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인태반 가수분해물의 항염작용과 진통효과서경묵 교수 (중앙의대)

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Article Review

인태반 가수분해물의 항염작용과 진통효과

Anti-inflammatory and Analgesic Effects of Human Placenta Extract

Lee KH, Kim TH, Lee WH et alNatural Product Research 2011;11: 1090-1100

112

서 경 묵 교수중앙의대 재활의학과

EXPERT OPINION

+ 항염증제는 염증반응 관련 병리생리 치료에 도움이 되지만 현재 가용한 항염증제들은 이상반응

으로인한부작용을나타내고있다. 따라서부작용이적은항염증제의개발이필요한현상황에서천연물,

특히인태반가수분해물의항염작용과진통효과를살핀본연구는시의적절하다할수있다.

+ 본연구에의하면인태반가수분해물은쥐의대식세포에서세포독성을보이지않았고, LPS로유

도된산화질소, 종양괴사인자, COX-2 등의생성을억제함으로써이와관련된항염작용을가지고있다는

것을보여주었다.

+ 인태반가수분해물은만성염증성질병모델에서도만성관절부종발생을유의하게억제하는실

험결과를 보임으로써, 인태반 가수분해물이 급성 염증뿐 아니라 만성 염증의 치료에서도 효과적일 수 있

는가능성을시사한다.

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인태반 가수분해물의 항염작용과 진통효과

+ 인태반 가수분해물은 복부 수축, hot-plate, Randall-Selitto, tail-flick 등의 실험을 통해 진

통작용을나타냈다.

+ 인태반가수분해물의항염증효과에대한작용기전및치료효과에대한정보가제한적인상황에

서실험모델을 이용해 항염작용과 진통효과를 살핌으로써 향후 약물 개발과 치료 전략에 많은 도움이 될

것으로기대된다.

ABSTRACT

본 연구는 Lipopolysaccharide (LPS)로 염증을 유도하여 활성화된 RAW264.7 대식세포에서 분비되는 전

염증성 사이토카인과 매개물질에 미치는 인태반 가수분해물(human placenta extract; HPE, 라이넥)의 효

과를 조사한 것이다. 이 연구를 통해 라이넥(HPE)이 산화질소(nitric oxide, NO), 종양괴사인자(TNF-α)와

COX-2 (cyclooxygenase-2)의생성을유의하게억제한다는것을밝혀내었다.

라이넥의 항염작용 및 진통효과에 대한 가능성을 알아보기 위해 쥐를 모델로 하여 연구하 다. 쥐들은 6개

군으로 배당하여 생리식염수 또는 라이넥(0.33, 1, 3, 6 mL/kg)을 복막 내로 투여하 고, 활성 대조군으로

는diclofenac을사용하 다.

연구 결과 HPE는 쥐 뒷발의 부종을 감소시켰으며, 아세트산으로 유도된 혈관 투과성이 HPE에 의해 유의

하게 감소되었다. HPE는 carrageenan air pouch 모델에서 육아종 형성을 감소시키고, 완전한 Freund’

adjuvant로 유도된 만성 관절염 쥐에서 뒷발 부종을 감소시켰으며, 극심한 고통으로 온몸을 비트는 횟수

(writhing episode)를감소시켰다.

HPE를 투여받은 쥐는 hot-plate에 견디는 시간이 증가하 다. 또한 HPE는 Randall Selitto test에서 통증

역치를 증가시켰고, Tail flick assay에서 쥐의 방사열 자극에 대한 반응시간을 연장시켰다. 이러한 결과들

은HPE가강력한항염작용및진통효과가있음을말해주고있다.

114

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연구 배경

염증은다양한자극과국소적손상에대해인체가

나타내는 유익한 반응이다. 염증반응은 물리적 또

는 화학적인 외상, 장기의 침범과 항원항체반응에

의해 촉발될 수 있으며, 그 결과 조직의 부종과 통

증, 심한 경우 세포의 손상까지 이르게 한다. 따라

서항염증제를사용하면염증반응과관련된병리생

리를 치료하는 데 도움이 될 수 있다. 그러나 현재

가용한항염증제들은이상반응으로인해실제임상

에서사용시중요한합병증을나타내고있다. 예를

들어, 일부 비스테로이드성 소염진통제(non-

steroidal anti-inflammatory drug, NSAID)는

위궤양과 신장애를 일으킬 수 있다. 그러므로 부작

용이덜한항염증제가개발될필요가있다. 최근천

연물제제에대한관심이증가하고있고, 새로운약

물개발을위한원천물질로서눈길을끌고있다.

