WSZCZĘCIE PRZEWODU DOKTORSKIEGO

Proponowany tytuł pracy

Chelatory metali w terapiach przeciwnowotworowych

Katarzyna Malarz

Opiekun pracy:

dr hab. Robert Musioł

Opiekun pomocniczy:

dr Anna Mrozek-Wilczkiewicz

Instytut Chemii

Wydział Matematyki, Fizyki i Chemii

Uniwersytet Śląski

Katowice, 2016

2

Spis treści

I. Wstęp 3

II. Przegląd literatury 4

1. Charakterystyka i metabolizm reaktywnych form tlenu 4

2. System komórkowej regulacji redoks 5

3. Stres oksydacyjny w terapiach przeciwnowotworowych 7

4. Rola jonów żelaza i miedzi w utrzymaniu homeostazy komórkowej 9

5. Chelatory metali w terapiach przeciwnowotworowych 9

III. Cel i zakres pracy 14

IV. Badania własne 15

1. Tiosemikarbazony 15

1.1. Oznaczenia cytotoksyczności in vitro 15

1.2. Generowanie reaktywnych form tlenu i wpływ na poziom glutationu 21

1.3. Peroksydacja lipidów 24

2. Glikokoniugaty 25

2.1. Cytotoksyczność in vitro 25

2.2. Wpływ jonów metali na proliferację komórek 27

2.3. Generowanie reaktywnych form tlenu przez glikokoniugaty 29

2.4. Wpływ reaktywnych form tlenu na glutation oraz indukcję apoptozy 30

2.5. Interkalacja DNA 31

V. Podsumowanie 33

VI. Dalsze plany 35

VII. Bibliografia 35

VIII. Dorobek naukowy 39

3

I. Wstęp

Choroby nowotworowe to jeden z najpoważniejszych problemów zdrowotnych na świecie.

Zgodnie z raportami Światowej Organizacji Zdrowia, odpowiadają one za ponad 13%

wszystkich zgonów na całym świecie, co plasuje je na drugim miejscu, zaraz po chorobach

układu krążenia [1]. W związku z tym, konieczne jest poszukiwanie nowych, skutecznych

leków, a także rozwiązań w walce z nowotworami. Istotnym elementem tych poszukiwań jest

coraz lepsze poznanie mechanizmów działania potencjalnych leków, co jest kluczowe dla

stałego ich doskonalenia i stanowi jedno z najważniejszych wyzwań dla współczesnej nauki.

Rozwój chemii medycznej oraz racjonalnego projektowania leków tworzy podstawy

nowoczesnych metod leczenia. Obecnie wiele badań w tej dziedzinie skupia się na

mechanizmach nowotworzenia, wskazując szczególną rolę cząsteczek zaangażowanych

w progresję cyklu komórkowego oraz transdukcje sygnałów [2]. Z uwagi na stopień

skomplikowania procesu, leki skupione wyłącznie na jednym celu molekularnym, jak

inhibitory docelowych białek, nie spełniają wszystkich wymagań. Kluczowym problemem

jest bowiem szybki rozwój i transformacja nowotworów, które – poprzez specyficzne mutacje

mogą zmieniać strukturę celów. W związku z tym coraz więcej uwagi zyskuje dynamicznie

rozwijane podejście polifarmakologiczne jako właściwsze wobec złożonych

i wieloaspektowych chorób nowotworowych [3]. Głównym jego założeniem jest

projektowanie leków, które oddziałują z wieloma celami, przez co posiadają lepszy profil

selektywności i skuteczności, w odniesieniu do leków jednocelowych. Zaletą

wielokierunkowych terapii celowanych jest również przezwyciężenie problemu oporności na

lek [4]. Co ciekawe, w ostatnim czasie rozwijany jest nurt terapii oksydacyjnej, która wpisuje

się w założenia polifarmakologii, a której podstawą jest zaburzenie komórkowej homeostazy

redoks [5]. Terapia ta może być skutecznie wykorzystywana, bowiem łączy dwa ważne

aspekty, takie jak selektywność terapeutyczną oraz mniejszą wrażliwość na lekooporność

[6,7]. Podstawowym celem takiej terapii są zjawiska związane ze zwiększonymi stężeniami

reaktywnych form tlenu (ang. reactive oxygen species, ROS) w komórkach nowotworowych

w porównaniu z komórkami normalnymi [8,9]. W efekcie, komórki nowotworowe są jeszcze

bardziej wrażliwe na stres oksydacyjny wywołany przez związki cytotoksyczne, zdolne

zwiększać poziom ROS lub zmniejszać skuteczność obrony antyoksydacyjnej. Ponadto

w komórkach nowotworowych obserwowane są wyższe poziomy wewnątrzkomórkowego

glutationu, co jest związane ze zjawiskiem oporności na leki [10–12].

Interesującymi grupami potencjalnych leków, które wpisują się w powyższe strategie,

a także nurt wielokierunkowych terapii celowanych mogą być związki chelatujące metale,

takie jak tiosemikarbazony (TSC) [13] oraz pochodne chinoliny [14]. Szczególnie na uwagę

zasługują związki oparte o motyw strukturalny 8-hydroksychinoliny (8-HQ), który może

wywołać określone efekty biologiczne [15]. Co więcej, połączenie 8-HQ z fragmentami

cukrowymi, prowadzi do powstania glikokoniugatów (GC), które charakteryzują się lepszymi

parametrami farmakokinetycznymi, właściwościami biologicznymi, a także większą

biodostępnością niż związki macierzyste [16].

4

II. Przegląd literatury

1. Charakterystyka i metabolizm reaktywnych form tlenu

Reaktywne formy tlenu charakteryzują się dwoistą naturą, wywierając w układach

biologicznych, zarówno korzystne, jak i szkodliwe efekty [17]. Początkowo ROS uważano za

produkty uboczne metabolizmu komórkowego, szczególnie oddychania komórkowego [18].

Jednakże, obecnie uznawane są również za cząsteczki sygnałowe, odpowiedzialne za

aktywację i regulację wielu ważnych procesów komórkowych, takich jak transdukcja

sygnałów, metabolizm, proliferacja oraz apoptoza [8,19].

Mianem reaktywnych form tlenu określana jest heterogenna grupa związków tlenu,

które charakteryzują się większą reaktywnością od tlenu cząsteczkowego O2 [20]. Do tej

grupy zaliczamy wolne rodniki, m.in. anionorodnik ponadtlenkowy (O2•-), rodnik

hydroksylowy (•OH), a także formy o charakterze nie rodnikowym, jak nadtlenek wodoru

(H2O2). Większość wewnątrzkomórkowych ROS powstaje wskutek jednoelektronowej

redukcji tlenu cząsteczkowego do anionorodnika ponadtlenkowego (Rys. 1) [21,22].

Rys. 1 Etapy powstawania reaktywnych form tlenu podczas redukcji tlenu cząsteczkowego. SOD – dysmutaza

ponadtlenkowa; CAT – katalaza; GPx – peroksydaza glutationu [21,22].

Anionorodnik ponadtlenkowy nie jest zbyt reaktywny wobec aminokwasów i kwasów

nukleinowych. Jednakże może szybko reagować z enzymami, jonami metali – zwłaszcza

miedzi oraz związkami zawierającymi grupy tiolowe. W ten sposób przyczynia się do

powstawania następczych form ROS [23]. W kolejnym etapie redukcji O2, anionorodnik

ponadtlenkowy ulega przekształceniu do nadtlenku wodoru pod wpływem dysmutazy

ponadtlenkowej (SOD) [21]. Nadtlenek wodoru może być bardzo reaktywny w obecności

jonów metali Fe i Cu, wytwarzając rodnik hydroksylowy w reakcjach Fentona i Habera-

Weissa (Rys. 2) [24].

Rys. 2 Reakcje Fentona (1) i Habera-Weissa (2) [24].

5

Silnie elektrofilowy charakter •OH powoduje, iż jest on odpowiedzialny za

powstawanie większości oksydacyjnych uszkodzeń cząsteczek DNA oraz może indukować

uszkodzenia białek oraz lipidów [24,25]. Oksydacyjne uszkodzenia DNA obejmują utlenianie

puryn i pirymidyn, co w konsekwencji prowadzi do pojedynczych modyfikacji zasad, całych

nukleotydów oraz jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA [26,27]. Najczęściej modyfikowana

przez rodnik hydroksylowy jest guanina, tworząc 8-hydroksyguaninę (8-OH-G) [27,28].

Wiele danych literaturowych wskazuje na bezpośredni związek poziomu 8-OH-G

z transformacją nowotworową guzów, a także silne zaangażowanie tego produktu utleniania

w proces kancerogenezy [29,30].

Reaktywne formy tlenu mogą być generowane w wyniku wewnętrznych przemian, jak

i przy pomocy zewnętrznych czynników. Głównymi źródłami wewnątrzkomórkowych ROS

jest mitochondrialny łańcuch oddechowy, cytochrom P-450, peroksysomy oraz aktywne

komórki zapalne [24,29]. Natomiast zewnątrzkomórkowe źródła ROS to czynniki fizyczne,

np. promieniowanie jonizujące i ultrafioletowe, ultradźwięki, a także ksenobiotyki, takie, jak

chinony, kompleksy metali, związki nitroaromatyczne, fotosensybilizatory, itp. [24,26,31].

Ze względu na wysoce reaktywny charakter, poziom ROS jest ściśle kontrolowany

przez system obrony antyoksydacyjnej, który utrzymuje komórki w stanie równowagi redoks

[29].

2. System komórkowej regulacji redoks

System kontroli wewnątrzkomórkowego potencjału redoks jest niezbędnym elementem

zapewniającym utrzymanie homeostazy komórkowej, a także regulatorem wielu funkcji

metabolicznych komórek [32]. Centralną rolę w systemie pełnią mitochondria, które nie tylko

są głównym źródłem produkcji reaktywnych form tlenu, ale również posiadają rozbudowany

system antyoksydacyjny (Rys. 3) [33,34]. System antyoksydacyjny składa się z białek

enzymatycznych, takich jak dysmutaza ponadtlenkowa (Mn-SOD), katalaza (CAT),

peroksydaza (GPx) i reduktaza glutationowa (GR), peroksydaza tioredoksyny

i peroksyredoksyna (PRX), a także białek nieenzymatycznych - glutationu (GSH),

tioredoksyny (Trx) oraz witaminy C i E [8,31,34,35].

Obecnie za główne układy redukujące i chroniące przed stresem oksydacyjnym

w komórkach uważane są systemy oparte na glutationie i tioredoksynie [32].

6

Rys. 3 System komórkowej regulacji redoks. Skróty: PM (ang. plasma membrane) – błona komórkowa; OMM

(ang. outer mitochondrial membrane) –zewnętrzna błona mitochondrialna; IMM (ang. inner mitochondrial

membrane) – wewnętrzna błona mitochondrialna; MPTP - por zmiany przepuszczalności mitochondrialnej [8].

Glutation jest najbardziej rozpowszechnionym małocząsteczkowym tiolem

w komórkach zwierzęcych, składającym się z trzech reszt aminokwasowych: cysteiny,

glutaminy i glicyny, posiadającym grupę tiolową (SH), która jest potencjalnym reduktorem.

W zdrowych komórkach i tkankach przeważającą część zasobów glutationu stanowi jego

forma zredukowana, pozostałe 10% to forma utleniona [25]. GSH pełni kluczową rolę

w utrzymaniu równowagi stosunków form utlenionych do zredukowanych dinukleotydu

nikotynoadeninowego (NADP/NADPH) oraz glutationu utlenionego (GSSG) do formy

zredukowanej - GSH poprzez regulację wewnątrzkomórkowego poziomu NADPH [8].

