cercetari in microbiologie

7/27/2019 Cercetari in microbiologie

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1988, 54(3):741.Appl. Environ. Microbiol.E L Domingue, R L Tyndall, W R Mayberry and O C PancorboLegionella pneumophila serogroup 1.Effects of three oxidizing biocides on

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A P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , M a r . 1 9 8 8 . p . 7 4 1 - 7 4 70 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 8 / 0 3 0 7 4 1 - 0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 8 8 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

E f f e c t s o f T h r e e O x i d i z i n g B i o c i d e s onL e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a S e r o g r o u p 1E. L . DOMINGUE,'2 R . L . TYNDALL,-* W. R . M A YBE R R Y,3 AND 0. C . PANCORBO4

D e p a r t m e n e t o f E n v i r o n m e n t a l H e a l t h l a n i d Department o f M i c r o b i o l o g y , 3 Q i a i l l e n - D i s h l n e r C o l l e g e o f M e d i c i n e , EastT e n n e s s e e S t a t e U n i v e r s i t y , J o h I n s o n C i t U , T e n n e s s e e 3 7 6 1 4 ; D e p a r - t m e n i t o f Z o o l o g y , U n i v e r s i t y o f T e n n e s s e e , K n o x v i l l e ,T e n n l e s s e e 3 7 9 9 6 2 ; and E n v i r o n m e n t a l H e a l t h S ( i e n c e P r c o g r a i n , D e p a r t m e n i t o f Food S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ,U n i v e r s i t y of G e o r - g i a , A t h e n s , G e o r - g i a 3 0 6 0 2 4R e c e i v e d 3 0 M a r c h 1 9 8 7 / A c c e p t e d 2 1 December 1 9 8 7

A s t u d y was c o n d u c t e d t o d e t e r m i n e t h e b a c t e r i c i d a l e f f e c t s o f ozone and h y d r o g e n p e r o x i d e r e l a t i v e t o t h a to f f r e e c h l o r i n e on L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a s erog roup 1 . I n l a b o r at o ry b a t c h - t y p e e x p e r i m e n t s , o r g a n i s m ss e e d e d a t v a r i o u s d e n s i t i e s were e x p o s e d t o d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s e b i o c i d e s i n d e m a n d - f r e e b u f f e r s .B a c t e r i c i d a l e f f e c t s were m e a s u r e d b y d e t e r m i n i n g t h e a b i l i t y o f L . p n e u m o p h i l a t o grow on b u f f e r e dc h a r c o a l - y e a s t e x t r a c t a g a r s u p p l e m e n t e d w i t h a - k e t o g l u t a r a t e . O z o n e was t h e most p o t e n t o f t h e t h r e eb i o c i d e s , w i t h a g r e a t e r t h a n 99% k i l l o f L. p n e u m o p h i l a o c c u r r i n g d u r i n g a 5 - m i n e x p o s u r e t o 0 . 1 0 t o 0 . 3 0 , u go f 03 p e r m l. T h e b a c t e r i c i d a l a c t i o n o f 03 was n o t m a r k e d l y a f f e c t e d b y c h a n g e s i n p H o r t e m p e r a t u r e .C o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 3 0 a n d 0 . 4 0 , u g o f f r e e c h l o r i n e p e r ml k i l l e d 99% o f t h e L . p n e u m o p h i l a a f t e r 3 0 - a n d 5 - m i nexposures, r e s p e c t i v e l y . A 3 0 - m i n expo su re t o 1 , 0 0 0 , u g o f H202 p e r ml was r e q u i r e d t o e f f e c t a 99% r e d u c t i o no f t h e v i a b l e L . p n e u m o p h i l a p o p u l a t i o n . H o w e v e r , n o v i a b l e L . p n e u m o p h i l a c o u l d b e d e t e c t e d a f t e r a 2 4 - hexposure t o 1 0 0 o r 3 0 0 , u g o f H202 p e r ml. A t t e m p t s were m a d e t o c o r r e l a t e t h e b i o c i d a l e f f e c t s o f 03 and H202w i t h t h e o x i d a t i o n o f L . p n e u m o p h i l a f a t t y a c i d s . T h e s e t e s t s i n d i c a t e d t h a t c e r t a i n b i o c i d a l c o n c e n t r a t i o n s o f03 a n d H202 r e s u l t e d i n a l o s s or s ev e r e r e d u c t i o n o f L . p n e u m o p h i l a u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s .

The p r e s e n c e o f L e g i o i e l l a s p p. i n a w i d e r a n g e o f a q u a t i ch a b i t a t s , b o t h n a t u r a l a n d h u m a n - m a d e , i s w e l l d o c u m e n t e d( 1 0 , 1 1 , 2 0 , 2 7 , 2 8 , 3 2 , 3 4 , 3 6 ) . D u r i n g t h e l a s t d e c a d e ,e p i d e m i o l o g i c a l a n d e n v i r o n m e n t a l i n v e s t i g a t i o n s h a v eshown t h a t c o o l i n g system waters a r e p o t e n t i a l e n v i r o n -ments f o r t h e a m p l i f i c a t i o n a n d d i s s e m i n a t i o n o f t he s e b a c -t e r i a . C o o l i n g towers a n d e v a p o r a t i v e c o n d e n s e r s h a v e b e e ni m p l i c a t e d a s t h e common s our ce o f i n f e c t i o u s L e g i o n e l l as p p . i n some o u t b r e a k s o f l e g i o n e l l o s i s ( 4 , 5 , 1 3 , 1 8 , 1 9 ) .C o n v e r s e l y , t h e s e p o t e n t i a l p a t h o g e n s h a v e a l s o b e e n f o u n di n c o o l i n g systems a n d n a t u r a l waters i n t h e a b s e n c e o f o v e r to u t b r e a k s o f d i s e a s e ( 2 0 , 3 4 ) . Q u e s t i o n s a b o u t t h e v i r u l e n c ep a t t e r n s , minimum i n f e c t i o u s d o s e , r e s i s t a n c e t o d r y i n g , a n de c o l o g i c a l f a c t o r s c o n t r i b u t i n g t o a m p l i f i c a t i o n a n d p e r s i s -t e n c e o f l e g i o n e l l a e h a v e y e t t o b e f u l l y a n s w e r e d . A l t h o u g he r a d i c a t i o n o f L e g i o n e l l a spp. f r o m a l l c o o l i n g systema q u a t i c h a b i t a t s may n o t b e p r a c t i c a l or nec essary, c o n t r o l o fL e g i o n e l l a p n e , i i n o p h i l a serogroup 1 d e n s i t i e s i n s e l e c t e dsystems m i g h t b e d e s i r a b l e t h r o u g h e f f e c t i v e b i o c i d a l t r e a t -m e n t r e g i m e n s . T h i s i s e s p e c i a l l y p r u d e n t i n p o p u l a t i o na r e a s w i t h h i g h - r i s k , i m m u n o c o m p r o m i s e d i n d i v i d u a l s ( 1 7 ,2 4 , 3 3 ) .I n a d e q u a c i e s e x i s t i n c u r r e n t b i o c i d a l t r e a t m e n t p r a c t i c e sf o r c o o l i n g system w a t e r s . S e v e r a l o r g a n i c b i o c i d e s i n us et o d a y h a v e b e e n shown t o b e i n e f f e c t i v e i n c o n t r o l l i n gL e g i o n e l l a d e n s i t i e s ( 8 , 1 2 , 1 5 , 2 0 , 3 4 ) . F l i e r m a n s a n dc o - w o r k e r s ( 9 ) h a v e d e m o n s t r a t e d t h e e f f e c t i v e n e s s o f h y -p e r c h l o r i n a t i o n f o r t h e i n i t i a l r e d u c t i o n o f L e g i o n c e l l a popu-l a t i o n s i n c o o l i n g system w a t e r s . T h i s p r a c t i c e i n c e r t a i ns y s t e m s , h o w e v e r , may b e p o t e n t i a l l y d e l e t e r i o u s t o h e a te x c h a n g e r s . M o r e o v e r , U . S . E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o nA g e n c y r e g u l a t i o n s governing p e r i o d i c d i s c h a r g e s o f c o o l i n gsystem water i n t o l o c a l r i v e r s o r s treams h a v e b e g u n t or e s t r i c t t h e a mount o f c h l o r i n e r e s i d u a l p r e s e n t i n s u c h

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

d i s c h a r g e s ( 3 5 ) . T h e c o o l i n g system i n d u s t r y i s t h e r e f o r e i nn e e d o f e n v i r o n m e n t a l l y s a f e b i o c i d e s t h a t a r e c o m p a t i b l ew i t h system o p e r a t i o n a n d e f f e c t i v e i n r e d u c i n g t h e b u r d e no f p o t e n t i a l l y i n f e c t i o u s L e g i o n e l l a spp.T h i s s t u d y was u n d e r t a k e n t o i n v e s t i g a t e t h e e f f i c a c y o fa l t e r n a t i v e b i o c i d e s s u c h a s ozone a n d h y d r o g e n p e r o x i d e i nk i l l i n g L . p n e i u m o p h t i l a s e r og r ou p 1 , t h e mos t commone n v i r o n m e n t a l a n d c l i n i c a l i s o l a t e o f t h e g e nu s L e g i o n e l l a .F i e l d s t u d i e s , l a b o r a t o r y s t u d i e s , or b o t h b y P o p e e t a l . ( 3 0 )a n d E d e l s t e i n e t a l . ( 6 ) h a v e i n d i c a t e d t h e p o s s i b l e u s e f u l n e s so f o z o n e i n c o n t r o l l i n g L e g i o n e l l a p o p u l a t i o n s . I n t h ep r e s e n t s t u d y , t h e b i o c i d a l e f f e c t i v e n e s s o f ozone was s t u d -i e d a t t h e d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s a n d p H v a l u e s t h a t r e f l e c tc o o l i n g tower o p e r a t i n g c o n d i t i o n s . I n a d d i t i o n , t h e o z o n es e n s i t i v i t y o f P s e a i d o i n o n a s a er l a g i l 0 o s a , a n o t h e r p o t e n t i a l l yp a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m f o u n d i n c o o l i n g system e nviron-m e n t s , was c o m p a r e d w i t h t h a t o f L . p n e a l m o p h i l a ; a n d t h ee f f i c a c i e s o f t h r e e o x i d i z i n g b i o c i d e s , i . e . , ozone, h y d r o g e np e r o x i d e , a n d f r e e c h l o r i n e , i n d e s t r o y i n g L . p n e i a m o p h i l awere c o m p a r e d u n d e r s t a n d a rd c o n d i t i o n s o f p H 7 . 2 a n d250C.

