chapter ii

BAB II

METODOLOGI PENELITIAN

2.1 Waktu dan tempat penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara Medan pada tanggal 20 Oktober 2010 sampai tanggal

15 Nopember 2010.

2.2 Alat-alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah satu unit alat

KCKT lengkap (Hitachi) dengan pompa (L-2130), degasser (DGU 20 AS),

injektor Autosampler L-2200, kolom C18 (250 mm x 4,60 mm), detektor UV-Vis

L-2420, wadah fase gerak, vial Autosampler, Sonifikator (Branson 1510), pompa

vakum (Gast DOA - P604 – BN), neraca analitik (mettler Toledo), membran filter

PTFE 0,5 µm dan 0,2, cellulose nitrat membran filter 0,45 µm, Spektrofotometer

UV-Vis (Shimadzu Mini 1240). Spektrofotometer FTIR (Shimadzu IR Prestige-

21) DRS 8000 ( Diffuse Reflecttance measuring).

2.3 Bahan-bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu metanol untuk

HPLC(Baker Analyzed®), aquabidestilata (PT. Ikapharmindo Putramas),

Propranolol HCl BPFI (Badan POM RI), Propranolol HCl baku pabrik (PT. Kimia

Farma), Tablet generik Propranolol HCl (PT. Kimia Farma), Propranolol HCl

(PT. Dexamedica), tablet Farmadral (PT. Fahrenheit).

Universitas Sumatera Utara

2.4 Pengambilan sampel

Pengambilan sampel secara purposif yaitu tanpa membandingkan antara

satu tempat dengan tempat yang lain, karena tempat pengambilan sampel

dianggap homogen. Menurut Sudjana (1989), Sampling purposif dikenal juga

sebagai sampling pertimbangan, terjadi apabila pengambilan sampel berdasarkan

atas pertimbangan peneliti. Sampel yang digunakan adalah tablet generik

(PT.Kimia Farma dan PT. Dexamedica), tablet Farmadral (PT. Fahrenheit).

2.5 Prosedur Penelitian

2.5.1 Uji Identifikasi Baku Propranolol HCl Menggunakan FTIR

Uji identifikasi baku Propranolol HCl dapat dilakukan dengan

menggunakan spektrofotometer FTIR, yaitu dengan cara dicampur 1 mg serbuk

Propranolol HCl dengan 100 mg serbuk KBr dalam lumpang, digerus hingga

halus dan homogen, campuran tersebut diletakkan pada sampel pan kemudian

dipasangkan pada DRS 8000 dan dianalisa pada bilangan gelombang 4000-500

cm-1.

2.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Sejumlah lebih kurang 50 mg Baku Pembanding Propranolol HCl

ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml, dilarutkan dengan

metanol lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan metanol dan dikocok

homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 mcg/ml, larutan

induk baku I (LIB I). Dipipet sebanyak 5 ml LIB I, dimasukkan ke dalam labu

tentukur 25 ml, dilarutkan dengan metanol lalu dicukupkan sampai garis tanda

dengan metanol dan dikocok homogen, sehingga diperoleh larutan dengan

konsentrasi 100 mcg/ml, larutan induk baku II (LIB II).


Kemudian dipipet sebanyak 0,2 ml LIB II, dimasukkan ke dalam labu

tentukur 10 ml, dilarutkan dengan metanol lalu dicukupkan sampai garis tanda

dengan metanol dan dikocok homogen, sehingga diperoleh larutan dengan

konsentrasi 20 mcg/ml.

2.5.3 Pembuatan fase gerak Metanol – Air Metanol 500 ml disaring dengan menggunakan membran filter PTFE 0,5

µm dan diawaudarakan selama 20 menit.

Aquabidestilata 500 ml disaring dengan menggunakan sellulosa nitrat

membran filter 0,45 µm dan diawaudarakan selama 20 menit.

2.5.4 Pembuatan pelarut

Pelarut dibuat secara kuantitatif dari larutan metanol dan akuabidestilata

dengan perbandingan yang sama seperti perbandingan fase gerak hasil optimasi.

