CHS1O07S8

Dis^ETHNr.8990

£TTH-J)>'u—f?fO

Liposomen als Träger der ß-Strahler Rhenium-186 und Rhenium-188

zur Anwendung in der Radiotherapie

ABHANDLUNG

zur Erlangung des Titels eines DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN

der EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE

ZÜRICH

vorgelegt von

URSHAFELI eidg. dipl. Apotheker

geboren am 18. Juli 1960 von Klingnau (AG)

angenommen auf Antrag von

Prof. Dr. H.G. Weder, Referent Dr. L. Tiefenauer, Korreferent

ok Kohler Zürich 1989

ET* - Vs.5» - - Xlto

Diss. ETH Ni. 8990

Liposomen als Tiäga der flr-äaWei Rhenium-186 und Rhenium-188

zur Anwendung in der Radiotherapie

ABHANDLUNG zui Erlangung des Titels eines

DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN der

EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZÜRICH

vorgelegt von

URSHÄFEU eidg. dipl. Apotheker

geboren am 18. Juli 1960 von Klingnau (AG)

angenommen auf Antrag von

Prof. Dr. H.G. Weder. Referent Dr. L. Tiefenauer. Korreferent

1989

Für Lydia

Ich möchte meinen Eltern danken füi die jahrelange Unterstfzur j .

Die vorliegende Arbeit wurde am Paul Scherrer Institut in Vir igen ur 'er der wohlwollenden Leiung von

Herrn Prof. Dr. H.G. Wedei

und der unermüdlichen Unterstützung und Betreuung von

Herrn Dr. L Tiefenauer

durchgeführt. Ich möchte beiden für ihr Interesse und ihre s'ändige

Gesprächs- und Diskussionsbereitschaft danken.

Vielen Dank auch an Dr. P. Bläuenstein und Dr. H.F. Beer s. wie Dr. A. Amman, nicht zu vergessen meine beiden Kollegen Dr. G. Hu'c er rnd i? . R. Alberto, welche mir in allen chemischen Problemen Auskur»1 und R^t wussten.

Ein ganz besonderer Dank gebührt meinen Ko!'.egen und Kolleginnen n der Gruppe Weder am Pharmazeutischen Institu der ETH 7u:ich Tür ihr-? stete Hilfsbereitschaft und die immer prompte G össenmessury r?iner i_'-posomenproben.

Bedanken möchte ich mich auch bei Dr. E. Wehr'i (Institu' f,.ir Zellb'o'ogie der ETHZ) für die elektronenmikroskopischen Au'nahrnen.

Ich möchte Herrn Dr. Schubiger und dem gesamten Team ÖÖS Labors iür Radiopharmazie (ehemals Isotopenproduktion) in Sekretariat, .«.'eik tciit und Labor danken füi die Bereitstellung aller notwendigen H;'f?T-.»r';i und a q gute Arbeitsklima.

Vielen Dank dem Bibliothekar Herrn Dr. S. Huwyler u<-3. pe./sr : lanr-schaft für das Bestellen aller Literaturstellen und der !.'n!-.'fstf,Jzu? j brA der Literatursuche. Herr Dr. R. Andres löste mir e;n kompl.zie:._-s -laih ,-malisches Problem, merci!

Dem PSI gebührt ferner Lob für die finanzielle Unic-stuizun j v.r.d c'-e gu­te Küche unter der Leitung von Herrn Stalder.

Ferner danke ich allen anderen die, entweder au! geistes -, naturv issen-schaftlichem, oder auf beiden Gebieten zum Gelingen dieser Arbeit bei­getragen haben.

Inhaltsverzeichnis Seite

Zusammenfassung

Summary

Liste der Abkürzungen Erwähnte Elemente Einheilen der HaciioaM'vitä!

1 Einleitung

1.1 ß-Strahler in der Nuklei rr.edizin 11 1.1.1 Physikalisch*- Gexseoenheiten d ^-Zerfalls 1.1.2 Effekte der ß-. :ilung auf UÖ G* vebe und

ihre Anwendung

1.2 Geschichte des Elementes Rhenium 13

1.3 Eigenschaften von Rhenium 13 1.3.1 Physikalische Rhenium-Eigensch-üen 1.3.2 Die Chemie von Rhenium 1.3.3 Eigenschaften üt»r radioaktiven Hheniumisotope

