chemické a biochemické interakce -...
TRANSCRIPT
Strana 1
DNA čipy
• Zařízení pro detekci specifické sekvence bází v molekule DNA nebo RNA
• DNA čip je tvořen maticí detekčních míst (microarray)
• Detekční místa jsou obvykle tvořena gelem s imobilizovaným receptorem – ssDNA (denaturovaná jednořetězcová DNA)
• V analyzovaném vzorku jsou přivedeny fluorescenčně značené ssDNA (ligandy)
• V případě komplementarity ligandu a receptoru proběhne hybridizace a stabilní dsDNA (dvouřetězcová DNA) je vytvořena v detekčním místě
• Po odmytí nenavázané ssDNA, může být provedena fluorescenční detekce.
Strana 2
Princip DNA čipu- schéma
Typický fluorescenční obraz
DNA čipu po hybridizaci
Strana 3
DNA čipy
• DNA čipy vykazují extrémní specifitu, která je závislá na počtu párů bází (pb) ve vzniklém komplexu ligand-receptor (~ 4n, kde n je počet pb).
• Charakteristický rozměr detekčních míst bývá v mm, což umožňuje vytváření obrovských matic detekčních míst (fotolitografie, microspotting, inject printing).
• Na jednom DNA čipu mohou být vázány všechny sekvence DNA kódující nějaký gen určitého organizmu (cca desítky tisíc míst)
• DNA čipy jsou využívány pro detekci genetických poruch (mutací), identifikaci osob (DNA fingerprint), detekci přítomnosti virových nebo bakteriálních infekcí, zjišťování nejúčinnějšího léčebného postupu u závažných onemocnění (personal therapy)
Přednáška #12 Strana 4
Microarrays (mikromaticové systémy)
- Původně studie exprese genů (mRNA profily) - Nyní k celé řadě aplikací: transcriptional profiling, genotyping, comparative genomic hybridization, epigenetic analysis
- Limitace difusí: targety musí difundovat z jádra tekutiny k detekčním polím D(DNA)~ 10-12 až 10-13 m2/s (inkubace trvá hodiny) - Zkrácení difusního času: 1. integrace mikromaticového pole s mikrokanálem a recirkulace (vysoký poměr povrch/objem, vyšší počet oligonukleotidů k funkcionalizaci) 2. konvektivní míchání: v mikrofluidice dosti neefektivní Pe okolo 100 (zlepšení přestupu hmoty se škáluje s Pe1/3 což odpovídá přibližně jednomu řádu)
Přednáška #12 Strana 5
http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_microarray
Strana 6
DNA čipy
• Pod detekčním místem (gelem) bývá umístěna elektroda
• Vložené elektrické pole urychluje transport DNA ze vzorku k detekčnímu místu vlivem elektroforetické migrace
• Analýzu na čipu tak lze urychlit z hodin na minuty • Zapojením vybraných elektrod je možné složky
vzorku usměrňovat (adresovat) pouze ke zvoleným detekčním místům
• Vzhledem k univerzálnosti interakce ssDNA-ssDNA a její vysoké specificitě, je již mnoho DNA čipů dodáváno komerčně
Strana 7
Příklady komerčních DNA čipů
DNA čip firmy Nanogen se 100
testovacími místy s uloženými
mikroelektrodami pro adresování.
DNA čip s možností adresování
standardního připojení k řídící
jednotce.
Typická čtečka signálu DNA čipů
Strana 8
Na DNA čipu může být umístěn celý genom libovolného organizmu
DNA čip – Escherichia coli
18880 detekčních míst (25 pb) o průměru 11 mm
Sledování exprese až 5500 transkriptů
Affymetrix, Inc.
DNA čip – Drosophila melanogaster (octomilka)
18880 detekčních míst (25 pb) o průměru 11 mm
Sledování exprese až 18500 transkriptů
Affymetrix, Inc.
