到不同变化趋势的

2）TAL与内毒素反应的动态曲线(Rt-T曲线)

以透光度（Rt）为纵座标，时间（T）为横座标，把 TAL

便得到该反应的动态曲线如图 2：

光度测定法

（定量法检测）

浊度法

（比浊法）

显色法

（比色法）

动态浊度法

终点浊度法

动态显色法

终点显色法

入射光

反应混合物

透射光

透光容器

光

如图 1。

至低，如图 2。

至升高，如图 3。

动态曲线。

与内毒素反应引起反应混合液透光度

I

电池

Is

It

Ie

I

- 24 -

的变化连续地描绘在座标系中，

T(分)图1


3）TAL

以吸

标系

4）动态

把标准

5) 光度测

6) 动态

R

Rt（%）

动态曲线100

100

与内毒素反应的动态曲线(OD-T曲线)

光度（OD）为纵座标，时间（T）为横座标，把 TAL 与内毒素反应引起反应混合液吸光度的变化连续地描绘在座

中，便得到该反应的动态曲线如图 3：

T（分）

孕育期反应期结束

图2

OD

动态曲线

- 25 -

曲线的特点

内毒素制备成三个浓度 C1、C2、C3（ C1>C2>C3 ），分别与 TAL 反应，描绘出反应的动态曲线如下图：

定法试验的相关变量

法原理

t（%）

T（分）

C2C1 C3

分析动态曲线可看出：

内毒素浓度越高，孕育期越短；

内毒素浓度越高，反应期曲线越陡；

内毒素浓度越高，进入结束期越快。

C3

C2C1

Rt （%）

T（分）

相关变量：

内毒素浓度(C)

透光度(Rt或OD）

反应时间(T)

图3

孕育期反应期结束

T（分）0


原理：固定透光度（Rt）建立内毒素浓度与反应时间关系的标准曲线（C-T 曲线），用供试品的反应时间比对标准

曲线，得出供试品的内毒素浓度。这里的反应时间是指反应混合液的透光度到达预设透光度值（R0）的时间。

（1）建立标准曲线

（2）测

用鲎

量 C

7）终点法原

原理：固定

内毒素浓度

（1）建立

（2）测定样

Rt(%)

R1

R3

R2

100

Rt%

92

100预设透光度值（R0）

C1

C2 C3

回归分析

Rt

92

LgT

T3

T2

T1

LgT=b-kLgC

定样品

试剂与未

s。

理

反应时间

。

标准曲线

品内毒素

预

T1

(%)

内毒素浓

知内毒素

，建立内

浓度（

设反应终

T2

Ts

度（

含量的

毒素浓

Cx）

止时间

C1

T3

Cs）

供试品（S）反应，得到反应时间 Ts，比对 C-T 关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含

度与透

终

（To）

T(分)

Cs

LgT=b-kLgC

LgT

C3 C2 C1 LgC

光度关系的标准曲线（C-Rt 曲线），用供试品的透光度

点时间

T(分)

C2

C3

比对标准曲线

T(分)

R0

Ts

Rt

R3

R2

R1

C3

回归分析

比

Cs

- 26 -

对标准曲线，得出供试品的

LgC

C2 C1

Rt=b-K·C


用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品（X）反应，得到透光度值 Rx，比对 C-Rt 关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含量

Cx。

3、动态比浊法BET

1）试验仪器及器具

– 动态微孔平板仪或试管仪

– BET 软件

– 微孔平板、反应试管

Rx

100

Rt(%)

To

Rt(%)Rt=b-K·C

Rx比对标准曲线

美国Charles River Endosafe 内

毒素全自动测定系统

- 27 -

Cx

T(分) Cx

美国 Charles River Endosafe 动态

测定仪,使用96孔微孔板

日本和光纯药株式会社

Toxinometer

32孔动态试管仪


- 28 -

2）动态比浊法试验程序

（1）器具的准备

（2）验证试验

– 标准曲线的可靠性试验

– 干扰试验

（3）检查法

（1）试验器具的准备

美国Bio-Tek Elx808IU

英国Lab Kinetics公司

ATi动态试管仪, 96孔

湛江安度斯公司开发的BET专用软件

生物探针-2002

器具分类器具名称

反应试管玻璃试管（外径8×75mm或10×75mm）

稀释容器大口径玻璃试管

移液器具刻度吸管及洗耳球，或移液器及无热原吸头等

其他试管架、酒精灯、异丙醇浸泡的无纺布、镊子、剪刀、砂轮、

封口膜或医用胶布、标记纸等

凡是与供试品或反应试剂接触的器具，必须经除热原处理。通常玻璃器具

需经250 ℃、60分钟的干烤处理


（2）标准曲线的可靠性试验

I. 试验目的

– 验证实验室的条件是否满足 BET 试验的要求

– 验证实验人员的实验技能是否满足 BET 试验的要求

– 验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET 水等）是否满足 BET 试验要求

II. 试剂

III. 反应项目

•将标准内毒素制备成至少 3 个浓度的稀释液，相邻浓度间稀释倍数不得大于 10，最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测

