117Hrvatske vode 18(2010) 72 117-126

J. Horvatić i sur. UtJecAJ nUtRiJenAtA nA potenciJAl RAStA kUltURe CHLOrELLA KESSLErI U VODI BOrOš DrAVE

Istraživan je utjecaj nutrijenata na potencijal rasta

kulture zelene alge Chlorella kessleri u Boroš Dravi,

kanalu Lanka (Mađarska) koji u nju dotječe te u rijeci

Dravi (84 i 83 r. km), koja prima vodu Boroš Drave.

Utjecaj dostupnih nutrijenata za rast alga kulture

C. kessleri praćen je minijaturiziranim biotestom u

laboratorijskim uvjetima te uspoređen s nutrijentima

u in situ uvjetima. Najveći potencijal rasta alga C.

kessleri utvrđen je u kanalu Lanka, gdje su i algama

dostupne količine anorganskog dušika i o-fosfata

in situ bile najveće, a najmanji u Boroš Dravi, gdje

je ukupni N bio uglavnom organskog porijekla.

Biotest obogaćivanja nutrijentima pokazao je na svim

postajama Boroš Drave značajnu limitaciju dušikom,

odnosno N i P kolimitaciju. Na postajama rijeke Drave

i kanalu Lanka N i P pojedinačno i u kombinaciji nisu

djelovali kao ograničavajući čimbenici na prirast alga

kulture C. kessleri ukazujući na značajnije opterećenje

hranjivim tvarima na tim postajama. Metoda biotesta

pogodna je za praćenje trofičkih uvjeta i limitirajućih

nutrijenata u plitkim vodama koje su izložene

povećanom unosu nutrijenata.

izvorni znanstveni rad original Scientific paper UDk 582.26:556.531] (282.243.741)primljeno (Received): 9. 2. 2010. prihvaćeno (Accepted): 1. 4. 2010.

Utjecaj nUtrijenata na potencijal rasta kUltUre Chlorella kessleri U vodi Boroš drave

Izv. prof. dr. sc. Janja Horvatić, prof. biol. kem.

Odjel za biologiju Sveučilišta J. J. Strossmayera u Osijeku

Trg Ljudevita Gaja 6, 31000 Osijek jhorvati@ffos.hr

mr. sc. Vesna Peršić, prof. biol. kem.

Odjel za biologiju Sveučilišta J. J. Strossmayera u Osijeku

Trg Ljudevita Gaja 6, 31000 Osijek

Aleksandra Kočić, prof. biol. kem.

Odjel za biologiju Sveučilišta J. J. Strossmayera u Osijeku

Trg Ljudevita Gaja 6, 31000 Osijek

Vera Santo, dipl. ing. preh. teh. Zavod za javno zdravstvo

Osječko-baranjske županije Franje Krežme 1, 31000 Osijek

Zoran Đuroković, dipl. ing. građ. Hrvatske vode, VGO Osijek

Splavarska 2a, 31000 Osijek

Davor Haničar, dipl. ing. građ.

Hrvatske vode, VGO Osijek Splavarska 2a, 31000 Osijek

Silvio Brezak, dipl. ing. građ. Hrvatske vode, VGO Osijek

Splavarska 2a, 31000 Osijek

Dr. sc. Ljiljana Čačić JP Vodovod Osijek

Poljski put 1, 31000 Osijek

Vera Tikas, dipl. ing. preh. teh. Odjel za biologiju Sveučilišta J. J. Strossmayera u Osijeku

Trg Ljudevita Gaja 6, 31000 Osijek

Ključne riječi: minijaturizirani biotest, trofički uvjeti, ograničavajući nutrijenti, Chlorella kessleri, Boroš Drava, rijeka Drava (84 i 83 r. km)

118 Hrvatske vode 18(2010) 72 117-126

J. Horvatić i sur. UtJecAJ nUtRiJenAtA nA potenciJAl RAStA kUltURe CHLOrELLA KESSLErI U VODI BOrOš DrAVE

1. UVOD

U slatkovodnim sustavima primarni ograničavajući čimbenik (limitirajući nutrijent) za razvoj fitoplanktona najčešće je fosfor (Wetzel, 2001.). Međutim, vrlo često su i dušik i fosfor ograničavajući čimbenici (kolimitacija fosforom i dušikom) razvoja fitoplanktona (Elser i sur., 1990., North i sur., 2007.). Da bismo odredili koji je nutrijent ograničavajući čimbenik razvoja fitoplanktona, potrebno je koristiti više različitih metoda, osobito in situ i laboratorijske biotestove (Ojala i sur., 2003.; Camacho i sur., 2003.). U minijaturiziranom biotestu potencijal rasta alga kulture C. kessleri FOTT et NOV. uvjetovan je koncentracijama nutrijenata prisutnim u testiranim uzorcima vode (Horvatić i sur., 2009.). U biotestu obogaćivanja nutrijentima moguće je u laboratorijskim uvjetima odrediti veličinu limitacije, uspoređujući prirast uzgajane kulture alga bez dodanih nutrijenata i sa dodanim nutrijentima (Peršić i sur., 2009.). Važno je naglasiti da su rezultati biotesta usporedivi s in situ rezultatima određivanja limitacije alga nutrijentima, ali u odsutnosti drugih čimbenika koji mogu biti potencijalno ograničavajući (Elser i Kimel, 1986.). To znači da stupanj povećanja ili smanjenja biomase alga u biotestu daje mjerljivu vrijednost veličine limitacije nutrijentima, koju je moguće uspoređivati s rezultatima drugih istraživanja (Downing i sur., 1999.). Povezivanjem in situ i laboratorijskih istraživanja, cilj ovoga rada je postizanje cjelovitijeg pristupa u procjeni utjecaja nutrijenata na potencijal rasta alga.

