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〔技術資料〕

牛にイソプロチオラン製剤を飼料添加投与後の残留確認試験

小池（浜本）好子、臼井 優、峯戸松勝秀、１ １ １下山 晃 、園部研一 、飯塚智美

（平成 年１月 日受付、平成 年４月７日受理）21 30 21

〔 〕TECHNICALREPORT

A Residue Determination Test of Isoprothiolane-added Cattle Feed Additive

Koko Koike-Hamamoto, Masaru Usui, Katsuhide Minetomatsu,１ １ １Akira Shimoyama , Kenichi Sonobe , Tomomi Iizuka

National Veterinary Assay Laboratory, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries1-15-1 Tokura, Kokubunji, Tokyo 185-8511, Japan

( )Received: 30th January 2009; Accepted: 18th June 2009

A feed additive which contained isoprothiolane as an active ingredient was added to a cattle feed at the highestapproved level and was continuously administered to three cows for four weeks. After a 14 day withdrawal period,the cows were sacrificed and quantitative analyses of isoprothiolane concentration in fat, the liver and smallintestines were carried out by GC-MS/MS.

イソプロチオランを有効成分とする飼料添加剤を、承認された用法及び用量の最高用

量となるように飼料に添加し、３頭の牛に４週間連続投与した。これらの牛を使用禁止期

間（ 日間）経過後に屠殺採材し、脂肪、肝臓及び小腸の中のイソプロチオラン濃度を14質量分析装置付ガスクロマトグラフィー（ ）を用いて測定した。GC/MS/MS

緒言

この試験の目的は、イソプロチオランを

有効成分とする飼料添加剤の使用基準の妥

当性を確認することである。暫定残留基準

値（暫定ＭＲＬ）が設定されている成分で

あるが、当該成分の使用基準作成時には、

イソプロチオランの牛への強制経口投与で

の残留試験の結果しかなかったため、本試

験を実施した。

本試験では、３頭の牛にイソプロチオラ

（財）日本冷凍食品検査協会１

Japan Frozen Foods Inspection Corporation

ンを有効成分とする飼料添加剤を、使用基

準の用法及び用量の最高用量となるように

飼料に添加し、承認されている最長投与期

間である４週間の連続投与を行った。投与

終 了 か ら 使 用 禁 止 期 間 （ 日 間 ） 経 過 後14にこれらの牛を屠殺採材し、臓器・組織中

のイソプロチオラン濃度を質量分析装置付

ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ ） をGC/MS/MS用いて測定した。臓器・組織としては、牛

