Chapter 5Bacterial genetics

미생물학교실권 형 주

DNA: The genetic materialBacterial genome (prokaryotes) : chromosome, a single, double-stranded, circular DNA : Extrachromosomal genetic elements – plasmids, bacteriophages : only one copy of chromosome (haploid) : structure of the bacterial chromosome – polyamines, spermine, spermidine : Operons – groups of one or more structural genes expressed from a particular promoters and ending at a transcriptional terminator - polycistronic, e.g, E. coli lac operon

Replication of DNA Initiation of synthesis : Initiated a specific sequence (at one fixed point) – OriC 1700bps/sec, 40 min for entire genome copy-DNA 복제과정 동안 double helix 는 replication fork 에서 되고 , 각 strand 는 DNA polymerase 의 template 로 이용 : replication fork - DNA 복제가 일어나는 point, - DNA 의 unwinding (helicase)-DNA 복제 결과 두 개의 새로운 strands 가 만들어지고 각 strand 는 original strand 와 상보적 염기서열

- Semiconservative replication : one original strand (conserved) + one newly-synthesized strand- DNA 는 5’->3’ 으로 합성 : replication fork 에서 하나의 daughter strand 는 continuously 합성 (leading) 다른 하나는 discontinuously 합성 (lagging)- Lagging strand 에서의 DNA 합성은 : replication fork 의 이동방향과 반대방향으로 일어나고 RNA polymerase, RNA primer, DNA-dependent DNA polymerase, DNA ligase 에 의해 완성- Bidirectional replication : replicative origin 에서 initiation 되면 동시에 반대방향으로 양쪽으로 replication 이 진행

- DNA 합성에 필요한 단백질 및 효소 1) unwinding enzymes : 2) stabilizing proteins : single stranded parental DNA 의 rewinding 을 못하게 한다 . 3) DNA polymerases Pol I : role for maturation, Pol II : unclear role, Pol III : 3’->5’ exonuclease activity 4) RNA polymerase : leading strand – RNA primer 제공 Primase : lagging strand 의 RNA primer 제공 , : insensitive to the RNA polymerase inhibitor rifampicin 5) DNA ligase 6) Topoisomerase (gyrase) : Interconvert DNA molecules with different types of supertwisting

The rate of DNA replication - Log phase 에서 multiple replication fork 현상이 일어날 수 있어 generation time 은 염색체 복제에 걸리는 시간보다 짧을 수 있다 .

Transcriptional control Transcription

- 3 types of RNA : rRNA, tRNA, mRNA

1) ds DNA 의 한쪽 strand 를 template 로 하여 RNA polymerase 가 RNA 를 합성2) RNA 는 nucleotide A, C, G, U 로 합성한다 .3) Promoter site – transcription 시작부위로 RNA polymerase 가 binding Terminator site – transcription end point4) RNA 도 5’->3’ 으로 합성한다 .5) Prokaryotes : 세포질에서 transcription Eukaryotes : 핵에서 transcription (hnRNA) -> RNA processing -> mRNA -> 세포질

Operon : 효소의 생성은 structural gene 에 의해 결정된다 . 박테리아에서 서로 관련된 대사기능을 가지고 있는 일련의 structural gene 들이 같은 mechanism 에 의해 조절되는 경우가 있다 . promoter, operator site 가 위와 같은 structural gene 들의 transcription 을 조절하는데 이러한 structural gene 과 promoter 와 operator site 를 operon 이라 함

Regulation of gene expression

- Regulating protein synthesis at the gene level is energy efficient because proteins are only synthesized as they are needed- Constitutive enzymes are always present in a cell

Repression and Induction

1) Repression 은 유전자 발현이 억제되고 , 효소 생성이 저하되는 mechanism Repression 은 하나 이상의 repressible enzyme 의 합성을 조절 - regulatory proteins Repressor : protein capable of binding to specific sequences of DNA (Operator) overlap with the promoter turning off the gene or set of genes Corepressor2) 일반적으로 세포가 어떤 end-product 에 노출되면 그 end-product 의 합성에 관여하는 효소의 합성은 감소한다 .3) Induction : 유전 전사를 turn-on Inducer 의 존재 하에 세포가 보다 많은 효소를 합성할 수 있는데 , 이를 induction 이라 함 Effectors : inducers-combine with repressors to decrease binding affinity for DNA Activators : positive-acting proteins, e.g. CAP protein4) Induction 의 예 : E. coli 에서 lactose 존재 하에 -galactosidase 의 생산이 유도되어 lactose 의 대사가 일어난다 .

