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PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEIO AMBIENTE
E DESENVOLVIMENTO REGIONAL
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CLASTOGÊNICO DE AMOSTRAS DE ÁGUAS FLUVIAIS EM ÁREA URBANA DO MUNICÍPIO DE PRESIDENTE PRUDENTE-SP
ATRAVÉS DO TESTE DE Allium cepa L.
ANA CAROLINA PRETO MALAMAN
Projeto de pesquisa apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Meio Ambiente e Desenvolvimento Regional, Pró-Reitoria e Pós-Graduação da Universidade do Oeste Paulista, como parte dos requisitos para a sua admissão ao curso de Mestrado.
Orientador: Dr. Paulo Antonio da SilvaCo-orientador: Dr. Antonio Fluminhan JúniorIniciação Científica: Gabriela Araújo LourençoIniciação Científica: Iago Fernandes SantosIniciação Científica: Nathália Caetano Tagliati
Presidente Prudente - SP
2017
RESUMO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CLASTOGÊNICO DE AMOSTRAS DE ÁGUAS FLUVIAIS EM ÁREA URBANA DO MUNICÍPIO DE PRESIDENTE PRUDENTE –SP
ATRAVÉS DO TESTE DE Allium cepa L.
Muitos problemas de saúde em humanos são atribuídos à contaminação do meio ambiente por resíduos decorrentes das atividades antrópicas. Para a avaliação de riscos mutagênicos, a detecção de agentes contaminantes e o biomonitoramento ambiental, os bioensaios com plantas superiores têm sido amplamente utilizados, sendo que uma das espécies mais empregadas é o Allium cepa L. (cebola comum). O objetivo dessa pesquisa é avaliar a citotoxicidade e a genotoxicidade da água coletada do córrego do Limoeiro, situado na cidade de Presidente Prudente, SP, por meio do sistema teste Allium cepa como bioindicador. Pretende-se verificar a ocorrência e os tipos de danos causados em células meristemáticas radiculares através dos testes de aberrações cromossômicas, índice mitótico e micronúcleo. Os testes serão realizados em amostras coletadas em cinco pontos do córrego, desde a sua nascente, ao longo do percurso do curso d’água dentro do município e até alguns quilômetros distantes da área urbana. Serão avaliados dois períodos do ano, sendo as primeiras amostras coletadas nos meses de junho a agosto, quando o clima é predominantemente seco. As demais amostras serão coletadas nos meses de janeiro a março, quando o clima tem predominância chuvosa. Serão utilizados 10 bulbos de Allium cepa para cada ensaio em cada um dos cinco pontos de amostragem. Serão utilizados como controle negativo bulbos mantidos sobre água destilada e, como controle positivo, bulbos mantidos em solução com peróxido de Hidrogênio a 300mM, perfazendo um total de 70 bulbos para os testes realizados em cada estação climática. Pontas de raízes em crescimento serão coletadas em fixador Carnoy e mantidos em geladeira até o preparo das lâminas. Será empregada a técnica de esmagamento de meristemas radiculares após a sua coloração pelo método de Feulgen. Configurações celulares serão observadas em microscópio óptico, através da técnica de varredura, onde serão contadas 2000 células por ponto de coleta. O índice mitótico será avaliado através da observação do número de células em cada fase da divisão celular. Será analisada a frequência dos diferentes tipos de aberrações cromossômicas, tais como: formação de anel, atraso na separação de cromátides-irmãs, presença de pontes e fragmentos cromossômicos em anáfase e telófase, formação de micronúcleos e outras anomalias que permitam a detecção de danos ao DNA a nível qualitativo. Os resultados serão submetidos à análise de variância pelo teste F e ao teste de Tukey para a comparação de médias ao nível de 5% de probabilidade, utilizando-se o programa estatístico Assistat.
Palavras-chave: Biomonitoramento ambiental, Allium cepa L., Águas pluviais, Aberrações mitóticas, Mutagenicidade ambiental
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
Atualmente muitos problemas de saúde em seres humanos são atribuídos à
contaminação do meio ambiente por resíduos decorrentes das atividades humanas.
Alguns tipos de câncer podem estar associados à utilização de água contaminada
por resíduos industriais que são lançados propositalmente nos cursos d’água, ou por
resíduos urbanos e agrícolas que são carregados de forma difusa através do
escoamento pluvial.