Jednakże, układ ten oprócz swoich własności przeciwutleniających i zaangażowania

w utrzymaniu komórkowej równowagi redoks, odgrywa istotną rolę w regulacji śmierci

komórkowej w wyniku zubożenia GSH [36]. W wyniku nadmiernej produkcji ROS, na

przykład indukowanej chemioterapeutykami i metalami, a w konsekwencji nagromadzenia

wolnych rodników dochodzi do obniżenia poziomu zredukowanego glutationu oraz zmiany

stosunku form GSH/GSSG w stronę form utlenionych. W związku z następującym przejściem

dochodzi do zwiększonej wrażliwości komórek na stres oksydacyjny, co w konsekwencji

prowadzi do wyzwolenia apoptozy [37–39]. Interesującym faktem, jest udział GSH

7

w procesie oporności na leki. Zjawisko to jest związane ze wzrostem poziomu GSH, a także

aktywności S-transferazy glutationu (GST) i ligazy γ-glutamylocysteiny (GLC) [40]. Bowiem

podwyższona ekspresja GST, w połączeniu z wysokimi poziomami GSH, może zwiększyć

szybkość sprzęgania i detoksykacji chemioterapeutyków, zmniejszając ich efektywność

[10,35].

Z kolei tioredoksyna jest białkiem o masie cząsteczkowej 12kDa, które zawiera 5 reszt

cysteiny. Cząsteczki Trx mogą katalizować odwracalną redukcję wiązań disiarczkowych

białek powstałych w wyniku stresu oksydacyjnego, po czym same mogą ulegać utlenieniu

w wyniku redukcji wiązań. Z Trx współdziała reduktaza tioredoksyny, która redukuje formy

utlenione Trx wykorzystując NADPH jako donor elektronów [41]. Ponadto podobnie jak

GSH, układ Trx reguluje wiele innych procesów biologicznych. Układ Trx współpracuje nie

tylko z reduktazą glutationu (Grx) przy redukcji mostków disiarczkowych białek, ale również

dostarcza elektrony dla reduktazy rybonukleotydowej (RR) [36]. Enzym ten, katalizuje

reakcje redukcji rybonukleotydów do odpowiadających im deoksyrybonukleotydów (dNTP)

niezbędnych składników DNA [42]. Zatem blokowanie aktywności RR może hamować

syntezę i naprawę DNA, co w konsekwencji może prowadzić do aktywacji apoptozy.

Ponadto, dalszy rozwój badań nad wpływem Trx i Grx w regulacji aktywności RR może

przyczyniać się do projektowania i rozwoju nowych inhibitorów RR, które mogą

charakteryzować się złożonym mechanizmem działania, opierającym się na zatrzymaniu

syntezy DNA, a także indukcji stresu oksydacyjnego [43].

3. Stres oksydacyjny w terapiach przeciwnowotworowych

Stres oksydacyjny jest definiowany jako zaburzenie równowagi pomiędzy wytwarzaniem

reaktywnych form tlenu, a systemem ich eliminacji poprzez mechanizmy obronne komórki

[44]. Wzmożona produkcja i akumulacja ROS w wyniku działania czynników zewnętrznych,

może indukować odpowiedź komórkową. W konsekwencji dochodzi do zmiany ekspresji

wielu genów, zatrzymania cyklu komórkowego, aktywacji czynników transkrypcyjnych, a w

ostateczności do wyzwolenia śmierci komórkowej [45]. Zwiększony stres oksydacyjny

odgrywa kluczową rolę w różnych stanach patologicznych, szczególnie w chorobach

neurodegeneracyjnych, nowotworowych oraz starzeniu [34].

Poprawa aktywności terapeutycznej i selektywności jest głównym celem rozwoju

strategii przeciwnowotworowych. Wykorzystanie i zastosowanie terapii opartych na

wywołaniu stresu oksydacyjnego, jest obiecującym podejściem ze względu na różnice

genetyczne między komórkami normalnymi, a nowotworowymi [46]. Komórki nowotworowe

charakteryzują się podwyższonym podstawowym poziomem ROS ze względu na zmiany

aktywności metabolicznej, a przede wszystkim wzmożoną glikolizą tlenową (efekt Warburga)

[9]. Tym samym, znajdując się w stanie stałego stresu oksydacyjnego posiadają

zmodyfikowany system obrony antyoksydacyjnej, który pozwala zaadaptować się do tych

warunków i uniknąć negatywnych skutków oddziaływania ROS (Rys. 4) [46,47]. Wysoki

poziom reaktywnych form tlenu w komórkach nowotworowych może wywołać dwojaki efekt

8

[41,48]. Z jednej strony może wpływać na progresję cyklu komórkowego, wzmożoną

proliferację i indukcję dalszych zmian prowadzących do transformacji komórek. Z drugiej

strony, może powodować zmiany wrażliwości komórek na czynniki zewnętrzne, takie jak

związki cytotoksyczne i kompleksy metali, w związku z tym, że podczas długotrwałego stresu

oksydacyjnego następuje zużycie mechanizmów adaptacyjnych [5,9,46]. Co więcej,

zastosowanie chemioterapeutyków charakteryzujących się zwiększonym generowaniem ROS,

a nawet hamowaniem wydajności systemu antyoksydacyjnego prowadzi do przekroczenia

poziomu granicznego, powyżej którego dochodzi do aktywacji szlaków sygnałowych

związanych ze stresem oksydacyjnym. Ich uruchomienie w ostateczności kieruje komórki na

szlak programowanej śmierci [9,46].

Rys. 4 Podstawy strategii wykorzystującej stres oksydacyjny w terapiach przeciwnowotworowych [9,46].

Zgodnie z danymi literaturowymi, w odpowiedzi na wytwarzanie ROS i indukcję

stresu oksydacyjnego aktywowanych jest wiele szlaków sygnałowych. Najważniejszym

z nich jest proapoptotyczna ścieżka sygnalizacyjna zależna od kinaz. Aktywacja kaskady

sygnałowej związanej z kinazami białkowymi ma kluczowe znaczenie w wykryciu stresu

oksydacyjnego, a następnie uruchomieniu procesu transdukcji sygnałów, inicjujących reakcję

komórkową. Kluczowe regulatory, które są aktywowane przez ROS obejmują kinazy

białkowe aktywowane mitogenami (MAPK), kinazę 1 sygnalizującą apoptozę (ASK1), p38

i kinazy JNK [27]. Aktywowane kinazy przeważnie indukują apoptozę poprzez mechanizmy,

które zachodzą w mitochondriach i związane są z uwolnieniem cytochromu C, a następnie

aktywację kaspaz -3, -7 i -9 [49]. Alternatywnie, z mitochondriów do cytozolu mogą być

uwalniane inne czynniki takie jak, czynnik wywołujący apoptozę – AIF i endonukleaza -

Endo G, które wywołują apoptozę niezależnie od aktywacji kaskady kaspaz [50]. Białka

uwolnione do cytozolu ulegają translokacji do jądra komórkowego, gdzie zaangażowane są

9

w procesy fragmentacji DNA (duże fragmenty - 50 tysięcy par zasad) i kondensacji

chromatyny [51].

4. Rola jonów żelaza i miedzi w utrzymaniu homeostazy komórkowej

Metale przejściowe, takie jak żelazo i miedź odgrywają kluczową rolę w regulacji

komórkowego metabolizmu. Żelazo jest niezbędne do prawidłowego przebiegu procesów

wzrostu i proliferacji komórkowej, bowiem zaangażowane jest w szereg istotnych procesów,

takich jak oddychanie komórkowe, transport tlenu, syntezę hemu i DNA oraz produkcję

energii – ATP [52]. W układach biologicznych żelazo może występować na dwóch stopniach

utleniania – Fe2+ i Fe3+. Dzięki temu posiada zdolność do przyjmowania i oddawania

elektronów, co warunkuje jego dużą reaktywność, a zarazem tłumaczy funkcje jako kofaktora

dla wielu enzymów redoks [53]. Istotnym faktem jest również możliwość tworzenia z tym

metalem, redoks-aktywnych kompleksów, które mogą generować reaktywne formy tlenu, co

w konsekwencji przyczynia się do powstawania stresu oksydacyjnego [54][55].

Zaburzenie homeostazy żelaza w komórce wywołuje wiele efektów, między innymi

zatrzymanie cyklu komórkowego czy hamowanie aktywności enzymu RR. Enzym ten składa

się z dwóch podjednostek białkowych - R1 i R2, przy czym aktywność katalityczną RR

warunkuje podjednostka R2, która jest zależna od jonów Fe2+ [42]. Ponadto, wiązanie żelaza

występującego w puli labilnego żelaza (LIP, ang. labile iron pool), pozbawia komórki

składnika niezbędnego do proliferacji. Jest to szczególnie ważne w przypadku komórek

nowotworowych, które w wyniku szybkiego wzrostu i namnażania, wykazują zwiększone

zapotrzebowanie na ten pierwiastek [56]. Komórki nowotworowe są też bardziej wrażliwe na

zmiany poziomu żelaza, realizując zwiększoną podaż pierwiastka poprzez wysoką ekspresję

transferyny (TfR), a także większą liczbę receptorów transferyny na powierzchni komórek

[57][58].

Miedź natomiast, odgrywa kluczową rolę przy detoksykacji reaktywnych form tlenu

przez dysmutazę ponadtlenkową [59]. W układach biologicznych miedź, podobnie jak żelazo,

może występować na dwóch stopniach utlenienia – Cu+ i Cu2+ [36,59]. Nadmiar miedzi może

sprzyjać uszkodzeniu molekuł i struktur komórkowych, głównie przez powstawanie

anionorodnika ponadtlenkowego. Zgodnie z danymi literaturowymi, pierwiastek ten może

wywoływać stres oksydacyjny na podstawie dwóch mechanizmów [60]. Pierwszy z nich

polega na reakcji Fentona, a drugi na redukcji puli komórkowego glutationu [60,61]. Bowiem

tiol ten może hamować aktywność katalityczną miedzi poprzez jej chelatację, utrzymując ją

w stanie stabilnym, wykluczającym udział w reakcjach redoks [60].

5. Chelatory metali w terapiach przeciwnowotworowych

Rozwój badań nad chelatorami żelaza jako środkami terapeutycznymi dotychczas skupiał się

głównie na ich zastosowaniu w leczeniu zaburzeń gospodarki żelazem. Jednakże związki te,

10

ze względu na swoje interesujące właściwości mogą być niezwykle skutecznymi

chemioterapeutykami w leczeniu chorób nowotworowych [62,63]. Związki te posiadają

zdolność do wiązania i wychwytywania jonów metali z komórki zaburzając jej metabolizm

i prowadząc do zatrzymania procesów proliferacji i wzrostu guza. Z drugiej strony,

kompleksy tworzące się z żelazem, również mogą brać udział w reakcjach redoks. Tym

samym warunkują właściwości cytotoksyczne i wywołanie stresu oksydacyjnego, który

prowadzi do uszkodzeń struktur komórkowych i śmierci komórek [55,62]. Dla wystąpienia

takiej aktywności, w strukturze chelatorów szczególnie istotne jest występowanie miękkich

atomów donorowych, takich jak azot czy siarka, które pełnią kluczową rolę w tworzeniu

redoks-aktywnych kompleksów [64]. W przeciwieństwie do chelatorów, które w swojej

strukturze posiadają twarde atomy, jak tlen, który gwarantuje zwiększenie powinowactwa do

żelaza, jednak tym samym zmniejszenie ich aktywności biologicznej [64,65].

Jednym z najważniejszych środków chelatujących jony metali jest

8-hydroksychinolina (8-HQ). Fragment ten jest również najczęściej występującym

heterocyklicznym farmakoforem, który stanowi doskonałe rusztowanie dla związków

o szerokim spektrum działania i zastosowań farmaceutycznych [15,66]. 8-HQ z powodzeniem

może być wykorzystywana do projektowania chemioterapeutyków wykorzystywanych

w leczeniu zakażeń grzybiczych, pasożytniczych, a także chorób neurodegeneracyjnych

i nowotworowych [15]. Dane literaturowe wskazują na kilka możliwych mechanizmów

działania 8-HQ w komórkach nowotworowych. Związki oparte o fragment 8-HQ mogą

oddziaływać z tiolami i białkami, wywołując zmiany ekspresji różnych genów związanych ze

stresem oksydacyjnym, indukując odpowiedź cytotoksyczną [67]. Ponadto, 8-HQ podobnie

jak wiele związków aromatycznych może interkalować pomiędzy zasady DNA, co powoduje

zmiany konformacyjne, które ostatecznie prowadzą do pęknięć nici DNA [15].