186Re und 1flaRe

1.4 Anwendung von Rhenium in der Nukltdtraedizin 17 1.4.1 Rückblick 1.4.2 Aussicht

1.5 Liposomen als Träger von ß-Strahlern 19

1.6 Zielsetzung 21

2 Herstellung und Charakterisierung der Liposomen

2.1 Einleitung 23

2.2 Material und Methoden 25 2.2.1 Lipide und Chenikalien 2.2.2 Liposomenhersteilung

2.2.2.1 Herstellung mittels Ultraschall 2.2.2.2 Herst*!; ;ng mit'els Gelfiltration

- 2 -

Seite 2.2.3 Charakterisierung der Liposomen

2.2.3.1 Grössenmessung mittels Laserlichtstreuung 2.2.3.2 Grössenmessung mittels Elektronenmikroskopie 2.2.3.3 Phospholipidanalytik mittels HPLC 2.2.3.4 Restdetergensgehaltsbestimmung 30

2.2.3.4.1 Prinzip 2.2.3.4.2 Materialien und Methode 2.2.3.4.3 Resultate und Diskussion

2.3 Resultate 33 2.3.1 Liposomencharakteristik 2.3.2 Charakteristik der Gelfiltration

2.4 Diskussion 37

3 Einschluss von Penhenat in die Liposomen

3.1 Einleitung 39

3.2 Materialien und Geräte 39

3.3 Methoden 40 3.3.1 Herstellung der YRe04~ -Lösung 3.3.2 Liposomenherstellung mit Perrhenateinschluss 3.3.3 Stabilitätsbestimmung mittels Gelfiltration

3.4 Resultate und Diskussion 41 3.4.1 Herstellung der YRe04~-Lösung 3.4.2 Perrhenai-Einschluss in Ultraschall-Liposomen 3.4.3 Stabilität der Ultraschall-Liposomen

4 Einschluss von Rhenium in DTPA-SA-Liposomen

4.1 Einleitung 45

4.2 Vergleich von Rhenium und Technetium 48

4.3 Material und Methoden 49 4.3.1 Chemikalien und Material 4.3 2 Liposomenherstellung 4.3.3 Beladen von DTPA-SA-Liposomen mit " m T c 4.3.4 Stabilitätsbestimrnung von 99mTc-DTPA-SA-Liposomen

mittels Dialyse 4.3.5 Beladen von DTPA-SA-Liposomen mit YRe

4.4 Resultate und Diskussion 51 4.4.1 99mTc-DTPA-SA-üposomen 4.4.2 Stabilität der 99mTc-DTPA-SA-Liposomen 4.4.3 YRe-DTPA-SA-Liposomen

4.4.3.1 Reduktion von ReGV 4.4.3.2 Komplexierung von Rhenium an

DTPA-SA-Liposomen 4.4.4 Problematik der Reduktion von Re(VII)

- 3 -

Seite 5 Herstellung verschiedener Tetraaminkomplexe mit Rhenium

5.1 Einleitung 63 5.2 Analysengeräte und Chemikalien 65 5.3 Methoden 66

5.3.1 Synthese von Rephos 5.3.2 Synthese eines Rephos-Isomeres 5.3.3 Synthese von [Re02(en2)]Cl und [Re02(en)2]PF6 5.3.4 Synthese von [Re02(2.3.2-tet)]Cl 5.3.5 Synthese von mtp-SA

5.3.5.1 Gemischte Anhydrid-Methode 5.3.5.2 Diphenylphosphorylazid-Methode

5.4 Resultate und Diskussion 68 5.4.1 Analyse des grünen /tep/?os-Komplexes 5.4.2 Analyse des violetten Rephos-Komplexes 5.4.3 Analyse der [Re02(en)2]

+-Komplexe 5.4.4 Analyse des [Re02(2,3^-tet)]Cl-Komplexes 5.4.5 Resultate der mtp-SA-Synthese

5.4.5.1 Gemischte Anhydrid-Methode 5.4.5.2 Diphenylphosphorylazid-Methode

5.5 Zusammenfassung 77

6 Herstellung von Methylthiosemicarbazidkomplexen mit Rhenium

6.1 Einleitung 79 6.2 Material und Methoden 80

6.2.1 Chemikalien 6.2.2 Synthese von Polystyrol-mts 6.2.3 Markierung des Polystyrol-mts mit YRhenium 6.2/ Stabilitätsbestimmung von aps-mts-YRhenium