연구 목적

인태반 가수분해물(HPE)은 많은 아시아 국가들

에서 질병의 치료와 활력증진의 보충을 위한 전통

적인치료제로사용되어왔다. HPE는만성간질환

과 건선 같은피부염증에 치료적효과가 있다고보

고되었다. 최근에HPE는중년여성에서갱년기증

상과 피로를 개선시킨 것으로 나타났으며, 보조제

로 유도된 관절염을 가진 쥐에서 관절염을 개선시

키는 것으로 나타났다. 더불어 HPE는 단백질·지

질·DNA 등을 포함한 생물학적 분자들이 손상됨

으로써 정상 신진대사와 생리적 균형을 해치게 되

는 산화 스트레스의 부정적인 결과에 대응하는 항

산화작용을 가지고 있다고 보여진다. HPE는 사람

의 단핵구 세포주(human monocytic cell line)에

서 JNK/SAPK와 전사인자(transcription factor)

인 NK-κB, AP-1의 활성화를 통해 IL-8의 발현

을촉진시킨다. HPE가다양한임상적상황에서폭

넓게 사용되어 왔다고는 하지만 항염증 효과의 자

세한 작용기전 및 그와 관련된 치료효과에 대해서

는알려진정보가매우제한적이다. 따라서본연구

에서는 여러 실험모델에서 HPL의 항염작용과 진

통효과에대해알아보았다.

연구 방법

1. 화학약품Dulbecco’s modified Eagle’s medium

(DMEM), Dulbecco’s phosphate buffer

saline(PBS), penicillin/streptomycin (1000

U/mL, 1000 μg/mL, respectively) 그리고 fetal

bovine serum (FBS)은 Gibco BRL, Life

Technologies (Grand Island, NY, USA)로부터

입수하 다. LPS (Escherichia coli serotype

0127:B8), 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide (MTT) 및다른세

포배양을 위해 필요한 모든 재료들은 Sigma

Chemical Company (St Louis, MO, USA)로부

터 구입하 다. Type IV lambda carrageenan,

Brewer’s yeast, complete Freund’s adjuvant,

diclofenac, Evans blue는 Sigma Chemical Co.

(USA)로부터 공급받았다. 이 연구에서 모든 다른

화학약품들은 reagent grade이었고, 현 지역에서

상업적으로얻을수있는것들이었다.

2. HPE의구성HPE라는 제품명으로 녹십자 Japan Bio

Product (한국)에서 시판하고 있는 인태반 가수분

해물인 라이넥을 사용하 다. 10개월을 채운 출산

을기준으로 수집된인태반은 즉시 얼음속에 보관

되었고, 인간면역결핍바이러스(HIV)와 B형·C형

간염바이러스 시험을 거친 후 조각으로 잘려져 효

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인태반 가수분해물의 항염작용과 진통효과

소분자 분해와 화학적 가수분해를 통해 물 속에서

추출되었다. 추출과 멸균 과정은 품질관리 가이드

라인에따라실행되었다. HPE 최종산물은아르기

닌(0.08%), 리신(0.1%), 페닐알라닌(0.08%), 티로

신(0.03%), 류신(0.12%), 메티오닌(0.03%), 발린

(0.04%), 알라닌(0.08%), 세린(0.07%), 트레오닌

(0.06%)을 포함한 다양한 아미노산이 들어있는 2

mL 앰플에 보관하 다. Polysaccharide,

polynucleotide와 같은 불용성 고분자 물질은 제

조과정에서제외되었다.

3. 세포배양Macrophge RAW264.7 세포들은 American

Type of Culture Collection로부터 입수하 다.

이 세포들은 37℃의 습한 환경에서 95%의 공기,

5%의이산화탄소를같이넣어보관되었다.