限

•实验前，先预热动态仪，使其达到反应温度

IV. 溶液C的制备

V. 鲎试剂的

① 取 TAL

② 用刻度

③ 取反应

VI. 软件系统

– 进入动

– 进入数

试剂名称厂家装量规格

动态浊度法TAL 安度斯 1.25ml/支 10EU/ml~0.03EU/ml

内毒素标准品（CSE）安度斯 10ng/支 10EU/ng（CoA）

BET水（W）安度斯 25ml/瓶内毒素<0.003EU/ml

项目平行管

阴性对照溶液(D) O O

O O OO O OO O O

内毒素标准（C）

(EU/mL)

0.03125

0.25

2.0

30s

0.4ml

30s

0.4ml

30s

0.8ml

30s

0.4ml

BET水 1.0ml 2.8ml 2.8ml3.6ml 3.2ml

CSE/E100 E10 E2 E0.25 E0.0313

混合5分钟

准备

1 支，用砂

吸管或移液

试管 11 支，

的设置

态仪系统软

据采集模

轮在安瓿颈划痕，擦拭后从安瓿颈处折断（避免玻

器准确吸取 BET 水 1.25ml 沿瓶壁加入安瓿内，轻

按 2.0 EU/ml、0.25 EU/ml、0.03125EU/ml 各浓

件，根据试验要求，设置相关参数，如反应时间、

块，使软件进入待采集状态

璃屑落入安瓿

轻转动瓶壁，

度平行 3 管，

预设透光度

- 29 -

内）；

使内容物全部溶解（避免产生气泡）；

NC 平行 2 管标记；

值等。


- 30 -

VII. 加样反应

– 先将复溶好的鲎试剂分装至各反应试管中，0.1ml/管；

– 再将反应溶液加入各反应管中，一般按照从低浓度到高浓度的顺序加样，首先加阴性对照溶液；

– 加样完成后，将每支反应管内的混合液轻轻混匀后，插入动态仪中反应

VIII.填写参数

在软件给出的表格中填写反应项目及相应参数

IX. 结果判断

• 药典要求

– 阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间

TAL

2.0EU/ml

0.1ml

0.1ml

0.1ml

0.25EU/ml

CSE

0.1ml

0.03125EU/ml

0.1ml

NC

BET水

0.1ml 0.1ml 0.1ml

加样顺序从低浓度到高浓度


- 31 -

– 标准曲线的相关系数|r|≥0.980

• 厂家建议值

– 变异系数CV%<10%

• 关于相关系数

– 当对一组数据作线性回归分析时，以相关系数r表示其标准曲线的线性状况，即该组数据的相关状况。当r值为正时，表

示该组数据呈正相关关系；r值为负时，该组数据为负相关关系。当r值的绝对值|r|=1时，其标准曲线的线性最好。


- 32 -

（3）干扰初筛试验

I. 目的及原理

– 只有在无干扰情况下，样品的内毒素检测结果才是有效的。

– 通过检测从供试品原液到其MVD或MVC之间的适当浓度的稀释液的内毒素回收率，初步判断供试品的干扰情况。

II. 试验步骤

（i）供试品限值的确定

（ii）试剂的选择

（iii）供试品最大有效稀释的计算

（iv）反应溶液的制备

（v）加样及反应

（vi）结果判断

III. 干扰初筛试验举例

（i）供试品限值

– 硫酸庆大霉素，100ml/瓶，5000U/ml；

– 药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.5EU/1000U

（ii）试剂

• 本试验使用鲎试剂的检测范围为10~0.03EU/ml，选择标准曲线浓度为2、0.25、0.03125EU/ml

（iii）最大有效稀释倍数的计算

• 光度测定法中，供试品最大有效稀释倍数计算公式：

MVD=cL/λ，其中λ为标准曲线最低点浓度

• 本试验，

（iv）反应溶液的制备

• 溶液C的制备：

• 溶液A的制备：

试剂名称厂家装量规格

动态浊度法TAL 安度斯 1.25ml/支 10EU/ml~0.03EU/ml

内毒素标准品（CSE）安度斯 10ng/支 10EU/ng（CoA）

BET水（W）安度斯 25ml/瓶内毒素<0.003EU/ml

MVD=5000U/ml x 0.5EU/1000U

0.03125EU/ml=80（倍）

E100

0.4ml

3.6ml W

E10

0.8ml

3.2ml W

E2

0.4ml

2.8ml W

E0.25

0.4ml

2.8ml W

E0.03125

E0.5

0.8ml

2.4ml W

S原液

0.4ml

3.6ml W

S10

1.4ml

1.4ml W

S20

1.4ml

1.4ml W

S40

1.4ml

1.4ml W

S80

备用液


- 33 -

• 溶液B的制备：

（v）加样及反应

（vi）结果判断

• 药典要求