Z uwagi na takie możliwości, 8-hydroksychinolina jest obecnie uznawana za

uprzywilejowany fragment molekularny (ang. privileged structure), a więc taki, który

z definicji, może wywoływać skutki biologiczne częściej niż inne struktury [68].

Projektowanie nowych leków w oparciu o koncepcję uprzywilejowanych fragmentów wydaje

się skutecznym narzędziem w poszukiwaniu nowych aktywnych bioefektorów. W Zakładzie

Chemii Organicznej Uniwersytetu Śląskiego od lat syntezowane są związki w oparciu

o fragment 8-hydroksychinoliny, należą do nich m.in. tiosemikarbazony.

Tiosemikarbazony (TSC) są klasą związków znaną od 1950 roku. Charakteryzują się

one szerokim spektrum aktywności biologicznej, włączając w to działanie przeciwwirusowe,

przeciwbakteryjne oraz przeciwnowotworowe [13]. TSC swoje doskonałe właściwości

antyproliferacyjne najprawdopodobniej zawdzięczają zdolności do chelatowania jonów metali

i generowania ROS [13]. Jednakże dokładny mechanizm ich działania nie jest jeszcze w pełni

wyjaśniony. Postulowanych jest kilka innych mechanizmów, do których należą: eliminacja

żelaza z wnętrza komórki lub blokowanie jego wychwytu z przestrzeni międzykomórkowej,

hamowanie aktywności RR oraz wywołanie nadekspresji genu Ndrg1 (ang. N-myc

downstream regulated gene 1) [69][70].

11

Dotychczas zsyntezowane pochodne tiosemikarbazonu w Zakładzie Chemii

Organicznej Uniwersytetu Śląskiego, charakteryzują się wysoką aktywnością

antyproliferacyjną wobec komórek raka jelita grubego. Wiele z nich hamuje wzrost komórek

nowotworowych w stężeniach nanomolowych (Tabela 1). Na szczególne uznanie zasługuje

pochodna ketonu dipirydylowego (MS154), która wykazuje najwyższą dotychczas opisaną

w literaturze aktywność antyproliferacyjną wobec tej linii komórkowej [64].

Tabela 1. Przykłady aktywności antyproliferacyjnej wybranych pochodnych tiosemikarbazonu wobec linii

ludzkiego raka jelita grubego (HCT116 +/+ - typ dziki) oraz komórek prawidłowych; ludzkich fibroblastów

(NHDF).

Nazwa Struktura

Aktywność IC50 [µM]

HCT116

p53+/+

NHDF

MS154

0,00081±

0,00013

0, 00173±

0,00071

MS199

0,00206±

0,00088 0,16±0,04

MS1

0,00298±

0,00018 11,07±4,31

MS168

0,00384± 0,00146

10,64±3,48

MS2

0,01069±

0,00112 10,58±4,07

MS200

0,0378± 0,00305

0,01385± 0,00003

MS181

0,0505± 0,0281

12,14± 3,58

12

Reasumując, różnorodny mechanizm działania TSC oraz wysoka aktywność czyni je

szczególnie interesującymi związkami do dalszych badań i wykorzystania w rozmaitych

terapiach przeciwnowotworowych.

Kolejną klasą związków o ciekawych właściwościach są glikokoniugaty prostych

pochodnych chinoliny. Wyniki dotychczasowych badań nad tymi związkami wskazują na ich

znaczący potencjał jako leków przeciwnowotworowych, ze względu na wykorzystanie

specyficznych cech charakteryzujących te komórki, m. in. zwiększonej ekspresji

β-glukozydaz, transporterów glukozy (GLUT), a także zwiększonego zapotrzebowania na

jony metali [71,72]. Ponadto wprowadzenie ugrupowania cukrowego ma za zadanie poprawić

biodostępność związków, a także ich parametrów farmakokinetycznych, które pozwalają na

lepsze przenikanie związków do wnętrza komórki [72]. Przykładem może być

glikokoniugacja z hydroksypirydonem, która prowadzi do powstania aktywnego proleku

przeciwko chorobie Alzheimera, który dodatkowo charakteryzuje się dobrą przenikalnością

przez barierę krew-mózg [73]. Ponadto połączenie pierścienia cukrowego z pochodną

8-hydroksychinoliny może prowadzić do otrzymania nowych wysoce specyficznych,

a zarazem selektywnych związków względem komórek nowotworowych (Rys. 5) [74].

Rys. 5 Glikokoniugaty oparte o fragment 8-hydroksychinoliny [71].

Co ciekawe, zastosowanie strategii opartych na glikokoniugacji, może skutkować

polepszeniem właściwości biologicznych związków. Przykładem może być połączenie dwóch

13

nieaktywnych fragmentów ugrupowaniem cukrowym, które prowadzi do otrzymania

związków o dobrych właściwościach przeciwnowotworowych [16]. Do pełnego zrozumienia

tych efektów konieczne są jednak dalsze intensywne badania, w tym określenie możliwych

mechanizmów działania tej klasy związków. Wyniki tych prac są kluczowe zarówno z punktu

widzenia projektowania nowych struktur, jak i poznania możliwych skutków ubocznych czy,

interakcji z innymi lekami.

14

III. Cel i zakres pracy

Celem niniejszej pracy jest poszukiwanie nowych chelatorów metali o potencjalnych

właściwościach antyproliferacyjnych. Ponadto dla aktywnych pochodnych wyjaśnienie

molekularnego mechanizmu działania. Obiektem zainteresowania są nowe pochodne

tiosemikarbazonu, a także glikokoniugaty oparte na fragmencie 8-hydroksychinoliny.

W ramach pracy zostaną przeprowadzone oznaczenia cytotoksyczności in vitro na

nowotworowych liniach komórkowych, m.in. ludzkiego raka jelita grubego, raka piersi

i glejaków. W przypadku aktywnych związków przewiduje się przeprowadzenie oznaczeń

cytotoksyczności względem komórek prawidłowych – fibroblastów, celem charakterystyki

selektywności badanych pochodnych. Ocena zaangażowania wybranych pochodnych TSC

i glikokoniugatów w indukcję stresu oksydacyjnego będzie się opierać na oznaczeniu

poziomu generowania reaktywnych form tlenu, a także wpływać na stężenie

wewnątrzkomórkowego glutationu. Ponadto dla aktywnych pochodnych przewiduje się

przeprowadzenie badań mających na celu wyjaśnienie mechanizmów działania związanych

z zatrzymaniem cyklu komórkowego oraz wywołaniem apoptozy. Określenie zmian ekspresji

wybranych genów i białek związanych z tymi szlakami sygnalizacyjnymi zostanie

przeprowadzone przy pomocy metod Real-Time PCR oraz Western Blot. Ponadto, aktywne

pochodne tiosemikarbazonu zostaną zbadane pod kątem użyteczności w terapiach

kombinowanych z innymi chemioterapeutykami, a także fotouczulaczami z grupy chloryn

w terapii fotodynamicznej (PDT).

15

IV. Badania własne

1. Tiosemikarbazony

1.1. Oznaczenia cytotoksyczności in vitro

Obiektem badań w niniejszej pracy były nowe pochodne tiosemikarbazonu zsyntezowane

przez mgr Martę Rejmund w ramach prowadzonych badań do rozprawy doktorskiej

w Zakładzie Chemii Organicznej Uniwersytetu Śląskiego. Ponadto do analizy mechanizmów

działania wymienionej klasy związków, wytypowano szereg najaktywniejszych pochodnych

tiosemikarbazonu, które zostały zsyntezowane przez dr inż. Macieja Serdę (Tabela 1)

w ramach pracy doktorskiej [75].

Oznaczenia cytotoksyczności wykonano testem MTS względem komórek raka jelita

grubego linii HCT116 typu dzikiego (HCT 116 p53+/+), a także komórek HCT116 z nokautem

genu TP53 (HCT116 p53-/-). Wybór tych linii jest uwarunkowany różnymi poziomami

ekspresji ferrytyny – białka kompleksującego jony żelaza Fe3+, zależnego od obecności białka

p53 [76]. Ponadto selektywność wybranych aktywnych pochodnych TSC badano względem

prawidłowych komórek ludzkich fibroblastów linii NHDF. Test MTS jest kalorymetryczną

metodą detekcji proliferujących komórek. Opiera się on na zdolności enzymu dehydrogenazy

mitochondrialnej do przekształcania pomarańczowej soli tetrazolowej (MTS) do formazanu.

Ilość powstającego w reakcji produktu jest oznaczana spektrofotometrycznie oraz

proporcjonalna do ilości żywych komórek. Na tej podstawie, możliwe jest wyliczenie

wartości IC50, czyli stężenia które powoduje 50% zahamowanie wzrostu populacji komórek.

Rys. 7 Reakcji przekształcenia pomarańczowej soli tetrazolowej (MTS) do barwnego formazanu.

Dotychczas w ramach niniejszej pracy przebadano 130 nowych pochodnych

tiosemikarbazonu. W poniższej tabeli 2 przedstawiono aktywność biologiczną dla wybranych

50 pochodnych. Na szczególną uwagę zasługują związki aktywne, oparte o fragmenty

chinoliny, chinoksaliny, ketonu di-2-pirydylowego, pirydyno-2-karboksyaldehydu,

3-aminopirydyno-karboksyaldehydu oraz 6-bromo-3-hydroksypirydyno-karboksyaldehydu.

Tabela 2 przedstawiają aktywność biologiczną poszczególnych grup pochodnych

tiosemikarbazonu.

16

Tabela 2. Aktywność biologiczna szeregu pochodnych TSC.

Nazwa Struktura

Aktywność IC50 [µM]

HCT116

p53+/+

HCT116

p53-/-

NHDF

MR12K

0,1068 ±

0,0427

0,0967±

0,0048

0,2128±

0,0173

MR29

21,97± 3,96 0,4258±

0,0337 >25

MR34

18,31± 0,92 5,848±

0,4505 13,06± 1,9

MR3K3

1,100 ±

0,3345

0,0650±

0,0041

0,2825±

0,0502

MR5K3

0,2816 ±

0,0542

0,0696±

0,0015

0,1144±

0,0103

MR95

0,1393 ±

0,0131

0,0663±

0,0186 12,09± 0,61

MR96

0,1876±

0,0558

0,1377±

0,0499 16,66± 5,57

MR97

0,1596 ±

0,0535

0,1541±

0,0631 14,74± 0,79

MR9K2

0,1783±

0,0151

0,2221±

0,0185 17,13± 0,76

MR4K4

1,064 ±

0,1442

0,2934±

0,0790 -

MR6K2

5,468±

1,192 6,267± 1,95 -

MR18

0,3105 ±

0,0560

0,01538±

0,0040 12,87± 0,99

MR19

0,3086±

0,0579

0,1440±

0,0183 >25

17

MR21

0,8447 ±

0,1944

0,1818±

0,0263 10,3 ± 1,074

MR31

0,4432±

0,1388

0,0185±

0,00304 12,32± 0,37

MR48

7,210 ±

1,9985

0,2292±

0,0788 >25

MR49

0,1718 ±

0,0542

0,0138±

0,0038 >25

MR50

0,3777 ±

0,1197

0,01017±

0,0031 13,28± 0,56

MR160

0,1628 ±

0,0494

0,1518 ±

0,07441 >25

MR166

1,328 ±

0,209

0,1847 ±

0,0881 >25

MR167

0,252

±0,0928

0,1277

±0,0115 >25

MR169

1,139±

0,5336

0,7461±

0,354 >25

MR170

1,457 ±

0,195

0,5294±

0,03895 >25

MR171

0,6439 ±

0,1366

1,106±

0,4404 >25

MR172

1,856 ±0,73 2,121

±0,9185 >25

MR174

0,1052

±0,0097

0,1234

±0,0612 25,23± 2,57

MR193

0,5423 ±

0,0427

0,1388 ±

0,0196 -

18

MR203

0,2266 ±

0,0147

0,4778 ±

0,0325 -

MR36

7,986±

1,724

2,598±

0,334 15,62± 0,92

MR37

4,380±

1,971

1,726±

0,6265

12,07 ±

2,834

MR38

13,16±

1,535 6,00± 0,395 21,51± 3,02

MR39

6,568± 4,56 2,973

±1,414

17,03 ±

3,755

MR45

5,298±

1,333

1,405±

0,4225 >25

MR46

19,24± 2,94 7,756±

1,568 >25

MR47

8,032±

1,227

2,253±

0,8715 19,93± 2,81

MR90

4,76± 0,78 1,92± 0,31 14,48± 0,79

MR91

4,00± 0,62 3,37± 0,60 >25

MR92

4,58± 0,45 2,26± 0,49 18,53 ± 5,2

MR93

5,38± 0,63 3,25± 0,53 >25

MR94

9,56± 1,09 3,56± 0,17 >25

MR99

>25 11,69± 3,71 >25

19

MR100

20,96± 2,95 19,35± 3,15 >25

MR104

24,79±

0,203

8,953±

4,964 >25

MR71

>25 >25 -

MR83

>25 >25 -

MR103

>25 >25 -

MR114

>25 15,83±

7,6205 -

MR121

>25 >25 -

MR130

>25 >25 -

MR122

>25 >25 -

Analiza wyników dla poszczególnych grup TSC, ujawniła, że pochodne zbudowane na

fragmencie chinoliny czy ketonów pirydynowych, charakteryzują się wysoką aktywnością

biologiczną. Spośród badanych pochodnych tiosemikarbazonu najbardziej aktywnym

związkiem okazał się MR12K, którego struktura oparta jest na fragmencie chinoliny.