Routine subculture를위한매개체는10% FBS,

2mM glutamine, 100μg.mL penicillin/

streptomycin을보충한DMEM이다.

4. 세포생존력세포 생존능력에 대한 HPE 집중의 효과는 수정

된 MTT assay를 사용하여 평가된다. 간략하게 세

포들(10,000 cells/well)은 96-well plate에 심어

져 37℃에서 24시간 배양되었다. 세포들은 HPE

또는PBS 컨센트레이션과긍정적인컨트롤로만다

뤄졌으며, 추가적인 24시간 동안 37℃에서 배양되

었다. 배양후, MTT solution (5 mg/mL in PBS)

의 100 μL은 각각의 3시간 동안 37℃에서 배양된

well과 plate에 추가되었다. 나중에 dimethyl

sulfoxide 100 μL는침전된 formazon의용해도를

높이기 위해 각각의 well에 추가되었다. 각각 well

의 흡광도는 microplate reader를 사용해서 450

nm으로측정되었다.

5. 효소연결면역분석법에의한사이토카인의측정

RAW264.7 세포들은 배양 배지 2 mL와 함께

6-well cell culture plate 안에서 100,000

cells/mL 농도로 24시간 동안 plate되었고,

indomethacin (50 μM), dexamethasone (1 μM)

또는 HPE (0.0018, 0.018, 0.18, 3.6 mL/ mL)으

로 2시간 더 사전 처리되었으며, 그 다음 추가 24

시간동안LPS (1 μg/mL)로시험되었다. 종양괴사

인자-α(TNF-α), interleukin(IL)-1β, IL-6 같은

염증의 매개체는 제조자 인스트럭션에 따라 쥐

ELISA kits에의한LPS 치료24시간후에수량화

되었다.

6. Western blot 분석법RAW264.7 세포들은 indomethacin (50 μM),

dexamethasone (1 μM) 또는 HPE (0.0018,

0.018, 0.18, 3.6 mL/mL)으로 2시간 사전 처리되

었으며, LPS (1 μg/mL)로 24시간 자극되었다. 총

단백질 가수분해물의 20 μg은 10% SDS-PAGE,

nitrocellulose 막으로 전자 이동되었다.

nitrocellulose 막은 1시간 동안 무지방의 우유로

막고 그 다음 유도성의 nitric oxide를 위한

polyclonal 항체와 cyclooxygenase-2, β-actin

을 위한 monoclonal 항체와 함께 밤새 배양하

다. 모든 항체들의 결합은 제조자 인스트럭션에 따

른ECL 발견시스템을사용하여발견하 다. 면역

반응성 band의 강도는 densitometric analysis

프로그램(Japan)을사용하여발견하 다.

7. 실험동물Male Spraque-Dawley 쥐(150-250 g)와 ICR 쥐

(25-28 g)들은대한바이오링크(한국)에서입수하

고, 최소 1주일간 실험실 조건에 순응시켰다. 모든

동물들은성균관대학교동물보호위원회가이드라인

116

Article Review

에 따라 인도적으로 다루었다. HPE는 식염수에 희

석하여 0.33, 1, 3, 6 mL/kg의 용량으로 투여하

다. 여섯 개의 치료군(n=8-16)으로 나누어 연구하

는데, a) 위약대조군, b)-e) HPE 투여군, f) 활성

약(diclofenac) 대조군등이었다. HPE의용량은이

전연구에서효능이인정된용량을사용하 다.

8. Carrageenan 유도뒷발부종Winter 등에 의한 Carrageenan 유도 뒷발부종

을 약간 수정해 사용하 다. 1% sodium

carrageenan 0.1 mL subplantar 주를쥐의오른

뒷발에 복강내주사 30분으로 관리되었다. 오른발

용량은즉시측정되고, Ugo Basile (이탈리아)로부터의

water plethysmometer을 사용한 carrageenan

주사후0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12시간후에측정되

었다. 발부종비율은다음의방정식으로계산되었다.

부종 비율(%)= (B-A)/A x 100%

B는 carrageenan 주사 후 발의 용량이며, A는

주사 전 발의 용량이다.