– 1、阴性对照的反应时间（TD ）大于标准曲线最低浓度的反应时间（Tλ）

– 2、标准曲线的相关系数|r|≥0.980

– 3、回收率R满足：50% ≤R ≤200%

• 厂家建议值

– 4、变异系数CV%<10%

（vii）回收率的计算

光度测定法试验中，在供试品检查浓度的溶液中,添加标准曲线中点或靠近中点的内毒素浓度,根据回收的内毒素浓度与添加

的内毒素浓度的比值(回收率 R)，判断供试品溶液对试验的干扰程度。R 的计算公式如下：

Ct：试验测出的供试品溶液的内毒素含量

Cs ：试验测出的加入λm 标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量

λ m：标准曲线的中点或靠近中点的已知浓度内毒素

光度测定法规定：当 R 在 50~200%之间时，认为在此试验条件下该供试品溶液对试验无干扰。

溶液B溶液B溶液B溶液A溶液A

E0.5

S10

0.5ml

0.5ml

S20 E0.25

E0.5

S20

0.5ml

0.5ml

S40 E0.25

E0.5

S40

0.5ml

0.5ml

S80 E0.25

E0.03125

E0.25

E2

BET水

S20

S40

S80

S20E0. 25

S40E0. 25

S80E0. 25

• 取TAL两支，参照标准曲线可靠性试验中的方

法将其复溶；

• 复溶鲎试剂后，运行软件，使其进入待采集

状态；

• 将两支复溶好的鲎试剂溶液合并在一起，轻

轻混匀避免产生气泡；

• 将鲎试剂液分装至20支反应试管中，0.1ml/

管；

• 将相应的溶液A、B、C、D加至反应管中，

0.1mL/管，每浓度平行2管

溶液A

Cs-Ct

m

R=

溶液D

溶液C


- 34 -

（viii）本试验结果

（4）干扰试验

I. 根据干扰初筛试验结果，确定选择供试品的无干扰浓度

• 选择3批供试品进行干扰验证试验

• 溶液的制备方法与干扰初筛试验相同

II. 溶液的制备

相关系数绝对值|r|=0.9949>0.980

TD（>3600s）>Tλ

20倍回收率

40倍回收率

80倍回收率

试验有效

有干扰

无干扰

试验有效

无干扰

有干扰

不理想

无干扰


- 35 -

A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液

B为加入m内毒素且与A溶液有相同稀释倍数的供试品溶液

C为用于制备标准曲线的内毒素标准溶液

D为阴性对照

III. 反应项目设置

IV. 接受标准

• 药典要求

– 1、阴性对照的反应时间（TD ）大于标准曲线最低浓度的反应时间（Tλ）


– 3、各批样品的回收率R满足：50% ≤R ≤200%

• 厂家建议值


编号内毒素浓度配制内毒素的溶液平行管数

A 无供试品溶液不少于2个

B 标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设

为λm）

供试品溶液不少于2个

C 至少3个浓度（最低点设定为λ）检查用水每一浓度不少于2个

D 无检查用水不少于2个

溶液编号项目平行管

D 阴性对照 O OC 内毒素标准

(EU/mL)

E0.031 O OE0.25 O OE2 O O

A1 S80 O OB1 S80E0.25 O OA2 S80 O OB2 S80E0.25 O OA3 S80 O OB3 S80E0.25 O O

• 3批样品都在同一浓度做干扰验证试验

• 每浓度平行2管


- 36 -

（5）检查法（日常检查）

I. 根据干扰试验结果，选择无干扰的供试品浓度进行BET日常检查

II. 各反应溶液制备及反应项目设置与干扰试验相同

III. 结果判断

• 药典要求

– 1、阴性对照的反应时间(TD)大于标准曲线最低浓度的反应时间(Tλ)


– 3、各批样品的回收率R满足：50% ≤R ≤200%

• 厂家建议值


• 若供试品溶液A所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定，

否则判供试品不符合规定

• 无复测要求

4、终点比色法BET

1）原理

– 当鲎试验的显色反应到达预设的反应终止时间（T0）时，反应混合液的吸光度值（OD）与内毒素浓度（C）成正比，利

用标准内毒素建立OD-C关系的标准曲线，利用标准曲线定量测定供试品的内毒素含量。

2）仪器

– 分光光度计

– 酶标仪器

– 37℃恒温仪器

3）试验程序

（1）试验准备：仪器及用具等

（2）确定药品的细菌内毒素限值（L）

（3）选择终点比色法试剂盒

– 终点比色法鲎试剂

– 显色基质（底物）

– 工作标准内毒素（CSE）

（4）计算供试品的最大有效稀释（MVD）或最低有效浓度（MVC）

（5）标准曲线的可靠性试验

（6）干扰试验（验证）



(EU/mL)