Pelarut lalu disaring dengan penyaring membran sellulosa nitrat 0,45 µm dan

diawaudarakan selama ± 20 menit.

2.5.5 Pembuatan Larutan Induk Baku Propranolol HCl BPFI

Menurut Farmakope Indonesia (1995), Sejumlah 50 mg Baku Pembanding

Propranolol HCl ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml,

ditambah pelarut aduk hingga homogen, lalu dicukupkan sampai garis tanda,

maka diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 mcg/ml (LIB )

2.5.6 Penyiapan alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan kolom C18 (250 x 4,60

mm), detektor UV-Vis L-2420, dengan laju alir 1 ml/menit, sensitifitas 1.000

AUFS dan dideteksi pada panjang gelombang 290 nm.


Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak

dibiarkan mengalir selama 30 menit sampai diperoleh garis alas yang datar,

menandakan sistem tersebut telah stabil.

2.6 Penentuan Kualitatif dan Kuantitatif Propranolol HCl menggunakan

KCKT

2.6.1 Uji Kualitatif Propranolol HCl menggunakan KCKT

2.6.1.1 Penentuan perbandingan fase gerak

Dipipet 2 ml Larutan Induk Baku Propranolol HCl dan masukkan dalam

labu tentukur 50 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, kocok

sehingga diperoleh larutan Propranolol HCl dengan konsentrasi 20 mcg/ml,

disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µl dan diawaudarakan selama 20 menit,

kemudian diinjeksikan ke dalam sistem KCKT menggunakan vial autosampler

sebanyak 10 µl, menggunakan fase gerak metanol - air dengan perbandingan

(60:40), (70:30), dan (75:25), laju alir 1 ml/menit dan dideteksi pada panjang

gelombang 290 nm. Kemudian dipilih perbandingan fase gerak yang memberikan

data yang terbaik.

2.6.1.2 Menentukan waktu tambat Propranolol HCl BPFI

Larutan Induk Baku Propranolol HCl dipipet 2 ml masukkan dalam labu

50 ml, ditambah dengan pelarut dan dikocok hingga homogen lalu dicukupkan

sampai garis tanda. Maka diperoleh larutan Propranolol HCl dengan konsentrasi

20 mcg/ml.

Larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µl dan diawaudarakan

selama 20 menit, diinjeksikan ke dalam sistem KCKT menggunakan vial

autosampler sebanyak 10 µl menggunakan perbandingan fase gerak dan laju alir


yang memberikan pemisahan yang terbaik, kemudian dicatat masing-masing

waktu tambatnya.

2.6.1.3 Identifikasi sampel

Larutan sampel Propranolol HCl sediaan tablet dengan konsentrasi 20

mcg/ml, disuntikkan kesistem KCKT menggunakan vial autosampler sebanyak 10

µl pada kondisi kromatogafi yang sama dengan BPFI. Kemudian waktu tambat

masing-masing tablet dibandingkan dengan waktu tambat Propranolol HCl BPFI.

Apabila waktu tambat sampel hampir sama dengan waktu tambat BPFI, maka

sampel tablet mengandung Propranolol HCl.

2.6.2 Penentuan Kuantitatif Propranolol HCl menggunakan KCKT 2.6.2.1 Pembuatan Kurva Kalibras Propranolol HCl BPFI

Larutan Induk Baku Propranolol HCl dipipet sebanyak 1 ml, 1,5 ml, 2 ml,

2,5 ml dan 3 ml, dimasukkan dalam labu tentukur 50 ml, ditambah pelarut, kocok

hingga homogen dan dicukupkan sampai garis tanda. Maka diperoleh konsentrasi

10 mcg/ml, 15 mcg/ml, 20 mcg/ml, 25 mcg/ml, 30 mcg/ml. Kemudian masing-

masing larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µm dan diawaudarakan

selama 20 menit, diinjeksikan kesistem KCKT menggunakan vial autosampler

sebanyak 10 µl pada kondisi kromatogafi yang sama dengan BPFI, dengan laju

alir 1 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 290 nm. Selanjutnya dari

luas area yang diperoleh dibuat kurva kalibrasi, dihitung persamaan regresi dan

faktor korelasinya.