MATERIALS AND METHODSB a c t e r i a l i s o l a t e s . L . p n e u i n i m o p h i l a serogroup 1 was k i n d l y

p r o v i d e d b y C a r l F l i e r m a n s ( E . I. d u P o n t d e Nemours &C o . , A i k e n , S . C . ) . T h i s e n v i r o n m e n t a l i s o l a t e was c u l t u r e df r o m t h e r m a l l y a l t e r e d w a t e r . Th e P . a e r u ( g i n o s s a i s o l a t e wasc u l t u r e d f r o m c o o l i n g to w e r water i n t h e Oa k R i d g e , T e n n . ,area. P . a e r a g i n o i s a i d e n t i f i c a t i o n was c o n f i r m e d b y t e s t i n gw i t h t h e A P I - 2 0 E a n d R a p i d - N F T b i o c h e m i c a l t e s t s y s t e m s( A n a l y t a b P r o d u c t s , P l a i n v i e w , N . Y . ) . B e f o r e t h e i s o l a t e swere f r o z e n i n 1 . 0 - m l p o r t i o n s a t - 5 0 C , t h e P . a e r u l g i n o s ai s o l a t e was g r o w n f o r 1 8 t o 2 4 h on t r y p t i c soy agar ( T S A ;D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h . ) , and L . p n e l o n o p h i l aserogroup 1 was g r o w n f o r 7 2 h on b u f f e r e d c h a r c o a l - y e a s t

7 4 1

V o l . 5 4 , N o . 3


3/8

7 4 2 D OMING U E ET A L .e x t r a c t s u p p l e m e n t e d w i t h a - k e t o g l u t a r a t e ( B C Y E - a ) a g a r( G I B C O D i a g n o s t i c s , M a d i s o n , W i s . ) .G e n e r a t i o n a n d d i s t r i b u t i o n o f 0 3 . T h e g e n e r a t i o n o f 0 3was a c c o m p l i s h e d b y t h e c o r o n a e l e c t r i c a l d i s c h a r g e m e t h o da t 1 5 , 0 0 0 V b y u s i n g p u r e o x y g e n ( 0 2 ) a s t h e f e e d g a s . T h eo z o n e g e n e r a t o r ( D y n a m i c C o n c e p t s C o r p . , M i a m i , F l a . )c o n t a i n e d a s e r i e s o f t h r e e g l a s s t u b e s ( l e n g t h , 1 0 i n [ 2 5 . 4c m ] ) w h i c h h o u s e d t h r e e a l u m i n u m e l e c t r o d e s . A s m a l lp e r c e n t a g e ( 2 t o 3 % ) o f t h e 0 2 f l o w i n g i n s i d e t h e g l a s s t u b es e r i e s was c o n v e r t e d t o o z o n e d u r i n g t h e e l e c t r i c a l d i s -c h a r g e . T h e e q u i p m e n t was m o d i f i e d t o a l l o w t h e f l o w o f 0 2g a s t h r o u g h t h e s y s t e m w i t h o u t c o n c o m i t a n t p r o d u c t i o n o f0 3 . T h i s l a t t e r f e a t u r e p r o v i d e d t h e c a p a b i l i t y o f o x y g e n a t i n gt h e v a r i o u s b u f f e r s o l u t i o n s f o r c o n t r o l p u r p o s e s . T h e g a s e s ,e i t h e r 0 2 o r a m i x t u r e o f 0 2 a n d 0 3 , w e r e d i s t r i b u t e d w i t hT e f l o n ( E . I . d u P o n t d e Nemours & C o . , I n c . , W i l m i n g t o n ,D e l . ) o r t y g o n t u b i n g a n d p a s s e d t h r o u g h s e v e r a l g l a s s w o o lf i l t e r s b e f o r e c o n t a c t i n g t h e l i q u i d b u f f e r s y s t e m s v i a p o r o u s -f r i t t e d g l a s s t u b e s .P r e p a r a t i o n o f g l a s s w a r e . A l l g l a s s w a r e was w a s h e d w i t hl a b o r a t o r y d e t e r g e n t ( B i o - M i l d ; G r e e n M o u n t a i n R e s e a r c hC o r p . , W a t e r b u r y , V t . ) a n d r i n s e d t h o r o u g h l y w i t h t a pw a t e r , d e i o n i z e d w a t e r , a n d f i n a l l y , d e i o n i z e d d i s t i l l e d w a -t e r . G l a s s w a r e wa s t h e n s u b j e c t e d t o s e v e r a l 1 - h s o a k i n g s i na s t r o n g 0 3 - w a t e r s o l u t i o n ( 2 t o 4 , u g / m l ) , f o l l o w e d b y d r yh e a t s t e r i l i z a t i o n f o r 7 h a t 1 8 0 C ( 3 5 6 F ) . T h i s t r e a t m e n ta l l o w e d f o r t h e o x i d a t i o n o f a n y r e s i d u a l o r g a n i c m a t e r i a lw h i c h w o u l d o t h e r w i s e h a v e i n t e r f e r e d w i t h t h e d e t e r m i n a -t i o n o f t h e o x i d a n t c o n c e n t r a t i o n s n e c e s s a r y f o r i n a c t i v a t i o no f L . p n e u m o p h i l a .B u f f e r s o l u t i o n s . T h r e e b u f f e r s o l u t i o n s w e r e u s e d i n t h e s ee x p e r i m e n t s . A 0 . 0 1 M p h o s p h a t e b u f f e r wa s u s e d t o a c h i e v epH 7 . 2 a n d 8 . 0 . A 0 . 0 1 M s o d i u m c a r b o n a t e - b i c a r b o n a t eb u f f e r was u s e d t o a c h i e v e pH 8 . 9 . H i g h - p u r i t y d e i o n i z e dd i s t i l l e d w a t e r wa s t r e a t e d w i t h o z o n e i n 6 - l i t e r v o l u m e s f o r5 0 m i n t o o x i d i z e a n y s u b s t a n c e s t h a t may h a v e b e e np r e s e n t . T h i s o z o n e - t r e a t e d w a t e r was t h e n b o i l e d f o r 1 h t od i s s i p a t e a n y r e m a i n i n g o z o n e r e s i d u a l . I n t h i s m a n n e r ,w a t e r u s e d t o p r e p a r e t h e p h o s p h a t e a n d c a r b o n a t e b u f f e r swas r e n d e r e d d e m an d - f re e . A l l b u f f e r s w e r e f i l t e r - s t e r i l i z e dt h r o u g h 0 . 2 2 - p u m - p o r e - s i z e m e m b r a n e f i l t e r s ( t y p e L - S ; N a l -g e n e L a b w a r e D i v . , N a l g e / S y b r o n C o r p . , R o c h e s t e r , N . Y . )a n d s t o r e d i n s t e r i l e d e m a n d - f r e e g l a s s b o t t l e s .B i o c i d e p r e p a r a t i o n s . ( i ) O z o n e . O z o n e w a s g e n e r a t e d a t2 5 C a n d b u b b l e d i n t o a p p r o x i m a t e l y 2 0 0 m l o f b u f f e rs o l u t i o n c o n t a i n e d i n a b e a k e r w i t h a m a g n e t i c m i x i n g b a rr o t a t i n g a t 6 0 t o 8 0 r p m . D i l u t i o n s w e r e m a d e d i r e c t l y f r o mt h i s 0 3 s o l u t i o n t o a c h i e v e t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n s i n m i c r o -g r a m s p e r m i l l i l i t e r . T h e s t a n d a r d i o d o m e t r i c m e t h o d f o rozone d e t e r m i n a t i o n , a s o u t l i n e d p r e v i o u s l y ( 1 ) , was m o d i -f i e d f o r t h i s s t u d y . E q u a l v o l u m e s o f t h e o z o n e s o l u t i o n a n da 5 . 5 % K I s o l u t i o n w e r e r a p i d l y m i x e d , a c i d i f i e d w i t hc o n c e n t r a t e d H 2 S O 4 , a n d t h e n t i t r a t e d w i t h a s t a n d a r d i z e d0 . 0 1 N s o d i u m t h i o s u l f a t e s o l u t i o n b y u s i n g a n e x c e s s o ft h y o d e n e s t a r c h ( F i s h e r S c i e n t i f i c C o . , F a i r l a w n , N . J . ) a st h e i n d i c a t o r .( i i ) C h l o r i n e . A s o l u t i o n o f 4 t o 6% s o d i u m h y p o c h l o r i t e( F i s h e r S c i e n t i f i c ) was d i l u t e d i n d e m a n d - f r e e b u f f e r t op r e p a r e a s t o c k s o d i u m h y p o c h l o r i t e s o l u t i o n c o n t a i n i n ga p p r o x i m a t e l y 3 . 0 , u g o f f r e e c h l o r i n e p e r m l . T r i p l i c a t e1 0 0 - m l v o l u m e s o f t h i s s t o c k w e r e t i t r a t e d b y t h e DPD( N , N - d i e t h y l - p - p h e n y l e n e d i a m i n e ) - f e r r o u s ammonium s u l -f a t e m e t h o d ( 1 ) . A f t e r t h e mean c o n c e n t r a t i o n o f f r e e c h l o -r i n e w as d e t e r m i n e d , t h i s s t o c k s o l u t i o n w a s d i l u t e d f u r t h e rw i t h d e m a n d - f r e e b u f f e r t o a c h i e v e t h e f i n a l l e v e l i n m i c r o -g r a m s p e r m i l l i l i t e r f o r e x p o s u r e t o b a c t e r i a l s u s p e n s i o n s .