6.2.4.1 Stabilitätsbestimmung mittels Zentrifugation 6.2.4.2 Stabilitätsbestimmung mittels Dialyse

6.2.5 Herstellung von SA-mts 6.2.5.1 Versuch ].• Reaktion in der Schmelze 6.2.5.2 Versuch 2-. Reaktion in Lösung

6.3 Resultate und Diskussion 83 6.3.1 Bindung von Rhenium an poiystyrolgebundenes mts 6.3.2 Stabilitätsbestimmung von Re-mts 6.3.3 Herstellung von SA-mts

6.3.3.1 Versuch 1: Reaktion in der Schmelze 6.3.3.2 Versuch 2. Reaktion in Lösung

6.4 Zusammenfassung 86

- 4 -

7 Einschluss des flep/ias-Komplexes in Liposomen Seite

7.1 Einleitung 89

7.2 Methoden 90 7.2.1 Synthese von YRephos aus YPerrhenat 7.2.2 Neutronenaktivierung des inaktiven /?ep/70S-Komplexes 7.2.3 Herstellung von Liposomen mit YRephos IIA Stabilitätsbestimmung der Y/?ep/70s-Liposomen mittels

Dialyse gegenüber Phosphatpuffer und Vollblut

7.3 Resultate und Diskussion 91 7.3.1 Synthese von YRephos aus YReC>4~ und Liposomen-

einschluss 7.3.2 Neutronenaktivierung des inaktiven Rephos-Komplexes 7.3.3 Liposomeneinschluss des YRephos -Komplexes nach

Neutronenaktivierung 7.3.4 Stabilität der YRephos-Liposomen

7.4 Dosisberechnungen mit lfl6Re und 188Re 98 7.4.1 Grundlagen 7.4.2 Beispiel-Dosisberechnung für eine Radiosynovior-

these mit einer Mischung von 186Re und 188Re

8 Schlussdiskussion 101

8.1 Einschluss von wasserlöslichen Rheniumderivaten in 102 das Liposomen-Innere

8.2 Einbau einer Ankergruppe in die Liposomenmembran 102 mit nachfolgender Kopplung von Rhenium

8.3 Einbau eines lipophilen Rheniumkomplexes in die 104 Liposomenmembran

8.4 Ausblick 104

Literaturverzeichnis 107

10 Anhang Zerfallsberechnungen eines Gemisches von 186Re und 188Re 115

11 Lebenslauf 117

- 5 -

Zusammenfassung

Dank ihrer sirahiencharakierislischen Eigenschaften sind die beiden ß~-Strahler 186Rhenium und 166Rhenium (Re) geeignet zur Radiotherapie in der Nuklearmedizin. Um eine zukünftige Anwendung zu ermöglichen, wur­den Liposomen als ein nicht irritierendes und abbaubares Trägersystem gewählt. Therapeutisch erforderliche Mengen von 10 mCi (= 370 MBq) sollten . tabil mit Liposomen assoziiert werden.

1. Mittels Ultraschall wurden Liposomen von ?8 nm Grösse hergestellt, welche nur 0.64% des im Puffer enthaltenen radioaktiven Perrhenates ent­hielten. Dies ist die bei dieser Liposomengrösse und Lipidkonzentration berechnete Einschlussrate ohne Anreicherung. Für eine praktische Anwen­dung ist diese Methode unakzeptabel, umsomehr als die Liposomen nicht stabil waren. Nach 2 Tagen wurde sämtliches Perrhenat ausserhalb der Vesikel gefunden.

2. Es wurden Liposomen mit DTPA-stearat (DTPA-SA) hergestellt und mit Technetium (Tc) und Rhenium markiert. Technetium konnte problemlos komplexiert werden, die mittels Dialyse bestimmten Bindungen Tc-D~PA-SA-Liposomen waren stabil. Versuche, auf die gleiche Weise Rhenium zu komplexieren waren nicht erfolgreich, da die Sn2+-Menge, die zur Reduk­tion benötigt wurde so gross war, dass die Liposomen zerstört wurden.

3. Der dreizähnige Ligand Methylthiosemicarbazid (mts) wurde kovalent an Aminomethylpolystyrolkügelchen gekoppelt. An diesem Modellsystem wurde die Markierungsausbeute und die Stabilität des gebildeten Re-mts- Komplexes untersucht. Nach einem anfänglichen Radioaktivitätsver­lust von 40 % entwichen weiterhin pro Tag noch linear 1.0 % aus den Po-lymerkügelchen. Die Synthese eines zu DTPA-SA analogen SA-mts. wel­ches im Liposomenbilayer verankert werden könnte, gelang nicht.