1. 1. područje istraživanjaPodručje Boroš Drave nalazi se unutar graničnog

područja Republike Hrvatske i Republike Mađarske. Sa sjeverne Mađarske strane u Boroš Dravu dotječe kanal Lanka, a sa južne hrvatske strane se voda iz Boroš Drave odvodi kanalom Boroš u Dravu. U hrvatskom dijelu Baranje nalazi se 16 hektara, a u mađarskoj županiji

Baranya 14 ha površine zvane Boroš Drava. Područje se nalazi u inundaciji rijeke Drave na r. km 63 + 700. Boroš Drava je stari rukavac rijeke Drave koji vodu dobiva iz kanala Lanka, a putem kanala Boroš dugim cca 2.000 m voda se odvodi u rijeku Dravu na r. km 63 + 700 (slika 2). Prema visinskim kotama područja koje su u rasponu od 84 do 91 m nm, Boroš Drava je poplavljena gotovo svake godine. Morfološki promatrano, područje pripada sektoru poloja od državne granice s Republikom Mađarskom kod Torjanaca do linije Drava­Osijek (Višnjevac). Područje Boroš Drave je minirano, što otežava pristup, a umanjena je i mogućnost prihvaćanja velikih vodnih valova, čime je smanjena i učinkovitost zaštite od poplava.

Od vodenjarskih su zajednica na području rukavca Boroš Drava prisutne zajednice lopoča i lokvanja (As. Nymphaetum albo-luteae Nowinski 1928.) te pršljenastog krocnja i žutog lokvanja (Myriophyllo-Nupharetum W. Koch 1926.).

Dominantna zajednica koja je potpuno obrasla dno rukavca Boroš Drave submerzna je zajednica krute roščike (As. Ceratophylletum demersi Hild. 1956.). Od karakterističnih eutrofnih zajednica u manjoj je mjeri prisutna samo uz rubove rukavca zajednica vodene i barske leće (Lemno-Spirodeletum polyrrhizae W.Koch 1954.). Uz rubove rukavca nalazi se i zajednica kopnenog tršćaka s rančićem (Scirpo-Phragmitetum W. Koch 1926.), koja doprinosi uzdizanju dna rukavca (slika 1). Prostorni raspored poplavnih šuma vrbe i topole ovisan je o poplavnom vodnom režimu. Na nižim predjelima, sa dužim razdobljima poplava nalazi se zajednica bijele vrbe s močvarnom broćikom (Galio-Salicetum albae Rauš 1973.), dok se na uzdignutijem terenu, gdje su poplave kratkotrajnije i ne tako visoke, fragmentarno razvijaju šume vrbe i topole (Salici-Populetum nigrae rubetosum caesii). Cijeli vodeni sustav rukavca Boroš Drava nalazi se u osjetljivom i europski rijetkom staništu poplavnih šuma vrbe.

Slika 1: Područje Boroš Drave (postaje 2a i 2b)

119Hrvatske vode 18(2010) 72 117-126

J. Horvatić i sur. UtJecAJ nUtRiJenAtA nA potenciJAl RAStA kUltURe CHLOrELLA KESSLErI U VODI BOrOš DrAVE

Slika 2: Istraživane postaje na području Boroš Drave (1a, 2a, 3a, 1b, 2b, 3b) rijeke Drave (D2, D1) i kanala Lanka (Lanka). Na originalnu podlogu mjerila 1:25000 (šire područje) postavljen je aerofotogrametrijski prikaz samog područja Boroš Drave (uže područje).

2. MATERIJALI I METODE

2.1. Fizikalno-kemijska svojstva vodeUzorci vode uzimani su u Boroš Dravi 4. i 10. rujna

2008. godine na tri postaje: 1a (desna obala), 2a (sredina) i 3a (lijeva obala Boroš Drave). Zbog vrlo niskog vodostaja, uzorci su 17. i 24. rujna te 02. listopada 2008. godine uzimani u obalnom području Boroš Drave, na postajama obilježenim kao 1b, 2b i 3b (slika 2). Na rijeci Dravi uzorci su uzimani 04., 10., 17. i 24. rujna (84. i 83. r. km), odnosno uzvodno i nizvodno od kanala koji spaja rijeku Dravu i Boroš Dravu, a obilježeni su kao postaje D1 i D2. U kanalu Lanka (L) uzorci su uzimani 4., 10., 17. i 24. rujna te 2. i 9. listopada 2008. godine.

Na terenu su mjereni temperatura vode i zraka, dubina i prozirnost vode, a u laboratoriju otopljeni kisik, zasićenost vode kisikom, pH, kemijska potrošnja kisika (KPK­Mn), provodljivost, ukupni dušik, ukupni fosfor, o­fosfati, amonijak kao N i nitrati kao N (APHA, 1985.). Mjerenja kemijskih parametara vode obavljena su u Eko­laboratoriju, RJ „Kanalizacija“ Vodovoda Osijek. Terensko uzorkovanje vode iz čamca u Boroš Dravi, kao i u rijeci Dravi, omogućile su Hrvatske vode, Vodnogospodarski odjel za vodno područje sliva Drave i Dunava, Osijek. Djelatnici Odjela za ispitivanje vode, Službe za zdravstvenu ekologiju Zavoda za javno zdravstvo županije osječko­baranjske obavili su uzorkovanja i analizu fizičko­kemijskih svojstava vode na postaji kanala Lanka.