Presidente Prudente é considerada uma cidade de médio porte, sendo que a
sua população no ano de 2016 é estimada em de 223.749 habitantes (IBGE, 2016).
A sua localização geográfica compreende o paralelo 22°07’57”S e o meridiano
51°22’57”W, sendo o seu clima do tipo tropical continental sub-úmido e
caracterizado por um verão quente e chuvoso (AMORIM et al., 2009). Neste
município existe um sistema hidrográfico constituído por pequenos cursos d’água,
como o córrego do Botafogo e do Veado, formadores dos córregos do Cedro e do
Limoeiro, respectivamente. Ambos são afluentes do rio Santo Anastácio, um
importante rio do Oeste do Estado de São Paulo e que já foi o principal rio
responsável pelo abastecimento público de água da cidade de Presidente Prudente
(MARTIN, 2001; TEODORO; NUNES, 2011).
O córrego do Limoeiro é um corpo hídrico superficial que se encontra inserido
na Unidade de Gerenciamento de Recursos Hídricos do Pontal do Paranapanema
(UGRHI22) e que constitui, em parte, o limite geográfico dos municípios de
Presidente Prudente e Álvares Machado e que também é receptor de efluentes da
ETE de ambos municípios (TAKENAKA et al., 2013). Ele também constitui o
Balneário da Amizade, uma área que, ultimamente, sofre um intenso processo de
urbanização com alto índice de atividade antropogênica (BOAVENTURA et al.,
2010).
Para a avaliação, detecção de contaminantes e biomonitoramento em
ambientes de importância regional como o córrego do Limoeiro, os bioensaios com
plantas superiores têm sido amplamente utilizados, sendo que as espécies mais
comumente empregadas são: Allium cepa L. (cebola comum), Vicia faba L. (feijão-
fava), Zea mays L. (milho), Tradescantia spp (coração-roxo), Nicotiana tabacum L.
(fumo), Crepis capillaris (L.) Wallr. (barba-de-facão) e Hordeum vulgare L. (cevada)
(GRANT, 1994; 1999).
O teste de Allium cepa L. foi desenvolvido inicialmente por Levan (1938) e é
considerado uma ferramenta útil para a pesquisa básica do potencial genotóxico e
citotóxico de produtos químicos, substâncias complexas como extratos de plantas,
dejetos industriais e, principalmente, águas contaminadas.
A utilização de Allium cepa L. tem sido recomendada para análises de
efluentes devido a sua elevada sensibilidade, baixo custo, rapidez, facilidade de
manipulação e da utilização de amostras sem tratamento prévio, determinando-se a
diminuição do índice mitótico e a formação de aberrações cromossômicas (LEME;
MARIN-MORALES, 2009). Este teste é utilizado rotineiramente em laboratórios que
trabalham com testes de genética toxicológica, e é considerado uma ferramenta
valiosa quanto à determinação da contaminação ambiental, havendo um extenso
banco de dados de substâncias químicas já testadas através dele (FISKESJÖ, 1993;
CUCHIARA et al., 2012)
O teste com Allium cepa fornece dois parâmetros principais para análise de
toxidade que são classificados como: a) Parâmetros macroscópicos, que podem ser
observados através da formação de tumores, avaliação de crescimento de raízes e
presença de raízes torcidas, entre outros, e b) Parâmetros microscópicos, que
envolvem: o Índice mitótico, para a análise de taxa de divisão celular, ocorrência de
aberrações cromossômicas, como: cromossomos em anel, pontes cromossômicas,
retardo na separação de cromátides-irmãs, que ocorrem principalmente nas fases de
metáfase e anáfase, e formação de micronúcleos como indicadores de
anormalidades no DNA (MONARCA et al., 2000).
Este teste tem sido validado internacionalmente como bioindicador de amostras
ambientais (EVSEEVA et al., 2003), sendo utilizado como teste preliminar na
avaliação do potencial genotóxico e citotóxico de substâncias cancerígenas e como
bioindicador de contaminação ambiental (BARBÉRIO et al., 2009). Segundo estes
autores, devido ao crescimento da população humana, aliado ao consequente
aumento do consumo hídrico nas áreas urbanas e às notórias variações climáticas
observadas nos últimos anos, a realização de estudos com cursos d'água torna-se
necessários para o monitoramento das condições das águas dessas regiões.