( i i i ) H y d r o g e n p e r o x i d e . Tw o s o l u t i o n s o f H 2 0 2 , e i t h e r 3%H202 ( M e d i c , S m y r n a , T e n n . ) o r 30 % H202 ( M a l l i n c k r o d t ,P a r i s , K y . ) , w e r e d i l u t e d w i t h d e m a n d - f r e e b u f f e r t o a c h i e v et h e f i n a l l e v e l i n m i c r o g r a m s p e r m i l l i l i t e r f o r e x p o s u r e t ob a c t e r i a l s u s p e n s i o n s . T h e K i n g z e t t i o d i d e m e t h o d w a s u s e dt o c o n f i r m t h e p e r c e n t a g e o f H202 i n t h e s e s o l u t i o n s ( 1 4 ) .E x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e . On t h e d a y o f e a c h e x p e r i m e n t ,f r o z e n v i a l s o f o r g a n i s m s w e r e t h a w e d i n a w a t e r b a t h a t3 7 C . B a c t e r i a l s u s p e n s i o n s w e r e t h e n w a s h e d t h r e e t i m e sw i t h t h e a p p r o p r i a t e b u f f e r . A f t e r e a c h w a s h , o r g a n i s m sw e r e p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t a p p r o x i m a t e l y 1 , 0 0 0 x gf o r 1 5 m i n a t 2 5 C . F o r some e x p e r i m e n t s , t h e f r o z e n s t o c ko f L . p n e u m o p h i l a was i n o c u l a t e d i n t o y e a s t e x t r a c t b r o t h( 1 % y e a s t e x t r a c t , 1% ACES ( N - [ 2 - a c e t a m i d o ] - 2 - a m i n o e t h -a n e s u l f o n i c a c i d ) b u f f e r , 0 . 0 2 5 % f e r r i c n i t r a t e , 0 . 0 4 % L -c y s t e i n e , 0.1% a o - k e t o g l u t a r a t e ; t h e p H was a d j u s t e d t o 6 . 9w i t h 5 N KOH) o r o n t o BCYE-a a g a r a n d i n c u b a t e d a t 3 5 Cu n t i l t h e c u l t u r e w a s i n t h e l a t e - l o g o r e a r l y - s t a t i o n a r y p h a s e .S u s p e n s i o n s o f t h e s e o r g a n i s m s w i t h a d e n s i ty e q u i va l e n t t ot h a t o f t h e f ro z e n s to c k o f L. p n e u m o p h i l a w e r e w a s h e d a sd e s c r i b e d a b o v e . T h e f i n a l d e n s i t y o f a l l b a c t e r i a l s u s p e n -s i o n s was a d j u s t e d w i t h b u f f e r t o y i e l d 1 0 5 t o 1 0 6 CFU/mlwhen t h e s u s p e n s i o n s w e r e d i l u t e d i n a 1 0 - m l v o l u m e . I nsome e x p e r i m e n t s , t h e d e n s i t y o f o r g a n i s m s was a d j u s t e d t o1 0 7 t o 1 0 9 C F U / m l . F o l l o w i n g t h e f i n a l w a s h , o r g a n i s m s w e r ee q u i l i b r a t e d i n t h e a p p r o p r i a t e b u f f e r a t t he i nd ic at e d t e m -p e r a t u r e f o r a p p r o x i m a t e l y 2 h b e f o r e t h e y w e r e e x p o s e d t ob i o c i d e s .B i o c i d e s w e r e d i v i d e d i n t o a l i q u o t s b y u s i n g g l a s s p i p e t t e sa n d p l a c e d i n t o s t e r i l e g l a s s c u l t u r e t u b e s c o n t a i n i n g T e f l o n( d u P o n t ) m a g n e t i c s t i r r i n g b a r s . T h e t o t a l v o l u m e i n e a c ht u b e was h e l d c o n s t a n t a t 1 0 . 0 m l . T u b e c o n t e n t s w e r e m i x e da t 6 0 t o 8 0 rpm w i t h a m a g n e t i c s t i r r e r f o r t h e d u r a t i o n o fe a c h e x p e r i m e n t a n d i n c u b a t e d a t 2 5 , 3 5 , o r 4 5 C . C o n t r o lt u b e s c o n t a in i n g o n l y t h e o r g a n i s m s s u s p e n d e d i n b u f f e rw e r e i n c l u d e d f o r e v e r y e x p e r i m e n t .B i o c i d a l a c t i v i t y was q u e n c h e d a t v a r i o u s c o n t a c t t i m e s b yr e m o v i n g 1 . 0 - m l v o l u m e s f r o m e a c h t u b e a n d q u i c kl y a d d i n gt h e m t o 9 . 0 m l o f b u f f e r e d d i l u t i o n w a t e r ( 3 . 1 x 1 0 - 4 MKH2PO4 p e r l i t e r , 1 . 0 x 1 0 - 3 M MgSO4 7H2O p e r l i t e r [ p H7 . 2 ] ) w h i c h c o n t a i n e d 0 . 1 m l o f a 10% s o d i u m t h i o s u l f a t es o l u t i o n . T hi s c o nc e n t ra ti o n o f s o d i u m t h i o s u l f a t e q u e n c h e dt h e o x i d i z i n g a c t i v i t y o f o z o n e a n d f r e e c h l o r i n e a n d r e d u c e dt h e a c t i v i t y o f h y d r o g e n p e r o x i d e . T h e r a p i d d e c a y o f o z o n ea n d c h l o r i n e , t h e l o w c o n c e n t ra t i o n s o f o z o n e a n d c h l o r i n e ,o r b o t h i n t h e t e s t s y s t e m s p r e c l u d e d d e t e rm i n a ti o n o f t h eo x i d a n t c o n c e n t r a t i o n a t t h e v a r i o u s c o n t a c t t i m e s . H y d r o -g e n p e r o x i d e l o s t n o n e o f i t s o x i d i z i n g p o t e n t i a l o v e r t h e 2 4 - hc o n t a c t p e r i o d a f t e r t h e a d d i t i o n o f L . p n e u m o p h i l a . T h es e n s i t i v i t i e s o f L . p n e u m o p h i l a a n d P . a e r u g i n o s a t o s o d i u mt h i o s u l f a t e w e r e d e t e r m i n e d b y e x p o s i n g v a r i o u s d i l u t i o n s o ft h e o r g a n i s m s t o s o d i u m t h i o s u l f a t e u n d e r t h e e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s d e s c r i b e d a b o v e . No d e l e t e r i o u s e f f e c t o f t h eq u e n c h i n g a g e n t w a s o b s e r v e d .F o l l o w i n g q u e n c h i n g o f t h e b i o c i d e s , t h e o r g a n i s m s w e r es e r i a l l y d i l u t e d i n b u f f e r e d d i l u t i o n w a t e r . D u p l i c a t e 0 . 1 - m lv o l u m e s o f t h e s e d i l u t i o n s w e r e s p r e a d p l a t e d o n t o e i t h e rTSA ( f o r P. a e r u g i n o s a ) o r B C Y E - a o a g a r ( f o r L . p n e u m o -p h i l a ) . T h e TSA p l a t e s w e r e i n c u b a t e d f o r 1 8 t o 2 4 h a t 3 5 C .N e g a t i v e TSA p l a t e s w e r e i n c u b a t e d f o r 7 d a y s b e f o r e t h e yw e r e d i s c a r d e d . T h e BCYE-a p l a t e s w e r e i n c u b a t e d f o r 4d a y s a t 3 5 C i n a h u m i d a t m o s ph e re . N e g a t i v e BCYE-ap l a t e s w e r e i n c u b a t e d f o r 1 0 d a y s b e f o r e t h e y w e r e d i s -c a r d e d . B a c t e r i a l c o l o n i e s w e r e c o u n t e d m a n u a l l y w i t h t h ea i d o f a c o l o n y c o u n t e r (New B r u n s w i c k S c i e n t i f i c C o . , I n c . ,E d i s o n , N . J . ) . A l l p l a t e s w e r e u s e d f o r e n u m e r at i o n , b u t i n

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


4/8

EFFECTS OF BIOCIDES ON L . PNEUMOPHILA 7 4 3most c a s e s f i n a l d e t e r m i n a ti o n o f CF U p e r m i l l i l i t e r wasmade f r o m p l a t e s t h a t c o n t a i n e d b e t w e e n 3 0 a n d 3 0 0 c o l o -n i e s . T h e l i m i t o f d e t e c t a b i l i t y f o r e n u m e r a t i o n was 1 0CFU/ml when 0 . 1 m l was p l a t e d d i r e c t l y . The a b s e n c e o fd e t e c t a b l e c o l o n y f o r m a t i o n was c o n s i d e r e d e v i d e n c e o f ab i o c i d a l e f f e c t , a l t h o u g h t h e p o s s i b i l i t y e x i s t s t h a t t h e L .p n e u m o p h i l a o r g a n i s m s were d a m a g e d t o t h e e x t e n t t h a tt he y c o u l d no l o n g e r r e p l i c a t e on BCYE-a b u t m i g h t h a v er e p l i c a t e d i n more c o m p l e x e n v i r o n m e n t a l m i l i e u s .F o r e a c h e x p e r i m e n t t h e l o w e s t c o n c e n t ra t i o n o f b i o c i d et h a t r e s u l t e d i n a t l e a s t a 99% r e d u c t i o n i n v i a b l e o r g a n i s m swas d e s i g n a t e d a s t h e e n d p o i n t . T w o or more e x p e r i m e n t swere p e r f o r m e d , a n d d e t e r m i n a t i o n o f t h e mean b i o c i d ec o n c e n t r a t i o n f o r 99% i n a c t i v a t i o n i n a group o f r e l a t e de x p e r i m e n t s was m a d e . A 99% i n a c t i v a t i o n c o r r e s p o n d e d t oa l o g s u r v i v a l r a t i o [ l o g ( N , 1 N o ) , w h e r e N , a n d N o a r eb a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o n s a t t i m e s t a n d zero, r e s p e c t i v e l y ] o f- 2 . 0 0 .S i n c e a g g r e g a t i o n o f m i c r o o r g a n i s m s c a n e x e r t a p r o t e c -t i v e e f f e c t d u r i n g t h e d i s i n f e c t i o n p r o c e s s a n d c a n r e s u l t i nd e c r e a s e d b a c t e r i a l s e n s i t i v i t y t o b i o c i d e s , an e s ti m at e o f t h ep r o p o r t i o n o f a g g re g a te d o r g a n i s m s i n L . p n e u m o p h i l a sus-p e n s i o n s was m a d e b y u s i n g a d i r e c t f l u o r e s c e n t a n t i b o d yt e c h n i q u e ( 3 ) . L e s s t h a n 10% o f t h e L . p n e u m o p h i l a p o pu -l a t i o n was a g g r e g a t e d i n e i t h e r t h e p h o s p h a t e o r t h e c a r b o n -a t e b u f f e r s .F a t t y a c i d a n a l y s i s . P r i o r t o f a t t y a c i d a n a l y s i s , ex p o s u r e o fL . p n e u m o p h i l a t o t h e v a r i o u s b i o c i d e s a n d q u e n c h i n g o f t h eb i o c i d a l a c t i v i t y was d o n e as d e s c r i b e d a b o v e . A f t e r expo-sure f o r e i t h e r 3 0 or 6 0 m i n , o r g a n i s m s were p e l l e t e d b yc e n t r i f u g a t i o n a t 1 , 0 0 0 x g f o r 4 0 m i n . O r g a n i s m s weres u s p e n d e d i n a p p r o x i m a t e l y 2 . 0 m l o f m e t h a n o l a n d s t o r e d a troom t e m p e r a t u r e u n t i l t h e f a t t y a c i d a n a l y s i s c o u l d b ep e r f o r m e d as d e s c r i b e d b y M a y b e r r y ( 2 5 ) .