Wyliczona wartość IC50, to jest wartość przy jakiej następuje 50% zahamowanie wzrostu

komórek HCT116 p53+/+ wynosiła 0,10 μM. Podobnie, kolejne dwie pochodne MR95 oraz

MR96 oparte na fragmencie chinoliny wraz z grupą trifluorometylową dołączoną do

pierścienia fenylowego charakteryzowały się bardzo dobrą aktywnością antyproliferacyjną

wobec komórek HCT116 p53+/+. Wyliczone wartości IC50 wynosiły odpowiednio 0,13 μM

i 0,18 μM. Ponadto, dla obu pochodnych obserwowano swoistość względem linii

HCT116 p53-/- oraz wysoką selektywność wobec komórek rakowych. Szczególnie, dla

analogu MR95 aktywność wobec linii z unieczynnionym genem TP53 była 2-krotnie wyższa

i wynosiła 0,06 μM. Odmienną sytuację obserwowano w przypadku pochodnej MR12K.

Istotny na to wpływ może mieć podstawienie pierścienia fenylowego atomem chloru, co

prowadzi do utraty swoistości wobec linii komórkowej z nokautem genu TP53, a także

20

skutkuje brakiem toksyczności wobec komórek prawidłowych – fibroblastów. Dodatkowo,

w przypadku analogu MR97 zastąpienie grupy trifluorometylowej poprzez podstawienie

pierścienia fenylowego dwoma atomami chloru skutkowało brakiem swoistości wobec

komórek HCT116 p53-/-.

Z kolei, podstawnik benzonitrylowy lub 4-metylo-tiomorfolinowy wyraźnie zmniejsza

aktywność wobec komórek HCT116 p53+/+. Szczególnie, ciekawym związkiem wydaje się

MR29, który wykazuje słabą aktywność wobec linii HCT116 typu dzikiego, wartość IC50

wynosiła 22 μM. Ponadto, pochodna ta nie wykazuje aktywności względem prawidłowych

fibroblastów. Jednakże, wobec linii z unieczynnionym białkiem p53, aktywność MR29 była

58-krotnie wyższa i wynosiła 0,43 μM. Odmienną sytuację obserwowano w grupie

pochodnych TSC opartych na ketonie di-2-pirydylowym, pochodna MR31 z dołączonym

fragmentem benzonitrylu charakteryzowała się dobrą aktywnością antyproliferacyjną wobec

komórek nowotworowych linii HCT116 p53+/+, a wartość IC50 wynosiła 0,4 μM. Ponadto,

pochodna ta wobec linii HCT116 p53-/- wykazywała wysoką swoistość, wartość IC50 wynosiła

0,02 μM. Natomiast wśród pochodnych, których struktura oparta jest na fragmencie ketonu

di-2-pirydylowego, najbardziej aktywnym analogiem okazał się MR18, zawierający

dołączone dwa atomy chloru do pierścienia fenylowego. Potwierdziło to wcześniejsze

obserwacje, iż obecność atomów halogenu powoduje zwiększenie aktywności biologicznej.

Związek ten wykazuje interesujące właściwości względem komórek zmutowanych, bowiem

wartość IC50 dla linii HCT116 p53+/+ wynosiła 0,31 μM, natomiast dla linii z nieaktywnym

białkiem p53 aktywność była 20-krotnie wyższa.

Z kolei, dla dużej grupy pochodnych opartych na fragmencie 3-aminopirydyno-

karboksyaldehydu, najbardziej aktywnym związkiem okazał się MR174, który w swojej

strukturze zawierał grupę 3-fluorometylową. Co ciekawe, drugim najaktywniejszym

związkiem, okazał się MR203, który do pierścienia piperazynowego miał dołączony

difenyloetan. Dodatkowo pochodna ta nie wykazała swoistości wobec linii HCT116 p53-/-.

Wśród grupy pochodnych opartych o pirydyno-2-karboksyaldehyd, związkami

o interesujących właściwościach okazały się MR49 oraz MR50. Pierwszy z nich, zawierał

atom fluoru, który warunkował wysoką aktywność biologiczną wobec komórek HCT116

p53+/+, a także wysoką swoistość (aktywność 13-krotnie wyższa) wobec komórek

zmutowanych. Pochodna MR49 charakteryzowała się także brakiem toksyczności wobec

komórek prawidłowych. Natomiast pochodna MR50 z dołączoną grupą nitrową do

pierścienia fenolowego wykazywała wyższą swoistość (aktywność 37-krotnie wyższa) od

MR49.

Dalsza analiza poszczególnych grup pochodnych TSC, ujawniła, że wprowadzenie do

pierścienia chinolinowego atomu azotu w pozycji 4 skutkuje spadkiem aktywności

biologicznej (np. MR4K4 oraz MR6K2). Podobnie, dołączenie atomów bromu lub grupy

hydroksylowej do pierścienia pirydylowego powoduje znaczne zmniejszenie aktywności.

Przykładem mogą być pochodne posiadające w swojej strukturze atomy halogenów lub grupę

3-fluorometylową, jak MR90 i MR93, wykazujące aktywność rzędu 5 μM.

21

Ponadto przebadano szereg pochodnych TSC opartych na fragmentach: fenolu,

2-fluorobenzaldehydu, 3,5-difluorobenzaldehydu oraz 3,6-difluorobenzaldehydu. Jednakże,

żadna z powyższych pochodnych nie wykazywała aktywności biologicznej wobec komórek

nowotworowych raka jelita grubego.

Analiza selektywności przebadanych pochodnych TSC wykazała, że większość

związków, za wyjątkiem MR12K, MR3K3, MR5K3 wykazuje słabą bądź umiarkowaną

aktywność wobec linii prawidłowych komórek typu fibroblastów.

Podsumowując, pochodne TSC zawierające grupę trifluorometylową dołączoną do

pierścienia fenylowego charakteryzują się najwyższą aktywnością biologiczną wobec

komórek nowotworowych HCT116. Zgodnie z danymi literaturowymi, zależność ta może być

podyktowana obecnością atomu fluoru, który ulepszając parametry fizykochemiczne związku,

zwiększa aktywność antyproliferacyjną, a także powinowactwo do docelowych cząsteczek.

Fluor może także wpływać na przepuszczalność błony komórkowej [77]. Dodatkowo, związki

zawierające atomy halogenowe w pierścieniu fenylowym charakteryzują się większą

aktywnością antyproliferacyjną wobec komórek nowotworowych z nokautem genu TP53.

Możliwym wyjaśnieniem tego zjawiska, może być indukcja kaskady kaspaz i śmierci

komórkowej niezależnej od białka p53, tak jak w przypadku styrylochinolin [78]

1.2. Generowanie reaktywnych form tlenu i wpływ na poziom glutationu

W celu zbadania możliwości generowania ROS przez pochodne tiosemikarbazonu

przeprowadzono test fluorescencyjny. W teście wykorzystano odczynnik CellROX Green,

który pod wpływem reaktywnych form tlenu utlenia się do fotostabilnego produktu,

emitującego jasno-zieloną fluorescencję. Maksimum absorpcji barwnika wynosi 485 nm,

podczas gdy emisja jest obserwowana przy długości fali 520 nm. Test ten został

przeprowadzony dla najbardziej aktywnych pochodnych zsyntezowanych przez

dr inż. M. Serdę (Tabela 1.). Obserwacja mikroskopowa, potwierdziła znaczące generowanie

ilości ROS po traktowaniu aktywnymi pochodnymi, o czym świadczy intensywna zielona

fluorescencja (Fig. 1). Obserwowany sygnał punktowy skupiał się przede wszystkim wokół

mitochondriów żywych komórek. Co więcej, dla grupy kontrolnej - komórek nietraktowanych

TSC obserwowano niewielki sygnał fluorescencyjny wynikający z autofluorescencji struktur

komórkowych, a nie produkcji ROS.

22

Fig. 1 Powstawanie ROS w komórkach HCT116 p53+/+ po 24h inkubacji z TSC oraz 15 minutowej inkubacji

z nadtlenkiem wodoru (kontrola pozytywna). Negatywną kontrolę stanowiły komórki nietraktowane.

Skala = 50μm.

Dodatkowo, przeprowadzono eksperymenty opierające się na ilościowej analizie

poziomu generowanych reaktywnych form tlenu oraz glutationu w czasie pomiaru

kinetycznego. Określenie poziomu stężenia zredukowanego GSH było możliwe, dzięki

wykorzystaniu luminescencyjnego testu GSH-Glo Glutathione Assay. Pojawienie się sygnału

luminescencyjnego odpowiadającego ilości GSH w próbce było wynikiem sprzężonej reakcji

konwersji pochodnych lucyferyny do lucyferyny, katalizowanej przez S-transferazy

glutationu (GST), gdzie produkt był utleniany przez tlen cząsteczkowy oraz enzym lucyferazę

(Rys. 7). Powyższe analizy prowadzono w czytniku płytek wielodołkowych.

Rys. 7 Reakcja konwersji pochodnych lucyferyny do lucyferyny katalizowanej przez S-transferazy glutationu.

W ten sposób możliwe było określenie wpływu ROS na poziom jednego z głównych

przeciwutleniaczy w komórce. Wyniki dla wybranych pochodnych o kodowaniu MS

przedstawiono na wykresach 1 oraz 2. Związkiem referencyjnym w tych oznaczeniach była

doksorubicyna (DOX), która zgodnie z danymi literaturowymi może indukować apoptozę

poprzez generowanie reaktywnych form tlenu oraz oddziaływanie z endogennymi

przeciwutleniaczami [79]. Szczegółowa analiza danych wykazała, iż pierwszy silny wzrost

ilości produkcji ROS odnotowano w 6h od podania badanych pochodnych tiosemikarbazonu

LUMINESCENCJA

23

oraz związku referencyjnego. Podobnie, zwiększenie stężenia ilości ROS odnotowano w 24h

od aplikacji MS168, MS181, MS200, DOX oraz w 24h i 30h dla MS154 (Wykres 1).

Wykres 1. Wpływ TSC i DOX na poziom generowanych reaktywnych form tlenu w komórkach HCT116 p53+/+.

Dane znormalizowano wobec nietraktowanych komórek (kontrola).

Zmniejszenie poziomu zredukowanego glutationu obserwowano już po 3 godzinach

od podania badanych chelatorów. Wyniki, te mogą sugerować, iż tiosemikarbazony mogą

wpływać na spadek stężenia GSH niezależnie od poziomu stężenia reaktywnych form tlenu.