Conforme descrito por Cuchiara et al. (2012), a partir de dados observados em
um grande número de estudos, pode-se concluir que o potencial mutagênico de
corpos d’água depende do contexto ao qual ele está inserido. Os autores pontuam
que locais com grande atividade industrial demonstram potencial mais elevado em
relação a locais com outros tipos de atividades, como a agropecuária e lavoura ou
regiões urbanas.
O regime de chuvas e fatores climáticos também são variáveis que devem ser
consideradas, pois estudos feitos em períodos de seca demonstraram maiores
potenciais genotóxicos se comparados aos períodos de chuva, onde há maior
diluição das amostras da água coletada (CUCHIARA et al., 2012)
No caso específico do córrego do Limoeiro, sabe-se que ele se enquadra na
classe 4, o qual deve ser destinado à navegação, harmonia paisagística e a usos
menos exigentes, de acordo com a resolução CONAMA no. 357/2005. Entretanto,
apesar desta recomendação, verifica-se que muitos efluentes são lançados ao longo
do seu percurso em área urbana, como é o caso da ETE Limoeiro, construída pela
SABESP em 1997, que despeja esgoto tratado com diversas substâncias químicas
desinfetantes de microrganismos, além das águas pluviais oriundas do córrego do
Veado, e de bairros localizados às margens do Balneário da Amizade, nos levando a
supor a existência de substâncias que podem apresentar potencial genotóxico sendo
lançadas no referido córrego.
A liberação de poluentes em corpos hídricos de forma inadequada é, muitas
vezes, clandestina, principalmente em grandes centros urbanos cuja gestão
ambiental dos resíduos e efluentes não acompanha de forma adequada o
crescimento econômico e populacional. Desta forma, justifica-se a avaliação da
mutagenicidade do córrego do Limoeiro através da realização do teste Allium cepa
L. Ressalta-se a sua recomendação devido à sua elevada sensibilidade, baixo custo,
rapidez de análise, facilidade de manipulação e da utilização de amostras sem
tratamento prévio.
Esta pesquisa possibilitará a coleta de informações de significativo valor
científico e social, em complementação aos diversos parâmetros físico-químicos de
qualidade das águas, normalmente avaliados pelas agências regulatórias oficiais.
2. OBJETIVOS
122.1. Objetivos Gerais
O objetivo dessa pesquisa é avaliar a citotoxicidade e a genotoxicidade das
amostras de água coletadas no córrego do Limoeiro, situado na cidade de
Presidente Prudente, São Paulo, por meio do sistema teste Allium cepa como
bioindicador, verificando os danos causados em células meristemáticas radiculares
através dos testes de aberrações cromossômicas, índice mitótico e de ocorrência de
micronúcleos.
2.2. Objetivos Específicos
Os testes para verificação do potencial clastogênico das águas do córrego do
Limoeiro serão realizados em amostras coletadas em cinco pontos do córrego,
desde a sua nascente, ao longo do percurso do curso d’água dentro do município e
até alguns quilômetros distante da área urbana.
Será avaliada também a sazonalidade destas observações, através da análise
em dois períodos do ano, sendo as amostras coletadas nos meses de junho a
agosto, quando o clima é predominantemente seco e entre os meses de janeiro a
março, quando o clima tem predominância chuvosa.
3. HIPÓTESES
Esta pesquisa pretende verificar as seguintes hipóteses:
1. A qualidade das águas do córrego do Limoeiro, representada pelo seu
potencial clastogênico, sofre variações devido às influências provocadas
pelas atividades antrópicas existentes nos municípios de Presidente
Prudente - SP e Álvares Machado - SP.
2. O potencial clastogênico das amostras de águas coletadas em locais mais
próximos das áreas urbanas será mais elevado do que o observado em
amostras coletadas na nascente do córrego e em locais distantes das
cidades.
3. As frequências de anormalidades cromossômicas observadas em ensaios
realizados na estação seca serão mais elevadas do que aquelas
observadas em ensaios realizados na estação chuvosa, refletindo o fato
de existir maior diluição dos agentes mutagênicos.