9. 아세트산유도혈관투과성HPE의 근육내 주사 후 30분, 2.5% Evans blue

solution은 쥐로 정맥주사하고 20분 후 acetic

acid solution의 0.6%의 10 μL/g(몸무게)를 복강

내로 주사했다. 또 다른 20분 후 쥐는 희생되었고

식염수로 복강을 씻어냈다. 복강 구멍 유체의 상청

액의빛흡수력은분광광도계를사용하여630 nm

으로측정되었다.

10. Carrageenan-induced air pouchpouch를만들기위해8 mL의공기가쥐등의피

하 공간으로 주입되었다. 0.2% carrageenan-

saline solution은 공기 주입 24시간 후에 주입되

었다. Vehicle, HPE 또는 diclofenac (5 mg/kg)

은 7일 동안 같은 시간에 하루 한 번 복강 내로 투

여되었다. 마지막치료24시간후동물들은희생되

었고, 삼출물과육아종은수집되어측정되었다.

11. 보조제유발관절염Cox와Welch (2004)에의해보고된이론에따르

면 동물들은 완전한 Freund’s adjuvant의 1 mL

안에 열처리된 Mycobacterium butyricum 1 mg

로오른쪽뒷발에피하로주사되었다. 보조제주사

11일후에HPE는 10일동안복막내로매일투여되

었다. 관절염은 체적변량유랑계로 발의 붓는 정도

를 측정했다. 부종의 비율은 위에 언급한 방법으로

측정하 다.

12. 아세트산유도비틀기반응HPE는실험전30분에근육내로투여하 고, 이

후식염수에든아세트산(0.7%, 0.1 mL/10 g 몸무

게)는 복막 내로 주사되었다. 아세트산의 주사 5분

후다음10분동안몸이비틀어졌다.

13. Randall-Selitto assayBrewer 효모의 20% 현탁물이 쥐 뒷발바닥에 주

사되었다. Brewer 효모 주사 2시간 후 HPE는 복

막내로투여되었다. 이어서처치후0.5, 1, 2, 3, 4

시간에 analgesymeter를 사용하여 각 군의 손상

되지 않은 발과 염증 있는 발 둘 다의 통증 역치를

측정하 다. 통증 역치는 쥐가 소리를 내거나 발을

움추리는힘에의해정의되었다.

14. Tail-flick testTail-flick 잠복기는HPE 복강내주사후5, 15,

30, 60, 90, 120, 180분에 측정하 다. 쥐 꼬리의

대략 중간 부분에 열을 집중시켰고, 자극으로부터

꼬리를치우기까지의잠복시간을기록하 다. 조직

손상을막기위해실험시간을15초로하 다.

15. Hot-plate testHot-plate test를 위해 hot-plate의 온도는 섭

씨55±0.5도로설정하 다. HPE 복강내주사30

분 후 쥐를 hot-plate에 올려놓고 쥐가 뛰어오르

거나 뒷발을핥을 때까지경과한 시간을초 단위로

기록했다. 조직 손상을 막기 위해 실험 시간을 30

초로하 다.

16. 통계분석모든 유의성은 단측 분산분석(ANOVA)으로 검정

하 고, 특정시점에서각군간차이는다중비교에

적당한 Bonferroni correction을 사용하여

p<0.05일때유의한것으로간주하 다. 모든결과

치는평균±표준편차로표시하 다.

연구 결과

1. Cell ViabilityHPE 3.6 mL/mL 농도까지는세포독성이관찰되

지않았다[그림1].