RESULTSB e c a u s e o f t h e r e a c t i v e n a t u r e a n d n a t u r a l d e c a y t e n d e n c y

o f ozo n e i n s o l u t i o n s ( 1 6 , 2 9 , 3 8 ) , ozo n e d e c a y u n d e r t h ee x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s c h o s e n f o r t h i s s t u d y was d e t e r -m i n e d . O z o n e d e c a y was d e f i n e d as a l o s s o f o x i d i z i n gc a p a c i t y , as m e a s u r e d b y t h e a b i l i t y t o l i b e r a t e f r e e i o d i n ef r o m a 5 . 5 % K I s o l u t i o n . A g r e a t e r d e c a y r a t e o c c u r r e d a tpH 8 . 0 t h a n a t p H 7 . 2 d u r i n g t h e f i r s t 5 m i n ( F i g . 1 ) .C o m p a r i s o n s o f t h e b i o c i d a l a c t i v i t i e s o f ozo n e a t d i f f e r e n tpHs a n d t e m p e r a t u r e s are s h o w n i n T a b l e 1 . U n d e r s t a n d a r d

E *~ ~ ~ ~ ~ ~ O p H 7 . 2 _l 6 {

Z 5 030z0TIME (minutes)

FIG. 1. 03 decay in demand-free, 0.01 Mphosphate buffer at2 5 C . Points represent the mean of triplicate experiments. Barsrepresent 1 standard deviation.

conditions ofpH7.2 and 2 5 C , 0.10 to 0.30 , u g of 03 per mleffected at least a 99%inactivation ofL. pneumophila within5 m i n . Similar bactericidal effects were also obtained with P.aeruginosa within min after exposure to 0.20 to 0.30 , u g of03 per ml. Nodifferences were noted in the 03 sensitivitiesof stored frozen stock of L. pneumophila and freshly grownL. pneumophila harvested during the late-log or the early-stationary growth phase. By increasing the temperature to 35and45C atpH7.2, the amount of 03 needed for at least 99%inactivation of L. pneumophila was 0.11 to 0.15 and 0.11 to0.14 , u g / m l , respectively. The control tubes of L. pneumo-phila exposed to these higher temperatures showed a lessthan 10%loss of viability at 3 5 C , while 25% loss of viabilityoccurred at 4 5 C .The effect of increasing pH on 03 inactivation of L.

pneumophila is also shown in Table 1. AtpH8.0 and 2 5 C ,a concentration of 0.20 , u g of 03 per ml effected at least a99% inactivation within 5 m i n . Whenthe pHwas increasedto 8.9 a t 2 5 C , a level of 0.14 , u w g of 03 per mlwas required forinactivation. Inactivation for eachgroup ofexperiments with03 consistently occurred within 5 m i n . Because of thetemporal constraints when the various concentrations of

TABLE 1 . O z o n e i n a c t i v a t i o n o f L . p n e u m o p h i l a s e r o g r o u p 1 a n d P . a e r u g i n o s a0 3 concn ( p . g / m l )forLoNbO r g a n i s m p H Temp N o . o f a p p r o x . 99% i n a c t i v a t i o n a L o g ( N / N o ) b( O C ) t e s t s Mean R a n g e SD Mean R a n g e SD

L . p n e u m o p h i l a 7 . 2 2 5 6 C 0 . 2 1 0 . 1 0 - 0 . 3 0 0 . 1 0 - 2 . 3 7 - 2 . 0 3 t o - 2 . 6 0 0 . 2 2L . p n e u m o p h i l a d 7 . 2 3 5 2 0 . 1 3 0 . 1 1 - 0 . 1 5 0 . 0 3 - 2 . 2 1 - 2 . 1 4 t o - 2 . 2 8 0 . 1 0L . p n e u m o p h i l a e 7 . 2 4 5 2 0 . 1 3 0 . 1 1 - 0 . 1 4 0 . 0 2 - 2 . 5 5 - 2 . 5 1 t o - 2 . 5 9 0 . 0 6L . p n e u m o p h i l a 8 . 0 2 5 2 0 . 2 0 0 . 1 9 - 0 . 2 0 0 . 0 1 - 2 . 4 5 - 2 . 1 0 t o - 2 . 7 9 0 . 4 9L . p n e u m o p h i l a 8 . 9 2 5 2 0 . 1 4 0 . 1 3 4 . 1 4 0 . 0 1 - 3 . 2 8 - 2 . 6 4 t o - 3 . 9 2 0 . 9 1P . a e r u g i n o s a 7 . 2 2 5 3 0 . 2 7 0 . 2 0 - 0 . 3 0 0 . 0 5 - 2 . 1 9 - 1 . 6 6 t o - 2 . 7 9 0 . 5 7a R a t e o f i n a c t i v a t i o n f o r e a c h g r o u p o f e x p e r i m e n t s o c c u r r e d w i t h i n t h e m i n i m u m c o n t a c t t i m e o f 5 m i n .b S u r v i v a l r a t i o i s l o g ( N , / N O ) , w h e r e N , a n d N o a r e b a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o n s a t t i m e t a n d 0 , r e s p e c t i v e l y . L o g ( N , / N ^ ) = - 2 . 0 0 c o r r e s p o n d s t o a 99% i n a c t i v a t i o n .Mean N o = 4 . 5 x 1 0 ' C F U / m l .c I n c l u d e s o n e t e s t i n w h i c h t h e b a c t e r i a were g r o w n on BCYE-a a g a r a n d on e i n w h i c h b a c t e r i a w e r e g r o w n i n y e a s t e x t r a c t b r o t h a n d t e s t e d i m m e d i a t e l y onh a r v e s t . T h e m e a n 0 3 c o n c e n t r a t i o n s r e q u i r e d f o r 9 9 % t i n a c t i v a t i o n were 0 . 1 5 a n d 0 . 2 5 , r e s p e c t i v e l y , w h i c h w e r e i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h o s e f o r t h e f r o z e n s t o c kc u l t u r e u s e d i n o t h e r r e p l i c a t e e x p e r i m e n t s .d L e s s t h a n 1 0 % l o s s o f v i a b i l i t y o c c u r r e d i n t h e c o n t r o l t u b e a t 3 5 ' C .e A 25 % l o s s o f v i a b i l i t y o c c u r r e d i n t h e c o n t r o l t u b e a t 4 5 C .

V O L . 5 4 , 1 9 8 8


5/8

7 4 4 DO M I N GU E ET A L .

CONTACT T I M E ( m i n u t e s )F I G . 2 . E f f e c t o f 0 3 c o n c e n t r a t i o n o n t h e i n a c t i v a t i o n o f L .p n e u m o p h i l a s e r o g r o u p 1 i n 0 . 0 1 M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 8 . 0 a n d2 5 C ) .