Wyniki takie zgodne są z danymi literaturowymi wskazującymi że zubożenie glutationu może

prowadzić do indukcji apoptozy komórek nowotworowych, niezależnie od generowania ROS

[80]. Z drugiej strony, największy spadek ilości GSH obserwowano po 9h, 24h i 30h

inkubacji od zaaplikowania pochodnych MS154 i MS168 oraz po 9 godzinnej inkubacji

z MS200 (Wykres 2). Można, więc wnioskować iż, zjawisko to, może być dodatkowym

wynikiem oddziaływania generowanych ROS z glutationem. W związku z tym, postępujący

24

wypływ glutationu z komórki oraz nasilenie stresu oksydacyjnego, może prowadzić do

indukcji wielu uszkodzeń, w tym mitochondrium, a w ostateczności całej komórki.

Wykres 2. Wpływ TSC i DOX na poziom wewnątrzkomórkowego GSH w komórkach HCT116 p53+/+. Dane

znormalizowano wobec nietraktowanych komórek (kontrola).

1.3. Peroksydacja lipidów

Jednymi z uszkodzeń komórkowych wywołanych działaniem ROS są produkty peroksydacji

lipidów. Utworzone wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFA) po ataku ROS, mogą

prowadzić do uszkodzeń strukturalnych i funkcjonalnych błon komórkowych, w tym

mitochondrialnych [81]. W celu zbadania wpływu TSC na procesy utleniania

przeprowadzono pomiary intensywności powstającego produktu reakcji –

malonylodialdehydu (MDA) z kwasem 2-tiobarbiturowym (TBARS). Analiza wyników

25

wykazała, że pochodne TSC mogą inicjować proces peroksydacji lipidów błonowych

(Wykres 3). Szczególnie, w przypadku pochodnej MS154 widoczny jest ok. 1,5 krotny wzrost

malonylodialdehydu w porównaniu z komórkami nietraktowanymi. Co ciekawe, powstające

addukty MDA mogą odgrywać dalszą rolę w progresji śmierci komórkowej. Albowiem

malonylodialdehyd może wchodzić w reakcje z białkami wytwarzając pochodne karbonylowe

białek, a także z DNA prowadząc do wielu uszkodzeń helisy, a w konsekwencji do

hamowania procesów replikacji oraz transkrypcji DNA [81].

Wykres 3. Wpływ tiosemikarbazonów na proces peroksydacji lipidów w komórkach HCT116 p53+/+. Dane

znormalizowano wobec nietraktowanych komórek (kontrola).

2. Glikokoniugaty

2.1. Cytotoksyczność in vitro

W niniejszej pracy badania przeprowadzono także na szeregu glikokoniugatów, które zostały

zaprojektowane i zsyntezowane w ramach współpracy z zespołem dr Gabrieli Pastuch-

Gawołek z Politechniki Śląskiej w Gliwicach. Główną ideą glikokoniugacji było połączenie

pochodnych chinoliny o dobrych parametrach do chelatowania metali, ale słabej

farmakokinetyce z fragmentem cukrowym: D-glukozy lub D-galaktozy. Takie połączenia

stosowane są często dla poprawy biodostępności substancji ksenobiotycznych,

w szczególności w projektowaniu proleków. W rezultacie połączenie dwóch nieaktywnych

fragmentów, doprowadziło do otrzymania związków o umiarkowanej lub dobrej aktywności

antyproliferacyjnej. Do oznaczeń cytotoksyczności wybrano komórki raka jelita grubego, ze

względu na podwyższoną ekspresję transporterów glukozy – GLUT [82]. Podobnie, jak

w przypadku poprzedniej klasy związków, w celu określenia aktywności biologicznej

glikokoniugatów przeprowadzono testy cytotoksyczności - MTS na liniach komórkowych

HCT116 p53+/+ (typ dziki) oraz HCT116 p53-/- z nokautem genu TP53. Ponadto selektywność

wybranych pochodnych badano na liniach prawidłowych komórek ludzkich fibroblastów –

NHDF. Tabela 3 przedstawia aktywność biologiczną zsyntezowanych nowych pochodnych

GC.

26

Tabela 3. Aktywność biologiczna substratów (1-13) i szeregu glikokoniugatów (17-25). *Najwyższe

możliwe zbadane stężenie.

Nazwa Struktura

Aktywność IC50 [µM]

HCT116

p53+/+

HCT116

p53-/-

NHDF

1

N

OH

HOOC

>750* >750* -

2 N

OH

HOOC

>750* >750* -

3

>450* >300* -

6

>750* >500* -

10

>150* >150* -

11

>150* >150* -

12

>150* >150* -

13

>150* >150* -

14 O

AcOAcO

OAc

OAc

N CH3

HN

OOH

13.591.43 15.092.92 23.61±0.68

15

11.591.27 11.681.61 18.59±0.28

16

>750* >750* -

17 O

AcOAcO

OAc

OAc

N CH3

S

OOH

>25 >25 -

18 O

AcO

AcOOAc

OAc

N CH3

S

OOH

>25 >25 -

19

>25 >25 -

27

20

>25 >25 -

21

>25 >25 -

22

12.044.14 10.651.90 12.39±0.61

23 O

AcO

AcOOAc

S

OAc

N CH3

HN

OOH

12.594.03 8.940.89 13.27±1.09

24 O

AcO

AcOOAc

S

OAc

N N CH3

HN

OOH

7.861.04 7.051.19 9.32±0.74

25

4.880.98 4.420.67 11.48±0.14

Zarówno substraty pochodnych kwasu hydroksy-metylochinolino-karboksylowego,

fragmenty cukrowe oraz pochodne tetra-O-acetylo-D-glukozy okazały się nieaktywne wobec

komórek nowotworowych. Podobny efekt, obserwowano dla związków zawierających

fragment tetra-O-acetylo-D-glukozy. Jednakże, wyjątek stanowiły amidy 14 i 15, które

wykazywały umiarkowaną aktywnością biologiczną. Ponadto, wprowadzenie łącznika

aromatycznego – grupy fenylowej lub pirydynowej pomiędzy fragment cukrowy, a pochodną

chinoliny prowadziło do znacznego zwiększenia aktywności. Najbardziej aktywnymi

glikokoniugatami z całej przebadanej grupy okazały się pochodne 24 i 25, które w swojej

strukturze zawierały łącznik pirydynowy. Można, więc wnioskować iż, zastosowanie łącznika

pirydynowego w stosunku do fenylowego, ma istotny wpływ na zwiększenie aktywności

antyproliferacyjnej. Co więcej, nie stwierdzono różnic aktywności pochodnych, pomiędzy

komórkami linii HCT116 p53+/+ i p53-/-, co sugeruje, że mechanizm śmierci wywołany

działaniem tych związków nie koncentruje się na szlaku apoptotycznym zależnym od białka

p53. W związku z tym, w celu wyjaśnienia możliwego mechanizmu działania

przeprowadzono dalsze analizy dla aktywnych glikokoniugatów.

2.2. Wpływ jonów metali na proliferację komórek

Ze względu na zdolność 8-hydroksychinoliny do chelatowania jonów metali, przeprowadzono

analizy określające wpływ jonów miedzi oraz cynku na proliferację komórek linii HCT116

p53+/+ i p53-/-. Oznaczenie wykonano przy pomocy testu MTS po traktowaniu komórek

aktywnymi pochodnymi w stężeniu IC50, dodatkowo dodając do pożywki sole CuCl2 lub

ZnCl2. Otrzymane wyniki, dowodzą, iż badane związki mogą tworzyć kompleksy

28

z aktywnymi metalami. Dla wszystkich pochodnych zaobserwowano wzrost procentu

przeżywalności komórek, w obecności jonów cynku, w przeciwieństwie do jonów miedzi,

które zwiększały toksyczny efekt związków (Wykres 4).

Wykres 4. Wpływ jonów metali na proliferację komórkową po traktowaniu aktywnymi glikokoniugatami.

Można, więc wnioskować, iż dodanie jonów cynku może powodować powstawanie

nieaktywnych kompleksów z glikokoniugatami. Dodatkowym wyjaśnieniem, może być fakt,

iż cynk należy do grupy metali redoks nieaktywnych. Podobną zależność po dodaniu Zn lub

Cu, zaobserwowała grupa badaczy pod kierunkiem WQ Dinga dla innych prostych

pochodnych chinoliny [83]. Z drugiej strony, dodanie miedzi powinno skutkować

utworzeniem redoks-aktywnych kompleksów. Porównując dane dla wszystkich aktywnych

glikokoniugatów, dla pochodnej 14 zanotowano największy spadek przeżywalności (50%)

komórek dla linii HCT116 p53+/+. Podobnie, dla pochodnej 25 odnotowano 75% zmniejszenie

proliferacji komórek nowotworowych linii HCT116 p53-/-. Zmiany te, dają się wyjaśnić

wysokim powinowactwem pochodnych 8-hydroksychinoliny oraz ich glikokoniugatów do

jonów miedzi i tworzeniem aktywnych kompleksów z tymi jonami. W celu potwierdzenia tej

hipotezy przeprowadzono pomiary spektrofotometryczne procesu kompleksowania miedzi dla

aktywnych związków, uzyskując krzywe izozbestyczne przedstawione na wykresie 5.

Absorbancję związku 14 mierzono w obecności jonów Cu w stosunkach 1:1; 2:1; 3:1; 4:1; 5:1

w porównaniu do czystego związku. Analiza uzyskanych widm wykazuje zmiany

intensywności absorpcji oraz utworzenie charakterystycznych punktów izozbestycznych. Dla

kompleksu miedzi (II) z pochodną 14 obserwowano maksimum absorpcji przy 276 nm oraz

trzy punkty izozbestyczne, przy 268, 288 oraz 312 nm.

29

Wykres 5. Krzywe izozbestyczne procesu kompleksowania pochodnej 14 za pomocą CuCl2.

2.3. Generowanie reaktywnych form tlenu przez glikokoniugaty

Jak wspomniano we wstępie, związki chelatujące jony metali, mogą tworzyć z nimi aktywne

kompleksy, tworzące w reakcjach Fentona i Habera-Weissa, toksyczne reaktywne formy

tlenu. W celu zbadania możliwości generowania ROS przez glikokoniugaty przeprowadzono

fluorescencyjny test opierający się na ilościowo-jakościowej analizie. Obserwacja

mikroskopowa, potwierdziła znaczne generowanie ilości ROS po traktowaniu aktywnymi

pochodnymi, o czym świadczy intensywnie emitowana zielona fluorescencja (Fig. 2).

Ponadto, dla pochodnych 14, 15 i 25 obserwowano większą intensywność świecenia, niż

w przypadku pochodnych 22, 23, 24 a więc trend zgodny ze względną aktywnością

antyproliferacyjną badanych związków. Dokładna analiza zebranych obrazów, pozwala

stwierdzić, iż silny sygnał fluorescencyjny skupia się wokół wybranych organelli,

prawdopodobnie jąder i mitochondriów. Można, więc wnioskować iż, wytwarzanie

reaktywnych form tlenu następuje głównie w mitochondriach, co może korelować ze

zmianami poziomu zredukowanego glutationu w komórkach, a także postępującym

upośledzeniem funkcji mitochondriów.

Fig. 2 Powstawanie ROS w komórkach HCT116 p53+/+ po 24h inkubacji z glikokoniugatami oraz 15 minutowej

inkubacji z nadtlenkiem wodoru (kontrola pozytywna). Negatywną kontrolę stanowiły komórki nietraktowane.

Skala = 50μm.