2. Effects of HPE on LPS-induced andcytokine release in RAW264.7 cell

대식세포에 의해 생성되는 NO는 LPS에 노출된

후 0.64 μM에서 34.71 μM까지 증가되었고, 이러

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인태반 가수분해물의 항염작용과 진통효과

[그림 1] RAW264.7 대식세포에서 HPE의 세포 생존력에 미치는효과

120

100

80

60

40

20

0

Viability (%

of co

ntrol)

IndomethacinDexamethasone

HPE

(μM)(μM)(mL/mL)

- 50 - - - - -- - 1 - - - -- - - 0.018 0.18 1.8 3.6

[그림 2] HPE의 NO 생성(a) 및 전염증성 사이토카인 생성(b)에 미치는 효과

40

30

20

10

0

(a)

**** **

Nitrate(μM

)

TNF-αIL-1βIL-6

LPSIndomethacin

DexamethasoneHPE

(μg/mL)(μM)(μM)(mL/mL)

- 1 1 1 1 1 1 1- - 50 - - - - -- - - 1 - - - -- - - - 0.018 0.18 1.8 3.6

++**

++** ++

** ++**

120

90

60

30

0

(b)

**

Cytok

ine prod

uctio

n(%)

LPSIndomethacin

DexamethasoneHPE

(μg/mL)(μM)(μM)(mL/mL)

- 1 1 1 1 1 1 1- - 50 - - - - -- - - 1 - - - -- - - - 0.018 0.18 1.8 3.6

******

++

**** ** +

**

* *+

***+**

+**

+** +

**

++

**++

**

++

**++

**

한변화는HPE 1.8 mL/mL와3.6 mL/mL 농도에

서 유의하게 억제되었다[그림 2a]. 또한 HPE가

TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성에 미치는 효과에 대

해서도연구하 다.

TNF-α, IL-1β, IL-6의 수치는 LPS에 의해 유

의하게 증가하는데, HPE는 용량 의존적으로

TNF-α수치의 증가를 억제시켰고, 3.6 mL/mL

농도에서 IL-1β, IL-6 수치의 증가를 억제하 다

[그림2b].

3. Effects of HPE on LPS-induced proteinexpression of iNOS and COX-2 inRAW264.7cell

LPS 처치군에서iNOS와COX-2 단백질발현수

치는대조군에비해각각5배, 4배정도더높았다.

이러한 iNOS와 COX-2 단백질 발현 증가는 HPE

에 의해 유의하게 용량 의존적으로 억제되었다[그

림3].

4. Effects of HPE on carrageenan-induced hind paw edema

Carrageenan을쥐의발에주사하면위약대조군

쥐에서 뒷발의 부피가 시간 의존적으로 증가하는

결과를 보 다[그림 4]. 이러한 증가는 1시간 시점

부터관찰되어carrageenan 주사후6시간시점에

서 최대치를 보 다. 0.33 mL/kg 용량의 HPE는

위약대조군과 비교했을때 발 부피에 향을 미치

지않았다. 그러나 1, 3, 6 mL/kg 용량에서는유의

하게발부피의증가를감소시켰다. 또한활성약대

조군으로 사용된 diclofenac도 유의한 항염증효과

를보여주었다.

5. Effects of HPE on acetic acid-inducedvascular permeability

아세트산에 의한 염색액의 유출은 위약 대조군에

서체중10 g 당 31.6±2.6 μg이었다. HPE 0.33, 1,

3 mL/kg의용량에서는염색액유출에서명확한변

화가 관찰되지 않았다. 그러나 HPE 6 mL/kg에서

는염색액의복강내유출을유의하게감소시켰다[그

림5].

118

Article Review

[그림 3] HPE의 iNOS 및 COX-2 단백질 발현에 대한 효과

4

3

2

1

0Protein ex

pres

sion

(arbitra

ry units)

iNOSCOX-2

** **

++ ++

++

++

++

++

++

++

**+

**++**

LPSIndomethacin

DexamethasoneHPE

(μg/mL)(μM)(μM)(mL/mL)

- 1 1 1 1 1 1 1- - 50 - - - - -- - - 1 - - - -- - - - 0.018 0.18 1.8 3.6

iNOS ▶

COX-2 ▶

β-actin ▶

[그림 4] HPE가 carrageenan으로 유도된 쥐의 뒷발 부종에미치는 효과

150

120

90

60

30

00.5 1 2 4 6 8 10 12

Paw

swelling(%)

ControlHPE 0.33 mL/kg

1 mL/kg3 mL/kg6 mL/kg

Diclofenac 25 mg/kg

Time(h)

6. Effects of HPE on carrageenan-induced air pouch

위약 대조군에 속한 동물들에서 삼출물의 용적은

6.3±0.8 mL 고, 육아종 형성물은 2.0±0.2 g이

었다. 실험군에서 삼출물의 용적은 유의한 변화를

보이지 않았다. 육아종 형성물은 HPE 1, 3, 6

mL/kg에서유의하게감소하 다[표1].

