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Chapitre 3Les Enzymes
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Médicaments ciblés sur des enzymes
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Médicaments ciblés sur des enzymes
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Plan– 3.1 Structures et propriétés des enzymes.
• 3.1.1 La catalyse enzymatique.– 3.1.1.1 Comparaison récepteurs-enzymes.– 3.1.1.2 La spécificité enzymatique.– 3.1.1.3 Caractéristiques de la catalyse enzymatique.
• 3.1.2 Le rôle des coenzymes.– 3.1.2.1 Le phosphate de pyridoxal (PLP).– 3.1.2.2 L’acide tétrahydrofolique (THF) et les nucléotides à pyridine.– 3.1.2.3 Les flavines (FAD et FMN).– 3.1.2.4 Le hème ou protoporphyrine IX.– 3.1.2.5 L’adénosine triphosphate et le coenzyme A.
• 3.1.3 Les substrats d’enzymes comme médicaments.
– 3.2 Inhibition et désactivation des enzymes.• 3.2.1 Définitions.
– 3.2.1.1 Déficience ou excès en un métabolite.– 3.2.1.2 Invasion par un organisme étranger.– 3.2.1.3 Reproduction anarchique des cellules.– 3.2.1.4 Le choix des enzymes cibles.
• 3.2.2 La résistance aux médicaments.• 3.2.3 Le synergisme.• 3.2.4 Classification des inhibiteurs d’enzymes
– 3.2.4.1 L’inhibition non covalente.– 3.2.4.2 L’inhibition covalente.
• 3.2.5 Inhibition non covalente.– 3.2.5.1 Inhibiteurs rapidement réversibles.– 3.2.5.2 Analogues d’états de transition et analogues multisubstrats.– 3.2.5.3 Inhibiteurs à haute affinité et inhibiteurs à intéraction lente.
• 3.2.6 Inhibition covalente.– 3.2.6.1 Les marqueurs d’affinité.– 3.2.6.2 Les inhibiteurs suicides.
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3.1 Structures et propriétés des enzymes
a) Structure primaire
Dans chaque cellule : ~ 500 enzymes
160
3.1 Structures et propriétés des enzymes (suite 1)
b) Structure secondaire
161
3.1 Structures et propriétés des enzymes (suite 2)
c) Structure tertiaire d) Structure quaternaire
De 2 à 60 sous unités (le plus souvent de 2 à 8) conduisent àdes masses moléculaires allant de 35,000 à plusieurs 100,000.
162
3.1.1 La catalyse enzymatique
3.1.1.1 Comparaison récepteurs-enzymes
Récepteur Complexe
Réponse
+ Ligand Récepteur + Ligand
Enzyme Complexe+ Substrat
Complexe Enzyme + Produit
reconnaissancereconnaissance
reconnaissancereconnaissance
catalysecatalyse
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3.1.1.2 La spécificité enzymatique
164
3.1.1.3 Caractéristiques de la catalyse enzymatique
H2O2 → H2O + 1/2 O2pas de catalyseur: ∆G≠ = 18 kcal/molplatine: ∆G≠ = 12 kcal/molperoxydase: ∆G≠ = 2 kcal/mol
165
Le site actif
166
Raisons de la catalyse
E S Ks
E.S
Kcat
E.P E P+ →
← →←
→← +
sans enzyme
avec enzyme +
énergie de liaison
avec enzyme +
énergie de liaison+
déstabilisation
167
Moyens de la catalyse
1) Approche des espèces réactives
2) Catalyse nucléophilique (covalente)
168
Moyens de la catalyse (suite)
3) Catalyse générale acido-basique
4) Catalyse électrostatique
5) Torsion du(es) substrat(s)
169
3.1.2 Le rôle des coenzymes
Site actif Site actif
fonctionnelfonctionnel
cofacteurcofacteur
enzyme inactiveenzyme inactive enzyme activeenzyme active
cofacteurscofacteurs
ions mions méétalliquestalliques(oligo(oligo--ééllééments)ments)
coenzymescoenzymes(petites mol(petites moléécules organiques)cules organiques)
liens non-covalents
liens covalents groupes prosthétiques
Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mo+, K+...