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Testes com plantas superiores são reconhecidos como excelentes indicadores
de efeitos citotóxicos e mutagênicos de elementos químicos ambientais e são,
portanto, aplicados para detecção de mutagenicidade. Dois ensaios que são
considerados ideais para o monitoramento in situ e para testes de agentes
mutagênicos atmosféricos ou aquosos, envolvem a análise dos pelos estaminais de
Tradescantia e a análise de micronúcleos em Tradescantia, sendo que ambos
estudos podem ser utilizados em testes in vivo e in vitro (GRANT, 1994). Outras
plantas superiores que possuem grande número de marcadores genéticos são
Arabidopsis thaliana, Allium cepa, Hordeum vulgare, Vicia faba, e Zea mays
(GRANT, 1999). Segundo o autor, esses ensaios são recomendados como um meio
alternativo de detectar possíveis danos genéticos resultados da poluição ou do uso
de substancias químicas. Além disso, o autor menciona que, devido à facilidade de
coleta de dados e baixa exigência de infraestrutura laboratorial, todos eles são
considerados ideais para cientistas de países em desenvolvimento.
4.1 O teste Allium cepa
O teste Allium cepa é um teste muito conveniente para estimar efeitos danosos
de substâncias químicas e biológicas. Devido à sua excelente caracterização
genômica, com reduzido número de cromossomos e de grande dimensão, a cebola
é amplamente utilizada para vários propósitos desde que foi introduzida pela
primeira vez através do sistema de Levan em 1938. Posteriormente, o teste se
estendeu aos fatores de risco no monitoramento ambiental. O teste mostrou boa
correlação com outros sistemas de testes, envolvendo toxidade geral (crescimento
da raiz) e genotoxidade (aberrações cromossômicas).
O teste Allium cepa é sugerido como um padrão no monitoramento ambiental,
como parte da bateria de testes. Suas vantagens são: baixo custo, fácil manuseio,
boa condição dos cromossomos para o estudo de danos cromossômicos durante a
divisão celular incluindo a avaliação do risco de aneuploidia. O uso de series de
cebolas para cada concentração dos testes químicos permitem realizar
considerações estatísticas e a partir das curvas de crescimento os efeitos das
concentrações são obtidos. Esse teste se mostrou muito sensível em relação a
outros sistemas de testes. Os testes positivos no teste Allium cepa devem ser
considerados como alerta e também como indicação de que os químicos testados
podem causar riscos à saúde humana e ambiental (FISKESJO, 1985). Em um
estudo realizado na Suécia, os resultados do teste Allium cepa foram admitidos
como evidências em uma ação judicial contra a fábrica acusada de poluir um rio
adjacente a ela. FISKESJO, 1993).
Grant (1982) descreveu que, além do fato da cebola ser uma planta excelente
para ensaios de aberrações cromossômicas, outras espécies do mesmo gênero, tais
como: A. cepa var. proliferum, A. carinatum, A. fistulosum e A. sativum também já
foram empregados, mas com menor frequência. Ainda segundo o autor, em geral, os
protocolos foram desenvolvidos para o uso das raízes provenientes dos bulbos ou
das sementes para estudos citológicos. Mesmo assim, considera-se que ambos
tipos de divisão (meiose e mitose) podem ser igualmente utilizados, e possibilitam a
avaliação dos efeitos genotóxicos das substâncias químicas.
4.2 Estudos de mutagenicidade em efluentes e cursos d’água no Brasil e no mundo
A poluição do meio ambiente por produtos mutagênicos provoca uma elevação
nas taxas de mutagênese ambiental e afeta tanto as gerações atuais, mas também
as próximas gerações, não apenas a humana, mas também as de plantas, animais e
microrganismos. Estudos realizados para avaliar o potencial clastogênico em cursos
d’água já foram realizados em diversas localidades no Brasil e no mundo, como
descritos a seguir.
Para a caracterização do potencial mutagênico de poluentes presentes na água
do rio Paraíba do Sul, um estudo realizado na cidade de Tremembé – SP, por
Oliveira et al., (2011) avaliou as alterações cromossômicas em células
meristemáticas de Allium cepa, no verão (abril) e inverno (agosto) de 2008. Em abril,
os poluentes exerceram elevada ação mutagênica nas células meristemáticas de A.
cepa, com a ocorrência de micronúcleos e cromossomos pegajosos em frequências
maiores do que o controle negativo. Em agosto, a única alteração encontrada em
nível significativo foram as pontes cromossômicas. Segundo os autores, não houve
alteração significativa para o índice mitótico.