120 Hrvatske vode 18(2010) 72 117-126

J. Horvatić i sur. UtJecAJ nUtRiJenAtA nA potenciJAl RAStA kUltURe CHLOrELLA KESSLErI U VODI BOrOš DrAVE

Slika 3: Chlorella kessleri Larg/1 FOTT. et NOV. Slika 4: Testna komorica

2.2. Metoda potencijala rasta alga – biotestZa procjenu potencijala rasta alga korištena je

laboratorijski uzgajana kultura alga Chlorella kessleri FOTT et NOVAK. strain LARG/1 (slika 3) i metoda minijaturiziranog biotesta (Lukavský, 1992.) modificirana prema Horvatić i sur. (2006.). Alge su uzgajane u laboratoriju za ekofiziologiju alga na Odjelu za biologiju, Sveučilišta J. J. Strossmayera u Osijeku, u tekućem hranjivom mediju prema Bischoff i Bold (1963.). Uzorci vode uzimani na odabranim postajama spremani su u plastične bočice te čuvani na temperaturi ­18ºC sve do početka njihove obrade. Nakon odmrzavanja uzorci su centrifugirani kako bi se eliminirale krupnije krute čestice. Biotest eksperiment načinjen je u polistirenskim pločicama ravnog dna (Labsystem, Finland) i veličine 9x13 cm (slika 4). Volumen svake od 96 jažica iznosi 300 μl. Svaki uzorak repliciran je u stupcu šest puta. Periferne jažice punjene su destiliranom vodom kako bi se smanjio efekt isparavanja. Nakon dodatka 100 μl testne otopine (uzorka vode s odabrane postaje) u svaku jažicu, nepokrivene pločice izložene su UV sterilizaciji kroz tri sata.

2.2.1. Chlorella kessleri kao testni organizamChlorella kessleri FOTT. et NOVAK jednostanična je

zelena alga koja živi u planktonu slatkih voda. Promjer okruglih stanica iznosi 5 – 10 μm (slika 3). Zbog neobično brzog rasta, za tri do šest sati dolazi do udvostručenja biomase. Ta značajka čini ovu algu pogodnom za uzgoj u kontroliranim uvjetima.

2.2.2. Određivanje gustoće stanicaBrojanjem stanica u Bürker­Türk­ovoj komorici

(Karl Hecht KG, Sondheim, Germany), pod svjetlosnim mikroskopom (Axiovert 25, Carl Zeiss, Inc., Göttingen, Germany) određena je početna koncentracija stanica algi koja je iznosila 200 000 stanica/ml, a pripremljena je ispiranjem alga s krute hranjive podloge u sterilnu destiliranu vodu.

2.2.3. Određivanje nutrijenata kao ograničavajućih čimbenika za rast alga

Nakon sterilizacije uzoraka vode s terena, mikropločice su punjene inokulum otopinom alga (50 μl), koja je dodana svakoj jažici, osim rubnima u koje je dodana destilirana voda (H2O). Prikaz punjenja mikropločica vidljiv je u tablici 1.

U mikropločice su redom dodavane koncentracije dušika, fosfora te kombinacije dušika i fosfora za određivanje nutrijenata kao ograničavajućih čimbenika. Dušik je dodavan kao (V = 50 μl) KNO3 finalne koncentracije nitrata 100 mg/l (N1) te 1000 mg/l (N2). Fosfor je dodavan kao (V = 50 μl) K2HPO4 finalne koncentracije fosfata 10 mg/L (P1) i 100 mg/l (P2). Kombinacija dušika i fosfora sastojala se od kombinacije N1+P1 i N2+P2 (omjer N/P iznosio je 7). Kontrola se sastojala od originalnog uzorka s terena u koji je umjesto tretmana dodana sterilna destilirana voda (V = 50 μl). Originalni uzorak (OR) služio je za utvrđivanje potencijala rasta alga preko ukupne biomase (250 μl uzorka + 50 μl inokulum otopine alga).

Tablica 1: Prikaz punjenja mikropločica.

H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O

H2O N1 N2 P1 P2 N1+P1 N2+P2 kontrola OR H2O

H2O N1 N2 P1 P2 N1+P1 N2+P2 kontrola OR H2O

H2O N1 N2 P1 P2 N1+P1 N2+P2 kontrola OR H2O

H2O N1 N2 P1 P2 N1+P1 N2+P2 kontrola OR H2O

H2O N1 N2 P1 P2 N1+P1 N2+P2 kontrola OR H2O

H2O N1 N2 P1 P2 N1+P1 N2+P2 kontrola OR H2O

H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O

121Hrvatske vode 18(2010) 72 117-126

J. Horvatić i sur. UtJecAJ nUtRiJenAtA nA potenciJAl RAStA kUltURe CHLOrELLA KESSLErI U VODI BOrOš DrAVE

2.2.4. Statistička obrada podataka Prirast biomase testirane kulture alga C. kessleri

praćen je svakodnevnim mjerenjem optičke gustoće pri valnoj duljini od 750 nm, pomoću automatiziranog čitača (Multiskan MS, Labsystem, Finland) koji je spojen s osobnim računalom pomoću GENESIS II programa (Windows™ Based Microplate Software). Prvo mjerenje je izvršeno prije stavljanja pločica s uzorcima na inkubaciju, a ostala sljedećih 14 dana, koliko je i trajao sam eksperiment. Konverzija optičke gustoće na 750 nm u suhu tvar (mg/l) C. kessleri izvedena je pomoću formule (Lukavský, 1992.):

(1)