7. Effects of HPE on adjuvant-inducedarthritis

위약 대조군에서 발의 부피는 제8일에 최고치가

관찰되었고, 그 후 제20일까지 감소하 다. HPE

투여 후 제5일까지 위약 대조군에 비해 눈에 띄는

변화는 없었고, 발의 부피는 HPE 0.33, 1, 3

mL/kg의 용량에서 제18일부터 제20일까지 현저

히감소하 다. HPE 6 mL/kg 용량에서는제20일

에 발의 부피를 통계적으로 유의하게 감소시켰다

[그림6].

8. Effects of HPE on acetic acid-inducedwrithing response

극심한 고통으로 온몸을 비트는 횟수(writhing

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인태반 가수분해물의 항염작용과 진통효과

[그림 5] HPE가 아세트산으로 유도된 쥐에서 혈관 투과성에미치는효과

45

30

15

0

Leak

age of d

ye (mg/10 g

. b. w

t.)

Control Diclofenac0.33 1 3 6

HPE(ml/kg)

**

[표 1] HPE가 Carrageenan 유도 육아종 형성에 미치는 효과

Each value represents mean±SEM from 9-12 rats per group** Significantly different (p＜0.01) from control group

GroupDose Volume of exudate

Inhibitation (%)Granulation tissue

Inhibitation(%)(mL/kg) (mL) (g)

Control - 6.3±0.8 2.0±0.2

HPE 0.33 5.8±1.0 25.2 1.5±0.4 28.1

1 5.9±1.2 7.1 1.1±0.1** 44.5

3 4.3±0.7 -4.8 1.2±0.2** 39.6

6 5.1±1.2 31.4 1.1±0.1** 46.5

Diclofenac 5 mg/kg 4.7±0.4 18.9 0.9±0.1** 56.6

[그림 6] HPE가보조제로유도된관절염에미치는효과

100

70

40

102 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Paw

swelling(%)

ControlHPE 0.33 mL/kg

1 mL/kg3 mL/kg6 mL/kg

Diclofenac 5 mg/kg

Time after adjuvant injection (day)

Treatment

episode)는위약대조군에서18.0±1.6회 다. HPE

0.33, 1, 3 mL/kg 용량을 투여한 동물들은 아세트

산으로인해복부를비트는횟수가유의하게감소하

다. 활성 대조약으로 사용된 아미노피린도 역시

몸을비트는횟수를유의하게감소시켰다[표2].

9. Effects of HPE on Randall-Selittoassay

위약 대조군에서, 염증이 유발된 쥐 발의 통증 역

치는 실험 기간 내내 일정했다. HPE 0.33, 1

mL/kg 용량에서는 통증 역치를 증가시키지 않았

다. 그러나 HPE 3, 6 mL/kg 용량에서는 위약 대

조군에 비해 통증 유발 역치를 유의하게 증가시켰

다[그림7].

10. Effects of HPE on tail-flick test실험기간동안위약대조군에서반응시간은짧게

유지되었다. HPE 0.33 mL/kg 용량에서 5분, 30

분, 60분에 반응시간이 유의하게 증가하 고,

HPE 1 mL/kg 용량에서는5분시점에서만반응시

간이증가되었다. HPE 3 mL/kg과 6 mL/kg 용량

은통증유발역치를유의하게증가시켰다[그림8].