170
3.1.2 Le rôle des coenzymes (suite 1)
Source : vitamines
171
3.1.2 Le rôle des coenzymes (suite 2)
Autres sources
vitamine
172
3.1.2.1 Le phosphate de pyridoxal (PLP)
173
3.1.2.1 Le phosphate de pyridoxal (PLP) (suite 1)
174
3.1.2.1 Le phosphate de pyridoxal (PLP) (suite 2)
175
3.1.2.1 Le phosphate de pyridoxal (PLP) (suite 3)
176
3.1.2.2 L’acide tétrahydrofolique (THF) et les nucléotides à pyridine
177
3.1.2.2 L’acide tétrahydrofolique (THF) et les nucléotides à pyridine (suite)
178
3.1.2.3 Les flavines (FAD et FMN)
Les flavo-enzymes catalysent une grande variété de réactions d’oxydo-réduction et de mono-oxygénation car le tricycle iso-alloxazine très conjugué est un excellent accepteur d’électrons, qu’il peut prendre un électron à la fois ou deux d’un coup.
OPO3– :
flavine mono nucléotide (FMN)
179
3.1.2.3 Les flavines (FAD et FMN) (suite 1)
180
3.1.2.3 Les flavines (FAD et FMN) (suite 2)
La monoamine oxydase (MAO) est une flavo-enzyme qui est responsable du catabolisme de plusieurs neuro-transmetteurs comme la norépiné-phrine et la dopamine.
181
3.1.2.4 Le hème ou protoporphyrine IX
Le hème est une porphyrine contenant du Fe(III). On le retrouve dans les enzymes à cytochrome P-450 principalement dans le foie ou avec certaines flavo-enzymes elles dégradent les xénobiotiques.
182
3.1.2.4 Le hème ou protoporphyrine IX (suite)
Après réduction du Fe3+ en Fe2+ , il y a liaison d’oxygène et formation d’une espèce Fe4+ qui est responsable des réactions d’hydroxylation et d’époxydation de composés normalement peu oxydables.
183
3.1.2.5 L’adénosine triphosphate et le coenzyme A
Les enzymes qui dépendent de l’ATP servent au transfert de plusieurs substrats.
Un substrat nucléophile peut attaquer l’ATP
- au phosphore γγγγγγγγ pour transférer un groupe phosphoryle (cassure a),
- au phosphore ββββββββ pour transférer un groupe diphosphoryle (cassure b)
ou un groupe adénosine diphosphoryle (cassure c),
- au phosphore αααααααα pour transférer un groupe adénosine monophosphoryle (cassure d)
- ou à la position 55’’ pour transférer un groupe adénosyle (cassure e).
184
3.1.2.5 L’adénosine triphosphate et le coenzyme A (suite 1)
Dans le cas de la conversion des acides gras en leurs dérivés acylco-enzyme A, qui sont des substrats pour l’acyl- CoAdéhydrogénase, l’ATP est utilisé pour activer l’acide carboxylique sous forme d’ester d’adénosine monophosphate. Ce composé réactif réagit avec le thiol nucléophile du coenzyme A.
185
3.1.2.5 L’adénosine triphosphate et le coenzyme A (suite 2)
Les thio-esters du coenzyme A ont 3 fonctions principales pour différentes enzymes:
1) Les thio-esters sont très réactifs vis-à-vis des nucléophiles (réaction d’acylation).2) Ils sont importants pour le transport des molécules et leurs liaisons aux enzymes.3) Le proton en α devient plus acide donc plus facile à retirer.
186
3.1.3 Les substrats d’enzymes comme médicaments
Maladie de Parkinson : [dopamine]cerveau ↓
187
3.2 Inhibition et désactivation des enzymes
3.2.1 Définitions
MaladieMaladie
⇓⇓⇓⇓ou
⇑⇑⇑⇑en
[m
étab
olit
e]
invasion
par organ
isme étran
ger
reproduction anarchique des cellules
188
3.2.1.1 Déficience ou excès en un métabolite
3.2.1.2 Invasion par un organisme étranger
3.2.1.3 Reproduction anarchique des cellulesBiochimie n’est pas ≠≠≠≠Division cellulaire rapide ⇒⇒⇒⇒ Demande accrue en métabolites essentiels⇒⇒⇒⇒ inhiber les enzymes qui produisent les métabolites essentiels (antimétabolites)
Toxicité sélective (chimiothérapie)
Biochimie ≠≠≠≠ ⇒⇒⇒⇒ Possibilité d ’inhiber des enzymes spécifiques à l’envahisseur.