Rezultati su prikazani kao krivulje rasta (biomasa kao DW vs. vrijeme trajanja eksperimenta), a ukupnu biomasu alge C. kessleri tijekom eksperimenta predstavlja integral površine ispod krivulje rasta i horizontalne linije (ISO, 1989.):

(2)

Ukupna biomasa alge C. kessleri izražena je kao suha tvar DW, mg/l (B) sa biomasom alga (Bo) na početku eksperimenta (t0); biomasom alga (B1) kod prvog mjerenja (t1) i biomasom (Bn) kod n­tog mjerenja (tn). Srednji specifični prirast (μ) tijekom eksponencijalnog rasta

dobiven je iz nagiba krivulje rasta tijekom eksponencijalne faze rasta prema (do 7. dana eksperimenta) prema ISO 8692 (1989.):

(3)

Stupanj limitacije nutrijenata (Δr) predstavlja jačinu odgovora alge na obogaćivanje nutrijentima tijekom eksponencijalne faze rasta (do 7. dana), a izražava se kao razlika između brzine rasta (porasta) alga C. kessleri u obogaćenim uzorcima (μE) i brzine rasta alga C. kessleri u kontrolnim uzorcima (Downing i sur., 1999.):

(4)

Analizom varijance utvrđeno je postojanje razlike u srednjim vrijednostima između srednjeg specifičnog porasta alga C. kessleri između kontrole i tretmana. Tukey HSD test korišten je za dokazivanje razlika između N­tretmana i kontrole te P­tretmana i kontrole. Na taj je način utvrđeno postoji li statistički značajan utjecaj dodanih nutrijenata (N, P) na brzinu rasta C. kessleri u određenom uzorku. Multiparametarski testovi primijenjeni su i za utvrđivanje razlike između pojedinih uzoraka za procjenu potencijala rasta alga C. kessleri. Korištena je i linearna korelacija koja se bazirala na 23 uzorka.

Tablica 2: Srednje, minimalne i maksimalne vrijednosti fizičko-kemijskih svojstava vode i koncentracije klorofila-a na istraživanim postajama

Postaja/Parametar

Boroš Drava

1a

Boroš Drava

2a

Boroš Drava

3a

Boroš Drava

1b

Boroš Drava

2b

Boroš Drava

3b

Drava(84 r.km)

D1

Drava(83 r.km)

D2

Kanal Lanka

(Mađarska)

Temperaturavode, oC

18,015,5-22,0

18,115,0-22,0

18,115,0-22,5

19,015,0-22,5

18,915,0-22,0

19,015,0-22,5

19,015,0-22,5

19,015,0-22,5

16,714,0-24,4

Otopljeni kisik,mgO2/l

1,800,82-2,78

4,952,25-7,65

4,053,60-4,50

10,677,61-12,76

9,135,88-11,56

9,375,50-11,38

9,278,93-9,81

9,309,09-9,82

5,061,6-10,08

Zasićenost vode kisikom, %

21,069,52-32,59

57,9126,13-89,68

47,2841,81-52,75

110,9779,60-131,82

94,2961,50-119,42

96,958,0-116,59

102,4694,42-108,68

102,8996,41-107,62

55,1215,625-121,48

pH 7,7247,14-8,30

8,508,32-8,68

8,328,27-8,38

8,538,35-8,71

8,518,36-8,73

8,548,38-8,72

8,178,00-8,35

8,198,01-8,34

8,1957,81-8,65

Provodljivost, µS/cm 620,5522-719

555,5507-604

644640-648

779742-798

761744-772

774751-792

278,75222-311

283221-316

1009,8879-1139

KPK-Mn,mgO2/l

9,09,0-9,0

11,011,0-11,0

11,511,0-12,0

1513,0-17,02

14,5613,0-16,7

15,0713,0-16,22

8,85,0-13,0

5,254,0-6,0

17,237,0-54,0

Ukupni N/Ukupni P

2,841,52-4,16

2,392,27-2,51

1,811,31-2,30

3,832,51-5,05

3,322,47-3,97

4,122,46-5,53

5,741,46-8,39

4,481,59-7,12

1,150,44-2,24

Klorofil-a, µg/l 10,168,96-11,36

47,1046,67-47,53

35,8314,60-57,05

141,5775,43-190,5

67.752,69-77,6

129,3675,17-190,3

12,894,62-25,87

12,123,15-25,87 -

122 Hrvatske vode 18(2010) 72 117-126

J. Horvatić i sur. UtJecAJ nUtRiJenAtA nA potenciJAl RAStA kUltURe CHLOrELLA KESSLErI U VODI BOrOš DrAVE

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

1aBorošDrava

3a 2b D2Drava

LLanka

NO

2 - N

mg/

l

Nitriti kao N

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1aBorošDrava

3a 2b D2Drava

LLanka

Uku

pni N

mg/

lUkupni N

-0,02

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

1aBorošDrava

3a 2b D2Drava

LLanka

NH

4 - N

mg/

lAmonijak kao N

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1aBorošDrava

3a 2b D2Drava

LLanka

NO

3 - N

mg/

l

Nitrati kao N

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1aBorošDrava

3a 2b D2Drava

LLanka

Kje

ldah

l N m

g/l

Kjeldahl N

Slika 5: Koncentracija amonijaka, nitrata, nitrita, ukupnog i Kjeldahl dušika u vodi Boroš Drave, rijeke Drave uzvodno (D1) i nizvodno (D2) od Boroš kanala i kanala Lanka.