120

Article Review

[그림 7] HPE가통증역치에미치는효과

180

120

60

00 0.5 1 2 3 4

Pain thresh

old

(g)

ControlHPE 0.33 mL/kg

1 mL/kg3 mL/kg6 mL/kg

Diclofenac 25 mg/kg

Time (h)

[그림 7] HPE의 tail flick 도피잠복시간에미치는효과

8

7

6

5

4

3

2

10 30 60 90 120 150 180

Pain se

nsitivity (s)

ControlHPE 0.33 mL/kg

1 mL/kg3 mL/kg6 mL/kg

Diclofenac 25 mg/kg

Time (min)

[표 2] HPE가 아세트산으로 유도된 비틀기 증후군에 미치는 효과

Each value represents mean##SEM from 10-13 mice per group** Significantly different (p＜0.01) from control group

GroupDose

Number of writhing Inhibitation rate (%)(mL/kg)

Control - 18.0±1.6

HPE 0.33 8.5±1.3** 52.6

1 8.6±1.0** 52.4

3 9.9±.3** 44.8

6 14.0±2.0 22.5

Aminopyrine 50 mg/kg 0.1±0.1** 99.4

11. Effects of HPE on hot-plate test위약 대조군에서 반응시간은 13.8±1.6초 다.

HPE 0.33, 1, 3 mL/kg 용량에서는반응시간이각

각25.2초, 23.6초, 25.0초로증가함으로써진통작

용을 나타내었고, 이는 위약 대조군과 현저하게 다

른수치 다[표3].

고찰

본 연구에서는 실험실내 세포배양과 생체내 동물

모델을 사용하여 HPE의 항염효과 및 진통작용에

대해 조사하 다. LPS로 유발한 RAW264.7 대식

세포는 항염작용을 나타내는 약제 및 생약 제제의

효과를연구하기위한염증성세포모델로서사용되

어져왔다(Kim et al. 2003).

대식세포의 활성화는 iNOS와 COX-2에 의해 합

성된 NO를 포함하여 염증매개물질뿐만 아니라,

TNF-α, IL-1β, IL-6와같은전염증성사이토카인

을 생성함으로써 염증반응을 개시하고 증진시키는

데 중요한 역할을 한다(Chan, & Riches. 2001).

따라서, LPS 유발 RAW264.7 대식세포에서 이러

한핵심염증성사이토카인과매개물질을평가함으

로써 HPE의 항염효과를 확인하고자 하 다. HPE

는 쥐의 대식세포에서 세포독성을 보이지 않았으

나, LPS로유도된NO, TNF-α, COX-2 생성억제

효과를 나타냈다. 그러므로, 본 연구 결과는 HPE

가NO, TNF-α, COX-2 생성억제와관련된항염

작용을가지고있다는것을보여준다.

Carrageenan 유발생쥐의발부종은항염증약제

를평가하는데에적합한검사법이며, 부종억제효능을

평가하는 데에 자주 사용되어 왔다. Carrageenan

투여후쥐의발부종발생은두개의단계(phase)를

갖는현상이다(Vinegar et al. 1969).

처음 1시간 동안 관찰되는 초기 단계는 히스타민

과세로토닌분비의결과 고, 두번째단계의부종

은 프로스타 란딘 분비가 원인이다(Di Rosa et

al. 1971). 위약 대조군에서 실험용 쥐의 발 부피는

carrageenan 투여 후 유의하게 증가하 고, 이는

급성 염증성 손상을 의미한다. 반대로, HPE 투여

군에서는 쥐의 뒷발 부종을 현저하게 가라앉혔다.

이러한 결과는 HPE가 염증성 질환의 치료에 있어

서실제임상에적용될수있는잠재력이있음을말

해준다.

혈관삼투압의상승은급성염증반응의주요한특

징중의하나이다. 히스타민, 프로스타 란딘, 류코

트리엔과같은염증매개물질은자극에의해방출된

다(Hseu et al, 2005). 이는세동맥및세정맥을확

장시키고, 혈관 투과성을 증가시킨다(Vogel, &

Vol.9 No.6 June 2012 ∷121

Ar

ti

cl

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Re

vi

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인태반 가수분해물의 항염작용과 진통효과

[표 3] HPE가 hot-plate 반응시간에 미치는 효과

Each value represents mean±SEM from 8-13 mice per group*, ** Significantly different (p＜0.05, p＜0.01) from control group

GroupDose

Response time (sec)(mL/kg)

Control - 13.8±1.6

HPE 0.33 25.2±2.5*

1 23.6±1.2*

3 25.0±2.5*

6 23.3±2.3

Morphine 5 mg/kg 35.4±3.0**

Vogel, 1997). 그결과, 체액과혈장단백질이복강

내로 침출되어 부종이 발생한다. HPE는 아세트산

에의한복막염증의강도를감소시켰고, 이는HPE

가 급성 염증기에소혈관 투과성을억제할 수있다

는것을의미한다.