E0.031 O OE0.25 O OE2 O O

A S80 O OB S80E0.25 O O


- 37 -

（7）检查法（日常检查）

4）终点比色法日常检查举例

I. 试剂及器具

II. 试验步骤

• 1、开启微孔平板恒温器预热

• 2、溶液C的制备

根据试剂盒说明书标准曲线浓度的要求，制备标准内毒素系列溶液，如1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml及0.125EU/ml（λ）；

• 3、溶液A、B的制备

MVD=L/λ=0.5/0.125=4（倍）

将供试品稀释到S2、S4（溶液A）

0.6ml S2+0.6E1.0 1.2ml S4E0.5（溶液B）

•4、反应项目设置

•5、取微孔平板放到37℃恒温器上；每孔加0.05ml相应溶液（A、B、C及D溶液），每溶液浓度平行2孔；加样完毕恒温孵育

5分钟* ；

•6、复溶鲎试剂及显色基质（底物）；

•7、每孔加入0.05ml鲎试剂，恒温7分钟* ；

•8、每孔加入0.1ml显色基质溶液，恒温5分钟* ；

•9、每孔加入0.1ml终止液；

•10、把微孔平板放入酶标仪中用405nm波长测吸光度值；

•11、根据各内毒素浓度对应的吸光度值建立内毒素浓度与吸光度值的标准曲线；

终点比色法试剂盒终点比色法试剂

显色基质（底物）

工作标准内毒素（CSE）

酶标仪 405nm

微孔平板 96孔，无热原

微孔平板恒温器提供37℃恒温环境

供试品（S）生理盐水，L=0.5EU/ml

O OE0.5



(EU/mL)