Slika 6: Koncentracija orto-fosfata i ukupnog fosfora u vodi Boroš Drave, rijeke Drave uzvodno (D1) i nizvodno (D2) od Boroš kanala i kanala Lanka.0

0,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

1aBorošDrava

3a 2b D2Drava

LLanka

o-P

O4

mg/

l

o-Fosfati

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1aBorošDrava

3a 2b D2Drava

LLanka

Uku

pni P

mg/

l

Ukupni P

Slika 7: Ukupna biomasa i trofički uvjeti prema ukupnoj biomasi C. kessleri.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1aBorošDrava

2a 3a 1b 2b 3b D1Drava

D2 L Lanka

Uku

pna

biom

asa

C. k

essl

eri

(mg/

l)

Hipertrofija

Eutrofija

Mezoeutrofija

Mezotrofija

Politrofija

Slika 8: Razlika u prirastu alga kult. C. kessleri izražena kao jačina limitacije dušikom (ΔmN, d-1), jačina limitacije fosforom (ΔmP, d-1) i jačina kolimitacije N i P (ΔmNP, d-1).

-0,1

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

1aBorošDrava

2a 3a 1b 2b 3b D1Drava

D2 LLanka

Jači

na li

mita

cije

(, d

-1)

N1 N2 N1/P1 N2/P2 P1 P2* *

*** *

**

* ** *

*

* *

*

*

123Hrvatske vode 18(2010) 72 117-126

J. Horvatić i sur. UtJecAJ nUtRiJenAtA nA potenciJAl RAStA kUltURe CHLOrELLA KESSLErI U VODI BOrOš DrAVE

3. REZULTATI

3.1. Fizikalno-kemijska svojstva vodeRezultati mjerenja fizikalno kemijskih parametara

vode i koncentracije klorofila­a na postajama Boroš Drave, rijeke Drave i kanalu Lanka prikazani su u tablici 2 i na slikama 5 i 6. Koncentracije otopljenog kisika bile su najmanje na postaji Boroš Drave ­ 1a, a najveće na postaji 1b. Istodobno, na postaji 1a izmjerene su i najmanje, a na postaji 1b najveće vrijednosti koncentracije klorofila­a fitoplanktona, što je prikazano u tablici 2. Budući da klorofil­a imaju sve alge, rezultati mjerenja koncentracije klorofila­a pokazatelj su njihove biomase. Vrlo niske količine anorganskog dušika ­ nitrata (algama dostupan oblik) i visoke vrijednosti (u odnosu na anorganski oblik) algama nedostupnog organskog dušika (Kjeldahl N) pokazuju da je u Boroš Dravi, kao i u kanalu Lanka, ukupni dušik uglavnom organskog porijekla. Srednje vrijednosti o­fosfata varirale su postajama Boroš Drave od 0,19 do 0,432 mg/l, u Dravi 0,043 ­ 0,046 mg/l, a najveće su bile u kanalu Lanka (0,634 mg/l), što je vidljivo na slici 6. Srednje vrijednosti omjera ukupnog dušika i ukupnog fosfora bile su na svim istraživanim postajama manje od 7. Prema količini otopljenih soli, provodljivost je bila najveća (1009,8 μS/cm) u vodi kanala Lanka. Također su veće vrijednosti provodljivosti (761 ­ 779 μS/cm) bile izmjerene na postajama uz obalu Boroš Drave (1b, 2b i 3b), nego na postajama poprečnog profila (1a, 2a, i 3a).

3.2. potencijal rasta kulture chlorella kessleri

Potencijal rasta alga u uzorcima vode s istraživanih postaja praćen je do stacionarne faze rasta alga kulture C. kessleri, odnosno tijekom 14. dana trajanja eksperimenta. Srednja vrijednost ukupne biomase C. kessleri bila je na istraživanim postajama Boroš Drave veća u obalnom području (89,34 – 101,20 mg/l), nego u poprečnom profilu

rukavca (76,30 – 93,53 mg/l). Također je veći potencijal rasta alga utvrđen u vodi rijeke Drave, nego u Boroš Dravi (slika 7). Na postaji D2 utvrđena vrijednost ukupne biomase C. kessleri iznosila je 271,43 mg/l, a na postaji D1 304,68 mg/l. Najveća biomasa C. kessleri, odnosno najbolji potencijal rasta alga (832,83 mg/l) izmjeren je na postaji kanala Lanka, gdje su i ukupne vrijednosti otopljenih soli i algama dostupne količine anorganskog dušika in situ bile najveće (tablica 2).

Utvrđena je statistički značajna razlika između ukupne biomase C. kessleri dobivene u uzorcima vode uzetim na postajama kanala Lanka u odnosu na biomasu C. kessleri s postaja Boroš Drave (Tukey HSD, p = 0,0001) te između ukupne biomase C. kessleri dobivene u uzorcima kanala Lanka i ukupne biomase C. kessleri u uzorcima rijeke Drave (Tukey HSD, p = 0,002). Klasifikacija stupnja trofije temeljena na vrijednostima ukupne biomase C. kessleri uzgajane u vodi s istraživanih postaja (Žáková, 1986.) ukazuje na mezotrofne uvjete u Boroš Dravi, mezoeutrofne uvjete u rijeci Dravi i mezoeutrofne do hipertrofne uvjete u kanalu Lanka (slika 7).

