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CFX96 TouchTM

Real Time PCR System El equipo de PCR en Tiempo Real CFX96 Touch es uno de los sistemas más novedosos del mercado. Diseñado para cubrir todas las necesidades del usuario, combina un potente y rápido termociclador con un novedoso sistema óptico de seis canales de detección/excitación basados en tecnología LED, y un potente software de análisis intuitivo y práctico. Tres son sus características destacables:

- Rápido – es capaz de reducir el tiempo de un protocolo estándar de 2 horas a 25 minutos.

- Sencillo – el mantenimiento del equipo es mínimo. Su pantalla táctil facilita la

programación, y la obtención y análisis de resultados. No necesita estar conectado a un ordenador para poder trabajar. La utilización del gradiente de temperatura y el editor de protocolos Autowriter hacen posible la optimización de experimentos ahorrando tiempo y dinero.

- Flexible - sistema completamente abierto que ofrece la máxima flexibilidad al usuario,

tanto en la selección de la química de detección como en el fungible a utilizar. Además, puede ser actualizado a un módulo óptico de Real Time PCR de 384 pocillos fácilmente por el usuario, sin necesidad de instalación ni calibración.

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Características principales del equipo El sistema para Real Time PCR CFX96 Touch posee una pantalla táctil de 9,5 pulsadas con la que se puede programar tanto un protocolo de PCR convencional, como uno de PCR en tiempo real en sólo tres pasos, sin necesidad de estar conectado a un ordenador que lo gestione. En el caso de los ensayos de Real Time PCR, las curvas de amplificación se pueden ver a medida van siendo generadas en la misma pantalla táctil, sin necesidad de ordenador, (ver figura 1). Características técnicas del termociclador Las características técnicas del termociclador son las siguientes:

Capacidad para trabajar con 96 muestras independientes, utilizando distintos tipos de fungible: microplacas de 96 pocillos o tubos individuales, tanto de alto como de bajo perfil.

Visualización de la curvas de amplificación en tiempo real en la pantalla táctil del CFX96 Touch. No es necesario ordenador.

PASO 1: Seleccionar nuevo protocolo

PASO 2: Introducir los tiempos y temperaturas del protocolo térmico y guardar en la librería para futuros usos. Pulsar carrera.

PASO 3: Confirmar la configuración

Figura 1. Pantallas de configuración y análisis en la pantalla táctil del CFX96 Touch Real Time PCR System

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El sistema de calentamiento/enfriamiento está basado en un Sistema Peltier de aluminio con forma de “panal de abeja”, lo que permite intercambios de temperaturam entre el bloque y la muestra muy rápidos. (ver figura 2)

La tapa del termociclador es automática y cierra herméticamente gracias a una barrera en forma de anillo, lo cual previene la condensación permitiendo utilizar volúmenes de reacción muy pequeños, garantiza el mantenimiento uniforme de la temperatura, reduce los tiempos de espera y disminuye los tiempos de ejecución de PCR (ver figura 2), sin necesidad de utilizar equipos de sellado térmico especial.

La velocidad máxima de temperatura es de 5ºC/seg, recudiendo la duración de un protocolo estándar de 2 horas a 25 minutos, sin necesidad de utilizar ningún tipo de fungible o reactivo especial.

La precisión de la temperatura en el bloque es de 0.2 ºC

La uniformidad térmica del bloque es de +/- 0.4ºC a los 10 segundos después de alcanzar 90ºC.

Permite trabajar con un rango de volumen de 1-50 ul (recomendado 10-25 µl), gracias a su tapa automática de cierre hermético

Permite regular la temperatura en el rango de 0 a 100ºC.

El termociclador dispone de una tapa termostatizada a 105ºC que elimina la utilización de aceites en los tubos de PCR asegurando la presión óptima sobre los tubos durante los ciclos de amplificación para evitar evaporaciones.

Figura 2. Sistema Peltier en forma de “panal de abeja” del CFX96 Touch y cierre hermético en forma de anillo del CFX96 Touch.