o z o n a t e d b u f f e r w e r e d i v i d e d i n t o a l i q u o t s , 5 m i n was t h em i n i m u m s a m p l i n g t i m e f o r e a c h r e a c t i o n t u b e .T h e o z o n e i n a c t i v a t i o n k i n e t i c s f o r L . p n e u m n o p h i l a a t pH8 . 0 i s s h o w n i n F i g . 2 . I n a c t i v a t i o n o f L . p n e u m o p h i l ao c c u r r e d w i t h i n 5 m i n o n c e a c r i t i c a l c o n c e n t r a t i o n o f o z o n ew a s r e a c h e d . O z o n e l e v e l s o f 0 . 1 3 [ i g / m l o r l e s s h a d n oe f f e c t , e v e n a t c o n t a c t t i m e s o f u p t o 3 0 m i n . N o t u n t i l ac o n c e n t ra t i o n o f a t l e a s t 0 . 2 0 . z L g / m l w a s r e a c h e d d i d i n a c t i -v a t i o n o c c u r .E x p o s u r e o f L . p n e u m o p h i l a t o 0 . 3 , u g o f f r e e c h l o r i n e p e rm l r e s u l t e d i n a 99% i n a c t i v a t i o n a f t e r a 3 0 - t o 4 5 - m i n c o n t a c tt i m e ( F i g . 3 ) . A t a c o n c e n t ra t io n o f 0 . 4 I . g o f f r e e c h l o r i n e p e rm l , a >99% i n a c t i v a t i o n o c c u r r e d w i t h i n 5 m i n , i n d i c a t i n gt h a t t h e r e i s a d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e c o n -c e n t r a t i o n o f f r e e c h l o r i n e a n d t h e r a t e o f i n a c t i v a t i o n .E v i d e n c e f o r t h e b a c t e r i o s t a t i c e f f e c t s o f f r e e c h l o r i n e o n L .p n e u m o p h i l a w e r e o b s e r v e d a t t h e l o w e r c h l o r i n e c o n c e n -t r a t i o n o f 0 . 3 , u g / m l f o r p r o l o n g e d c o n t a c t t i m e s ( 3 0 m i n o rg r e a t e r ) . L a t e - o c c u r r i n g c o l o n i e s w e r e n o t e d o n d a y s 6 a n d 8a f t e r i n c u b a t i o n . C o n t r o l p l a t e s w i t h c o m p a r a b l e n u m b e r s o fo r g a n i s m s d i d n o t s h o w s i m i l a r l a t e - o c c u r r i n g g r o w t h .I n c o n t r a s t t o o z o n e a n d f r e e c h l o r i n e , H 2 0 2 i n a c t i v a t i o no f L. p n e u m o p h i l a r e q u i r e d much h i g h e r c o n c e n t r a t i o n su n d e r s t a n d a r d c o n d i t i o n s . I t i s s h o w n i n F i g . 4 t h a t >99% o ft h e L . p n e u m o p h i l a p o p u l a t i o n w a s i n a c t i v a t e d a t 1 , 0 0 0 p L go f H 2 0 2 p e r m l w i t h i n 3 0 m i n . I f t h e c o n c e n t r a t i o n w a si n c r e a s e d t o 1 0 , 0 0 0 V i g / m l , a > 9 9 . 9 9 % i n a c t i v a t i o n o c c u r r e da t a f a s t e r r a t e . T h i s w a s t r u e f o r a l l i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s o fL . p n e u m o p h i l a f r o m 1 0 5 t o 1 0 9 C F U / m l . I t i s a l s o e v i d e n tf r o m t h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n F i g . 4 t h a t l o w e r c o n c e n t r a t i o n so f 1 0 0 a n d 3 0 0 p . g o f H 2 0 2 p e r m l h a d n o a p p r e c i a b l e e f f e c tw i t h i n 6 0 m i n , b ut r e q u i r e d a l o n g e r c o n ta c t t i m e f o r i n a c t i -v a t i o n . A f t e r a 2 4 - h c o n t a c t t i m e , w i t h a n i n i t i a l ( N O ) L .p n e u m o p h i l a c o n c e n t r a t i o n o f 7 . 1 x 1 0 5 C F U / m l , n o v i a b l eo r g a n i s m s c o u l d b e d e t e c t e d a f t e r e x p o s u r e t o 1 0 0 a n d 3 0 0p . g o f H 2 0 2 p e r m l .T h e l o s s o r s e ve r e r e d u c t i o n i n L . p n e u m o p h i l a u n s a t u -r a t e d f a t t y a c i d s a f t e r e x p o s u r e o f a p p r o x i m a t e l y 2 . 0 x 1 0 'C F U / m l t o 7 . 2 p L g o f 0 3 p e r m l c a n b e s e e n i n T a b l e 2 .R e d u c t i o n i n u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s w a s a l s o e v i d e n t a f t e re x p o s u r e o f L . p n e u m o p h i l a t o 1 0 , 0 0 0 , u g o f H 2 0 2 p e r m l , b u tn o t a f t e r e x p o s u r e t o 1 , 0 0 0 j i g o f H 2 0 2 p e r m l . O r g a n i s m s

CONTACT T I M E ( m i n u t e s )F I G . 3 . E f f e c t o f f r e e c h l o r i n e c o n c e n t r a t i o n o n t h e i n a c t i v a t i o n

o f L . p n e u i m o p h i l a s e r o g r o u p 1 i n 0 . 0 1 M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 2a n d 2 5 C ) . P o i n t s r e p r e s e n t t h e mean o f d u p l i c a t e e x p e r i m e n t s . B a r sr e p r e s e n t 1 s t a n d a r d d e v i a t i o n .w e r e a l s o e x p o s e d t o o x y g e n a t e d b u f f e r f o r t h e maximum6 0 - m i n c o n t a c t t i m e w i t h n e i t h e r a r e d u c t i o n i n v i a b l eo r g a n i s m s n o r a n a l t e r a t i o n o f f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n .

DISCUSSIONT h e b i o c i d a l e f f e c t o f o z o n e was d e m o n s t r a t e d i n t h i ss t u d y . O z o n e w a s e f f e c t i v e a g a i n s t P . a e r u g i n o s a a n d L .

CONTACT TIME ( h o u r s )F I G . 4 . E f f e c t o f H , 0 , c o n c e n t r a t i o n o n t h e i n a c t i v a t i o n o f L .p n e u m o p h i l a s e r o g r o u p 1 i n 0 . 0 1 M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 2 a n d2 5 C ) . P o i n t s r e p r e s e n t t h e mean o f d u p l i c a t e e x p e r i m e n t s . B a r sr e p r e s e n t 1 s t a n d a r d d e v i a t i o n . F o r 1 0 0 , u g / m l ( 0 ) a n d 3 0 0 , u g / m l( O ) , N o = 7 . 1 x 1 0 5 C F U / m l ; f o r 1 , 0 0 0 p . g / m l ( A ) a n d 1 0 , 0 0 0 , u g / m l( A ) , No = 1 . 9 x 1 0 9 C F U / m l ; c o n t r o l ( O ) i s i n d i c a t e d .

A P P L . E N V I RO N . M I CR O BI O L.


6/8

EFFECTS O F BIOCIDES ON L . PNEUMOPHILA 7 4 5TABLE 2 . E f f e c t o f v ar i ou s b i o c i d e t r e a t m e n t s o n t h e n o n h y d r o x y f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n o f L . p n e u m o p h i l a , s e r o g r o u p 1

R e a c t i o n % R e d u c t i o n F a t t y a c i d i d e n t i f i c a t i o n a n d r e l a t i v e a b u n d a n c e c d 'T r e a t m e n t " t i m e ( m i n ) i n v i a b i l i t y b n l 5 : 1 d i l 6 : 1 i l 6 : 0 n l 6 : 1 i l 7 : 1 a l 7 : 1C o n t r o l + N a 2 S 2 0 3 6 0 0 4 4 1 0 0 2 6 t r t rC o n tr o l o f 7 . 2 , u g o f 0 3 p e r m l + N a 2 S 2 0 3 6 0 0 4 5 1 0 0 2 2 t r t rC o n t r o l 0 2 6 0 0 4 5 1 0 0 2 3 t r t r1 , 0 0 0 j i g o f H202per m l 3 0 9 9 . 0 3 4 1 0 0 1 9 1 t r1 , 0 0 0 p . g o f H202 p e r m l 6 0 9 9 . 9 9 4 5 1 0 0 2 3 t r t r1 0 , 0 0 0 R g o f H202 p e r m l 3 0 9 9 . 9 9 N I f ND 1 0 0 1 ND ND1 0 , 0 0 0 V g o f H202per m l 6 0 9 9 . 9 9 ND ND 1 0 0 ND ND ND7 . 2 R g o f 0 3 p e r m l 3 0 9 9 . 9 8 ND ND 1 0 0 1 ND ND7 . 2 R g o f 0 3 p e r m l 6 0 9 9 . 9 9 ND ND 1 0 0 9 ND ND

a O r g a n i s m s w e r e e x p o s e d t o b i o c i d e s i n g l a s s t u b es c o n ta i ni n g a p pr o x i m a te l y 5 0 m l o f t h e b i o c i d e s d i l u t e d i n 0 . 0 1 M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 2 ) ; t u b e s w e r es e e d e d w i t h a p p r o x i m a t e l y 2 . 0 x 1 0 9 CFU/ml f r o m t h e f r o z e n s t o c k c u l t u r e . R e a c t i o n s o c c u r r e d a t 2 5 C w i t h a m i x i n g s p e e d o f 6 0 t o 8 0 r p m . B i o c i d a l a c t i v i t yw a s q u e n c h e d o n t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 m l o f 10 % N a 2 S 2 0 3 p e r 1 0 - m l r e a c t i o n v o l u m e .b V i a b i l i t y w a s d e t e r m i n e d b y s e r i a l l y d i l u t i n g t h e o r g a n i s m s i n b u f f e r e d d i l u t i o n w a t e r , f o l l o w e d b y p l a t i n g 0 . 1 - m l v o l u m e s o f t h e s e d i l u t i o n s o n t o B C Y E - c s a g a r .F a tt y a c id p r o f i l e s w e r e a n a l y z e d a s m e t h y l e s t e r s a n d a r e e x p r e s s e d a s r e l a t i v e a b u n d a n c e , i 1 6 : 0 = 1 0 0 ( s e e f o o t n o t e d f o r e x p l a n a t i o n o f i 1 6 : 0 ) .d D e s i g n a t i o n s i n d i c a t e t h e n u m b e r o f c a r b o n s : t h e n u m b e r o f d o u b l e b o n d s ; a b b r e v i a t i o n s : i , i s o - b r a n c h e d ; a , a n t e i s o - b r a n c h e d ; c y c , c y c l o p r o p a n e ; t r , t r a c e ;n , n o r m a l ( s t r a i g h t c h a i n ) .I N o n h y d r o x y f a t t y a c i d s n o t a l t e r e d b y t h e s e t r e a t m e n t s i n c l u d e d t h e f o l l o w i n g ( m e a n r e l a t i v e a b u n d a n c e ) : i l 4 : 0 ( 1 8 ) , n 1 4 : 0 ( t r ) , i l 5 : 0 ( t r ) , a l 5 : 0 ( 4 9 ) , n 1 5 : 0 ( 2 ) ,n l 6 : 0 ( 1 2 ) , i l 7 : 0 ( t r ) , a l 7 : 0 ( 2 3 ) , 1 7 c y c ( 3 ) , n 1 7 : 0 ( 1 ) , i 1 8 : 0 ( 1 ) , n 1 7 : 0 ( 5 ) , a 1 9 : 0 ( t r ) , n 1 9 : 0 ( 1 ) , i 2 0 : 0 ( t r) , a 2 1 : 0 ( t r ) , a n d n 2 1 : 0 ( t r ) .f ND, N o t d e t e c t e d .