E0.125 O OE0.25 O O

E1 O OA S4 O OB S4E0.5 O O


- 38 -

•12、利用标准曲线计算A、B溶液的内毒素含量及供试品的回收率。此计算一般由仪器自动进行。判断实验的有效性与动态浊

度法相同；

*此时间根据终点比色试剂盒使用说明书要求确定


- 39 -

五、细菌内毒素检查的常见干扰及消除

1、BET干扰的普遍性

– 一项对人用药品与鲎试验相容性的研究证实了干扰的影响范围。在所研究的品种中仅30%的药品可以不经任何处理直接进行

BET；有97%的干扰问题可以通过稀释供试品的方法去消除。

2、干扰的表现

1）凝胶法

– FDA的鲎试验指南中规定，同一标准内毒素的阳性对照与阳性样品对照系列的反应终点存在显著差异时，即可确定为存在干

扰。

– CP2005规定无干扰条件：

0.5λ≦Es ≦ 2λ；0.5Es ≦ Et ≦ 2Es

– USP27规定无干扰条件：

0.5λ ≦ Es ≦ 2λ；0.5λ ≦ Et ≦ 2λ

2）光度法

– CP、USP规定无干扰条件：

50% ≦ R ≦ 200%

– FDA规定无干扰条件：

50% ≦ R ≦ 150%

1

平行

管数

溶液 C（Es）

2λ λ ½ λ ¼ λ

－+ －—

2 －+ －—

3 －+ －—

4

平行

管数

溶液B（Et）

－—

－—

－—

－—

－—

－—

－—

1

2

3

4

－+ －+

－+ －+

－+

－+－+

－+ －—

－+

－—

－SE¼ λ－SE½ λ－SE2λ

－SEλ

－+ －—

－+－—

－+ －—－—

－+

平行

管数

溶液C（Es）

2λ λ ½ λ ¼ λ

1 －+ －—

2 －+ －—

－+ －—

平行

管数

溶液B（Et）

－+

－+ －—

－+ －—

－+ －—

1

2

3

4

－+ －+

－+ －+

－+

－+－+

－+ －—

－+

－+－SE¼ λ－SE½ λ－SE2λ

－SEλ

－+ －+

－+－+

－+ －+－+－+

3

4

不符合CP要求，但符合USP要求符合CP要求，但不符合USP要求

1

平行

管数

溶液 C（Es）

2λ λ ½ λ ¼ λ

－—

－—

2 －—

－—

3－—

－—

4

平行

管数

溶液B（Et）

－—

－—

－—

－—

－—

－—

－—

1

2

3

4

－+ －+

－+ －+

－+

－+－+

－+ －—

－—

－—

－SE¼ λ－SE½ λ－SE2λ

－SEλ

－+ －+

－+ －+

－+ －+－+－+

最理想的无干扰状况


- 40 -

3、干扰的类型

• 抑制

– 供试品含有的内毒素浓度≥2倍检测试剂的灵敏度，但检测结果仍为阴性，称之为假阴性。

• 增强

– 供试品含有的内毒素浓度低于检测试剂灵敏度的1/2，但检测结果仍为阳性，称之为假阳性。

4、抑制的来源

• 内毒素激活的酶反应受抑制

– pH

– 二价阳离子的减少

– 酶的改良

• 内毒素损耗

– 吸附

– 损耗

5、抑制的解决办法

– 鲎试验的正常反应需要中性的pH值、一定浓度的钠离子及二价阳离子；

– 用BET水稀释供试品可以解决大多数情况下的抑制

• pH值

– 鲎试验的反应混合液（TAL+供试品）的 pH 值应在 6~8 范围内。

– 用BET水在容许范围对供试品内进行稀释

– 用缓冲液制备样品稀释液

– 用酸、碱或缓冲液来调节pH

• 二价阳离子

– 在含有鳌合剂的样品制备中使用MgSO4缓冲剂可平衡Ca++

、Mg++

离子的水平

• 蛋白和酶的改良

– 血浆和血清中的丝氨酸蛋白酶可经加热处理使其变性；

某些蛋白的变性或酶的抑制原料需要用超滤方法去除

• 内毒素损耗

– 在标准内毒素制备及使用过程，需要经常旋涡混合其溶液

– 避免使用对标准内毒素有吸附作用的实验器具

6、增强的来源和解决方法

1）来源

– β-葡聚糖是造成鲎试剂结果假阳性的一个已知来源。

– USP24-NF-19 第二补充版 BET 法的要求：

“除了内毒素，鲎试剂还与某些β-葡聚糖反应，一些经处理而制备的鲎试剂不会与β-葡聚糖反应，应用这种鲎试剂检测含葡聚

糖的样品”