HPE의 생체내 항염효과는 아만성 염증이 있는

동물모델에서도 시험하 다. 이 모델은

carrageenan 투여7일후까지삼출물의양과백혈

구축적, 육아종, 삼투압, 단백질제거율등으로특

성화되었다(Hambleton, & Miller, 1989). HPE는

육아종 형성을 유의하게 억제하 다. 이 결과는

HPE가 염증 과정에서 증식기를 억제하는 능력이

있음을의미한다.

우리는HPE가만성염증성질병모델, 즉보조제

로 유발한 쥐의 관절염 모델에서도 항염 효능을 나

타낼수있는지를조사하 다. HPE는보조제로유

발된 만성 관절 부종 발생을 유의하게 억제하 다.

완전한Freund 보조제를쥐뒷발에주사하여원발

부위에서 염증을 유발하 다. 이 염증은 3-5일후

최고치에 이르 다. 2차 병변은 주사 후 발생하는

데, 체중이 감소하고 면역반응이 감소하 다. 세균

성 펩티도 리칸과 무라 디펩티드(MDP)가 이러

한 증상을 유발시키는 원인이 된다는 점이 밝혀졌

다(Crofford, 1993). 장기 실험(완전한 Freund 보

조제유발관절염쥐에기초한실험)뿐아니라단기

실험(실험쥐의 carrageenan 유발 부종과 관련된

실험)에서도 HPE는 유의한 항염증 효과를 나타내

었다. 이 결과는 HPE가 급성 염증뿐 아니라 만성

염증의치료에서도효과적임을시사한다.

HPE는복부수축, hot-plate, Randall-Selitto,

tail-flick 실험을 통해 평가할 때, 진통 작용을 나

타내었다. 아세트산은 내인성 물질의 분비로 인해

통증(algesia)을 일으킨다(Berkenkopf, &

Weichman, 1988). 이 방법은 리폭시게나제 반응

산물(Dhara et al. 2000)뿐만 아니라 복막액

(Deraedt et al. 1980)에서도 PGE2와 PGF2α수

치를 상승시키는 등 일반적으로 프로스타노이드와

관련이 있어왔다. Randall과 Selitto가 고안한 발

압력 실험에서, 효모에 대한 부종 반응의 절반이

5-HT 분비에 의해 발생한 직접적인 모세혈관 변

화의 결과로 이루어졌다(Stone et al. 1961). 염증

과 강력한 통각과민성(hyperalgesia)은 효모 주사

1-3시간 후에 발생한다(Winter, & Flataker,

1965). HPE는 극심한 통증으로 온몸을 비트는 반

응에서 현저한 억제 작용을 나타내고, 통증 역치를

증가시켰다.

급성진통작용을나타내는HPE의중추적작용기

전을 평가하기 위하여, hot-plate와 tail-flick법

이 사용되었다. 이들 방식에서 통증은 중추적 작용

기전을통해매개된다. 이들방법은더나아가서로

다른경로를 통해전해지는 통증 자극에대한 반응

을 구분할 수도 있다. Hot-plate 반응이 더 높은

대뇌 중추와 관련되어 있는 반면, tail-flick 반응

은 통증 활동에 대한 척추반사작용에 의해 매개되

며, 주로 척추 위쪽에서 조직된 반응으로 여겨진다

(Chapman et al. 1985).

HPE는 hot-plate 실험에서 유의하게 반응 시간

을증가시키고, tail-flick 실험에서도피잠복시간

을 유의하게 연장시킴으로써, 진통 효과를 나타냄

에있어서중추적작용이있다는것이밝혀졌다.

결론적으로HPE는강력한항염효과및진통작용

을 갖고 있는 것으로 보이며, HPE가 염증과 관련

된다양한 질병에있어서 치료제로서 사용될수 있

다는것을알수있다.

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