3.3. Biotest obogaćivanja nutrijentima Tijekom trajanja istraživanja na svim je postajama

Boroš Drave utvrđena značajna jačina limitacije dušikom (Δm N1 i N2, d­1). Također, na postajama Boroš Drava 1a, 2a te 1b i 2b dobiven je i značajan utjecaj dodatka N i P u kombinaciji na prirast alga kulture C. kessleri. U uzorcima vode s postaje rijeka Drava uzvodno ­ D1 i nizvodno ­ D2 nije nađen statistički značajan utjecaj niti dodatka N, niti P, a niti njihove kombinacije na rast testirane kulture alga. To znači da na postajama rijeke Drave N i P pojedinačno i u kombinaciji nisu djelovali kao ograničavajući čimbenici na prirast alga kulture C. kessleri. Također je i na istraživanoj postaji kanala Lanka dodatak testiranih nutrijenata pokazao da niti N niti P pojedinačno, ali ni u kombinaciji, nisu bili ograničavajući čimbenici za rast algi (slike 8 i 9).

Slika 9: Razlika u prirastu kulture C. kessleri izražena kao jačina limitacije dušikom (ΔmN, d-1), jačina limitacije fosforom (ΔmP, d-1) i jačina kolimitacije N i P (ΔmNP, d-1) u uzorcima vode s istraživanih postaja Boroš Drave, rijeke Drave i kanala Lanka. Crveno zaokružen je statistički značajan utjecaj dodatka N na prirast C. kessleri (one way ANOVA, Post-hoc Tukey HSD test, p < 0.05).

124 Hrvatske vode 18(2010) 72 117-126

J. Horvatić i sur. UtJecAJ nUtRiJenAtA nA potenciJAl RAStA kUltURe CHLOrELLA KESSLErI U VODI BOrOš DrAVE

4. RASPRAVA

Prema izmjerenoj dubini vode, koja je na sredini rukavca Boroš Drave iznosila samo 1­1,3 m, možemo govoriti o vrlo plitkom vodenom ekosustavu, u kome su vrijednosti prozirnosti vode varirale između 0,45 i 0,76 m. Prisutna je tendencija smanjivanja dubine Boroš Drave zbog taloženja velikih količina mrtve organske tvari nastale povećanom organskom produkcijom. Budući da je Boroš Drava stari rukavac rijeke Drave, koji vodu dobiva iz kanala Lanka gdje su utvrđene velike količine nutrijenata, postoji opasnost za ubrzanu eutrofizaciju ovog rukavca, odnosno pretvaranje vodenog ekosustava u kopneni, koji će poprimiti obilježja lokalne klimazonalne zajednice (npr. šuma). Često i smanjenje opterećenja nutrijentima može imati slabi efekt, jer se u sedimentu nagomila velika količina vezanog fosfora pa smanjenjem unosa fosfora i padom njegove koncentracije u vodi, važan izvor nutrijenata za fitoplankton postaje otpušteni fosfor iz sedimenta.

Za procjenu limitirajućih nutrijenata za rast fitoplanktona in situ postoji više pristupa. Jedan je pristup mjerenje koncentracije otopljenih nutrijenata u vodi, dostupnih za rast alga. Smatra se da fosfor djeluje kao ograničavajući čimbenik za rast alga ukoliko je koncentracija otopljenog o­fosfata 0,002 mg/l ili manja. Dušik djeluje kao ograničavajući čimbenik za rast alga ukoliko je koncentracija dostupnog dušika oko 0,015 mg/l (Wetzel, 2001.). U nekim uvjetima mogu oba navedena nutrijenta biti u ograničavajućim količinama. S druge strane, u nekim vodama mogu ti nutrijenti biti prisutni u suvišku pa neki drugi čimbenici, kao što su svjetlost ili toksične tvari, mogu djelovati ograničavajuće na rast alga. Drugi je pristup procjena limitirajućih nutrijenata pomoću omjera ukupnog dušika i ukupnog fosfora. Kada je omjer TN/TP veći od 7, ograničavajući faktor rasta alga je fosfor. Kada je omjer TN/TP manji od 7, dušik djeluje ograničavajuće na rast alga (Welch, 1980.). Prema N/P omjerima, na gotovo svim istraživanim postajama utvrđena je N limitacija. Izuzetak su postaje rijeke Drave, gdje niti N niti P nisu u istraživanom razdoblju bili ograničavajući čimbenici razvoja fitoplanktona. Međutim, na postaji kanala Lanka također je utvrđena limitacija dušikom, što se ne podudara s izmjerenim koncentracijama nitrata i o­fosfata. Ovaj rezultat zapravo je posljedica vrlo visokih koncentracija fosfora u vodi kanala Lanka, zbog čega je nastala prividna limitacija dušikom (Welch, 1980.).

Ukupna biomasa C. kessleri u minijaturiziranom biotestu uvjetovana je koncentracijama nutrijenata prisutnim u uzorcima vode (Horvatić i sur., 2006.). Veća vrijednost ukupne biomase C. kessleri na postajama Boroš Drave u obalnom području ukazuje na veću opterećenost nutrijentima uz obalu. Prema klasifikaciji stupnja trofije

temeljenoj na vrijednostima ukupne biomase C. kessleri uzgajane u vodi s istraživanih postaja (Žáková, 1986.), na postajama Boroš Drave utvrđeni su mezotrofni uvjeti. U uzorcima rijeke Drave uvjeti su bili mezoeutrofni, dok su u vodi kanala Lanka uvjeti za potencijal rasta alga kult. C. kessleri bili mezoeutrofni do hipertrofni, ukazujući na značajno opterećenje tog lokaliteta nutrijentima. Manje količine nutrijenata u vodi Boroš Drave posljedica su njihovog iskorištenja za razvoj bogate makrofitske vegetacije.