189
3.2.2 La résistance aux médicaments
1) Modification de l’absorption. La membrane plasmique peut ajuster sa charge nette.2) Surproduction de l’enzyme cible.3) Modification de l’enzyme cible. Il en résulte une moins bonne affinité pour le médicament.4) Surproduction d’une enzyme destructrice du médicament.5) Élimination d’une enzyme activant le médicament. Dans le cas ou le médicament est délivrésous une forme masquée (prodrogue), l’enzyme nécessaire pour l’activer cesse de fonctionner.6) Surproduction du substrat de l’enzyme cas des sulfamides.7) Nouveau chemin métabolique vers le produit de l’enzyme cible.
190
3.2.3 Le synergisme
1) Le médicament 2 inhibe une enzyme destructrice du médicament 1.2) Bloquage séquentiel. Dans le cas d’une inhibition compétitive du médicament 1, il est impossible de bloquer l’enzyme cible à 100%, le chemin métabolique n’est pas bloqué. En inhibant 2 enzymes consécutives de ce chemin, il devient possible
de l’inhiber totalement.3) Inhibition d’un autre chemin métabolique conduisant au même métabolite.4) Inhibition de l’enzyme cible par 2 médicaments. Une cellule sur 107 peut devenir résistante àun médicament; les chances d’en trouver qui résistent à 2 médicaments sont donc de 1 sur 1014.
L’antagonisme: 1+1=0.La sous additivité: 1+1<2.L’additivité: 1+1=2.Le synergisme: 1+1>2.Le synergisme: 1+1>2.
191
3.2.3 Le synergisme (suite)
l’association pyriméthamine-sulfadoxine présente une synergie antiparasitaire séquentielle qui permet la prise de doses efficaces moindres et diminue la toxicité pour l’hôte
ExemplesExemples
l’antituberculeux isoniazide qui inhibe la réplication du bacille de la tuberculose et le bactéricide rifampicine (inhibiteur de l’ARN-polymérase) sont utilisés additivement pour traiter la tuberculose
Inhibe l’ARN-polymérase
inhibe la réplication du bacille
Bloquage séquentiel
Bloquage additif
(antibactérien)
(tuberculose)
Même chemin métabolique
Deux chemins métaboliques différents
192
3.2.4 Classification des inhibiteurs d’enzymes
Non covalente
Réversible
Covalente
Irréversible (inactivation)
3.2.4.2 L’inhibition covalente
3.2.4.1 L’inhibition non covalente
193
métabolite important dans la division cellulaire
Les inhibiteurs rapidement réversibles sont des analogues de substrats, dans leurs états fondamentaux, dont les structures ont été modifiées afin d’interdire la réaction catalytique normale, ou du moins la ralentir, tout en préservant une bonne affinité pour l’enzyme.
Ce sont rarement des inhibiteurs puissants.
3.2.5 Inhibition non covalente3.2.5.1 Inhibiteurs rapidement réversibles
inhibiteur compétitif (Ki=19µM)
§ L’ornithine décarboxylase
194
prévient le catabolisme d’agents cytotoxiques
uridine ribose 1-phosphate uracile
5-fluoro-2’-désoxyuridine-5’-monophosphate (5-F-dUMP)
⇒ Synergie avec agents anticancéreux
§ L’uridine phosphorylase
195
Antibactérien
Affinité enzyme bactérienne
Affinité enzyme humaine
Bactérie seulement
= 10,000
§ La dihydroptéroate synthétase
§ La dihydrofolate réductase
ptéroyglutamatesynthétase
196
3.2.5 Inhibition non covalente (suite)
3.2.5.2 Analogues d’états de transition et analogues multisubstrats
Postulat de Hammond
Une enzyme, pour catalyser une réaction, doit avoir une meilleure affinité pour le substratdans l’état de transition (TS) que pour le substrat dans sont état fondamental.Après la formation de la combinaison de reconnaissance de Michaelis (E.S), l’enzymedéveloppe une affinité accrue, mais très transitoire pour le substrat lorsqu’il atteint l’état de transition. La stabilisation de TS par le site actif implique la mise en place de nouvelles liaisons (par exemple hydrogènes ou électrostatiques) qui n’existaient pas dans la combinaison E.S.