DNA čip – Myš
18880 detekčních míst (25 pb) o průměru 11 mm
Sledování exprese až 39000 transkriptů
Affymetrix, Inc.
DNA čip – Člověk
18880 detekčních míst (25 pb) o průměru 11 mm
Sledování exprese až 47000 transkriptů
Affymetrix, Inc.
Strana 9
Příklady komerčních DNA čipů
• Vzhledem k vysoké specificitě hybridizační reakce lze princip DNA čipů použít např. ke zvýšení bezpečnosti různých čipových karet
• Každá sekvence DNA je spojena se specifickým signálem elektronického čipu karty. Tento signál může být identifikován pomocí čtecího zařízení s komplementárním signálem.
Strana 10
Chemické a biochemické interakce
V biochemických reakcích dochází velmi často při
interakci ligandu a receptoru ke tvorbě ligand-
receptorového komplexu a/nebo jeho zpětné disociaci
Ligand + Receptor Komplex
Reaktanty Produkty katalyzátor
Při interakci jedné nebo několika chemických komponent (reaktantů) může
dojít k jejich chemické přeměně za vzniku produktů. Chemická přeměna
probíhá za přítomnosti nebo bez přítomnosti katalyzátorů, které se přímo
účastní transformace a snižují její aktivační energii.
Strana 11
Ag (aq) + Ab (aq) C (aq)
Uspořádání chemické interakce
• Homogenní – všechny reaktanty i katalyzátor jsou v jedné fázi,
obvykle kapalné – například kompetitivní imunoanalýza v roztoku
• Heterogenní – jeden nebo více reaktantů nebo katalyzátor je umístěn
v jiné fázi než ostatní reaktanty – například heterogenní imunoanalýza s antigenem nebo
protilátkou vázanou na pevný nosič
Ag (s) + Ab (aq) C (s)
Strana 12
Heterogenní biochemické reakce
Heterogenní uspořádání je obvyklé
u všech vysoce paralelizovaných
aplikací – DNA čipů nebo různých
proteinových čipů. Jeden z reaktantů –
receptor je imobilizován buď na povrchu
pevné fáze nebo v gelové vrstvě.
Receptorem může být antigen,
protilátka, proteinové ligandy a
receptory (GF, EGFR), jiné proteiny,
ssDNA, RNA atd.
Rozpoznávání se děje na základě
specifity komplementární interakce mezi
antigenem a protilátkou, ssDNA-ssDNA,
enzymem a substrátem atd.
Zatímco DNA čipy obsahují velké množství
vazných míst (až desítky tisíc), u proteinů
to bývají obvykle jednotky až desítky.
Protilátky
http://www.highlands.edu/academics/divisions/scipe/biology/faculty/harnden/2122/notes/immune.htm
Přednáška #12 Strana 14 http://en.wikipedia.org/wiki/Blood_type
hemaglutinace
Strana 15
Proteinové čipy
• Interakce mezi dvěma komplementárními proteiny nebo proteinem a molekulou nebílkovinné povahy
• Proteiny jsou velmi rozmanité molekuly – proteiny, lipoproteiny, glykoproteiny
– fibrilární a globulární
– hydrofilní nebo hydrofóbní charakter povrchu
– isoelektrický bod, celkový elektrický náboj
– protilátky, antigeny, enzymy, receptory, ligandy, substráty
– řádové rozdíly v molekulární hmotnosti
• Specificita nebývá absolutní, enzym je schopen zpracovávat více substrátů, protilátky se mohou vázat na více antigenů (epitopů)
Strana 16
Proteinové čipy
• Z uvedených vlastností plyne, že žádný proteinový čip nemůže být tak univerzální a specifický jako DNA čipy
• Přístup ke konstrukci proteinového čipu také není univerzální, protože každá aplikace vyžaduje zvláštní přístup, což je determinováno charakterem zkoumaného proteinového systému