2.6.2.2 Penetapan kadar sampel

Menurut Rohman (2007), penetapan kadar sampel dilakukan dengan cara

menimbang 20 tablet yang mengandung Propranolol HCl kemudian digerus,


ditimbang sejumlah serbuk tablet setara dengan 50 mg Propranolol HCl (sebanyak

6 kali perlakuan). Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml,

dilarutkan dengan pelarut sampai garis tanda. Maka diperoleh larutan dengan

konsentrasi 500 mcg/ml Propranolol HCl, kemudian saring dengan kertas saring

10 % filtrat pertama dibuang. Dari keenam larutan masing-masing dipipet 2 ml

dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, kocok hingga homogen dan

dicukupkan sampai garis tanda. Maka diperoleh larutan dengan konsentrasi 20

mcg/ml Propranolol HCl. Masing-masing larutan tersebut disaring dengan

membran filter PTFE 0,2 µl dan diawaudarakan selama 20 menit, kemudian

diinjeksikan ke sistem KCKT menggunakan vial autosampler sebanyak 10 µl.

dideteksi pada panjang gelombang 290 nm dengan laju aliran 1 ml/menit dan

dihitung kadarnya.

Kadar dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas area sampel pada Y dari

persamaan regresi : Y = aX + b.

2.6.3 Penentuan Uji Validasi dengan Parameter Akurasi dan Presisi

2.6.3.1 Uji akurasi dengan persen perolehan kembali (% Recovery)

Menurut Meyer (2004), Uji akurasi dengan parameter persen perolehan

kembali (% Recovery) dilakukan secara Standard Addition Method dengan

membuat 3 konsentrasi analit Propranolol HCl dan baku pembanding dengan

rentang spesifik 80%, 100%, 120%, setiap rentang mengandung 70% analit

sampel dan 30% bahan baku, pada perlakuan yang sama dengan perlakuan

sampel.

Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus:

% Perolehan kembali %100xC

BA−=


Keterangan :

A = Konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan bahan baku

B = Konsentrasi sampel sebelum penambahan bahan baku

C = Konsentrasi baku yang ditambahkan.

2.6.3.2 Uji Presisi

Menurut Rohman (2009), Uji presisi ditentukan dengan parameter Relatif

Standar Deviasi (RSD) merupakan ukuran ketepatan relatif dan umumnya

dinyatakan dalam persen. RSD dirumuskan dengan persamaan :

%100xX

SDRSD=

Keterangan:

RSD = Standar Deviasi Relatif (%)

SD = Standar deviasi

X = Kadar rata-rata sampel.

2.6.3.3 Penentuan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Menurut Miller (2005), Batas deteksi didefenisikan sebagai konsentrasi

analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu

dapat dikuantifikasi. Batas kuantifikasi didefenisikan sebagai konsentrasi analit

terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang

dapat diterima pada kondisi metode yang digunakan. Untuk menentukan batas

deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) digunakan rumus:

2)( 2

−−

=n

YiYSB

Slope

SBxLOD 3=


Slope

SBxLOQ 10=

Keterangan:

SB = Simpangan baku

LOD = Batas Deteksi

LOQ = Batas Kuantitasi.

2.6.3.4 Analisis Data Secara Statistik

Menurut Jones, S.D (2002), Untuk menghitung Standar Deviasi (SD)

digunakan rumus:

1

)(−

−= ∑

nXX

SD

Keterangan :

SD = Standar deviasi

X = Kadar sampel

X = Kadar rata-rata sampel

n = Jumlah perlakuan

Kadar dapat dihitung dengan persamaan garis regresi dan untuk

menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus:

t hitung nSD

XX

/

−=

Dengan dasar penolakan apabila t hitung ≥ t tabel

Untuk mencari kadar sebenarnya dengan α = 0,01, dk = n - 1, dapat digunakan

rumus:

n

SDxtX dk)2/11( αµ −±=


Keterangan:

μ = Kadar sebenarnya

X = Kadar sampel

n = Jumlah perlakuan

t = Suatu harga tergantung pada derajat kebebasan dan tingkat kepercayaan

dk= Derajat kebebasan.


chapter ii

Documents