197
3.2.5.2.1 Analogues d’états de transition
Des analogues glucidiques possédant en C-1 un carbone trigonal ou qui, de par leur charge positive, miment la déficience électronique de l’état de transition, sont de puissants inhibiteurs des glycosidases.
L’action catalytique de ces enzymes provient de leur possibilité de stabiliser des ions oxocarboniums.
sp3sp3 sp2sp2
cancer, infections virales, diabète (type II)…
Km des substrats pyranosidiques (1-3mM)
1-désoxynojirimycine (Ki=0.6nM) contre la sucrase
N-acétylglucosamine-lactone (Ki=0.5µM) contre la β-N-acétylglucosaminidase
§ Les glycosidases
198
3.2.5.2.1 Analogues d’états de transition (suite 1)
sp3sp3sp2sp2
Des molécules qui miment les intermédiaires réactionnels tétraédriques sont des inhibiteurs très puissants des peptidases.
§ Les peptidases
199
§ Les peptidases (suite)
3.2.5.2.1 Analogues d’états de transition (suite 2)
sp2sp2
sp2sp2
sp2sp2
sp3sp3
sp3sp3
sp3sp3
Chymotrypsine (Ki=0.16nM)
Chymotrypsine (Ki=10nM)
Élastase (Ki=0.8µM)
200
3.2.5.2.1 Analogues d’états de transition (suite 3)
Cytidine (Km=0.21mM)
Phosphopyrimidine nucléoside (Ki=0.9nM)
coformysine (Ki=0.2nM)
sp2sp2
sp2sp2
sp3sp3
sp3sp3
anticancereux
Adénosine (Km=31µM)
§ Les nucléosides désaminases
201
3.2.5.2.2 Analogues multisubstrats anticancereux
AdoDato (Ki=20nM)
Des enzymes importantes dans la biosynthèse des polyamines (la spermidineet la spermine sont nécessaires pour la synthèse des ADN) catalysent le transfert d’un reste aminopropyle à partir de S-adénosyl-L-méthionine décarboxylée (dcAdoMet).
L’analogue multi-substrat S-adénosyl-1,8-diamino-3-thiooctane (AdoDato) combine en une molécule des éléments structuraux de la putrescine et de la dcAdoMet, les deux substrats de la spermidine synthétase, en cours de réaction. Il possède pour le site actif de l’enzyme une meilleure affinité que chacun des substrats seul.
§ La spermidine synthétase
202
3.2.5.2.2 Analogues multisubstrats (suite 1) anticancereux
PALA (Ki=27nM)
Une inhibition efficace de cette enzyme peut entraîner l’arrêt de la croissance et de la division cellulaire, par déficit en nucléotides nécessaires à la synthèse d’ARN et d’ADN.
En amont de la voie de biosynthèse des pyrimidines (cytosine et thymine), l’aspartate transcarbamylasecatalyse le transfert d’un résidu carbamyle, à partir de carbamyle phosphate, sur la fonction amine de l’aspartate.
L-aspartate (Km=17mM)
§ L’aspartate transcarbamylase
Carbamyl-phosphate (Km=27µM)
203
3.2.5 Inhibition non covalente (suite)
3.2.5.3 Inhibiteurs à haute affinité et inhibiteurs àinteraction lente
Ki < 10–9M
Pour les inhibiteurs à haute affinité, les lois cinétiques classiques de Michaelis-Menten sont modifiées car la [inhibiteur libre] ≠ [inhibiteur total].