Hranidbeni elementi (N i/ili P) mogu se u vodi istraživanih postaja nalaziti u koncentracijama koje ograničavaju rast kulture alga u eksperimentalnim uvjetima pa je korištena metoda minijaturiziranog biotesta obogaćivanja nutrijentima (Lukavský, 1992.; Horvatić i sur., 2006.). Intenzitet ili jačina ograničavajućeg djelovanja testiranog hranidbenog elementa kvantificirana je kao intenzitet limitacije dušikom i/ili fosforom (Δm N ili Δm P; d­1), a dobiven je iz razlike prirasta alga kulture C. kessleri u uzorcima u koje su dodani N i P i prirasta C. kessleri u uzorcima vode s testiranih postaja bez dodanih hranidbenih elemenata. Ukoliko dođe do značajno većeg prirasta biomase alga u uzorku u koji je dodan određeni hranidbeni element u suvišku u odnosu na kontrolni uzorak bez tog istog nutrijenta, smatra se da je taj nutrijent ograničavajući čimbenik rasta i razvoja alga. Uzimajući u obzir da biomasu alga i ukupnu produkciju može kontrolirati vrsta kao i intenzitet limitacije nutrijentima (Dodds i sur., 2002.) laboratorijski biotestovi pružaju informacije vezane upravo uz jačinu ili intenzitet limitacije nutrijentima (Ojala i sur., 2003.; Dzialowski i sur., 2005.; Levine i Whalen, 2001.). Biotestom je dobivena značajna jačina limitacije nitratima u uzorcima Boroš Drave, a korelacijskom analizom utvrđena je značajna negativna korelacija između stupnja limitacije nitratima, odnosno dušikom i koncentracija NO3 u vodi (r = ­0.70, p < 0.001), te pozitivna korelacija između stupnja limitacije dušikom i koncentracija o­PO4 (r = 0.77, p < 0.001). Biotest utvrđivanja ograničavajućih čimbenika za rast alga kult. C. kessleri pokazao je da su nitrati stvarni ograničavajući čimbenik potencijala rasta alga u vodi Boroš Drave. Na postajama rijeke Drave, kao i na postaji kanala Lanka N i P pojedinačno ni u kombinaciji nisu djelovali kao ograničavajući čimbenici za rast alga kulture C. kessleri, ukazujući na značajnije opterećenje hranjivim tvarima na tim postajama. Biotest utvrđivanja ograničavajućih čimbenika potvrdio je veliko opterećenje nutrijentima u kanalu Lanka.

Uspoređujući rezultate biotesta obogaćivanja nutrijentima, odnosno procjene jačine limitacije dušikom i/ili fosforom za rast alga kulture C. kessleri na postajama

125Hrvatske vode 18(2010) 72 117-126

J. Horvatić i sur. UtJecAJ nUtRiJenAtA nA potenciJAl RAStA kUltURe CHLOrELLA KESSLErI U VODI BOrOš DrAVE

Boroš Drave, jasno je vidljivo da su ograničavajući čimbenici za rast testirane kulture alga bili nitrati odnosno dušik. Dobiveni rezultati mjerenja kemijskih svojstava vode i potencijala alga daju odgovor o prisutnosti u vodi biološki iskoristivih oblika nutrijenata važnih za rast alga, a time i za procjenu trofičkih uvjeta. Uvođenjem biotesta u monitoring voda mogu se izbjeći brojne skupe kemijske i biološke analize vode, a pomoću ove metode moguće je pratiti stanje plitkih vodenih tijela koja su sklona ubrzanoj eutrofizaciji.

ZAhVALA

Ova istraživanja financirana su sredstvima Hrvatskih voda Osijek, Vodno gospodarski odjel za vodno područje sliva Drave i Dunava. Zahvaljujemo djelatnicima Hrvatskih voda Zvonimiru Kraljeviću i Damiru Galiću na pomoći u terenskom radu.

LITERATURA

APHA (1985.): Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 16th edition. American Public Health Association, Washington DC.

Bischoff, H. W., Bold, C. H. (1963.): Phycological Studies IV. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. Univ Texas Publ No 6318, 32­36.

Camacho, A., Wurtsbaugh W. A., Miracle M. R., Armengol, X., Vicente, E. (2003.): Nitrogen limitation of phytoplankton in a Spanish karst lake with a deep chlorophyll maximum: a nutrient enrichment bioassay approach. J. Plankton Res., 25, 397­404.

Dodds, W. K., Smith, V. H., Lohman, K. (2002.): Nitrogen and phosphorus relationships to benthic algal biomass in temperate streams. Can. J. Fish Aquat. Sc., 59: 865­874.

Downing, J. A., Osenberg, C. W., Sarnelle O. (1999.): Metaanalysis of marine nutrient enrichment experiments: variation in the magnitude of nutrient limitation. Ecology, 80, 1157­1167.

Dzialowski, A. R., Wang, S. H., Lim, N. C., Spotts, W. W., Huggins, D. G. (2005.): Nutrient limitation of phytoplankton growth in central plains reservoirs, USA. J. Plankton Res., 27, 587­595.

Elser, J. J., Kimmel, B. L. (1986.): Alteration of phytoplankton phosphorus status during enrichment experiments: implications for interpreting nutrient enrichment bioassay results. Hydrobiologia, 133, 217­222.

Elser J. J., Marzolf E. R., Goldman, C. R. (1990.): Phosphorus and nitrogen limitation of phytoplankton growth in the freshwaters of North America: A review and critique of experimental enrichments. Can. J. Fish Aquat. Sci., 47, 1468–1477.

Horvatić, J., Peršić, V., Mihaljević, M. (2006.): Bioassay method in evaluation of trophic conditions and nutrient limitation in the Danube wetland waters (1388­1426 r. km). Hydrobiologia, 563, 453­463.