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Posee un sistema de gradiente de temperatura dinámico de 1-24 ºC con un rango operativo de entre 30—100ºC. Este sistema permite programar diferentes temperaturas a lo largo del bloque de 96 muestras para optimizar varios protocolos en un solo experimento, determinar la temperatura de hibridación de los primers o ejecutar hasta ocho reacciones con distintas temperaturas de hibridación de forma simultánea en la misma qPCR (ver figura 3). La ventaja del gradiente de temperatura dinámico, respecto a otro sistemas similares, es que todos los pocillos de la placa de 96 pocillos llegan a la misma temperatura al mimo tiempo.

El sistema puede ser fácilmente actualizable a un sistema de 384 pocillos de Real Time PCR por el usuario sin necesidad de calibración.

La tapa automática del CFX96 permite robotizar el sistema con el equipo opcional “CFX Automatition System II) (ver figura 4)

Figura 3. Esquema del sistema de gradiente de temperatura del CFX96 Touch

Figura 4. CFX Automation System II.

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Tiene una capacidad de memoria de 1G para poder almacenar hasta 100 carreras de Real Time PCR, >1000 programas de amplificación, y de modo ilimitado usando el puerto USB 2.0 de la parte frontal.

El equipo puede estar conectado a internet de manera que puede enviar automáticamente el fichero de resultados por email al terminar la Real Time PCR, para poder analizar los resultados donde y cuando se quiera sin necesidad de disponer de conexión wifi.

Características técnicas del sistema óptico

La tecnología óptica utilizada por el sistema CFX96 Touch consiste un sistema de excitación con seis filtros LEDs y un sistema de detección compuesto de seis fotodiodos específicos. (ver figura 5)

El sistema óptico escanea la placa de muestras, excitando cada muestra y leyendo la fluorescencia generada en cada una de ellas, en canales independientes (ver figura 5). Este sistema óptico aporta las siguientes ventajas frente a los sistemas tradicionales basados en cámaras CCD:

o Se maximiza la sensibilidad y precisión de los resultados. o Calidad de resultados: disminuye el ruido y las interferencias entre muestras y

fluorescencias distintas. o Se minimiza el potencial solapamiento espectral, lo que permite realizar PCR

múltiples de hasta cinco fluorescencias distintas con una rápida optimización (ver figura 6).

Figura 5: Esquema del sistema óptico del CFX96 Touch.

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o Mínimo mantenimiento, no es necesario calibraciones periódicas del sistema, lo que ahorra tiempo y dinero.

o No es necesario sacrificar uno de los canales de detección/excitación para

normalizar la recolección de datos con una referencia pasiva como ROX.

El sistema óptico es capaz de excitar y leer la fluorescencia de 96 muestras por los seis canales en 12 segundos. Si sólo se utiliza un canal, FAM/SyBrGree, este tiempo se reduce a 3 seg.

El rango de excitación/emisión es de 450-790 nm . El sistema CFX96 Touch, está calibrado de fábrica para los fluoróforos detallados en la tabla inferior. Con la herramienta “Dye Calibration” se pueden calibrar nuevos fluoróforos por el usuario.

Channel Excitation (nm) Detection (nm) Factory Calibrated Fluorophores

1 450 - 490 515 - 530 FAM™

, SYBR Green I TM

2 515 - 535 560 - 580 VIC®, HEX

™, TET

™, Cal Gold 540™

3 560 - 590 610 - 650 ROX™, TEXAS RED®, Cal Red 610™

4 620 - 650 675 - 690 CY5, Quasar 670™

5 672 - 684 705 - 730 Quasar 705™

6 450 - 490 560 - 580 FRET

Figura 6. Izq. Rangos de excitación/emisión de los canales del CFX96 Touch. Derch. Datos del software CFX Manager del CFX96Touch para una PCR multiplex con cinco sondas: A) FAM/Actina, B)HEX/GAPDH, C) Texas Red/Ciclofilina, D)Cy5/Tubulina , E) Quasar 705/ IL-1β y F) Reactas estándares de la amplificación de los cinco genes con una

eficiencia del 97-103%. Cq= ciclo de cuantificación y RFU= unidades relativas de fluorescencia.