30

2.4. Wpływ reaktywnych form tlenu na glutation oraz indukcję apoptozy

W celu określenia wpływu ROS na glutation, przeprowadzono dodatkowo eksperymenty

opierające się na kinetycznym pomiarze ilościowym generowanych rodników. Wyniki dla

wszystkich pochodnych GC przedstawiono na wykresie 6. Analiza danych, potwierdziła

produkcję ROS przez glikokoniugaty 14, 15 i 25. Najwyższy wzrost ROS odnotowano w 6h

i 12h od aplikacji pochodnych 14 i 15 oraz w 12h dla pochodnej 25. Wyniki te korelują

z najwyższym spadkiem poziomu zredukowanego glutationu (GSH) w komórkach HCT116

p53+/+ po 12h traktowaniu powyższymi pochodnymi. Otrzymana zależność wskazuje na

wystąpienie odpowiedzi komórkowej na powstały stres oksydacyjny. Ponadto, dla

pozostałych badanych pochodnych nie obserwowano znaczących różnic w generowaniu

reaktywnych form tlenu. Z drugiej strony, pomiary zredukowanego GSH wykazały spadki

poziomu tego tripeptydu, po 12 godzinnej inkubacji z badanymi związkami. Uzyskane wyniki

dla pochodnych GC wskazują, że zmiany poziomu GSH mogą być wywołane niezależnie od

generowania reaktywnych form tlenu, tak jak w przypadku TSC. Ponadto, GSH może

indukować apoptozę poprzez aktywację zewnętrznych lub wewnętrznych ścieżek

sygnalizacyjnych, w których rolę wykonawczą pełni kaspaza -3 [84].

Wykres 6. Wpływ glikokoniugatów na poziom ROS i wewnątrzkomórkowego GSH w komórkach

HCT116 p53+/+. Dane znormalizowano wobec nietraktowanych komórek (kontrola).

31

W celu zbadania, wpływu glikokoniugatów na stopień aktywacji ścieżki apoptotycznej

na drodze kaspazy 3/7 w komórkach HCT116 p53+/+ i p53-/- przeprowadzono

luminescencyjny test. Na podstawie otrzymanych wyników (Wykres 7), można wnioskować,

że kaspazy są aktywowane w komórkach HCT116 p53+/+ po inkubacji z pochodnymi 14 i 23,

a także przez pochodną 15 w komórkach obu linii nowotworowych. Otrzymane zależności

pozwalają przypuszczać, iż glikokoniugaty indukują apoptozę na drodze zależnej i niezależnej

od kaspaz. Podobna zależność, może być obserwowana dla kompleksów 8-HQ z miedzią,

które mogą hamować aktywność kaspazy -3 w retikulum endoplazmatycznym, tym samym

wymuszając przejście na drogę niezależną od aktywności kaspaz [85,86].

Wykres 7. Aktywność kaspazy 3/7 w komórkach HCT116 p53+/+ i p53-/- po 30h i 48h godzinnej inkubacji

z aktywnymi glikokoniugatami. Dane znormalizowano wobec nietraktowanych komórek (kontrola).

2.5. Interkalacja DNA

Z doniesień literaturowych wynika, że kompleksy metali przejściowych, a także pochodne

chinoliny posiadają zdolność do interkalacji DNA, a tym samym powodują uszkodzenie

kwasów nukleinowych. Ponadto, zjawisko to może być związane z mechanizmem działania

niezależnym od białka p53, jak wykazano dla styrylochinolin [78]. W celu określenia

zdolności GC do interkalacji DNA przeprowadzono pomiary spektrofotometryczne,

w obecności standardowego DNA pochodzącego z grasicy cielęcej (ang. calf-thymus DNA;

CT-DNA), a także samych pochodnych w buforze PBS. Analizując zarejestrowane widma

absorpcji związków 14 i 15 oraz 22-25 wykazano zdolność interkalacji do DNA, a wiązało się

to ze spadkiem intensywności absorbancji oraz przesunięciem maksimum w kierunku fal

dłuższych (przesunięcie ku czerwieni) (Fig. 3). Największe zmiany widm absorpcji

obserwowano dla najaktywniejszej pochodnej 25. Inkubacja z CT-DNA ujawniła spadek

intensywności absorpcji (efekt hipochromowy) o 41,5%, a także przesunięcie Stokesa

wynoszące 5nm (Tabela 4). Ponadto, dobre właściwości interkalacyjne obserwowano dla

pochodnych 14, 23 i 24 (spadki intensywności o 16,2%, 17,2% i 26,1%).

32

Fig 3. Widma absorpcyjne glikokoniugatów (14, 15, 22, 23, 24, 25) bez CT-DNA (linia ciągła) oraz w obecności

CT-DNA (linia przerywana) w buforze PBS. Czerwona linia wskazuje CT-DNA w PBS.

Tabela 4. Właściwości spektralne widm absorpcji dla glikokoniugatów związanych z CT-DNA.

Związek Absorpcja

λmax [nm]

Zmiana

absorbancji

%

hypochromizm

Δε M−1

cm−1

Przesunięcie

Stokesa [nm]

14 284 hypochromizm 16,2 36191,1 2

15 278 hypochromizm 9,0 16851,1 4

22 282 hypochromizm 10,7 1862,2 4

23 284 hypochromizm 17,2 20713,3 4

24 290 hypochromizm 26,1 5080,0 5

25 290 hypochromizm 41,5 7622,2 5

33

V. Podsumowanie

W ramach pracy przeprowadzono testy cytotoksyczności dla 130 nowych pochodnych

tiosemikarbazonu, zsyntezowanych w Zakładzie Chemii Organicznej Uniwersytetu Śląskiego,

a także dla 14 nowych glikokoniugatów otrzymanych we współpracy z Politechniką Śląską

w Gliwicach. Dla wszystkich związków przeprowadzono oznaczenia cytotoksyczności

względem dwóch linii nowotworowych komórek raka jelita grubego. Ponadto, dla aktywnych

związków wykonano oznaczenia na prawidłowych komórkach ludzkich, w celu określenia

selektywności ich działania.

Wśród badanej grupy TSC, najbardziej aktywnym związkiem okazał się MR12K,

którego struktura opierała się na fragmencie chinoliny, jego wyliczona wartość IC50 wynosiła

0,10 µM wobec komórek HCT116 typu dzikiego. Podobnie, jednymi z najbardziej aktywnych

związków okazały się pochodne zbudowane na fragmencie ketonu di-2-pirydylowego.

Ponadto, analiza cytotoksyczności poszczególnych grup pochodnych, ujawniła, iż dołączenie

atomów halogenu lub grupy tri-fluorometylowej do pierścienia fenylowego skutkowała

zwiększeniem aktywności biologicznej. Dodatkowo, zaobserwowano, iż znaczna większość

przebadanych pochodnych TSC cechuje się wysoką selektywnością wobec komórek

rakowych.

Dla aktywnych pochodnych tiosemikarbazonu wykonano badania mające na celu

scharakteryzowanie możliwego mechanizmu działania. W tym celu przeprowadzono testy

określające generowanie reaktywnych form tlenu w komórkach raka jelita grubego, które

potwierdziły wcześniejsze doniesienia dla tej klasy związków. Ponadto, analiza ilościowa

ujawniła, iż pierwszy silny wzrost stężenia reaktywnych form tlenu obserwowano po 6h od

aplikacji poszczególnych pochodnych. Co więcej, dla wszystkich pochodnych obserwowano

wzrost stężenia ROS po 24 godzinnej inkubacji. W kolejnym etapie badań, określono wpływ

pochodnych na wewnątrzkomórkowe stężenie zredukowanego glutationu, a także na poziom

peroksydacji lipidów. Analiza danych, ujawniła, iż zmniejszenie poziomu

wewnątrzkomórkowego glutationu obserwowano już po 3 godzinnej inkubacji z badanymi

pochodnymi. Co więcej, największy spadek poziomu zredukowanego glutationu

obserwowano po 9h i 24h inkubacji z poszczególnymi TSC. Uzyskane wyniki w czasie

eksperymentu mogą sugerować dwutorowe działanie TSC na spadek stężenia GSH.

Mianowicie badane pochodne mogą bezpośrednio wpływać na poziom stężenia

wewnątrzkomórkowego antyoksydanta, a także za pośrednictwem ROS wzmagać jego

utlenianie oraz wypływ ze środowiska komórki. Co więcej, generowane reaktywnych form

tlenu przez pochodne TSC inicjuje proces peroksydacji lipidów błonowych, który przyczynia

się do postępu wielu uszkodzeń komórkowych. Podsumowując, uzyskane wyniki badań

wydają się potwierdzać, zaangażowanie pochodnych tiosemikarbazonu w indukcję stresu

oksydacyjnego, który prowadzi do śmierci komórkowej.

Natomiast, wśród grupy badanych prostych pochodnych chinoliny – glikokoniugatów,

najbardziej aktywnymi związkami okazały się pochodne 24 i 25, które w swojej strukturze

zawierały łącznik pirydynowy. Ponadto, przeprowadzone badania cytotoksyczności, ujawniły,

34

iż połączenie nieaktywnych substratów za pomocą łącznika aromatycznego - grupy fenylowej

lub pirydynowej, który został wprowadzony pomiędzy fragment cukrowy, a pochodną

chinoliny prowadziło do znacznego zwiększenia aktywności. Co więcej, analiza ujawniła brak

różnic w aktywności biologicznej pomiędzy komórkami typu dzikiego oraz mutantami, co

sugerowało mechanizm niezależny od obecności białka p53 w komórkach raka jelita grubego.

W związku z tym, dla aktywnych glikokoniugatów wykonano eksperymenty określające

prawdopodobny mechanizm działania. Ze względu na występowanie fragmentu

8-hydroksychinoliny w aktywnych glikokoniugatach zdecydowano się na oznaczenia

kompleksowania jonów miedzi i cynku. Zarówno analiza cytotoksyczności aktywnych

pochodnych w obecności jonów miedzi, a także pomiary spektrofotometryczne procesu

kompleksowania jonów miedzi ujawniły, zdolność tych pochodnych do tworzenia aktywnych

redoksowo kompleksów z tymi jonami. W dalszym etapie badań, wykonano testy określające

generowanie reaktywnych form tlenu oraz ich wpływ na poziom komórkowego glutationu.

Uzyskane wyniki potwierdziły znaczne generowanie ilości ROS, a także oddziaływanie

badanych pochodnych glikokoniugatów z GSH. Jednakże, w przypadku niektórych

pochodnych obserwowano, iż zmniejszenie poziomu stężenia tego antyoksydanta, nie

korelowało z generowanymi ROS, podobnie jak w przypadku TSC. Następnie dalsze badania

skupiały się na określeniu aktywacji kaspaz 3/7 i indukcji ścieżki apoptotycznej. Wyniki

potwierdziły indukcję śmierci komórkowej poprzez apoptozę na drodze zależnej i niezależnej

od aktywacji kaspaz. Ponadto, ze względu na zdolności chinoliny do wiązania z DNA,

przeprowadzono pomiary widm UV/VIS i określono zdolności interkalacyjne badanych

pochodnych. Podsumowując, uzyskane wyniki badań dla szeregu glikokoniugatów, nakreśliły

wielokierunkowy mechanizm działania, który może opierać się na generowaniu reaktywnych

form tlenu przez aktywne kompleksy z jonami metali, co może mieć związek z indukcją

stresu oksydacyjnego oraz skierowaniem komórek na drogę apoptozy. Z drugiej strony,

oddziaływanie aktywnych pochodnych z DNA na drodze interkalacji może indukować

uszkodzenia kwasów nukleinowych.

35

VI. Dalsze plany

Dalsze plany badawcze przewidują wyselekcjonowanie 25 aktywnych tiosemikarbazonów,

a następnie przeprowadzenie:

- oznaczeń cytotoksyczności na liniach komórkowych raka piersi – MCF-7 oraz liniach

glejaków – U-251 oraz Hs 683. Wybór linii komórkowych podyktowany jest wysoką

ekspresją receptora transferyny w tych typach nowotworów,

- badania zmian poziomu ROS i GSH pozwalających na określenie zaangażowania

wybranych pochodnych w indukcję stresu oksydacyjnego,

- analizy zmian ekspresji wybranych genów i białek na szlakach odpowiedzialnych za

zatrzymanie cyklu komórkowego i indukcję śmierci komórkowej na drodze apoptozy przy

pomocy metod: Real-Time PCR oraz Western Blot.

Ponadto przewiduję analizę prawdopodobnego synergistycznego mechanizmu działania

scharakteryzowanych pochodnych tiosemikarbazonu z stosowanymi lekami w terapii

kombinowanej oraz fotouczulaczami w terapii fotodynamicznej (PDT).