Operon model1961, Jacob & Monod Induction (inducer) 와 repression (repressor) 에 의한 단백질합성 모델 -배지에 glucose 와 lactose 가 존재할 때 carbon 과 energy source 로 glucose 를 먼저 이용하기 때문에 lactose operon 은 작동되지 않음 (catabolite repression) : Glucose 이용하여 energy (ATP) 풍부 cAMP 농도 저하 catabolite repression- Inducer 가 없을 때 (Allolactose, IPTG) : active repressor 가 operator 에 결합하여 transcription 저해 - Inducer 가 있을 때 : inducer 와 repressor 가 결합하여 inactive repressor 로 되어 operator 에 결합하지 못함- In poor medium :cAMP 농도 증가 CAP (catabolite gene activator protein) 과 결합하여 CAP-cAMP complex 형성 promoter 에 결합 transcription : CAP 는 repressor 가 없는 상태에서는 promoter 에 결합하지 않음

Attenuation : tryptophan operon (trp operon)

- mRNA 의 합성은 시작되었지만 조기에 transcription dl 끝나는 현상- 아미노산이 없는 배지에서 자라는 E. coli 는 아미노산 합성에 필요한 효소를 가지고 있음- 배지에 아미노산 ( 예 : Trp) 을 첨가하면 tryptophan 을 만드는데 필요한 효소는 더 이상 필요하지 않기 때문에 이의 생성은 급격히 감소 Attenuator – tryptophan 존재하에 transcription termination site

1) mRNA 합성의 premature termination 을 유발하는 유전자 조절기전을 attenuation - Tryptophan operon2) 고농도의 tryptophan 이 존재하는 경우 - attenuator site 에서 transcription 의 premature termination 이 일어남3) 저농도의 tryptophan 이 존재하는 경우 - attenuator 가 작동되지 않아 mRNA 의 완전한 합성이 일어나 tryptophan 생성에 필요한 효소를 transcription

Mutation, Repair, and RecombinationMutation - 유전자의 변화 gene product ( 효소 등 ) 의 변화 효소의 불활성화 lethal 새로운 activity benefit- DNA base sequence 의 변화를 mutation 이라 함

Types of mutations1) Point mutation : DNA one base pair 가 다른 base pair 로 대치되는 경우 - Transition : one purine another purine one pyrimidine another pyrimidine - Transversion : Purine Pyrimidine - Silent mutation : base pair 의 변화에도 단백질합성에 장애가 없는 경우 예 ) codon 의 3 번째 위치에 mutation (degeneracy) - Missence mutation : DNA 의 변화로 인해 원래의 아미노산이 다른 아미노산으로 변화 : sickle cell anemia - Conservative mutation : DNA 의 변화로 인해 원래의 아미노산이 다른 아미노산으로 변화되는데 비슷한 성질을 가진 아미노산으로 변화 - Nonsense mutation : DNA 의 변화로 stop codon 이 생성 premature protein

2) Frameshift mutation : 하나 또는 몇 개의 base pair 가 deletion 되거나 addition 된 경우 - change in the reading frame useless peptide and premature protein3) Null mutation : Extensive insertion or deletion, or gross rearrngement of the chromosome structure - completely destroy gene function

Mutagen

- DNA 의 permanent change 를 유발시킬 수 있는 제제 - Spontaneous mutation 이란 mutagen 없이도 일어나는 변이

- Physical mutagens 1) heat : deamination of nucleotides 2) ionizing radiation : X-rays, g-rays…. DNA 와 반응할 수 있는 ion 과 free radical 생성 combine with DNA bases DNA 복제 , repair 에 error 초래 mutation Base substitution 이나 sugar-phosphate backbone 의 break 3) UV – nonionizing : 인접한 thymidine 의 crosslinking thymidine dimer