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La sensibilidad del sistema óptico garantiza la detección de una copia de DNA genómico humano con un rango dinámico de hasta 10 órdenes de magnitud.

El sistema CFX96 permite trabajar con todas las técnicas de marcaje habituales en PCR en tiempo real: SYBR Green, EvaGreen TaqMan, Molecular Beacons, sondas FRET, Scorpions y Amplifluor.

Características principales del software CFX Maestro. El sistema CFX96 Real Time PCR está gestionado por un único software, llamado CFX Maestro que permite controlar y programar los parámetros de análisis, así como, la recolección y análisis avanzado de los datos. Es un software fácil de usar y muy intuitivo, cuyas características principales son las siguientes:

- Compatible con los sistemas operativos PC y Mac. - Cumple los requisitos descritos en la guía MIQE (Minimun Information for Publication of

Quantitative Real Time PCR Experiments. Bustin et all. Clinical Chemistry, 2009) - Software no tiene licencias de usuario, lo que permite tantos puestos de trabajo como se

deseen. Así mismo, esta licencia se instala físicamente en el ordenador del usuario, lo que le permite trabajar donde y cuando quiera, sin necesidad de disponer conexión a internet.

- El software puede enviar automáticamente el fichero de resultados por e-mail al usuario/s,

de manera que este pueda analizar los resultados donde y cuando quiera. - Gestiona hasta cuatro equipos de real time a la vez (CFX384, CFX384, CFX Connect, y/o

MiniOpticon), para ahorrar espacio en los laboratorios. - Organiza eficazmente la reserva del instrumento entre los distintos usuarios del laboratoro

mediante un calendario online y avisos vía máil.

- El usuario puede comenzar una carrera de Real Time PCR inmediatamente sin necesidad de introducir la información del experimento. Dicha información puede introducirla durante la carrera o después de la misma.

- Calcula la línea base óptima de cada una de las 96 muestras independientemente, de forma

automática, aunque es posible que el usuario lo haga también manualmente, si lo desea.

- Determina de forma automática el valor de ciclo umbral (Therhold) para cada una de las muestras, y cada uno de los targets analizados de modo independiente.

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- Posee una herramienta que ayuda al usuario a calcular las concentraciones y volúmenes necesarios para cada experimento. Esta herramienta puede guardar una librería con las distintas condiciones experimentales, ya sea experimentos con SyBR Green o sondas, (ver figura 7)

- Programa y prepara diferentes ensayos mediante rutinas y ayudas específicas. El sistema

de ayuda “Wizard” guía al usuario a través del software permitiéndole diseñar fácilmente experimentos, en sólo tres pasos. (ver figura 8)

- El editor de protocolos Autowriter permite al usuario diseñar protocolos personalizados en modo estándar, rápido o ultrarrápido, así como determinar la temperatura de melting y annealing adecuada a cada experimento fácilmente. (ver figura 8)

-

Figura 7. La herramienta Master Mix Calculator permite crear diversas librerías con las condiciones experimentales de ensayos de SyBR Green y sondas, introduciendo los distintos parámetros (concentración y volumen de primers/sondas, mix de reacción, etc..) para calcular rápidamente los reactivos necesarios en cada experimento en función del número de muestras.

Figura 8. Arriba: ayuda rápida Wizard, para programación rápida e intuitiva de un experimento. Debajo: editor de protocolos Autowriter.

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- Permite la exportación de datos procesados, informes y gráficos a otros programas a través

del portapapeles de Windows. Formatos: Texto (*.txt), CSV (*.csv), Excel (*.xlsx), XML (*xml), HTML (*. Html), RDML y pdf, siendo posible elegir los parámetros del informe por el usuario.