2）解决方法

– 用湛江安度斯公司的抗增液复溶鲎试剂可以消除（1-3）β-D 葡聚糖的干扰。

– 湛江安度斯公司的 TAL，可以抵抗一般水平的β-葡聚糖干扰。


- 41 -

E0.03

E0.3

E3.0

NC

每个浓度的标准内毒素溶液分别与抗增液

复溶的鲎试剂及BET水复溶的鲎试剂反应

0.1Mg/ml葡聚

糖（抗增液）

0.1Mg/ml葡聚糖

0.1Mg/ml葡聚糖+E0.3

（抗增液）

0.1Mg/ml葡聚

糖+E0.3

0.1Mg/ml葡聚糖（抗增液）

不存在干扰

0.1Mg/ml葡聚糖出现明显

的增强


- 42 -

六、细菌内毒素检查法在药品生产质控的应用

1、鲎试验对药品生产质控的意义

1）GMP的意义在于使人们对产品质量的控制从传统的成品检验把关，上升到对产品生产全过程进行有效监控的现代质量管理。

2）医药领域中，在GMP条件下“热原就是内毒素，控制内毒素就控制了热原”已成为一致的认识。基于这种认识，许多国家

的药典药品已由细菌内毒素检查项取代热原检查项并且成为了发展的趋势，将会有越来越多的药典品种使用鲎试剂检查。

不仅如此，鲎试验法已在医药工业上成为注射药品生产质控的最好方法之一，它为众多的药品生产企业带来显而易见的经

济效益。

3）中国和美国是世界上应用鲎试剂最早的国家，也是鲎试剂产量及用量最多的国家。尽管如此，两国在鲎试剂应用的水平、

程度及范围上仍有明显的差异。中国药典2005年版收载的BET品种有160多种，而USP收载的BET品种超过700种

2、生产质控的基本要求

1）质量控制分事前控制和事后控制

药品生产过程的质量控制应属于事前控制

2）生产过程的质控又分静态质控及动态质控

3）对检验方式的要求

取样方便、微量，操作简单、快速，检查准确、灵敏，结果可靠并能自动处理数据

4）鲎试验法是药品生产过程热原控制的最好方法

– 鲎试验法的优点在于：取样方便、微量（1.0～0.1ml）；操作简便迅速，只需15～60分钟；灵敏，准确，可测出0.001EU/ml

的内毒素；定量检测的范围可涵盖0.001～1,000EU/ml；可由仪器自动处理检测数据。

– 鲎试验的优点使得药品生产过程热原质控能实现动态监控和事前控制。

3、药品生产过程内毒素的控制方法

1）内毒素监控体系

（1）监控对象

– 重要的媒体及原料

水是制药工业最重要的媒体

大量的原料

– 生产过程添加的各种辅剂

– 与中间体接触的各种用具、器皿及终产品的包装容器

– 各工序前后中间体内毒素水平的变化

至少在生产过程的重要工序之间要设置检测点，例如在除热原工序后设置检测点，检测该工序除热原（干烤、过滤、吸附）的效果。又如

在分装工序前需抽检，确保中间体内毒素水平不超出控制水平才进行分装

– 烘箱等除热原设备的验证

（2）内毒素监控体系示意图

70%

＜25%

生产质控

鲎试剂应用的比较

30%3%27%25%45%美国

＞75%— —— —＜5%＞90%中国

终产品检验终点显色动态显色动态浊度凝胶法

检验方法的比较


- 43 -

2）建立内毒素监控体系的步骤

– 确定药品的内毒素限值L；

– 分析药品生产过程，合理设置内毒素监测点；

– 制定各监测点合理的内毒素控制水平Lx；

– 进行干扰性验证试验确定各监测点样品的有效浓度或有效稀释范围，选择所用鲎试剂；

– 进行日常的内毒素监测检查。

3）内毒素控制限值的确定

– 如果终产品的内毒素限值为L，各监测点的内毒素控制水平为LX，则LX＜L。

– 某些原料或中间体在其后的生产工序中将要被稀释，计算其稀释后的内毒素含量ED，如果ED＜1/2L，可以允

许该原料或中间体的内毒素控制水平LX＞L。例如，某种主要原料在生产时将要被稀释10倍以上使用，如果L

为0.5EU/ml，可以允许该原料的内毒素控制水平LX为2.5EU/ml。

– 如果能确实保证在除热原工序后的中间体的内毒素含量至少低于1/2L，可允许该工序前的LX适当大于L。

– 在制定各监控点LX时，应注意热原具有积累性。制药企业需要根据自身的生产条件及工艺水平来制定合理的

LX值。在欧美通常以1/10L~1/4L作为LX。

4）干扰验证

– 目的：找出每个监测点的供试品的无干扰浓度

– 抽取监测点的适量样品

– 选择凝胶法鲎试剂的灵敏度或定量鲎试剂的标准直线范围；

– 计算检测样品的最大有效稀释倍数MVD

– 样品与鲎试剂相容性的初筛试验；

ΔΔ

药品生产过程细菌内毒素监控体系

Δ 内毒素检测点

工序运行路线

取样

检测结果反馈

Δ3

Δ8

Δ1

生产原料生产用具、容器清洗、除热原

工序1

原料

分装

辅剂

工序2

工序3 终成品入库

辅剂

Δ1 Δ2

Δ3

Δ4

Δ5

Δ6 Δ7

Δ9 Δ10

鲎试验检查

ΔΔ2

水

入库备用


– 样品与鲎试剂的干扰试验

5）内毒素监控的常规检查

– 取样

– 鲎试验检查

– 结果分析

– 将信息反馈至生产控制系统

4、内毒素的快速检测方法

1）细菌内毒素快速检测试剂盒

– 湛江安度斯公司的专利产品

– 属于凝胶法

– 反应时间只需 20~25 分钟

– 操作方便、简单

（详见本讲义第七：辅剂及相关产品的使用）

2）光度法定性快速检测法

– 属动态浊度法或动态显色法

– 步骤

（1）确定供试品原液（S0）的内毒素限值（L）；

（2）确定供试品无干扰浓度，如 S8；

（3）制备不含可测内毒素的供试品 S8；

（4）制备含 L8 浓度标准内毒素的阳性供试品 S8L8；

（5）在日常检测时以 S8L8 与 TAL 反应的时间 T0 作为判断其它供试品内毒素含量的标准：（见下图）

• 凡是反应时间 T<T0 的供试品，其内毒素含量>L8，即原液 S0 的内毒素含量>L；

• 凡是反应时间 T>T0 的供试品，其内毒素含量<L8，即原液 S0 的内毒素含量<L；

• 只需供试品的动态曲线一达到预设光度值，即可知道该供试品是否合格。

3）光度法定量快速检测法

– 属动态浊度法或动态显色法

– 需要使用安度斯软件“生物探针-2002”

– 步骤

（1）预先用标准内毒素与 TAL 反应制备一条标准曲线，存档。最理想的标准曲线是用同体系模型法建

义 2005 年 3 月版）；

预设透光度值

S8L8

产品不合格

产品合格

T1 T0 T2

Rt（%）

100

92

S8

- 44 -

立（参阅本公司讲

T(秒)


- 45 -

（2）检测开始前调出存档标准曲线；

（3）反应开始后，只要各供试品的动态曲线一达到预设光度值，界面上的表格中立即显示出该供试品的内毒素含量。

– 注意事项

（1）制备存档标准曲线的 TAL 必须与检测试剂相同；

（2）供试品应在无干扰浓度且不超过 MVD 浓度内检测。

4）便携式检测系统——PTS

（详见本公司讲义 2005 年 3 月版）

5、生产质控应用举例

– 下面的实例是某药厂对生产工艺用水连续25天的凝胶法（限量）和动态法（定量）的检测情况。该工艺用水的

细菌内毒素控制限值为0.125EU/ml，在第十一日时凝胶法呈阳性，立即对水系统进行处理，此后的第十二至二

十五日均为阴性。动态法的检测结果则揭示了内毒素的具体变化，在第八、九、十日内毒素含量明显上升，第

十日已经接近控制限值，按这一趋势，第十一日很可能超过限值，事实也确实如此。了解这一信息就可以在出

现不合格产品前采取预防措施。

样品原液内毒素

调用的标准曲线

(EU/mL)

(天)

0.125EU/mL

:

:


七、辅剂及相关产品的使用

1、内毒素指示剂

1）用途

– 用于干热设备灭活内毒素程序验证

2）使用方法

• 1、保留1~2支内毒素指示剂作为未经干热对照品

• 2、除去指示剂标签，开启，用铝箔纸把指示剂包裹

• 3、把指示剂放置在烤箱的不同位置，一般放置10~15个点。指示剂应与除热原物料夹放在一起。

• 4、按灭活内毒素程序进行干烤。

• 5、对经灭活程序后的指示剂进行鲎试验测试。

• 6、数据分析

3）使用举例

• 内毒素指示剂：标示效价2500EU/支

• 鲎试剂：标示灵敏度（λ） 0.25EU/ml

（1）未经干热的内毒素指示剂效价确认（按标示效价稀释至4λ、2λ、λ、λ/2、λ/4）

BET水

30s30s30s30s

2.0ml0.4ml

1.0ml

0.4ml

3.6ml

0.8ml

3.6ml 3.2ml 2.0ml

30s

2.0ml

2.0ml

30s

2.0ml

2.0ml

30s

0.8ml

3.2ml

30s

2.0ml

2.0ml

混合10分钟

（2）经干热的指示剂

– 经干热的指示剂需稀释至出

（3）结果计算及判断

2500EU/ml 250EU/m

BET水

未经

2500 5000

平

行

管

混合10分

＋

＋

＋

＋

现阴性结果的

25EU/mll

S1

1.0m

干热的指示

10000

钟

＋

＋

浓度

5EU/ml 1EU/m

2，50

30s

0.4ml

l 3.6

40000

剂

20000

＋

－－

－

0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.06EU/mll 0.5EU/ml

10，000倍 20，000倍 40，000倍5，000倍0倍

ml

- 46 -

S10

反应终点倍数反应终点浓度

（EU/ml)

20000 20000X0.25=5000

10000 10000X0.25=2500


- 47 -

• 可回收内毒素量Rc=

2、稀释剂I、稀释剂II

1）用途

– 稀释剂是一种细菌内毒素检查辅助剂，主要用于消除鲎试验的干扰因素

– 稀释剂I含有一定浓度的二价离子，用于枸橼酸盐类抗凝剂及血液保养液的细菌内毒素检查

– 稀释剂II用于调节样品的pH值

2）用法

– 稀释剂主要用于对样品的稀释

– 必须要经过验证试验，确认对试验无干扰后才能用于日常检查

– 仅用于配套本公司鲎试剂使用，勿用于其它厂家的鲎试剂产品

3）应用举例

用稀释剂稀释样品，以达到消除干扰的目的，必须做干扰验证试验

3、抗增液

1）用途

– 抗增液是一种细菌内毒素检查辅助剂，用于阻断β-葡聚糖的干扰（假阳性）

2）使用方法

– 抗增液使用时，用来代替BET水复溶鲎试剂

– 仅用于配套本公司鲎试剂使用，勿用于其它厂家的鲎试剂产品

－

lg-1

2

lg5000+lg2500=3535(EU/瓶)

经干热的指示剂反应终点倍数反应终点浓度

（EU/ml)1 10

平

行

管

<1 <1X0.25=0.25

<1 <1X0.25=0.25

－－

－

•残余内毒素量Rs< lg-1

2

lg0.25+lg0.25即Rs<0.25(EU/瓶)