Em outro estudo utilizando as espécies Vigna radiate e Allium cepa como
bioindicadores para investigação de genotoxicidade e mutagenicidade de efluentes
de uma fábrica de papel e celulose, foram realiadas analises citogenéticas e físico-
químicas. As plantas foram expostas à água do efluente e mostraram redução no
comprimento das raízes e na biomassa da parte aérea, e outros dados que
indicaram a indução de citotoxicidade, sendo também possível observar aberrações
cromossômicas (HAQ et al., 2016).
Amostras de água dos ribeirões Mandacaru, Maringá, Miosótis e Nazareth em
Maringá – PR, foram analisadas por Düsman et al., (2012) através do teste A. cepa,
preparadas pela reação de Feulgen e coradas com o reativo de Schiff. Segundo os
autores, os resultados obtidos não mostraram efeito citotóxico significativo das
amostras avaliadas. Isso demonstrou que os resultados obtidos podem ser
dependentes das variações climáticas, da concentração das substâncias nocivas, e
da época e local de coleta das amostras.
Em uma pesquisa realizada por Oliveira et al. (2013) no afluente do Rio Boa
Vista, no perímetro rural e urbano do município de Ouro Preto do Oeste - RO, foi
avaliado o potencial mutagênico de efluentes de uma indústria de laticínios
despejados em seu leito. A avaliação foi realizada através do levantamento da
ocorrência de micronúcleos em células de Allium cepa, sendo também realizadas
análises físico-químicas da água, além do levantamento de coliformes. Os autores
notaram que os bulbos tratados com amostras de água coletadas nos pontos
localizados após o lançamento dos efluentes apresentaram um relevante número de
micronúcleos, além de um aumento significativo das anomalias cromossômicas
quando comparados ao controle, o que denota que nestes locais existe a presença
de poluentes com potencial mutagênico.
Em uma pesquisa que procurou avaliar, pelo sistema-teste de Allium cepa, os
potenciais genotóxico e mutagênico de águas do rio Guaecá, município de São
Sebastião-SP, que foram impactadas por vazamento de oleoduto em fevereiro de
2004, Leme e Marin-Morales (2007) coletaram amostras de águas em dois períodos
sazonais, julho de 2005 (estação seca) e fevereiro de 2006 (estação chuvosa), em
quatro pontos ao longo do rio. Análises químicas de hidrocarbonetos totais de
petróleo (TPHs) e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs) foram realizadas
para as amostras coletadas, com a finalidade de dar suporte às investigações
biológicas. Sementes de A. cepa foram submetidas à germinação nas amostras
coletadas. Dos resultados obtidos, foi detectado potencial genotóxico e mutagênico
somente para a amostra de água coletada na estação seca na nascente do rio, a
qual corresponde ao local de afloramento do óleo vazado para o rio e a única
amostra a apresentar, segundo a análise química, hidrocarbonetos de petróleo. Tais
resultados levaram à conclusão que as águas impactadas por hidrocarbonetos de
petróleo podem comprometer a biota associada a este recurso, devido à indução de
efeitos genotóxicos e mutagênicos sobre organismos expostos. Concluiu-se também
que vazamentos de oleodutos em rios, se gerenciados corretamente, com a
realização de planos adequados de contingências do acidente pela empresa
poluidora, como a remoção e contenção do óleo vazado, podem levar a uma
recuperação da qualidade das águas, como foi observado no caso do rio Guaecá,
onde, após operações de limpeza do rio, hidrocarbonetos de petróleo não foram
mais detectados pelas análises químicas e, consequentemente, ausência de efeitos
danosos, como o observado pelo teste de Allium cepa para as amostras coletadas
em fevereiro de 2006 (LEME; MARIN-MORALES, 2007).
Bianchi et al. (2011) avaliaram os efeitos citotóxicos e genotóxicos através do
sistema Allium cepa em efluentes domésticos e industriais lançados no rio
Monjolinho em diferentes estações do ano. No verão e estações intermediárias
foram observadas aberrações cromossômicas, micronúcleos, morte celular e
inibição do índice mitótico. No inverno, caracterizado por ser predominantemente
chuvoso, não foram observadas alterações cromossômicas nem celulares. Através
das análises químicas da água, inferiu-se que o excesso de metais pesados como
Chumbo, Cobre e Zinco foram responsáveis pelos efeitos observados no teste.
Análises limnológicas mostraram a presença de nitrogênio e fosfato, demonstrando
que a contaminação do rio se deve também a descarga de matéria orgânica durante
o curso do rio. Notou-se também quem o rio tem alta capacidade autodepurativa no
fim do seu curso que desagua no rio Jacaré-Guaçu.