への強制経口投与による残留試験のデータ

からイソプロチオランが最も多く残留する

ことが想定される肝臓及び脂肪の他、その

他の内臓として小腸を選択した。

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実験材料及び方法

被検物質は、製剤１ｇ中イソプロチオ１

ランとして 含 有する顆粒剤である250mgフジックス（日本農薬（株）製、製造番

号： ） を用いた。B6512

試験方法２

（１）供試動物

（ 、ホルスタイン種の牛 雄２頭雌１頭

導入時体重 ～ ｋ ）を室温で飼育73 120 gした（ 日 間 。馴化期間中は、濃厚飼20 ）

料 及 び ヘ イ キ ュ ー ブ を ２ 回 日 給 餌 し 、/。 、自由飲水とした 休薬期間中においては

馴化期間と同様に飼育した。コントロー

ル（無投薬の臓器・組織）は、動物医薬

品検査所において投与群と同様に飼育し

た牛から別途採材した。

（２）投薬量及び投薬方法

薬 剤 は 、 イ ソ プ ロ チ オ ラ ン と し て

と な る よ う に 濃 厚 飼 料 に 混 合50mg/kgBWし、朝９時に投薬した。牛が薬剤を添加

した濃厚飼料を全て食べ終えた後、ヘイ

キューブを与えた。水は、自由飲水とし

。 、 、た 投薬時は １週間毎に体重を測定し

製剤の投与量を補正した。このような飼

料添加による投薬を、４週間連続で行っ

た。

（３）分析用試料の採材

休 薬 日 目 に 屠 殺 し 、 肝 臓 、 脂 肪14及び小腸（牛海綿状脳症の危険部位を除

く食用部分）を採材した。採材した臓器

g 80・組織は ５ ずつにわけ 分析まで－、 、

℃で凍結保存した。

試料中のイソプロチオランの残留分析３

（１）牛の各臓器・組織中のイソプロチオ

ラン濃度の測定は、平成 年１月 日17 24付 け 食 安 発 第 号 厚 生 労 働 省 医 薬0124001食 品 局 食 品 安 全 部 長 通 知 の 一 斉 試 験 法

（畜水産物）により行った。具体的な方

法を、スキーム１に示した。

この分析方法で使用したゲル浸透ク

ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ 、 固 相 抽 出GPC）（ ） 及 び の 条 件 等 は 、 下PSA GC/MS/MS記に示した。

① 条件GPC機種名 ： （ サイエンス製）GL-Science G-Prep-8150 GL

カラム： × （ 製）にGPC CLNpak EV-2000, 20mm i.d. 300mm shodex× （ 製）を接続した物。CLNpak EV-G, 20mm i.d. 100mm shodex

移動相 ：アセトン：シクロヘキサン（ ）1:45mL/min流速 ：

カラム温度： ℃40UV254nm検出波長 ：5mL注入量 ：

の分取範囲は、 とした。GPC 16.01-23.4min

② カラムPSA（ 製）Bond elute PSA 500mg Varian

③ 条件GC/MS/MS装置 ：タンデム型 （ 製）GC/MS/MS Varian

ガスクロマトグラフ（ 型）Cp-3800質量分析計（ ）300MS

条件GCカラム ： （ × 、 膜厚 μ 、 製）VF-5MS 30m 0.25mm 0.25 m Varianカラム温度：注入後 分間 ℃に保ち、その後 ℃まで ℃ で昇温し、1 50 125 25 /min

次いで ℃まで ℃ で昇温し、 ℃を 分間保持する。300 10 /min 300 10キャリアガス：高純度ヘリウム

1.2mL/minキャリアガス流量：注入口温度： ℃250注入方式 ：スプリットレス（ ）40psi,1mL

1 L注入量 ： μ

条件MS/MSEIイオン化モード：

イオン化エネルギー ：( )70eVトランスファーライン温度： ℃300イオン源温度 ： ℃250

25Vコリジョンエネルギー ：コリジョンガス ：アルゴン

2m torrコリジョンガス圧 ：定量イオン ：プロダクトイオン ｚ85.0m/

（プレカーサーイオン： ）162.0m/z

45 34-40 (2008)動薬検年報 第 号

食用動物における動物用抗菌薬の使用状況の調査結果について

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食用動物における動物用抗菌薬の使用状況の調査結果について

（２）検量線

イソプロチオラン標準品（和光純薬

、 、 ）工業製 残留農薬試験用 純度： ％99.0を 量り、アセトンで溶解し、標準20.0mg

原 液 （ ） を 作 成 し た 。 こ の 標 準200mg/L原液を ～ ｎ の 濃度となるよう5 100 g/mLにアセトン：ヘキサン（１：１）で希釈

した標準溶液を用いて、イソプロチオラ

ンのピーク面積を測定し検量線を求めた

結果、イソプロチオランの検量線は良好

。（ 、 ）な直線性を示した 以 上 図１r=0.995

（３）添加回収率及び検出限界

牛の各コントロールにイソプロチオ

ランの暫定 相当の と なるよMRL 0.02ppmう に 、 ( )の 標 準 原 液 （ ） を ア セ1 200mg/Lト ン ： ヘ キ サ ン （ １ ： １ ） で の0.1mg/L