Horvatić, J., Peršić, V., Kočić, A., Čačić, Lj., Has­Schön E. (2009.): Water quality and nutrient limitation in an area of the Danube River and an adjoining oxbow lake (1299 r. km): algal bioassay. Fresenius Environmental Bulletin, 18 (1), 12­20.

ISO (1989.): Water quality ­ Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum. ISO 8692.

Levine, M. A., Whalen, S. C. (2001.): Nutrient limitation of phytoplankton production in Alaskan Arctic foothill lakes. Hydrobiologia, 455, 189­201.

Lukavský J. (1992.): The evaluation of algal growth potential (AGP) and toxicity of water by miniaturized growth bioassay. Water Res., 26, 1409­1413.

North R. L., Guildford S. J., Smith R. E. H., Havens S. M., Twiss M. R. (2007.): Evidence for phosphorus, nitrogen, and iron colimitation of phytoplankton communities in Lake Erie. Limnol. Oceanogr., 52(1), 315­328.

Ojala, A., Kokkonen, S., Kairesalo, T. (2003.): The role of phosphorus in growth of phytoplankton in Lake Vesijarvi, southern Finland – a multitechnique approach. Aquat. Sci., 65, 287­296.

Peršić, V., Horvatić, J., Has­Schön, E., Bogut, I. (2009.): Changes in N and P limitation induced by water level fluctuations in Nature Park Kopački Rit (Croatia): nutrient enrichment bioassay. Aquatic Ecology, 43, 27­36.

Welch, E. B. (1980.): Ecological effects of waste water. Cambridge, Cambridge University Press.

Wetzel R. G. (2001.): Limnology. Lake and River Ecosystems. 3rd edn. Academic Press, San Diego.

Žáková, Z. (1986.): Criteria for evaluation of trophy, and eutrophication, mapping. Algal Assays and their Application (ur. O. Lhotsky, Z. Žáková, P. Marvan), 41­ 47, ČSVTS, Brno.

126 Hrvatske vode 18(2010) 72 117-126

J. Horvatić i sur. UtJecAJ nUtRiJenAtA nA potenciJAl RAStA kUltURe CHLOrELLA KESSLErI U VODI BOrOš DrAVE

DIE AUSwIRkUng VOn nähRSTOffEn AUf DAS wAChSTUMSPOTEnTIAL DER ALgEnkULTUR ChLORELLA kESSLERI

Zusammenfassung. Die Auswirkung von Nährstoffen auf das Wachstumspotential der Grünalgenkultur in der Boros­Dráva, im Kanal Lanka (Ungarn), der in die Drau mündet, und in der Drau (Flusskilometer 84 und 83), die das Wasser der Boros­Dráva aufnimmt, wurde untersucht. Die Auswirkung der vorhandenen Nährstoffen auf das Wachstum der Algenkultur C. kessleri wurde mit einem minimierten Biotest unter Laborbedingungen verfolgt und mit den Nährstoffen unter in­situ­Bedingungen verglichen. Das größte Wachstumspotential der Algen C. kessleri wurde im Kanal Lanka festgestellt, wo auch die meisten Mengen von anorganischem Stickstoff und o­Phosphaten in situ den Algen verfügbar waren. Das niedrigste Wachstumspotential wurde in der Boros­Dráva ermittelt, wo Gesamt­N meistens organischen Ursprungs war. Der Biotest zur Nährstoffbereicherung zeigte an allen Stationen an der Boros­Dráva eine hohe Stickstofflimitierung, d.h. eine N­P­Kolimitierung. An den Stationen an der Drau und im Kanal Lanka wirkten N und P vereinzelt und in Kombination nicht als limitierende Faktoren für das Wachstum der Algenkultur C. kessleri, weisend somit auf eine höhere Belastung mit Nährstoffen an diesen Stationen hin. Die Biotest­Methode ist für die Beobachtung von throphen Bedingungen und limitierenden Nährstoffen in seichten, der höheren Eintragung von Nährstoffen ausgesetzten Gewässern günstig.

Schlüsselwörter: minimierter Biotest, throphe Bedingungen, limitierende Nährstoffe, Chlorella kessleri, Boros­Dráva, Fluss Drau (Flusskilometer 84 und 83)

IMPACT Of nUTRIEnTS On ThE gROwTh POTEnTIALS Of ChLORELLA kESSLERI

Abstract. The impact of nutrients on the growth potentials of the green algae Chlorella kessleri was investigated in the Boroš Drava, in the Lanka canal (Hungary) which flows into it and also in the Drava River (84 and 83 r.km), which receives waters from the Boroš Drava. The impact of the available nutrients on the growth of the algal culture C. kessleri was monitored by means of the miniaturized biotest in laboratory conditions and then compared with the nutrients in the in situ conditions. The greatest growth potential of the algae C. kessleri was determined in the Lanka canal, where the highest in situ quantities of inorganic nitrogen and O­phosphates were available to the algae, and the lowest in the Boroš Drava, in which the total N was mostly of organic origin. The biotest of nutrient enrichment showed a significant nitrogen limitation, i.e. N and P co­limitation at all stations of the Boroš Drava. At the stations of the Drava River and the Lanka canal, N and P, both individually and combined, did not act as a limiting factor on the growth of the algal culture C. kessleri, thus indicating a significant nutrient load at these stations. The biotest method is suitable for monitoring of trophic conditions and limiting nutrients in shallow waters which are exposed to increased nutrient input.

Key words: miniaturized biotest, trophic conditions, limiting nutrients, Chlorella kessleri, Boroš Drava, Drava River (84 and 83 r.km)