Maceda et al. (2015) avaliaram a genotoxicidade e citotoxicidade de amostras
de água provenientes do córrego Arara no município de Rio Brilhante-MS, por meio
de testes toxicológicos utilizando biomarcadores. Para a avaliação da
genotoxicidade foram empregados o teste de micronúcleo e o ensaio cometa, ambos
com Astyanax altiparanae (lambari) e, para analisar a citotoxicidade utilizou-se o
teste de Allium cepa. As coletas foram realizadas nos meses de abril e junho de
2013, em três pontos. No teste de Allium cepa, o efeito citotóxico apresentou-se
significativamente maior na coleta de abril, porém a genotoxicidade das águas não
apresentou diferença estatística entre os meses de coleta. A presença de metais
acima dos níveis permitidos nas amostras de água analisadas do córrego Arara
indica possíveis potenciais genotóxicos e citotóxicos aos organismos devido a esses
poluentes derivados ou não de ações antrópicas.
Em outra investigação conduzida na região Sul do Brasil, foram analisados os
efeitos tóxicos e genotóxicos das águas do Rio dos Sinos sujeitas às descargas
industriais e urbanas, coletadas nos municípios de Novo Hamburgo-RS e São
Leopoldo-RS. Amostras de água deste rio foram coletadas durante as estações do
verão e o outono e utilizadas para a realização do teste Allium cepa e algumas
análises físico-químicas. Segundo os autores, os resultados mostraram que as
amostras apresentaram substâncias com potencial efeito genotóxico, dependente do
período e local avaliado. O Cromo hexavalente, encontrado nas análises físico-
químicas nas amostras de água, poderia ser um dos responsáveis pela toxicidade e
genotoxicidade induzidas em células meristemáticas do A. cepa (OLIVEIRA et al.,
2012).
A avaliação do teste de anáfase - telófase de Allium, em relação à triagem de
genotoxicidade de águas residuais das indústrias, demonstrou que a sensibilidade
do teste Allium foi calculada em 82%. Conclui-se que este teste é recomendado para
triagem de aguas residuais por sua alta sensibilidade, baixo custo, rapidez, e por
que pode ser usada para testar águas sem pré-tratamento (RANK e NIELSEN,
1994). Amostras de água mais poluídas, contendo efluentes industriais, causaram
inibição do crescimento das raízes acima de 50% e diminuição do índice mitótico
acima de 40% e considerável aumento na frequência de aberrações cromossômicas,
em comparação ao controle experimental (RADIC et al., 2010). Os autores
mencionam que os resultados foram corroborados através da realização de análises
físico-químicas.
Em uma pesquisa para a avaliação do potencial mutagênico de esgotos
tratados, através do teste em células meristemáticas de Allium cepa, foram
analisadas amostras de onze efluentes tratados provenientes de indústrias e
despejados em um curso d’água. Os resultados revelaram um aumento no índice de
aberrações de metáfase nas células expostas e o decréscimo de seu índice mitótico
à medida que o ponto analisado se encontrava mais próximo à jusante do curso
d’água. Tais resultados, conjuntamente com a análise química das amostras,
revelaram que, mesmo após o tratamento do efluente proveniente das indústrias,
substâncias com potencial citotóxico e genotóxico estão sendo despejadas no meio
ambiente, comprometendo a qualidade do ambiente aquático, principalmente porque
esses recursos hídricos são utilizados pela população ribeirinha, assim como pela
fauna e flora da região ciliar desses mananciais (PEREIRA et al., 2005).
Uma análise do potencial mutagênico em afluentes do rio Ji-Paraná
influenciados pela emissão de rejeitos de uma indústria de laticínios e um curtume
no município de Presidente Médici-RO, foi conduzida por Vanuchi et al. (2015)
utilizando o teste de micronúcleo em Allium cepa. Foi realizada a coleta de água em
oito pontos ao longo do Rio Machado, sendo que nas proximidades dos pontos de
coleta estão localizados um laticínio e um curtume. Os autores mencionam que, ao
final do estudo, foi possível averiguar que os lotes 01, 02, 04, 05 e 07 analisados
demonstraram um relevante número de micronúcleos, apresentando um aumento
significativo das anomalias quando comparados ao controle, o que denota que
nestes locais existe a presença de poluentes com potencial mutagênico.