p n e u m o p h i l a serogroup 1 a t t h e pHs a n d t e m p e r a t u r e si n v e s t i g a t e d . A t l o w l e v e l s ( 0 . 1 0 t o 0 . 3 0 , u g o f 0 3 p e r m l ) , t h er a t e o f i n a c t i v a t i o n was v e r y r a p i d ( c 5 m i n ) . T h e s e d a t acompare f a v o r a b l y w i t h t h e m i n i m a l 03 v a l u e s f o u n d t o b ee f f e c t i v e a g a i n s t o t h e r b a c t e r i a . B r o a d w a t e r e t a l . ( 2 ) n o t e d al e t h a l t h r e s h o l d l e v e l o f 0 . 1 2 , u g o f 0 3 p e r m l f o r B a c i l l u sc e r eus a n d a l e v e l o f 0 . 1 9 R x g o f 0 3 p e r m l f o r E s c h e r i c h i a c o l ia n d B a c i l l u s m e g a t e r i u m when t h e s e o r g a n i s m s w e r e s e e d e da t 1 0 6 C F U / m l ; t h e r a t e o f i n a c t i v a t i o n o c c u r r e d w i t h i n 5m i n . E d e l st e in a n d c o - w o r k e r s ( 6 ) r e p o r t e d t h a t a minimumc o n c e n t r a t i o n o f 0 . 3 2 , u g o f 03 p e r m l r e s u l t e d i n a 4 - l o g - u n i tr e d u c ti o n o f L . p n e u m o p h i l a serogroups 1 a n d 4 , w h i c h werea l s o s e e d e d a t 1 0 6 C F U / m l . I n f i e l d s t u d i e s , P o p e e t a l . ( 3 0 )s h o w e d t h a t o z o n e e f f e c t i v e l y r e d u c e d t h e b a c t e r i a l p o p u l a -t i o n i n c o o l i n g tower w a t e r , i n c l u d i n g , t o a d e g r e e , L .p n e u m o p h i l a . T h e pHs a n d r a t e o f i n a c t i v a t i o n w e r e n o ti n d i c a t e d i n t h e s e s t u d i e s .A t c o m p a r a b l e m i c r o g r a m p e r m i l l i l i t e r l e v e l s i n t h i ss t u d y , ozo n e i n a c t i v a t e d L . p n e u m o p h i l a more r a p i d l y t h a nd i d f r e e c h l o r i n e . S u c h a r a p i d r a t e o f i n a c t i v a t i o n may b e ad e f i n i t e a d v a n t a g e i n a l a r g e r e c i r c u l a t i n g water s y s t e mw h e r e r e t e n t i o n t i m e i n a t r e a t m e n t l o o p i s n e c e s s a r i l y s h o r t .Ozone was e f f e c t i v e a g a i n s t L . p n e u m o p h i l a over a p H rangeo f 7 . 2 t o 8 . 9 , d e s p i t e t h e n a t u r a l d e c a y a n d f a s t e r r a t e o fd e c a y o f ozo n e a t a l k a l i n e p H . I n c o n t r a s t , t h e r e d u c e db i o c i d a l e f f e c t i v e n e s s o f f r e e c h l o r i n e a t p H v a l u e s o f > 7 . 0h a s b e e n w e l l d o c u m e n t e d ( 9 , 2 2 ) . T h i s c o m p a r i s o n maymake ozo n e a more e f f i c i e n t b i o c i d a l a g e n t i n r e c i r c u l a t i n gw a t e r s y s t e m s t h a t t e n d t o b e a l k a l i n e . A l s o n o t e w o r t h y wast h e o b s e r v a t i o n o f b a c t e r i o s t a t i c e f f e c t s a t l o w l e v e l s o f f r e ec h l o r i n e f o r p r o l o n g e d c o n t a c t t i m e s . E v i d e n c e o f c h l o r i n er e s i s t a n c e i n L e g i o n e l l a p o p u l a t i o n s h a s b e e n c i t e d b y o t h e ri n v e s t i g a t o r s ( 2 1 , 2 2 , 3 7 ) . The r e s i s t a n c e o f L e g i o n e l l a s p p .t o l o w l e v e l s o f c h l o r i n e may h e l p t o e x p l a i n , i n p a r t , t h ep r e s e n c e a n d p e r s i s t e n c e o f l e g i o n e l l a e i n p o t a b l e as w e l l asr e c i r c u l a t i n g water s y s t e m s .I n c o n t r a s t t o b o t h ozo n e a n d f r e e c h l o r i n e , H 2 0 2 i n a c t i -v a t i o n o f L . p n e u m o p h i l a r e q u i r e d much h i g h e r m i c r o g r a mp e r m i l l i l i t e r l e v e l s . H o w e v e r , H202 i n a c t i v a t i o n d i d e x h i b i ta d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p between t h e c o n c e n t r a t i o n o fH202 a n d t h e r a t e o f i n a c t i v a t i o n . T h i s was s i m i l a r t o f r e ec h l o r i n e i n a c t i v a t i o n b u t d i f f e r e d from ozone i n a c t i v a t i o n ,w h i c h o c c u r r e d v e r y r a p i d l y a f t e r a c r i t i c a l l e v e l o f ozo n e

w a s r e a c h e d . T h e l o w e s t c o n c e n t r a t i o n o f H202 t e s t e d , i . e . ,1 0 0 , u g / m l , r e d u c e d t h e L . p n e u m o p h i l a p o p u l a t i o n b e l o w t h el i m i t o f d e t e c t a b i l i t y , b u t p r o l o n g e d c o n t a c t t i m e s o f c 2 4 hw e r e r e q u i r e d a t p H 7 . 2 a n d 2 5 C . U n l i k e o z o n e , t h e r e w a sn o d e c r e a s e i n t h e o x i d i z i n g p o t e n t i a l o f t h e v a r i o u s c o n c e n -t r a t i o n s o f H 2 0 2 d u r i n g t h e 2 4 - h c o n t a c t t i m e . Y o s h p e - P u r e ra n d E y l a n ( 3 9 ) r e p o r t e d a s i m i l a r p r o l o n g e d r a t e o f H 2 0 2i n a c t i v a t i o n a g a i n s t m i x e d p o p u l a t i o n s o f a v a r i e t y o f b a c t e -r i a . P e r s i s t e n t k i l l i n g e f f e c t s o f u p t o 1 3 d a y s w e r e n o t e d i ns o l u t i o n s c o n t a i n i n g 3 0 t o 9 0 , u g o f H202 p e r m l . D u r i n g a ni n v e s t i g a t i o n o f i n v i v o m i c r o b i o c i d a l s y s t e m s a g a i n s t L .p n e u m o p h i l a , L o c k s l e y e t a l . ( 2 3 ) w e r e a b l e t o d e m o n s t r a t ea 99% i n a c t i v a t i o n o f 1 0 6 C F U / m l a t 6 6 , u g o f H 2 0 2 p e r m lw i t h i n 1 h a t 3 7 C a n d w i t h c o n s t a n t a g i t a t i o n . W h i l e p e r h a p sn o t a m e n a b l e t o l a r g e c o o l i n g t o w e r a p p l i c a t i o n , H 2 0 2 m a yb e u s e f u l i n t h e c o n t r o l o f L eg i o n e l l a p o pu l at i o ns i n t h et r e a t m e n t o f e v a p o r a t i v e c o n d e n s e r s o r o th e r s m a l l e r v o l -umes o f w a t e r .T h e l o s s o r s e v e r e r e d u c t i o n o f L . p n e u m o p h i l a u n s a t u -r a t e d f a t t y a c i d s f o l l o w i n g e x p o s u r e t o o z o n e w a s n o tu n e x p e c t e d , o w i n g t o t h e p o w e r f u l o x i d i z i n g c a p a b i l i t y o fo z o n e a n d p r e v i o u s s t u d i e s o f o z o n e o x i d a t i o n o f commer-c i a l l y p r e p a r e d u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s ( 3 1 ) . T h e a b i l i t y o f 0 3t o a t t a c k t h e u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s o f L. p n e u m o p h i l a a n dt o k i l l t h e b a c t e r i a i n t h i s e x p e r i m e n t a l s y s t e m p r o b a b l yr e f l e c t s t h e p o w e r f u l o x i d i z i n g c a p a b i l i t y o f t h i s u n s t a b l eb i o c i d e , i t s r a p i d r a t e o f d i f f u s i o n t h r o u g h b a c t e r i a l c e l lw a l l s , a n d i t s r a p i d r a t e o f r e a c t i o n w i t h a w i d e r a n g e o fo r g a n i c c o m p o u n d s ( 2 6 , 3 1 , 3 8 ) . S i n c e f a t t y a c i d s a r e a ni n t e g r a l c o m p o n e n t o f b a c t e r i a l m e m b r a n e s , d i s r u p t i o n o fm e m b r a n e s t r u c t u r e a n d , h e n c e , f u n c t i o n m a y b e a c r i t i c a le f f e c t o f 0 3 e x p o s u r e . I n p a r t i c u l a r , m e m b r a n e - a s s o c i a t e dp r o t e i n s c o n t a i n i n g s u l f h y d r y l g r o u p s c a n b e r e a d i l y o x i -d i z e d b y o z o n e ( 2 6 ) .T h e r e t e n t i o n o f u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s a f t e r e x p o s u r e o fL. p n e u m o p h i l a t o 1 , 0 0 0 p L g o f H 2 0 2 p e r m l , c o n c o m i t a n tw i t h a 99 % p l u s l o s s i n v i a b i l i t y , wa s u n e x p e c t e d . T h i s w asi n c o n t r a s t t o t h e l o s s o f u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s a n d v i a b i l i t yw i t h e x p o s u r e t o h i g h e r l e v e l s o f H 2 0 2 a n d 0 3 . S u c h d a t as u g g e s t t h a t t h e l o s s o f L . p n e u m o p h i l a u n s a t u r a t e d f a t t ya c i d s f o l l o w i n g e x p o s u r e t o H 2 0 2 i s p r o b a b l y n o t t h e l e t h a le v e n t p e r s e . I n a d d i t i o n , 0 3 a t t a c k s t h e d o u b l e b o n d s o fu n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s more r a p i d l y a n d p o s s i b l y b y a

V O L . 5 4 , 1 9 8 8


7/8

7 4 6 D OMING U E ET A L .d i f f e r e n t m e c h a n i s m t h a n d o e s H 2 0 2 . A n o t h e r f a c t o r w h i c hmay e f f e c t t h e r e s p o n s e o f L . p n e u m o p h i l a t o H 2 0 2 com-p a r e d w i t h t h a t o f 0 3 a n d c h l o r i n e i s t h e presenc e o f c a t a l a s ei n many s p e c i e s o f L e g i o n e l l a . T h e i n c r e a s e d l e v e l s o f H 2 0 2nec essary f o r t h e k i l l i n g o f L . p n e u m o p h i l a a n d o x i d a t i o n o fi t s f a t t y a c i d s may r e f l e c t t h e d e s tr u c t i o n o f H 2 0 2 b y t h eb a c t e r i a l e nz y m e c a t a l a s e .