- Dispone de varias herramientas de edición y anotación para exportar tablas y gráficas con la

máxima resolución gráfica, de manera que, los datos sean enviados a su publicación rápidamente sin necesidad de retoques.

El software CFX Maestro es capaz de realizar los siguientes análisis de Real Time PCR.

1. Cuantificación absoluta: cuantificación automática de las muestras problema tomando como referencia una recta patrón estándar. Los datos se muestran en una única pantalla en donde se puede ver la colocación e información de las muestras, los valores Cq y desviaciones calculadas, la recta estándar con los valores de eficiencia y r2, y las curvas de amplificación (ver figura 9)

2. Presencia/Ausencia - el software determina automáticamente la presencia/ausencia de un target de ADN en una muestras de dos modos distintos: mediante curvas de melting o disociación y mediante análisis de punto final, tomando como referencia los valores de fluorescencia de los controles negativos. (ver figura 10)

Figura 9. Pantalla de Cuantificación Absoluta del CFX Maestro.

Figura 10. Izq. Pantalla de Curvas de Melting del CFX Maestro, y Derech. Pantalla de análisis de punto final del CFX Maestro.

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3. Método de discriminación alélica. El software realiza análisis de discriminación alélica

(SNPs) y clasifica automáticamente las muestras de acuerdo con su genotipo (ver figura 11)

4. Expresión génica (Cuantificación relativa): el software permite cuantificaciones relativas de las muestras o entre distintos grupos biológicos, mostrando los resultados con varios tipos de gráficas (ve figura 12):

a. Barras de desviación estándar y tablas de datos.

b. Clustergram: los datos se organizan en una jerarquía basada en el grado de similitud de expresión para diferentes genes objetivo y muestras.

c. Scatter Plot: diagrama de dispersión de la expresión normalizada de un control

frente a una muestra experimental

d. Volcano Plot: muestra el cambio en la expresión de una muestra experimental en comparación con un control e indica el grado de significación basado en el valor-p

e. Heat Map: Mapa de la placa que muestra la regulación experimental en

comparación con una muestra de control basado en la expresión relativa normalizada

Dichas cuantificaciones relativas pueden ser normalizadas frente a uno o varios genes de referencia teniendo en cuenta la eficiencia particular de cada uno de los genes comparados. Así mismo, realiza estudios de expresión génica de más de 5000 genes al mismo tiempo, agrupando en un único archivo distintos experimentos realizados en distintas placas.

Figura 11. Pantalla de Discriminación Alélica del CFX Maestro.

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En el módulo de expresión génica del CFX Maestro, es capaz de realizar análisis de la Varianza (ANOVA) de los datos, permitiendo determinar si los diferentes tratamientos muestran diferencias significativas o por el contrario puede suponerse que sus medias poblacionales no difieren. (ve figura 13)

Figura 12. Distintas representaciones de los datos de cuantificación relativa, expresión génica, realizados por el CFX Maestro.

Figura 13. Analisis estadística ANOVA realizado por el CFX Maestro.

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El software también permite encontrar el mejor candidato a gen de referencia según el método GeNorm. (Accurate normalization or real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Jo Vandesompele, et al.), (ver figura 14)

En el caso de utilizar los paneles para Real Time PCR “Prime PCR” de Bio-Rad (http://www.bio-rad.com/es-es/product/pcr-primers-probes-panels) el software incorpora diversas herramientas para una rápido análisis de los mismos, analizando automáticamente los controles de retrotranscripción, contaminación por DNA genómico, etc…(ver figura 15)

Bibliografía. Notas técnicas

Nota técnica 2592: Gradient Features: Maximize your optimization power. Nota técnica 6047: Optical Design of CFX96 Real Time PCR Detection System eliminates the requirement of a Passive Reference Dye

Figura 14. Herramienta de CFX Maestro para determinar los mejores genes de referencia

Figura 15. Análisis de controles de paneles PrimePCR por CFX Maestro.