•内毒素衰减lgRd=lgRc-lgRs>4

S S5 SMVDS10

样品

0.4ml

1.6 ml

1.0ml

1.0 ml

BET水稀释剂


- 48 -

3）应用举例

• 材料

– 样品：人血白蛋白，国产，低温乙醇工艺，热原检查合格，L=1.33EU/ml

– 鲎试剂：0.1ml/支，灵敏度λ=0.125EU/ml

– 抗增液：安度斯产品，0.6ml/支

• MVD=cL/λ=10倍

• 干扰验证试验

4、细菌内毒素快速检测试剂盒

• 用途

– 用于生产过程中，细菌内毒素的限量快速检测

• 特点

– 使用方便

快速检测盒内配置与国际使用接轨的单次试验鲎试剂（TAL）。使用这种单次试验TAL时，直接加0.2ml样品复溶试剂兼检测，

不必象使用0.1ml/支TAL那样要先加0.1ml的水复溶试剂，然后再加0.1ml样品检测。

– 同一试剂盒有多个灵敏度供选择

我们在每一批号的快速检测试剂盒上都标示有至少两个可供选择的灵敏度。使用时选择不同的灵敏度(λ0)对应有不同的反应

时间(T0)。如批号为0409082 的快速检测试剂盒，灵敏度标示如下：

平

行

管

WE0. 25 E0.125 E0.06 E0.03溶液内容

DC溶液编号

平

行

管

S10S10E0.25 S10E0.125 S10E0.06 S10E0.03溶液内容

AB溶液编号

平

行

管

S10S10E0. 25 S10E0.125 S10E0.06 S10E0.03溶液内容

AB溶液编号

＋

＋

－

－

0.1ml 抗增液复溶

用BET水复溶的

鲎试剂反应存在

干扰，增强

用抗增液复溶

的鲎试剂反应

干扰消除

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

－

－

－

－

－

－

－

－

－

－

25±1分钟0.125EU/mL

20±1分钟0.25EU/mL

T0λ0

0.1ml BET水复溶


- 49 -

– CSE无需稀释

我们我们知道，在细菌内毒素检查过程中，最繁琐耗时的操作就是稀释标准内毒素（CSE）。快速检测试剂盒配备了无需稀

释一步到位的CSE，使实验真正快速方便

– 配套器具，如虎添翼

在使用快速检测试剂盒时，如果配合使用湛江安度斯公司提供的可调移液器、采样瓶、可定时的干式恒温仪等实验器具，可

真正体会到BET实验的快速、准确及方便。

• 试剂盒组成

• 使用方法

– 以λ=0.125EU/ml为例，加样方法如上表。

– 若λ为0.25EU/ml则加样时，加入E5浓度0.02ml。

名称规格数量

鲎试剂TAL 0.2ml/支

λ：0.125EU/ml / 0.25EU/ml

8支

工作标准内毒素CSE ___ng/支； ___EU/ng 1支

BET水 2ml/支 1支

0.2mLS2供试品溶液A

0.2mLS+0.01mLE52供试品阳性对照溶液B

0.2mLTRW+0.01mLE52阳性对照溶液C

0.2mL TRW2阴性对照溶液D

每管加样反应管数检查项目


- 50 -

八、细菌内毒素检查常用术语、符号及英文缩写

常用术语、英文缩写或符号表示内容

BET 细菌内毒素检查(测)（Bacterial Endotoxin Test)

LAL 美洲鲎试剂 (Limulus Amebocyte Lysate)

TAL 东方鲎试剂 (Tachypleus Amebocyte Lysate)

TRW/LRW 鲎试验用水(TAL/LAL Reagent Water)

RSE 内毒素参考标准品 (Reference Standard Endotoxin)

NSE 内毒素国家标准品(National Standard Endotoxin)

CSE 内毒素工作标准品 (Control Standard Endotoxin)

LPS 脂多糖 (Lipopolysaccharide)

EU/IU 内毒素单位 (Endotoxin Unit / International Unit)

K 内毒素耐受阈值 (Endotoxin Tolerance Limit)

M 人体每公斤体重每小时最大用药剂量（Maximum Human dose per KG per

hour）

L 内毒素限值 (Endotoxin Limit) ，L=K/M

MVD 最大有效稀释 (Maximum Valid Dilution) ，MVD=L/

MVC 最低有效浓度(Minimum Valid Concentration)，MVC=1/MVD

LVP 大输液 (Large Volume Parenteral)

SVP 小输液 (Small Volume Parenteral)

Gel-clot Technique 凝胶法技术

Photometric Technique 光度测定法技术

Gel-clot Limit Test 凝胶限量试验

Gel-clot Assay 凝胶半定量试验

KTA 动态浊度法（Kinetic Turbidimetric Assay）

KCA 动态显色法（Kinetic Chromogenic Assay）

ETA 终点浊度法（Endpoint Turbidimetric Assay）

ECA 终点显色法（Endpoint Chromogenic Assay）

Inhibition 抑制

Enhancement 增强

Interference 干扰

NWC 阴性水对照 (Negative Water Control)

NC 阴性对照 (Negative Control)

PWC 阳性水对照 (Positive Water Control)

PC 阳性对照 (Positive Control)

NPC 阴性产品对照（Negative Product Control）

PPC 阳性产品对照 (Positive Product Control)


- 51 -

A 药典 BET 法中表示供试品溶液（系列）

B 药典 BET 法中表示添加内毒素标准的供试品溶液（系列）

C 药典 BET 法中表示内毒素标准溶液（系列）

D 药典 BET 法中表示阴性对照

λ 凝胶法鲎试剂标示灵敏度(Lambda) 或光度法标准曲线的最低浓度

m 光度法标准曲线的中点浓度

c 凝胶法灵敏度复核试验的测定值

Es 凝胶法干扰试验 C 溶液系列测定的灵敏度值

Et 凝胶法干扰试验 B 溶液系列测定的灵敏度值

γ 相关系数 (Correlation Coefficient)

CV 变异系数（Coefficient of Variation)

SD 标准方差 (Standard Deviation )

CoA 分析证书（Certificate of Analysis）

CoQ 质量证书（Certificate of Quality）

QA 质量保证 Quality Assaurance

QC 质量控制 (Quality Control)

SOP 标准操作规程 (Standard Operation Procedure)

OD 光密度 (Optical Density)

Absorbance 吸光度值

Regression Analysis 回归分析

STD Curve 标准曲线（Standard Curve）

Linearity 线性

GM 几何平均（Geometric Mean）

Valid Verification 有效验证

Onset Time 动态法的反应时间

细菌内毒素检测技术与应用...2016/08/31 · 细菌内毒素检测技术与应用....

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