One a d v a n t a g e t o a s t u d y s u c h as t h i s o n e i s t h a t c o mp a r-i s o n s o f amounts o f b i o c i d e s a n d t h e i r r e l a t i v e r a t e s o fi n a c t i v a t i o n c a n b e m a de u n d e r s t a n d a r d c o n t r o l l e d c o n d i -t i o n s . S u c h c o m p a r i s o n s d o n o t i m p l y h ow e f f e c t i v e t h e s eb i o c i d e s w o u l d b e i n a c o m p l e x e n v i r o n m e n t a l s i t u a t i o n .C e r t a i n l y , t h e i n t e r p l a y o f m a n y c h e m i c a l , p h y s i c a l , a n db i o l o g i c a l p a r a m e t e r s w i t h i n a c o o l i n g s y s t e m e n v i r o n m e n td e t e r m i n e s t h e b i o c i d a l e f f e c t i v e n e s s o f e a c h p a r t i c u l a rw a t e r t r e a t m e n t , as d o e s t h e d i s s o c i a t i o n s p e c i e s o f a b i o -c i d e . C o m p e t i t i o n o f t h e b i o c i d e s f o r r e a c t i o n w i t h o r g a n i cm a t t e r i s a l s o a f a c t o r . A d d i t i o n a l l y , b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s i nt h e i r n a t u r a l e n v i r o n m e n t p r e s u m a b l y grow more s l o w l yt h a n d o t h o s e same p o p u l a t i o n s c u l t i v a t e d o n n u t r i e n t - r i c hm e d i a . L e g i o n e l l a p o p u l a t i o n s , i n t h e i r n a t u r a l a q u a t i c h a b -i t a t s , may e x h i b i t d i f f e r e n t s e n s i t i v i t i e s t o t h e s e b i o c i d e s i nc o m p a r i s o n w i t h t h e i r l a b o r a t o r y - g r o w n c o u n t e r p a r t s .Ozone a n d h y d r o g e n p e r o x i d e a re n o t c u r r e n t l y i n w i d e -s p r e a d us e i n t h e c o o l i n g s y s t e m i n d u s t r y , b u t t h e y areb e c o m i n g more a t t r a c t i v e a s p o s s i b l e e n v i r o n m e n t a l l y s a f ea l t e r n a t i v e s t o t h e us e o f o r g a n i c b i o c i d e s a n d c h l o r i n e ( 7 ) .The f i n a l d e c o m p o s i t i o n p r o d u c t s o f b o t h 03 a n d H 2 0 2 are

02 a n d H 2 0 . I n t h e c a s e o f 0 3 , n o r e s i d u a l p e r s i s t s i n w a t e ru n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s . B e c a u s e o f i t s p e r s i s t e n t b i o c i d a la c t i v i t y , H 2 0 2 may b e a u s e f u l a d j u n c t b i o c i d e .As w i t h a n y b i o c i d e , t h e t r u e t e s t o f e f f e c t i v e n e s s i ne n v i r o n m e n t a l s i t u a t i o n s i s t h r o u g h w e l l - pl a n n e d m o n i t o r i n gi n t h e f i e l d . The r e s u l t s o f t h i s l a b o r a t o r y s t u d y g i v e cre-d e n c e t o a n d s u p p o r t t h e n e e d f o r f i e l d s t u d i e s i n t o t h ee f f e c t i v e n e s s o f b o t h 03 a n d H 2 0 2 i n c o n t r o l l i n g L e g i o n e l l ap o p u l a t i o n s .ACKNOWLEDGMENTS

We t h a n k H . Banks Edwards a n d L a r r y Green f o r t h e i r manyh e l p f u l d i s c u s s i o n s a n d s u g g e s t i o n s on t h e us e o f a n d m o n i t o r i n g f o rozone.

L I T E R A T U R E CITED1 . American P u b l i c H e a l t h A s so c i a ti o n . 1 9 7 5 . S t a n d a r d m e t h o d s f o r

t h e e x a m i n a t i o n o f w a t e r a n d w a s t e w a t e r , 1 4 t h e d . A m e r i c a nP u b l i c H e a l t h A s s o c i a t i o n , A m e r i c a n Water Works A s s o c i a -t i o n , a n d Water P o l l u t i o n C o n t r o l F e d e r a t i o n , W a s h i n g t o n ,D . C .2 . B r o a d w a t e r , W. T . , R . C . H o e h n , a n d P . H . K i n g . 1 9 7 3 .S e n s i t i v i t y o f t h r e e s e l e c t e d b a c t e r i a l s p e c i e s t o ozone. A p p l .E n v i r o n . M i c r o b i o l . 2 6 : 3 9 1 - 3 9 3 .3 . C h e r r y , W. B . , B . P i t t m a n , P. H a r r i s , G . A . H e b e r t , B . M.T h o m a s o n , L . T h a c k e r , a n d R . E . W e a v e r . 1 9 7 8 . D e t e c ti o n o fL e g i o n n a i r e s ' d i s e a s e b a c t e r i a b y d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n g . J . C l i n . M i c r o b i o l . 8 : 3 2 9 - 3 3 8 .4 . C o r d e s , L . G . , D . W. F r a s e r , P . S k a l i y , C . A . P e r l i n o , W. R .E l s e a , G . F . M a l l i s o n , a n d P . S . H a y e s . 1 9 8 0 . L e g i o n n a i r e s 'd i s e a s e o u t b r e a k a t a n A t l a n t a , G e o r g i a , c o u n t r y c l u b : e v i d e n c ef o r s p r e a d from a n e v a p o r a t i v e c o n d e n s e r . Am. J . E p i d e m i o l .1 1 1 : 4 2 5 - 4 3 1 .5 . D o n d e r o , T . J . , R . C . R e n d t o r f f , G . F . M a l l i s o n , R . M. W e e k s ,J . S . L e v y , E . W . L o n g , a n d W. S c h a f f n e r . 1 9 8 0 . An o u t b r e a k o fL e g i o n n a i r e s ' d i s e a s e a s s o c i a t e d w i t h a c o n t a m i n a t e d a i r - c o n -d i t i o n i n g c o o l i n g t o w e r . N . E n g l . J . M e d . 3 0 2 : 3 6 5 - 3 7 0 .6 . E d e l s t e i n , P . H . , R . E . W h i t t a k e r , R . L . K r e i l i n g , a n d C . L .H o w e l l . 1 9 8 2 . E f f i c a c y o f ozon e i n e r a d i c a t i o n o f L e g i o n e l l ap n e u m o p h i l a from h o s p i t a l p l u m b i n g f i x t u r e s . A p p l . E n v i r o n .