Finalmente, em uma pesquisa para verificar a ocorrência de compostos anti-
inflamatórios não esteróides em águas naturais, Stelato et al., (2016) avaliaram a
presença de naproxeno, paracetamol, diclofenaco e ibuprofeno ao longo dos
córregos do Veado / Limoeiro e do Cedro, em Presidente Prudente-SP, tanto no
período de chuvas quanto de estiagem. Segundo os autores, o diclofenaco e o
ibuprofeno foram os compostos que apresentaram maiores concentrações, 11 e 42
mg.L-1, respectivamente, indicando a contaminação por esgoto doméstico. Os
maiores níveis de concentração foram observados nos períodos chuvosos,
provavelmente devido à formação geológica do município ou a mecanismos de
dessorção dos fármacos a partir dos sedimentos de rios (STELATO et al., 2016).
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1. Materiais
5.1.1. Amostras de água
As amostras de água serão coletadas com auxílio de frascos de vidro na
superfície e em 5 pontos ao longo do curso do córrego do Limoeiro, conforme
descritos a seguir e apresentados na Figura 1:
Ponto 1 – localizado próximo à nascente do córrego, onde há pouca atividade
antrópica.
Ponto 2 – localizado próximo à barragem do Balneário da Amizade, onde há
atividades recreativas e grande frequência de banhistas.
Ponto 3 – localizado dentro do Campus II da Universidade do Oeste Paulista –
UNOESTE, e situada imediatamente à jusante do local de deságue do córrego
do Veado. Esse córrego possui sua nascente dentro de área urbana e percorre
toda a cidade de Presidente Prudente, carregando significativa parcela do
escoamento pluvial da área urbana e efluentes de várias industrias (TAKENAKA
et al., 2013).
Ponto 4 – localizado imediatamente após o despejo do esgoto tratado pela
Estação de Tratamento de Esgoto do Limoeiro – ETE/SABESP, que atende aos
municípios de Presidente Prudente e Álvares Machado.
Ponto 5 – localizado cerca de seis quilômetros de distância do despejo do
esgoto tratado pela ETE do Limoeiro, antes de sua confluência com o rio Santo
Anastácio.
Figura 1 – Mapa da região de Presidente Prudente-SP, onde está situado o córrego
do Limoeiro, apresentando os cinco pontos de coleta de amostras de água a serem
avaliadas no presente estudo.
Fonte: Google Maps, 2016
5.1.2. Bulbos de Allium cepa L.
Serão utilizados 6 bulbos de Allium cepa para cada ensaio, perfazendo um total
de 42 bulbos para os testes realizados no período chuvoso e 42 bulbos para os
testes realizados no período de estiagem.
Todos os bulbos deverão ser do mesmo cultivar, e adquiridos a partir de um
único produtor em uma mesma colheita para cada estação avaliada. Serão
escolhidos bulbos com características morfológicas similares entre si, com mesmo
diâmetro e sem sinais de doenças ou anomalias.
Os bulbos serão acondicionados em recipientes de vidro preenchidos com as
amostras de água coletadas e os controles, de forma que apenas a região radicular
da cebola fique submersa.
5.1.3. Controle Positivo e Controle Negativo
Como controle positivo, serão utilizados bulbos de cebola em contato com uma
solução de MMS (metil metanosulfonato) 4x10-4 M. Como controle negativo serão
utilizados bulbos de cebola em contato apenas com água destilada.
5.2. Métodos de análise do material
5.2.1. Análises físico-química da água
Antes da coleta das amostras de água serão medidos os valores de oxigênio
dissolvido (OD) e da temperatura (ºC) com uso do oxímetro e pHmetro portátil. As
amostras de água que utilizadas nas análises físico-química serão coletadas em
recipientes de vidro âmbar de 500 mL, devidamente etiquetados, a uma
profundidade de aproximadamente 50 cm da superfície. Em seguida, será
adicionado 1 mL de Ácido Nítrico Ultrapuro (ANU) em cada amostra que deverá ser
armazenada em caixa térmica com gelo durante o período de coleta amostral e
transporte ao laboratório.
No laboratório as amostras ficarão armazenadas sob refrigeração de 4°C até o
preparo para as análises. Os métodos de preservação de amostras para
determinação dos parâmetros físico-químicosestão preconizados no Standard
Methods for Examination of Water and WasteWater, 21ª Edition (APHA, 2012).