濃度に希釈し、試料５ にこの希釈液１gを 添 加 し て 、 添 加 回 収 率 を 求 め た 。mL

Table1 Recovery of Isoprotiolane from bovine tissuesSpike ｌeveｌ Recovery（％） CV

(0.02ppm) 1 2 3 Mean （％）

Liver 84.0 98.1 88.4 90.2 8.0

Fat 96.0 99.9 102.1 99.3 3.1

Intestines 89.0 97.4 96.7 94.4 4.9

イソプロチオラン標準溶液、コントロール、添

加回収及び検体の各クロマトグラムを図２～４に

示す。イソプロチオランの保持時間は、約 分で16あった。添加回収率は、全ての臓器・組織で平均

以上であり、変動係数は 以下であった。90% 10%これらの結果は、残留に関する試験ガイドライン

12（動物用医薬品関係事務の取扱について、平成

年３月 日、 農林水産省畜産局衛生課薬事31 12-33室長通知）を満足していた。

イソプロチオランの検出限界（Ｓ／Ｎ＝３）及

び定量限界（Ｓ／Ｎ＝ ）は、肝臓及び小腸でそ10れぞれ ｇ及び ｇ、脂肪でそれぞれ0.85ng/ 2.8ng/

及び ｇであった。肝臓及び小腸の定1.7ng/g 5.7ng/量限界は、暫定 （ ）の１／７以下であMRL 20ng/gり、脂肪の定量限界は１／３以下であったことか

ら、この残留分析法の感度は十分であると考えら

れた。

結果

１ 供試動物

（１）試験期間中、投薬期間以外の休日を除く毎

日一般状態を観察した。その結果、異常は観察

されなかった。

（２）導入時、投薬時、投薬後及び屠殺時に体重

を測定した。その結果を表１に示した。牛の平

均の体重増加は、投薬期間中は 日、休薬0.6kg/期間中は ｋ 日であった。1.2 g/

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Table2 Body weights of the three cattle

Body weight at each time point（ｋｇ）

Cattle No. Induction Pre-administration Post-administration Pre-sacrifice

120 124 142 1531

73 83 100 1152

95 108 123 1423

96 105 122 137Mean

23.5 20.7 21.0 19.6SD

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食用動物における動物用抗菌薬の使用状況の調査結果について

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２ 試料中のイソプロチオランの残留分析

（１）試料分析結果

牛の各臓器・組織におけるイソプロチオラ

ン濃度の分析結果を表３に示した。イソプロチ

オランは肝臓で５～９ 、脂肪で検出限界付ppb近の量が検出されたが、小腸では検出限界以下

であり、全て暫定 以下であった。MRL

ND Not detectedTable3 Residue levels of Isoprotiolene in each tissue ＊ ：

(A) Liver (B) Fat

Cattle No. Residue level Cattle No. Residue level

（ppm) （ppm)

1 0.005 1 (0.002)

2 0.004 2 (0.002)

3 0.009 3 (0.002)

Mean±SD 0.006±0.003 Mean±SD (0.002)

(C) Intestines

Cattle No. Residue level

（ppm)

1 ND

2 ND

3 ND

Mean±SD ND

まとめ

牛にイソプロチオランを有効成分とする飼料添

加剤を使用基準の用法及び用量の最高用量

50mg/kg/ 14（ 日）で４週間投与し、使用禁止期間（

日間）経過後に屠殺採材し、肝臓、脂肪及び小腸

のイソプロチオランを 法で定量した。GC/MS/MSその結果、すべての臓器・組織で、イソプロチオ

ランは暫定 以下であった。MRLこの結果より、イソプロチオランを有効成分と

。する飼料添加剤の使用基準の妥当性が確認された

引用文献

１）厚生労働省： 食品に残留する農薬、飼料添加「

物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法

について （平成 年１月 日 付け食安発第」 17 24号厚生労働省医薬食品局食品安全部長通0124001

知）別添