• Obvykle není vyžadován vysoký stupeň paralelizace (jedno až několik desítek detekčních míst)
• Typickým příkladem může být čip pro paralelní detekci několika antigenů spjatých s různými infekčními chorobami
Strana 17
Proteinové čipy • Proteinové čipy mají řádově menší charakteristické rozměry než
klasické systémy pro detekci proteinů (např. ELISA destičky) – řádové snížení doby analýzy (např. rychlá diagnostika) – snížení spotřeby proteinových reaktantů (cena) – přenositelnost systému (k pacientovy, na místo analýzy) – snadnější paralelizace – reprodukovatelnější reakční podmínky (přesné dávkování, lepší
homogenizace vzorku, …)
• Protože proteinové čipy nejsou masově rozšířené – chybí univerzální porty – ceny analýz jsou podstatně dražší než v klasických systémech, protože
pořizovací náklady na detektory, obslužné zařízení i samotné čipy jsou obrovské
– čipy jsou vyráběny v malých sériích – výhody proteinových čipů nepronikly mezi odbornou veřejnost
Jamkové destičky
ELISA in a microfluidic chip
Ultrasensitive microfluidic solid-phase ELISA using an actuatable microwell-patterned PDMS chip, Lab Chip, 2013, 13, 4190
fluorescein di-b-D-galactopyranoside (FDG) – nefluoreskující substrát
Strana 20
Příklad imunoanalýzy v homogenním uspořádání
Kompetitivní imunoanalytické stanovení
teofylinu v homogenním uspořádání.
Dávkování reaktantů a manipulace
s roztoky je založena na
elektroosmotickém transportu.Teofylin ze
vzorku (5) a známé množství značeného
teofylinu (6) jsou nejprve smíchány. Poté
jsou inkubovány s omezeným množstvím
protilátky (7). Vznikají komplexy
značeného a neznačeného teofylinu
s protilátkou a zůstává část
nespotřebovaného značeného teofylinu.
Značený teofylin a značený teofylin
v komplexu jsou následně na základě
různé elektroforetické mobility odděleny
v separačním kanále a jejich množství je
detekováno. Teofylin: lék k léčbě nemocí dýchacího ústrojí
Strana 21
Příklad imunoanalýzy v homogenním uspořádání
Míchání a inkubace
Separace
Kalibrační křivka – relativní poměr
značeného teofylinu volného
a v komplexu vypovídá o koncentraci
neznačeného teofylinu ve vzorku.
Strana 22
Příklad imunoanalýzy v homogenním uspořádání
Vysoce integrované
šestikanálové zařízení pro
paralelní imunoanalýzu
v homogenním uspořádání.
Zařízení obsahuje pouze
jeden fluorescenční
detektor. Separace
komplexu a značeného
antigenu se provádí na
základě rozdílných
elektroforetických mobilit.
Využit elektroosmotický
transport roztoků.
Strana 23
Mikrofluidní čip pro detekci proteinů na pevné fázi
Heterogenní stanovení IgG ze vzorku vazbou na imobilizovaný Protein A
Reakční komora
Zařízení kombinuje následující procesy:
imobilizace proteinu, inkubace,
proplachování, detekce a regenerace.
Transport je uskutečněn výhradně
elektrokineticky.
Strana 24
Mikrofluidní čip pro detekci proteinů na pevné fázi
Fluorescenční detekce
vázané protilátky
Kvantifikace signálu
v elektroosmotickém biosenzoru –
kalibrační křivka
Strana 25
Polystyrénový mikročip pro detekci IgG
Experimentální mikročip testovaný pro
přímou a sendvičovou detekci lidských
IgG na Proteinu A. Protein A je
imobilizován na stěně zařízení. Vzorek je
přiveden v roztoku. Doba inkubace je
5 minut.
Paralelizace kanálů umožňuje sestavení
kalibračních křivek nebo paralelní detekci
různých vzorků.