M i c ro b i o l . 4 4 : 1 3 3 0 - 1 3 3 4 .7 . E d w a r d s , H . B . 1 9 8 1 . T r e a t m e n t o f c o o l i n g t o w e r w a t e r w i t ho z o n e i n l i e u o f c h e mi c a l s, p . 2 1 - 2 9 . I n R . G . R i c e ( e d . ) , O z o n et r e a t m e n t o f w a t e r f o r c o o l i n g a p p l i c a t i o n s . I n t e r n a t i o n a l O z o n eA s s o c i a t i o n , V i en n a, V a.8 . E n g l a n d , A . C . , D . W. F r a s e r , G . F . M a l l i s o n , D . C . M a c k e l , P .S k a l i y , a n d G . W. G o r m a n . 1 9 8 2 . F a i l u r e o f L e g i o n e l l a p n e u -m o p h i l a s e n s i t i v i t i e s t o p r e d i c t c u l t u r e r e s u l t s f r o m d i s i n f e c t a n t -t r e a t e d a i r - c o n d i t i o n i n g c o o l i n g t o w e r s . A p p l . E nv i ro n . M i c r o -b i o l . 4 3 : 2 4 0 - 2 4 4 .9 . F l i e r m a n s , C . B . , G . E . B e t t i n g e r , a n d A . W. F y n s k . 1 9 8 2 .T r e a t m e n t o f c o o l i n g s y s t e m s c o n t a i n i n g h i g h l e v e l s o f L e g i o n -e l l a p n e u m o p h i l a . W a t e r R e s . 1 6 : 9 0 3 - 9 0 9 .1 0 . F l i e r m a n s , C . B . , W. B . C h e r r y , L . H . O r r i s o n , S . J . S m i t h ,D . L . T i s o n , a n d D . H . P o p e . 1 9 8 1 . E c o l o g i c a l d i s t r i b u t i o n o fL e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 1 : 9 - 1 6 .1 1 . F l i e r m a n s , C . B . , W. B . C h e r r y , L . H . O r r i s o n , a n d L . T h a c k e r .1 9 7 9 . I s o l a t i o n o f L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a f r o m n o n e p i d e m i c -r e l a t e d a q u a t i c h a b i t a t s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 7 : 1 2 3 9 -1 2 4 2 .1 2 . F l i e r m a n s , C . B . , a n d R . S . H a r v e y . 1 9 8 4 . E f f e c t i v e n e s s o f1 - b r o m o - 3 - c h l o r o - 5 , 5 - d i m e t h y l h y d a n t o i n a g a i n s t L e g i o n e l l ap n e u m o p h i l a i n a c o o l i n g t o w e r . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .4 7 : 1 3 0 7 - 1 3 1 0 .1 3 . F r a s e r , D . W . , D . C . D e u b n e r , D . L . H i l l , a n d D . K . G i l l i a m .1 9 7 9 . N o n p n e u m o n i c , s h o r t - i n c u b a t i o n - p e r i o d l e g i o n e l l o s i s( P o n t i a c f e v e r ) i n me n who c l e a n e d a s t e a m t u r b i n e c o n d e n s e r .S c i e n c e 2 0 5 : 6 9 0 - 6 9 1 .1 4 . F u r m a n , N . H . ( e d . ) . 1 9 4 9 . S t a n d a r d m e t h o d s o f c h e m i c a la n a l y s i s , 6 t h e d . D . V a n N o s t r a n d C o . , I n c . , P r i n c e t o n , N . J .1 5 . G i l p i n , R . W . , S . B . D i l l o n , P . K e y s e r , A . A n d r o k i t e s , M.B e r u b e , N . C a r p e n d a l e , J . S k o r i n a , J . H u r l e y , a n d A . M. K a p -l a n . 1 9 8 5 . D i s i n f e c t i o n o f c i r c u l a t i n g w a t e r s y s t e m s b y u l t r a v i -o l e t l i g h t a n d h a l o g e n a t i o n . W a t e r R e s . 1 9 : 8 3 9 - 8 4 8 .1 6 . G o r d o n , G . , a n d J . G r u n w e l l . 1 9 8 4 . I m p r o v e d t e c h n i q u e s f o rr e s i d u a l o z o n e . R e p o r t E P A - 6 0 0 / 5 2 - 8 4 - 0 3 6 . U . S . E n v i r o n m e n t a lP r o t e c t i o n A g e n c y , C i n c i n n a t i , O h i o .1 7 . H a l e y , C . E . , M. L . C o h e n , J . H a l t e r , a n d R . D . M e y e r . 1 9 7 9 .N o s o c o m i a l L e g i o n n a i r e s ' d i s e a s e : a c o n t i n u i n g common-s o u r c e e p i d e m i c a t W a d s w o r t h M e d i c a l C e n t e r . A n n . I n t e r n .M e d . 9 0 : 5 8 3 - 5 8 6 .1 8 . K a u f m a n , A . F . , J . E . M c D a d e , C . M. P a t t o n , J . V . B e n n e t t , P .S k a l i y , V . F . N e w h o u s e , M. B . G r e g g , a n d P . S . B r a c h m a n n .1 9 8 1 . P o n t i a c f e v e r : i s o l a t i o n o f t h e e t i o l o g i c a l a g e n t ( L e g i o n e l l ap n e u m o p h i l a ) a n d d e m o n s t r a t i o n o f i t s mode o f t r a n s m i s s i o n .Am. J . E p i d e m i o l . 1 1 4 : 3 3 7 - 3 4 7 .1 9 . K l a u c k e , D . N . , R . L . V o g t , D . L a R u e , L . E . W i t h e r e l l , L . A .O r c i a r i , K . G . S p i t a l n y , R . P e l l e t i e r , W. B . C h e r r y , a n d L . F .N o v i c k . 1 9 8 4 . L e g i o n n a i r e s ' d i s e a s e : t h e e p i d e m i o l o g y o f t w oo u t b r e a k s i n B u r l i n g t o n , V e r m o n t , 1 9 8 0 . Am . J . E p i d e m i o l . 1 1 9 :3 8 2 - 3 9 1 .2 0 . K u r t z , J . B . , C . L . R . B a r t l e t t , U . A . N e w t o n , R . A . W h i t e , a n dN . L . J o n e s . 1 9 8 2 . L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a i n c o o l i n g w a t e rs y s t e m s . J . H y g . 8 8 : 3 6 9 - 3 8 1 .2 1 . K u t c h t a , J . M . , S . J . S t a t e s , J . E . M c G l a u g h l i n , J . H . O v e r -m e y e r , R . M. W a d o w s k y , A . M. M c N a m a r a , R . S . W o l f o r d , a n dR . B . Y e e . 1 9 8 5 . E n h a n c e d c h l o r i n e r e s i s t a n c e o f t a p w a t e r -a d a p t e d L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a a s c o m p a r e d w i th a g a r m e d i -u m - p a s s a g e d s t r a i n s . A p p l . E n v i r o n . M ic r o b i o l . 5 0: 2 1 -2 6 .2 2 . K u t c h t a , J . M . , S . J . S t a t e s , A . M. M c N a m a r a , R . M. W a .d o w s k y , a n d R . B . Y ee . 1 9 8 3 . S u s c e p t i b i l i t y o f L e g i o n e l l a p n e u -m o p h i l a t o c h l o r i n e i n t a p w a t e r . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .4 6 : 1 1 3 4 - 1 1 3 9 .2 3 . L o c k s l e y , R . M . , R . F . J a c o b s , C . B . W i l s o n , W. M. W e a v e r , a n dS . J . K l e b a n o f f . 1 9 8 2 . S u s c e p t i b i l i t y o f L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l at o o x y g e n - d e p e n d e n t m i c r o b i c i d a l s y s t e m s . J . I m m u n o l . 1 2 9 :2 1 9 2 - 2 1 9 7 .2 4 . M a c f a r l a n e , J . T . , M. J . W a r d , R . G . F i n c h , a n d A . D . M ac r a e .1 9 8 2 . H o s p i t a l s t u d y o f a d u l t c o m m u n i t y -a c q u i re d p n e u m o n i a .L a n c e t i i : 2 5 5 - 2 5 8 .2 5 . M a y b e r r y , W. R . 1 9 8 4 . M o n o h y d r o x y a n d d i h y d r o x y f a t t y a c i dc o m p o s i t i o n o f L e g i o n e l l a s p e c i e s . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 3 4 :3 2 1 - 3 2 6 .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


8/8

EFFECTS O F BIOCIDES ON L . PNEUMOPHILA2 6 . M e n z e l , D . B . 1 9 7 1 . O x i d a t i o n o f b i o l o g i c a l l y a c t i v e r e d u c i n gs u b s t a n c e s b y o zo n e . A r c h . E n v i r o n . H e a l t h 2 3 : 1 4 9 - 1 5 3 .2 7 . M o r r i s , G . K . , C . M. P a t t o n , J . C . F e e l e y , S . E . J o h n s o n , G .G o r m a n , W. T . M a r t i n , P . S k a l i y , G . F . M al l i so n , B . D . P o l i t t i ,a n d D . C . M a c k e l . 1 9 7 9 . I s o l a t i o n o f t h e L e g i o n n a i r e s ' d i s e a s eb a c t e r i u m f r o m e n v i r o n m e n t a l s a m p l e s . A n n . I n t e r n . M e d . 9 0 :6 6 4 - 6 6 6 .2 8 . O r r i s o n , L . H . , W. B . C h e r r y , a n d D . M i l a n . 1 9 8 1 . I s o l a t i o n o f

L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a f r o m c o o l i n g tower w a t e r b y f i l t r a t i o n .A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 1 : 1 2 0 2 - 1 2 0 5 .2 9 . P e l e g , M. 1 9 7 6 . T h e c h e m i s t r y o f ozone i n t h e t r e a t m e n t o fw a t e r . W a t e r R e s . 1 0 : 3 6 1 - 3 6 5 .3 0 . P o p e , D . H . , L . W. E i c h l e r , T . F . C o a t e s , J . F . K r a m e r , a n d R . J .S o r a c c o . 1 9 8 4 . T h e e f f e c t o f ozon e on L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l aa n d o t h e r b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s i n c o o l i n g t o w e r s . C u r r . M i c r o -b i o l . 1 0 : 8 9 - 9 4 .3 1 . R o e h m , J . N . , J . G . H a d l e y , a n d D . B . M e n z e l . 1 9 7 1 . O x i d a t i o no f u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s b y oz o ne a n d n i t r o g e n d i o x i d e . A r c h .E n v i r o n . H e a l t h 2 3 : 1 4 2 - 1 4 8 .3 2 . S t o u t , J . E . , V . L . Y u , a n d M. G . B e s t . 1 9 8 5 . E c o l o g y o fL e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a w i t h i n w a t e r d i s t r i b u t i o n s y s t e m s .A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 9 : 2 2 1 - 2 2 8 .

3 3 . T a y l o r , R . J . , F . C . S c h w e n t k e r , a n d T . R . H a k a l a . 1 9 8 1 .O p p o r t u n i s t i c l u n g i n f e c t i o n s i n r e n a l t r a n s p l a n t p a t i e n t s : ac o m p a r i s o n o f P i t t s b u r g p n e u m o n i a a g e n t a n d L e g i o n n a i r e s 'd i s e a s e . J . U r o l . 1 2 5 : 2 8 9 - 2 9 2 .3 4 . T y n d a l l , R . L . 1 9 8 2 . C o n c e n t r a t i o n , s e r o t y p i c p r o f i l e s a n di n f e c t i v i t y o f L e g i o n n a i r e s ' d i s e a s e b a c t e r i a p o p u l a t i o n s i nc o o l i n g t o w e r s . J . C o o l i n g Tower I n s t . 3 : 2 5 - 3 3 .3 5 . U . S . E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n A g e n c y . 1 9 8 2 . S t e a m e l e c t r i cp o w e r g e n e r a t i n g p o i n t source c a t e g o r y e f f l u e n t g u i d e l i n e s a n ds t a n d a r d s . R e p o r t V . 4 7 F . R . : 5 2 2 9 0 - 5 2 3 0 9 . U . S . E n v i r o n m e n t a lP r o t e c t i o n A g e n c y , C i n c i n n a t i , O h i o .3 6 . W a d o w s k y , R . M . , R . B. Y e e , L . M e z m a r , E . J . W i n g , a n d J . N .D o w l i n g . 1 9 8 2 . H o t water s y s t e m s a s sourc es o f L e g i o n e l l ap n e u m o p h i l a i n h o s p i t a l a n d n o n h o s p i t a l p l u m b i n g f i x t u r e s .A pp l . E n vi r o n . M i c r o b i o l . 4 3 : 1 1 0 4 - 1 1 1 0 .3 7 . W a n g , W. L . , M. J . B l a s e r , J . C r a v e n s , a n d M. A . J o h n s o n .1 9 7 9 . G r o w t h , s u r v i v a l a n d r e s i s t a n c e o f t h e L e g i o n n a i r e s 'd i s e a s e b a c t e r i u m . A n n . I n t e r n . M e d . 9 0 : 6 1 4 - 6 1 8 .3 8 . W e b e r , W. J . 1 9 7 2 . P h y s i o c h e m i c a l p ro c e s s e s f o r w a t e r q u a l i t yc o n t r o l . J o h n W i l e y & S o n s , I n c . , Ne w Y o r k .3 9 . Y o s h p e - P u r e r , Y . , a n d E . E y l a n . 1 9 6 8 . D i s i n f e c t i o n o f w a t e r b yh y d r o g e n p e r o x i d e . H e a l t h L ab . S c i . 5 : 2 3 3 - 2 3 8 .

V O L . 5 4 , 1 9 8 8 7 4 7

cercetari in microbiologie

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