204
3.2.5.3 Inhibiteurs à haute affinité et inhibiteurs àinteraction lente (suite 1)
Pro
du
it f
orm
é
Temps (min)
avec inhibiteur classique
avec inhibiteur classique (liaison rapide)
avec inhibiteur
avec inhibiteur àà interaction lente
interaction lente
Progression d’une réaction enzymatique en fonction du temps
K+1 << 109 M–1 s–1
K+1 ~ 109 M–1 s–1 (vitesse de diffusion)
Inhibiteur à interaction lente: Phase transitoire de quelques minutes plutôt quedes millisecondes. Valeurs faibles pour K–1 (t½ > quelques secondes, mêmedes jours et des années).
205
3.2.5.3 Inhibiteurs à haute affinité et inhibiteurs àinteraction lente (suite 2)
Pro
du
it f
orm
é
Temps (min)avec inhibiteur classique
avec inhibiteur classique (liaison rapide)
avec inhibiteur
avec inhibiteur àà interaction lente
interaction lenteProgression d’une réaction enzymatique
en fonction du temps
Ki*< 10–9Mk6 << k5 ⇒ Ki* << Ki
Une première combinaison E.I se forme rapidement suivie d’une étape lente, conduisantà une combinaison plus affine E.I*. AvantageAvantage: : ↑↑↑↑↑↑↑↑ [[substratsubstrat] ] nn’’aa pas pas dd’’effeteffet..
206
biosynthèse des stérols
Ki* = 1.4 × 10 – 11 M
< 10–9 M
K +1 = 2.1 × 10 6 M – 1 min – 1
K – 1 = 3 × 10 – 5 min – 1
K+1 << 109 M–1 s–1
(vitesse de diffusion)
§ L’isopentenyl pyrophosphate isomérase
207
biosynthèse du cholestérol
Ki* = 0.24 × 10 – 9 M
< 10–9 M
K +1 = 2.7 × 10 7 M – 1 s – 1
K – 1 = 6.5 × 10 – 3 s – 1
K+1 << 109 M–1 s–1
(vitesse de diffusion)
⇒ inhibition presque irréversible
éétape limitante parmi 26tape limitante parmi 26
CompactineCompactine
§ L’hydroxyméthylglutaryl coenzyme A réductase
208
§ La dihydrofolate réductaseantibactérien
Ki* = 9 × 10 – 12 M
209
Téprotide: pGlu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro
§ L’enzyme de conversion de l’angiotensinerégulation de la
pression artérielle
210
régulation de la pression artérielle
Glycoprotéine liée à la membrane
Structure peu connue
Métalloprotéase (Zn) comparable à une autre protéase de structure connue: la carboxypeptidase A.
§ L’enzyme de conversion de l’angiotensine (suite 1)
211
§ L’enzyme de conversion de l’angiotensine (suite 2)
régulation de la pression artérielle
212
régulation de la pression artérielle
Ki* = 1.8 × 10 – 10 M
K +1 = 2 × 10 6 M – 1 s – 1
K – 1 = 3.6 × 10 – 4 s – 1
ÉÉnalaprilatenalaprilate
- démangeaisons - perte du goût
§ L’enzyme de conversion de l’angiotensine (suite 3)
213
3.2.6 Inhibition covalente2 types d2 types d’’inhibition covalente inhibition covalente
Marqueurs d’affinité Inhibiteurs suicides
E + I Ki
E.I Kinact
E - I
→←
→
Marqueurs d’affinité
actifs dès le départ.
Inhibiteurs suicides
inertes au départ.
214
3.2.6.1 Les marqueurs d’affinité
Les marqueurs d’affinité classiques sont pour la plupart, des analogues de substrats dans leurs états fondamentaux, modifiés pour accommoder des fonctions réactives (par exemple électrophiles) et qui présentent dans l’idéal une bonne affinité pour les sites de liaison d’enzymes cibles.
E + I Ki
E.I Kinact
E - I
→←
→
Étant donné que les marqueurs d’affinité ont des fonctions réactives, ils peuvent réagir avec des milliers de nucléophiles autre que ceux situés dans le site actif de l’enzyme cible.
Ce sont donc des drogues potentiellement toxiques (très utilisées en chimiothérapie du cancer).
Il est possible d’obtenir des drogues non toxiques en augmentant l’affinité pour le site actif cible (très petit Ki).