Strana 26
Polystyrénový mikročip pro detekci IgG
Intenzita fluorescenčního
zabarvení v konkrétním
kanále po vymytí zbytku
vzorku vypovídá o
koncentraci
imobilizovaného komplexu
PA-hIgG nebo PA-hIgG-
gIgG a tedy i o původní
koncentraci IgG
v analyzovaném vzorku.
Strana 27
Polystyrénový mikročip pro detekci IgG
Analýzou intenzity fluorescenčního signálu je možno získat kalibrační křivky
mikrofluidního zařízení. Z nich lze pomocí matematického modelu určit
rovnovážné a kinetické konstanty vazby ligand-receptor.
onoffd kkK
Rovnovážná konstanta
CAgAb onk
Rychlostní konstanta
Imobilizovaný Protein A
a lidské IgG v roztoku
kon = 5.5 m3mol-1s-1
Kd 3×10-6 mol m-3
PDMS mikročip pro kvantifikaci protilátek
Strana 28
hIgG mIgG FITC-gIgG glutardialdehyde
Mikročip z polydimethylsiloxanu (PDMS)
Vynikající optické vlastnosti, snadná výroba
Hydrofobní charakter povrchu
Dvoukroková detekce myších
protilátek mIgG
PDMS mikročip pro kvantifikaci protilátek
Strana 29
Měřen profil fluorescenční
emise napříč čipem
Schéma detekční
aparatury
Zařízení obsahuje
excitační laser a
fotonásobič
PDMS mikročip pro kvantifikaci protilátek
Strana 30
Výsledkem je kalibrační
závislost intenzity
fluorescenčního signálu na
koncentraci myších protilátek
ve vzorku
Strana 31
Mikročip pro heterogenní imunoanalýzu na vrstvě částic
Sendvičová heterogenní imunoanalýza – stanovení CEA (carcinoembryonic
antigen) při diagnostice rakoviny. Mikrofluidní zařízení obsahuje mikročástice
s imobilizovanou Ab proti CEA. CEA ze vzorku se váže na protilátku. Na vzniklý
komplex se váží protilátky proti CEA a dále zlatem značené protilátky proti CEA
protilátkám. Komplex obsahující zlaté částice může být detekován.
Strana 32
Mikročip pro heterogenní imunoanalýzu na vrstvě částic
Zařízení obsahuje lože mikročástic. Úniku mikročástic je zabráněno zúžením
kanálku. Roztoky obsahující analyty jsou dávkovány tlakem řízenou konvekcí.
Zařízení je schopno zpracovávat paralelně několik vzorků.
Strana 33
Příklad komerčních proteinových čipů
Kompaktní analyzátor
Sandia fluorescenčně
značených proteinových
toxinů – nM koncentrace
Jádrem analyzátoru je
mikrofluidní čip fungující na
principu kapilární elektroforézy
Modrý diodový laser
excituje fluorescenční
značku proteinů
Transport vzorků je
realizován elektrokineticky
34
Průtoková cytometrie Metoda slouží k
identifikaci a kvantifikaci
specifických buněk –
třídění buněk
Typické aplikace – detekce
rakovinných buněk v krvy,
detekce mikroorganizmů
Buňky se pohybují v sérii
kanálkem a specifické
buňky (například značené
fluoreskující protilátkou)
jsou opticky detekovány
35 Chen HT, Wang YN, MICROFLUIDICS AND NANOFLUIDICS 6, 529-537, 2009
Průtokový cytometr v mikrofluidním čipu
Přednáška #12 Strana 36
FACS - fluorescence activated cell sorting
http://www.thoughtyoumayask.com/picsbtqq/fluorescence-activated-cell-sorting/2
37
Elektrostatický dezintegrátor buněk
Carlos de la Rosa et al, IEEE TRANSACTIONS ON BIOMEDICAL
ENGINEERING, VOL. 55, NO. 10, OCTOBER 2008
Krátkodobé pulsy (50 ms) silného
elektrického pole (1×107 Vm-1) dezintegrují
buněčnou membránu/stěnu
Přednáška #12 Strana 38
Dielektroforéza v AC elektrickém poli
• Dielektroforetická síla působí částice dielektrika v nehomogenním elektrickém poli
• Jedná se o interakci časově proměnného elektrického pole (AC) a parciálního náboje molekul nebo částic dielektrika (dipólu)
• Částice nemusí nést celkový elektrický náboj • Velikost dielektroforetické síly závisí na tvaru částice, elektrických
vlastnostech částic a okolního kapalného média, frekvenci AC elektrického pole
• Dielektroforetická síla nezávisí na polaritě elektrického pole • Částice jsou vtahovány do oblastí s nejvyšší intenzitou elektrického pole,
pokud je jejich dielektrická konstanta vyšší (jsou lépe polarizovatelné) než dielektrická konstanta okolního média (pozitivní dielektroforéza)
• Částice jsou vtahovány do oblastí s nejnižší intenzitou elektrického pole, pokud je jejich dielektrická konstanta nižší (jsou hůře polarizovatelné) než dielektrická konstanta okolního média
• Vysoce selektivní metoda pro manipulaci a separaci mikro a nanočástic, buněk atd.