VII. Bibliografia

[1] Worldwide cancer statistics | Cancer Research UK, n.d.

[2] A. Levitzki, S. Klein, Signal transduction therapy of cancer, Mol. Aspects Med. 31

(2010) 287–329.

[3] G. Bottegoni, A.D. Favia, M. Recanatini, A. Cavalli, The role of fragment-based and

computational methods in polypharmacology, Drug Discov. Today. 17 (2012) 23–34.

[4] A. Petrelli, S. Giordano, From single- to multi-target drugs in cancer therapy: when

aspecificity becomes an advantage., Curr. Med. Chem. 15 (2008) 422–432.

[5] C. Gorrini, I.S. Harris, T.W. Mak, Modulation of oxidative stress as an anticancer

strategy, Nat. Rev. Drug Discov. 12 (2013) 931–947.

[6] E.O. Hileman, J. Liu, M. Albitar, M.J. Keating, P. Huang, Intrinsic oxidative stress in

cancer cells: a biochemical basis for therapeutic selectivity., Cancer Chemother.

Pharmacol. 53 (2004) 209–19.

[7] J. Chen, Reactive Oxygen Species and Drug Resistance in Cancer Chemotherapy,

Austin J. Clin. Pathol. 1 (2014) 1–7.

[8] V. Nogueira, N. Hay, Molecular Pathways: Reactive Oxygen Species Homeostasis in

Cancer Cells and Implications for Cancer Therapy, Clin. Cancer Res. 19 (2013) 4309–

4314.

[9] D. Trachootham, J. Alexandre, P. Huang, Targeting cancer cells by ROS-mediated

mechanisms: a radical therapeutic approach?, Nat. Rev. Drug Discov. 8 (2009) 579–

591.

[10] L.I. Mclellan, C.R. Wolf, Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer

drug resistance, Drug Resist. Updat. 2 (1999) 153–164.

[11] M. Polimeni, E. Gazzano, Is redox signaling a feasible target for overcoming

36

multidrug resistance in cancer chemotherapy?, Front. Pharmacol. 5 (2014) 286.

[12] A. Cort, T. Ozben, L. Saso, C. De Luca, L. Korkina, Redox Control of Multidrug

Resistance and Its Possible Modulation by Antioxidants, Oxid. Med. Cell. Longev.

2016 (2016) 1–17.

[13] D.S. Kalinowski, P. Quach, D.R. Richardson, Thiosemicarbazones: the new wave in

cancer treatment., Future Med. Chem. 1 (2009) 1143–51.

[14] V. Oliveri, G. Vecchio, 8-Hydroxyquinolines in medicinal chemistry: A structural

perspective, Eur. J. Med. Chem. (2016).

[15] Y. Song, H. Xu, W. Chen, P. Zhan, X. Liu, 8-Hydroxyquinoline: a privileged structure

with a broad-ranging pharmacological potential, Med. Chem. Commun. 6 (2015) 61–

74.

[16] G. Pastuch-Gawołek, K. Malarz, A. Mrozek-Wilczkiewicz, M. Musioł, M. Serda, B.

Czaplinska, et al., Small molecule glycoconjugates with anticancer activity, Eur. J.

Med. Chem. 112 (2016) 130–144.

[17] M. Valko, M. Izakovic, M. Mazur, C.J. Rhodes, J. Telser, Role of oxygen radicals in

DNA damage and cancer incidence., Mol. Cell. Biochem. 266 (2004) 37–56.

[18] J.D. Lambeth, NOX enzymes and the biology of reactive oxygen., Nat. Rev. Immunol.

4 (2004) 181–9.

[19] T. Finkel, Signal transduction by reactive oxygen species., J. Cell Biol. 194 (2011) 7–

15.

[20] D. Zhou, L. Shao, D.R. Spitz, Reactive oxygen species in normal and tumor stem

cells., Adv. Cancer Res. 122 (2014) 1–67.

[21] L.B. Sullivan, N.S. Chandel, Mitochondrial reactive oxygen species and cancer,

Cancer Metab. 2 (2014) 17.

[22] R.R. Bartz, C.A. Piantadosi, Clinical review: oxygen as a signaling molecule., Crit.

Care. 14 (2010) 234.

[23] I. Fridovich, Biological effects of the superoxide radical, Arch. Biochem. Biophys.

247 (1986) 1–11.

[24] M. Valko, C.J. Rhodes, J. Moncol, M. Izakovic, M. Mazur, Free radicals, metals and

antioxidants in oxidative stress-induced cancer., Chem. Biol. Interact. 160 (2006) 1–40.

[25] M.L. Circu, T.Y. Aw, Reactive oxygen species, cellular redox systems, and apoptosis,

Free Radic Biol Med. 48 (2010) 749–762.

[26] P. Kovacic, J. a Osuna, Mechanisms of anti-cancer agents: emphasis on oxidative

stress and electron transfer., 2000.

[27] D.G. Deavall, E.A. Martin, J.M. Horner, R. Roberts, Drug-induced oxidative stress

and toxicity, J. Toxicol. 2012 (2012) 645460.

[28] K.C. Cheng, D.S. Cahill, H. Kasai, S. Nishimura, L.A. Loeb, 8-Hydroxyguanine, an

abundant form of oxidative DNA damage, causes G----T and A----C substitutions., J.

Biol. Chem. 267 (1992) 166–72.

[29] K. Rahman, Studies on free radicals, antioxidants, and co-factors., Clin. Interv. Aging.

2 (2007) 219–36.

[30] S. Loft, H.E. Poulsen, Cancer risk and oxidative DNA damage in man., J. Mol. Med.

(Berl). 74 (1996) 297–312.

[31] A.T.Y. Lau, Y. Wang, J.F. Chiu, Reactive oxygen species: Current knowledge and

applications in cancer research and therapeutic, J. Cell. Biochem. 104 (2008) 657–667.

[32] K.C. Das, C.W. White, Redox systems of the cell: possible links and implications.,

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (2002) 9617–8.

[33] Y. Collins, E.T. Chouchani, A.M. James, K.E. Menger, H.M. Cochemé, M.P. Murphy,

Mitochondrial redox signalling at a glance., J. Cell Sci. 125 (2012) 801–6.

37

[34] D. Trachootham, W. Lu, M.A. Ogasawara, R.-D.V. Nilsa, P. Huang, Redox regulation

of cell survival., Antioxid. Redox Signal. 10 (2008) 1343–74.

[35] W.J. Davis, Z. Ronai, K.D. Tew, Cellular Thiols and Reactive Oxygen Species in

Drug-Induced Apoptosis, J. Pharmacol. Exp. Ther. 296 (2001) 1–6.

[36] U. Jungwirth, C.R. Kowol, B.K. Keppler, C.G. Hartinger, W. Berger, P. Heffeter,

Anticancer activity of metal complexes: involvement of redox processes., Antioxid.

Redox Signal. 15 (2011) 1085–127.

[37] R. Franco, J. Cidlowski, Apoptosis and glutathione: beyond an antioxidant, Cell Death

Differ. (2009).

[38] R. Franco, C.D. Bortner, I. Schmitz, J. a Cidlowski, Glutathione depletion regulates

both extrinsic and intrinsic apoptotic signaling cascades independent from multidrug

resistance protein 1., Apoptosis. 19 (2014) 117–34.

[39] R. Franco, J. a Cidlowski, Glutathione efflux and cell death., Antioxid. Redox Signal.

17 (2012) 1694–713.

[40] N. Traverso, R. Ricciarelli, M. Nitti, B. Marengo, A.L. Furfaro, M.A. Pronzato, et al.,

Role of glutathione in cancer progression and chemoresistance., Oxid. Med. Cell.

Longev. 2013 (2013) 972913.

[41] G.-Y. Liou, P. Storz, Reactive oxygen species in cancer., Free Radic. Res. 44 (2010)

479–96.

[42] N. Le, The role of iron in cell cycle progression and the proliferation of neoplastic

cells, Biochim. Biophys. Acta - Rev. Cancer. 1603 (2002) 31–46.

[43] R. Sengupta, A. Holmgren, Thioredoxin and glutaredoxin-mediated redox regulation

of ribonucleotide reductase., World J. Biol. Chem. 5 (2014) 68–74.

[44] B.B.A. Simone Reuter, Oxidative stress, inflammation, and cancer: How are they

linked?, Free Radic Biol Med. 49 (2011) 1603–1616.

[45] G. Manda, M. Nechifor, T. Neagu, Reactive oxygen species, cancer and anti-cancer

therapies, Curr. Chem. Biol. (2009).

[46] M. De Miguel, M.D. Cordero, Oxidative Therapy Against Cancer, Oxidative Ther.

Against Cancer, Oxidative Stress Dis. Dr. Volodymyr Lushchak (Ed.), ISBN 978-953-

51-0552-7, InTech. (2012) 497–520.

[47] H. Pelicano, D. Carney, P. Huang, ROS stress in cancer cells and therapeutic

implications., Drug Resist. Updat. 7 (2004) 97–110.

[48] D. Dreher, A.F. Junod, Role of oxygen free radicals in cancer development., Eur. J.

Cancer. 32A (1996) 30–8.

[49] D.N. Dhanasekaran, E.P. Reddy, JNK signaling in apoptosis., Oncogene. 27 (2008)

6245–51.

[50] S.A. Susin, H.K. Lorenzo, N. Zamzami, I. Marzo, B.E. Snow, G.M. Brothers, et al.,

Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor., Nature. 397

(1999) 441–6.

[51] S.P. Cregan, V.L. Dawson, R.S. Slack, Role of AIF in caspase-dependent and caspase-

independent cell death., Oncogene. 23 (2004) 2785–2796.

[52] M.R. Bedford, S.J. Ford, R.D. Horniblow, T.H. Iqbal, C. Tselepis, Iron Chelation in

the Treatment of Cancer: A New Role for Deferasirox?, J. Clin. Pharmacol. 53 (2013)

885–891.

[53] V.A. Rao, Iron chelators with topoisomerase-inhibitory activity and their anticancer

applications., Antioxid. Redox Signal. 18 (2013) 930–55.

[54] M. Kruszewski, Labile iron pool: the main determinant of cellular response to

oxidative stress, … Res. Mol. Mech. …. 531 (2003) 81–92.

[55] T.B. Chaston, D.R. Richardson, Iron chelators for the treatment of iron overload

38

disease: relationship between structure, redox activity, and toxicity., Am. J. Hematol.

73 (2003) 200–10.

[56] J.L. Heath, J.M. Weiss, C.P. Lavau, D.S. Wechsler, Iron deprivation in cancer-

potential therapeutic implications, Nutrients. 5 (2013) 2836–2859.

[57] K.C. Gatter, G. Brown, I.S. Trowbridge, R.E. Woolston, D.Y. Mason, Transferrin

receptors in human tissues: their distribution and possible clinical relevance., J. Clin.

Pathol. 36 (1983) 539–45.

[58] D. Richardson, Iron chelators as therapeutic agents for the treatment of cancer, Crit.

Rev. Oncol. Hematol. 42 (2002) 267–281.

[59] D.S. Kalinowski, C. Stefani, S. Toyokuni, T. Ganz, G.J. Anderson, N. V

Subramaniam, et al., Redox cycling metals: Pedaling their roles in metabolism and

their use in the development of novel therapeutics, Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell

Res. (2016).

[60] K. Jomova, S. Baros, M. Valko, Redox active metal-induced oxidative stress in

biological systems, Transit. Met. Chem. 37 (2012) 127–134.

[61] X. Cai, N. Pan, G. Zou, Copper-1,10-phenanthroline-induced apoptosis in liver

carcinoma Bel-7402 cells associates with copper overload, reactive oxygen species

production, glutathione depletion and oxidative DNA damage., Biometals. 20 (2007)

1–11.

[62] D. Kalinowski, D. Richardson, The evolution of iron chelators for the treatment of iron

overload disease and cancer, Pharmacol. Rev. 57 (2005) 547–583.

[63] J.L. Buss, F.M. Torti, S. V Torti, The role of iron chelation in cancer therapy., Curr.