215
thiazolidine
β-lactamedihydrothiazine
§ La transpeptidase
216
§ La transpeptidase thiazolidine
β-lactamedihydrothiazine
PeptideStructure Structure du
PeptidoglycannePeptidoglycanne ou
MurMurééineine
Glycanne (glucides reliés par des liaisons β-1,4)
Glycanne (glucides reliés par des liaisons β-1,4)
217
§ La transpeptidase
(suite 1)-N
AG-N
AM-N
AG-
-Gly5-
218
§ La transpeptidase (suite 2)
mime D-Ala-D-Ala
Na-Nb : 3.3Å
Na-COO- : 5.4Å
Na-COO- : 5.7Å
agit comme un bouclier
219
Elle sont responsables des effets observés pendant les inflammations : rougeur de la peau, augmentation du flux sanguin et vasodilatation, mal de tête, douleurs vasculaires, augmentation de température.
§ La cyclooxygénase Les prostaglandines sont toujours relâchées quand les cellules sont endommagées et on les trouve en forte concentration dans le pus.
220
L’inhibition de la prostaglandine synthétase responsable de la formation de toutes les prostaglandines conduit donc à un effet anti-inflammatoire, analgésique,antipyrétique.
aspirineaspirine
§ La cyclooxygénase (fin)
En particulier les enzymes des plaquettes ne sont pas régénérées, leur inhibition est donc très effective.
221
3.2.6.2 Les inhibiteurs suicides
Les inhibiteurs suicides sont des molécules stables qui ressemblent aux substrats (ce sont des pseudo-substrats) et qui possèdent une réactivité chimique latente Y (a).
Ils se lient au site actif de l’enzyme cible (b) et tout comme un substrat, subissent une transformation catalytique (c).
L’inhibiteur transformé va ensuite démasquer une fonction réactive qui devra réagir avec un résidu proximal du site actif de l’enzyme (d) en formant un lien covalent, le bloquant ainsi d’une manière permanente (e).
(b) (c)(a) (d) (e)
222
3.2.6.2 Les inhibiteurs suicides (suite)
Les inhibiteurs suicides ne s’attaquent qu’aux enzymes sachant les transformer; ils
sont donc bien plus sélectifs que les marqueurs d’affinités.
Leur absence de réactivitéchimique intrinsèque en fait des agents thérapeutiques de
choix
allopurinol
Lien non
covalent
223
anticancéreux,
antiparasitaire
Enzyme à phosphate de pyridoxal
Biosynthèse des polyamines
DFMO
§ L’ornithine décarboxylase
inhibiteur compétitif(Ki=19µM)
Ki=39µM,
inactive l’enzyme avec un T50 de 3.1 min (à saturation du site actif, il faut ~ 3 min pour inactiver 50% de l’activité enzymatique.
224
anti-épileptique
Enzyme à phosphate de pyridoxal
Km du GABA = 10-3 M
vigabatrine
Ki = 3.4 × 10-4 M
T50 = 3.3 min
§ La GABA transaminase
225
anticancéreux§ L’aromatase
226
convertit le dUMP (désoxyuridinemonophosphate) en dTMP (désoxythymidinemonophosphate) en présence de méthylène-tétrahydrofolate.
anticancéreux§ La 5-thymidilate synthétase
227
Synergie avec bactéricides β-lactames
Certaines lignées de bactéries sont devenues résistantes aux β-lactames par production de β-lactamases
§ La beta-lactamase
228
Synergie avec bactéricides β-lactames
L’acide clavulanique inhibe cette enzyme et présente un effet synergique important avec l’amoxycilline(augmentin)
amoxycilline (10mg/ml) après 1h à 37°C sur une souche résistante de E.coli.
amoxycilline (10mg/ml) + acide clavulanique(2.5mg/ml) après 1h à 37°C sur une souche résistante de E.coli.
§ La beta-lactamase (suite 1)
229
Synergie avec bactéricides β-lactames
1 sur 115
§ La beta-lactamase (suite 2)
Staphylocoque doré
230
Goutte
t½ = 5h
Mo (IV) —→ Mo (VI)
§ La xanthine oxydase