- Chemical mutagens 1) Nucleotide-base analogues : 5-bromouracil incorporation into DNA base pairing with guanine mistake in replication 2) Frameshift mutagens : intercalating agents, polycyclic, flat, molecules : Ethidium bromide, acridine derivatives 3) DNA-reactive chemicals : Chemicals that react with DNA : Nitrous acid (HNO2) : alkylating agent (nitrosoguanidine, ethyl methane sulfonate) - add methyl or ethyl groups to the rings of the DNA bases

Repair mechanisms of DNA

1) Direct DNA repair2) Excision repair3) Recombinational or postreplication repair4) SOS response5) Error-prone repair

Gene exchange in prokaryotic cells- Exchange of DNA between cells New strain Advantage ?? Antibiotic resistance genePlasmid- Circular, double-stranded DNA : 예외 존재- 보통 세포가 살아가는데 크게 중요하지 않은 유전자를 가지고 있으며 : extrachromosomal element -Antibiotic resistance, bacteriocins, toxins, virulence determinant…..- 1:1 ~~1: several copies (up to 50 copies)- Replicons : Autonomously replication, Capable of self duplication DNA molecules possess their own origin of replication- Episomes : integrate into host chromosome 예 : E. coli F plasmid-Transfer : conjugation – F plasmid transformation transduction

Bacteriophages- Bacterial viruses- Survive outside of a host cell- totally dependent for : Metabolic precursors Ribosomes, Cellular organelles necessary for making proteins- Lysogenic state : integrate into host genome- Lytic infection

- insertion : Bacteriophage lamda - Lytic phage : T2, T7

- How phage chromosome’s are inserted into bacterial chromosome…… : Circularize DNA : attach to E. coli chromosome (very homologous section) : crossover ; break and rejoin….

Transposon-Jumping genes, mobile genetic elements : 염색체의 한쪽 부위에서 동일염색체의 다른 부위로 움직여 다닐 수 있는 작은 DNA segment- Insertion sequence (IS, simple transposon) : carry no genetic information except for transposition : Specific terminal DNA sequence - Inverted repeat : 15-40 bases : coding region for an enzyme (transposase) : cutting and ligating DNA, recognition site- Composite transposons (complex transposons) : contain genetic information in addition to that needed for transposition-TnA family : transposase(tnpA) : resolvase (tnpR) : -lactamase – resistance to ampicillin : resolution site (Res site)- Mu bacteriophage Phage-associated transposon

Mechanism of genetic transfer between cells- Exchange of genetic material between bacterial cells

- Transformation : 용액내에서 naked DNA 상태로 유전자가 한 박테리아에서 다른 박테리아로 전달되는 현상 : Streptococcus pneumoniae 에서 처음 규명 : 몇 가지 박테리아에서는 natural transformation 발생 - Haemophilus influenzae - Neisseria - Acinetobacter - Streptococcus - Bacillus **Artificial transformation-Competence : end of logarithmic growth before stationary phase: work only in complete replicon capable of self-duplication - plasmid DNA - viral chromosomal DNA: Chemical methods: Electrophoration

Conjugation- 살아있는 세포들이 contact - Donor : F+ cells – plasmid F factor 를 가지고 있는 세포- Recipient : F- - F factor 가 transfer 된다 .- F factor 가 염색체에 삽입된 경우를 Hfr (high frequency recombination) 이라 함 : chromosomal DNA 전체가 transfer 되는 경우는 거의 없고 일부만 transfer-2 distinct sexes : F(fertility) factor - sex chromosome - circular dsDNA molecule - one copy/cell - capable of transferring genes into female cells -1/3 of the F+ DNA : : consist of 19 transfer (tra) genes : specifically involved in the transfer of genetic material : responsible for synthesis of the sex specific F pili

Transduction- 어떤 박테리아의 DNA 가 bacteriophage 에 의해 다른 박테리아로 transfer 되는 것을 말함- Generalized transduction : random gene transfer- Specialized transduction

Recombination- Genetic recombination : 두 개의 DNA 분자 사이에 유전자 교환이 일어나 유전자의 새로운 조합이 일어나는 현상 - Homologous (legitimate) recombination - Nonhomologous (illegitimate) recombination

Genetic engineering