Med. Chem. 10 (2003) 1021–34.

[64] M. Serda, D.S. Kalinowski, N. Rasko, E. Potůčková, A. Mrozek-Wilczkiewicz, R.

Musiol, et al., Exploring the Anti-Cancer Activity of Novel Thiosemicarbazones

Generated through the Combination of Retro-Fragments: Dissection of Critical

Structure-Activity Relationships, PLoS One. 9 (2014) e110291.

[65] R.T. Dean, P. Nicholson, The Action of Nine Chelators on Iron-Dependent Radical

Damage, Free Radic. Res. (2009).

[66] V.V. Prachayasittikul, S. Prachayasittikul, S. Ruchirawat, V.V. Prachayasittikul, 8-

Hydroxyquinolines: a review of their metal chelating properties and medicinal

applications., Drug Des. Devel. Ther. 7 (2013) 1157–78.

[67] S. Madonna, C. Béclin, Y. Laras, V. Moret, A. Marcowycz, D. Lamoral-Theys, et al.,

Structure-activity relationships and mechanism of action of antitumor bis 8-

hydroxyquinoline substituted benzylamines., Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 623–38.

[68] L. Costantino, D. Barlocco, Privileged structures as leads in medicinal chemistry.,

Curr. Med. Chem. 13 (2006) 65–85.

[69] A.M. Merlot, D.S. Kalinowski, D.R. Richardson, Novel chelators for cancer treatment:

where are we now?, Antioxid. Redox Signal. 18 (2013) 973–1006.

[70] Y. Yu, D.S. Kalinowski, Z. Kovacevic, A.R. Siafakas, P.J. Jansson, C. Stefani, et al.,

Thiosemicarbazones from the old to new: iron chelators that are more than just

ribonucleotide reductase inhibitors., J. Med. Chem. 52 (2009) 5271–94.

[71] V. Oliveri, New Glycoconjugates for the Treatment of Diseases Related to Metal

Dyshomeostasis, ChemistryOpen. 4 (2015) 792–795.

[72] A. Pettenuzzo, R. Pigot, L. Ronconi, Metal-based glycoconjugates and their potential

in targeted anticancer chemotherapy, Metallodrugs. 1 (2016) 36–61.

[73] H. Schugar, D.E. Green, M.L. Bowen, L.E. Scott, T. Storr, K. Böhmerle, et al.,

Combating Alzheimer’s disease with multifunctional molecules designed for metal

passivation., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46 (2007) 1716–8.

39

[74] V. Oliveri, M.L. Giuffrida, G. Vecchio, C. Aiello, M. Viale, Gluconjugates of 8-

hydroxyquinolines as potential anti-cancer prodrugs., Dalton Trans. 41 (2012) 4530–5.

[75] M. Serda, Synteza i aktywność biologiczna nowych analogów tosemikarbazonowych

chelatorów żelaza, 2013.

[76] F. Zhang, W. Wang, Y. Tsuji, S. V Torti, F.M. Torti, Post-transcriptional modulation

of iron homeostasis during p53-dependent growth arrest., J. Biol. Chem. 283 (2008)

33911–8.

[77] E. Parisini, P. Metrangolo, T. Pilati, G. Resnati, G. Terraneo, Halogen bonding in

halocarbon-protein complexes: a structural survey., Chem. Soc. Rev. 40 (2011) 2267–

2278.

[78] A. Mrozek-Wilczkiewicz, E. Spaczyńska, K. Malarz, M. Rams-Baron, V. Krystof, R.

Musioł, Design, synthesis and in vitro activity of anticancer styrylquinolines. The p53

independent mechanism of action, PLoS One. (2015) 10–13.

[79] S. Wang, E.A. Konorev, S. Kotamraju, J. Joseph, S. Kalivendi, B. Kalyanaraman,

Doxorubicin induces apoptosis in normal and tumor cells via distinctly different

mechanisms. intermediacy of H(2)O(2)- and p53-dependent pathways., J. Biol. Chem.

279 (2004) 25535–43.

[80] R. Franco, M.I. Panayiotidis, J.A.J. Cidlowski, Glutathione depletion is necessary for

apoptosis in lymphoid cells independent of reactive oxygen species formation, J. Biol.

Chem. 282 (2007) 30452–30465.

[81] A. Ayala, M.F. Muñoz, S. Argüelles, Lipid Peroxidation : Production , Metabolism ,

and Signaling Mechanisms of Malondialdehyde and 4-Hydroxy-2-Nonenal, Oxid. Med.

Cell. Longev. 2014 (2014) 31.

[82] S. Hauptmann, V. Grünewald, D. Molls, W.D. Schmitt, M. Köbel, K. Kriese, et al.,

Glucose transporter GLUT1 in colorectal adenocarcinoma cell lines is inversely

correlated with tumour cell proliferation., Anticancer Res. 25 3431–6.

[83] H. Jiang, J.E. Taggart, X. Zhang, D.M. Benbrook, S.E. Lind, W.Q. Ding, Nitroxoline

(8-hydroxy-5-nitroquinoline) is more a potent anti-cancer agent than clioquinol (5-

chloro-7-iodo-8-quinoline), Cancer Lett. 312 (2011) 11–17.

[84] D.R. McIlwain, T. Berger, T.W. Mak, Caspase Functions in Cell Death and Disease,

Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5 (2013) a008656–a008656.

[85] A. Barilli, C. Atzeri, I. Bassanetti, F. Ingoglia, V.D. Asta, O. Bussolati, et al.,

Oxidative Stress Induced by Copper and Iron Complexes with 8-Hydroxyquinoline

Derivatives Causes Paraptotic Death of HeLa Cancer Cells, Mol. Pharm. 11 (2014)

1151–1163.

[86] S. Tardito, I. Bassanetti, C. Bignardi, L. Elviri, M. Tegoni, C. Mucchino, et al., Copper

binding agents acting as copper ionophores lead to caspase inhibition and paraptotic

cell death in human cancer cells, J. Am. Chem. Soc. 133 (2011) 6235–6242.

VIII. Dorobek naukowy

Publikacje

1. Spaczynska E., Tabak D., Malarz K., Musiol R., Investigation of the spectrum of

applicability of quinoline amides, Der Pharma Chemica 6(6) (2014) 233-240

IF=0,48

40

2. Cieslik W., Spaczynska E., Malarz K., Tabak D., Nevin E., O’Mahony J.,

Coffey A., Mrozek-Wilczkiewicz A., Jampilek J., Musiol R., Investigation of the

Antimycobacterial Activity of 8-Hydroxyquinolines, Medicinal Chemistry 11(8) (2015)

771-779

IF=1,36

3. Mrozek-Wilczkiewicz A., Spaczynska E.*, Malarz K.*, Cieslik W.*, Rams-Baron

M., Kristof V., Musiol R., Design, synthesis and in vitro activity of anticancer

styrylquinolines. The p53 independent mechanism of action, Plos ONE (2015) Nov 23;

10(11): e0142678

IF=3,234

4. Pastuch-Gawołek G.*, Malarz K.*, Mrozek-Wilczkiewicz A., Musioł M., Serda M.,

Czaplinska B., Musiol R., Small molecule glycoconjugates with anticancer activity,

European Journal of Medicinal Chemistry 112 (2016) 130-144

IF=3,447

5. Łączkowski K.Z., Świtalska M., Baranowska-Łączkowska A., Plech T., Paneth A.,

Misiura K., Wietrzyk J., Czaplińska B., Mrozek-Wilczkiewicz A., Malarz K.,

Musioł R., Grela I., Thiazole-based nitrogen mustards: Design, synthesis,

spectroscopic studies, DFT calculation, molecular docking, and antiproliferative

activity against selected human cancer cell lines, Journal of Molecular Structure

(2016) doi:10.1016/j.molstruc.2016.04.058

IF=1,602

Zgłoszenia patentowe

1. Musioł R., Spaczyńska E., Mrozek – Wilczkiewicz A., Cieślik W., Malarz K.,

Rams-Baron M., Szurko A., Zastosowanie pochodnych styrylochinoliny do

wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia nowotworów jelita grubego, Zgłoszenie

patentowe P.407379, 2014

Prezentacje ustne na konferencjach naukowych

1. Malarz K., Rams-Baron M., Serda M., Mrozek-Wilczkiewicz A., Musioł R.,

Tiosemikarbazony - reaktywne formy tlenu i ich wpływ na glutation. 57 Zjazd

PTChem i SITPChem, Częstochowa, 14-18 września 2014

2. Malarz K., Rams-Baron M., Serda M., Mrozek-Wilczkiewicz A., Musioł R., Nowe

pochodne tiosemikarbazonu, mechanizmy działania oraz biologiczne zastosowanie w

terapiach przeciwnowotworowych. III Ogólnopolska Konferencja Naukowa Pomiędzy

Naukami – zjazd fizyków i chemików, Chorzów, 26 września 2014

3. Malarz K., Rams-Baron M., Mrozek-Wilczkiewicz A., Serda M., Polański J., Musioł

R., Wpływ reaktywnych form tlenu, generowanych przez pochodne tiosemikarbazonu,

41

na wewnątrzkomórkowe stężenie glutationu. Śląskie Spotkania Naukowe, Ustroń, 15-

17 maja 2015

Plakaty naukowe

1. Malarz K., Rams-Baron M., Serda M., Mrozek-Wilczkiewicz A., Musioł R.,

Tiosemikarbazony – wpływ reaktywnych form tlenu na glutation. III Studencka

Konferencja Biologii Molekularnej, Łódź, 20-22 marca 2014

2. Malarz K., Rams-Baron M., Serda M., Mrozek-Wilczkiewicz A., Musioł R.,

Gluthatione depletion and reactive oxygen species generation by thiosemicarbazones

in cancer therapy. IX Multidyscyplinarna Konferencja Nauki o Leku, Szydłów, 12-14

maja 2014

3. Malarz K., Rams-Baron M., Serda M., Mrozek-Wilczkiewicz A., Musioł R.,

The biological activity and mechanism of action of thiosemicarbazones in cancer

research. 7th Central European Conference “Chemistry towards Biology”, Katowice,

9-12 września 2014

4. Malarz K., Rams-Baron M., Serda M., Mrozek-Wilczkiewicz A., Musioł R.,

New insights into biological activity and mode of action of thiosemicarbazones in

cancer treatment. VI Konwersatorium Chemii Medycznej, Lublin, 18-20 września

2014

5. Malarz K., Rams-Baron M., Serda M., Mrozek-Wilczkiewicz A., Musioł R.,

Biological activity and model of action of thiosemicarbazones in colon cancer

treatment. 5th Meeting of the Paul Ehrlich MedChem Euro-PhD Network 2015,

Kraków, 3-5 lipca 2015

6. Malarz K., Rams-Baron M., Mrozek-Wilczkiewicz A., Serda M., Polański J.,

Musioł R., Effects of thiosemicarbazones analogs on oxidative stress and cells death

in human colon cancer. 44th Conference Drug Synthesis and Analysis, Brno, 2-4

września 2015

7. Malarz K., Mrozek-Wilczkiewicz A., Rams-Baron M., Serda M., Polański J.,

Musioł R., Synergistic effects of novel derivatives thiosemicarbazones in combination

with photodynamic therapy in human colon cancer. VII Konwersatorium Chemii

Medycznej, Lublin, 17-19 września 2015

8. Malarz K., Rams-Baron M., Mrozek-Wilczkiewicz A., Serda M., Polański J.,

Musioł R., Rola reaktywnych form tlenu wytworzonych przez pochodne

tiosemikarbazonu w regulacji procesu śmierci komórek nowotworowych. IV

Ogólnopolska Konferencja Naukowa Pomiędzy Naukami – zjazd fizyków i

chemików, Chorzów, 18 września 2015

9. Malarz K., Mrozek-Wilczkiewicz A., Rams-Baron M., Serda M., Polański J.,

Musioł R., Synergistic effects of novel derivatives thiosemicarbazones in combination

with chlorine derivatives in photodynamic therapy. Gliwice Scientific Meetings,

Gliwice, 20-21 listopada 2015