Para preparo para análise de metais pesados, as amostras de água serão
filtradas em membrana de celulose em um sistema de bomba a vácuo e
posteriormente transferidas para um recipiente onde será feita a adição de 0,5 mL
de Ácido Nítrico Ultrapuro para sua conservação até a leitura.
A leitura das concentrações dos metais pesados Cd, Cr, Cu, Pb e Zn serão
realizadas em um Espectrofotômetro de Absorção Atômica com Chama (AAS) que
realiza a análise de metais em níveis de parte por milhão (ppm).
Será também avaliada a possibilidade de análise da presença de agrotóxicos
diluídos nas amostras através do mesmo procedimento.
5.2.2. Análises de genotoxicidade da água
Os recipientes com os bulbos de Allium cepa serão dispostos dentro da estufa
B.O.D., sob temperatura controlada de 25ºC e fotoperíodo de 12h escuro, 12h claro.
A água testada será trocada a cada 24h e ao final de 72h, as raízes dos bulbos de
cebola serão observadas e medidas para a análise de morfologia e do comprimento
radicular (GRANT, 1982).
Para as análises citogenéticas, as raízes dos bulbos serão escolhidas
aleatoriamente e retiradas, após 48h de tratamento, com o auxílio de pinças. Serão
então fixadas em Carnoy (3:1, álcool etílico absoluto: ácido acético glacial) por um
período de 24h à temperatura ambiente e, posteriormente, acondicionadas em
frascos contendo solução de etanol a 70% e conservadas sob refrigeração a 4°C por
pelo menos 1 hora para posterior análise. As amostras das raízes serão então
hidrolisadas em solução de ácido clorídrico (HCl) 1N por 6 minutos em banho maria
a 60°C e lavadas em água destilada. Em seguida, as pontas das raízes serão
coradas com reativo de Schiff, através da técnica de coloração de Feulgen, e
intensificadas com solução de Carmin acético a 2%.
5.2.2.1. Métodos de preparo de lâminas, coloração e observação
As lâminas serão preparadas através da técnica de esmagamento (GUERRA;
SOUZA, 2002) e observadas em microscópio óptico sob objetiva de 40x, através da
técnica de varredura, onde serão contadas 2000 células por ponto de coleta,
observando-se o número de células em cada fase da mitose. Desta forma, o índice
mitótico será avaliado através da observação do número de células em cada fase da
divisão celular.
Em adição, será analisada a frequência dos diferentes tipos de aberrações
cromossômicas observáveis, tais como: formação de anel, cromossomos pegajosos,
atraso na separação de cromátides-irmãs, presença de pontes e fragmentos
cromossômicos em anáfase e telófase, formação de micronúcleos e outras
anomalias que permitam a detecção de danos ao DNA a nível qualitativo.
Para o teste de micronúcleo os meristemas hidrolisados serão lavados em
água destilada e serão utilizados para produção de esfregaços em lâminas. Estas
serão colocadas em Nitrogênio líquido por 30 segundos para retirada da lamínula e
aguardarão 30 minutos em temperatura ambiente para secagem. Posteriormente
será realizada a coloração das lâminas com solução de Giemsa a 1% por cinco
minutos e o enxague em água deionizada com pH 7,0. Depois de secas em
temperatura ambiente, será realizada observação ao microscópio óptico sob objetiva
de 40x, através da técnica de varredura para contagem de micronúcleos em 1000
células por ponto de coleta (FISKEJÖ, 1985).
5.2.3. Análises estatísticas
Os dados serão anotados em fichas individuais para cada um dos grupos de
tratamento, e submetidos à avaliação estatística através da análise de variância pelo
teste F e ao teste de Tukey para a avaliação de contrastes de médias ao nível de
5% de probabilidade, utilizando-se o programa estatístico Assistat.
6. CRONOGRAMA
Atividades
2017 2018 2019
Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Jan Fev
Revisão Bibliográfica X X X
Treinamento com metodologias
X X X
Implantação da técnica X X X
Coleta das amostras de água X X X X
Coleta de dados X X X X X X
Analise dos dados X X X X X X X
Elaboração de artigos X X X
Redação da Dissertação X X X X
Exame Geral de Qualificação X
Revisão final X
Defesa da Dissertação X
REFERÊNCIAS
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