Přednáška #12 Strana 39
Dielektroforéza v mikročipu - příklad
• Separování a koncentrování směsi kvasinek a polystyrénových mikročástic
• Buňky – malé, světlé
• Polystyrénové mikročástice – velké, tmavé
(Zhou et al., 2005)
Přednáška #12 Strana 40
• Frekvenčně závislá – pozorovatelná až při velmi vysokých frekvencích (reorientace dipólů)
• Lépe (rychleji) jsou polarizovány dielektrika s větší dielektrickou konstantou
• Tato více polarizovaná dielektrika jsou vtahovány do oblasti větších intenzit elektrického pole (pozitivní dielektroforéza)
• Částice více polarizované vytlačují z těchto míst částice méně polarizované (negativní dielektroforéza)
Dielektroforéza - princip
+
d+
d d+
d
Strana 41
Dielektroforéza – celková síla působící na kulovou částici
• Pro malé frekvence je Clausius-Mossotiho faktor (člen v závorce záporný)
• Pro vyšší frekvence je kladný
fi
g
ErF
kk
rms
mp
mp
m
DEP
2
22
*
2
**
**
3
Strana 42
Detektor červených krvinek založený na dielektroforéze
• Ve AC elektrickém poli se částice s odlišnou dielektrickou konstantou než má nosný elektrolyt koncentrují v místech největší nebo nejmenší intenzity elektrického pole.
• Buňky jsou také odpuzovány z povrchu elektrod vlivem elektrodové polarizace interagující s polarizací buněčné membrány.
Minerick et al. Electrophoresis (2003).
Strana 43
Kombinovaný AC elektroosmotický mísič a dielektroforetický koncentrátor
• Systém dvou soustředných elektrod na které je vloženo AC elektrické pole.
• Tangenciální coulombovskou silou je ke středu centrální elektrody strháván elektrický náboj tvořený polarizací elektrody.
• Pohybující se náboj strhává tekutinu, která proudí tangenciálně ke středu elektrody a poté normálovým směrem od elektrody.
• Dochází tak k promíchávání roztoku. • Nad středem centrální elektrody jsou
potom dielektroforetickou silou selektivně zachytávány molekuly DNA.
Strana 44
Detektor bakterií založený na elektroosmotickém transportu ve střídavém elektrickém poli
• Páry ko-planárních elektrod. • AC zdroj vytváří časově
proměnné elektrické pole. • Vlivem tangenciální složky
elektrického pole dochází ke tvorbě vírů.
• Nad určitým místem elektrod vzniká stagnantní bod s nulovou tangenciální coulombovskou silou a bez pohybu tekutiny, kde jsou zachycovány částice – buňky.
Wu et al. Microfluid Nanofluid (2005).
Zachycení Escherichia coli ve stagnantních bodech elektrod.