4. Der Rheniumkomplex ReO(OCH2CH3)Cl2(PPh3)2 =Rephos) in zwei iso­meren Formen wurde synthetisiert und charakterisiert. Dieser hoch lipo-phile Komplex wurde mittels Neutronenbestrahlung radioaktiv gemacht und zusammen mit Eierlecithin und dem Detergens Natriumdesoxycholat in eine Mischmizelle eingebaut. Daraus durch Gelfiltration hergestellte Liposomen mit einem Durchmesser von 60-80 nm enthielten bis zu 53.5 % der zuge­gebenen Radioaktivität. Die Stabilitätsdialyse zeigte nach einem 10-15 %igen Verlust am ersten Tag eine lineare Abnahme von täglich 3.3 %. Durch Beigabe von Antioxidantien wie Vitamin C konnte dieser Radioaktivitäts­verlust auf 1.0 % verkleinert werden, so dass nach 8 Tagen noch 82 % der Aktivität in den Liposomen gefunden wurde. Im Diaiysat wurde nur Per­rhenat nachgewiesen.

- 6 -

5. Es wurden die Tetraaminkomplexe [ReC2(en)2]Cl und [ReC>2(l .4.8.11-tetra-azaundecan)]Cl hergestellt und charakterisiert. Der Ligand mtp. ein Dipro-pionsäuret privat von Tetraazaundecan. konnte aber nicht in die Liposo­men veranKert werden, da die Kopplung an SA nicht gelang.

6. Zur Charakterisierung der Liposomen wurde eine enzymatische Deter-gensbesümmungsmethode erarbeitet. Cholsäurederivate können damit nach Verdünnen ohne Extraktionsschritte direkt in den Liposomen bestimmt wer­den.

Das Ziel. "Therapieliposomen" mit 10 mCi einer Mischung von 186Re/ia8Re herzustellen, wurde durch Inkorporation des lipophilen Rephos -Komplexes in die Liposomenmembran erreicht. Die Grösse dieser Vesikel kann variiert werden durch Änderung des verwendeten Detergenses. Dadurch eignen sich diese Liposomen zur Therapie wie beispielsweise zur Radiosynovior-these im Knie.

- 7 -

Summary

The two radioisotopes 186Rhenium and 188Rhenium (Re) are highly favou­red as therapeutic nuclides in nuclear medicine due to their unique ra­diation characteristics. For application in future we have chosen liposomes as biodegradable and not irritating carriers. For this purpose liposomes were filled stable with a radioactivity dose required for therapy (10 mCt = 370 MBq).

1. Small unilamellar liposomes (SUV's) of an average size of 28 nm were prepared by ultrasonic irradiation. They encapsulated only 0.64 % of the radioactive perrhenate into the internal volume. This is the amount that would be expected from calculations of the internal volume based on size and lipid concentration of the liposomes. This method has no practi­cal use because of poor yield incorporation. Moreover, these liposomes were unstable. The perrhenate was found to be outside the vesicles within two days.

2 Liposomes carrying a complex anchored in their bilayer (DTPA-SA) (SA = octadecylamine) were synthesised in order to form a complex with Technetium (Tc) and Rhenium. Technetium was complexed in high yield and the Tc-»DTPA- liposome bindings were found to be stable when tested by dialysis. Similar attempts to complex Rhenium were not successful because the amount of Sn2+ required for the reduction was so high, that the liposomes were destroyed.

3. The tridentate ligand, methylthiosemicarbazide (mts), was coupled cova-lently to aminomethylpolystyrol. These spheres were used as a very con­venient and simple model for testing the labelling-yield and the stability of the Rhenium-mts-complex. After an initial loss of 40 % radioactivity, the decrease that followed was linear at the rate of 1.0 % per day. The synthe­sis of the ligand-lipid conjugate mts-SA was not successful.

4. Two isomers of the complex ReO(OEt)Cl2(PPh3)2 i-Rephos) were syn­thesised and characterised. This highly lipid-soluble inactive complex was irradiated by neutrons and then used to prepare a mixed micelle with egg yolk lecithin and the detergent sodium deoxycholate. From this mi­celle Rephos-liposomes could be produced in a size of 60 - 80 nm in a very simple way by gelfiltration. Up to 53.5 % of the radioactivity could be incorporated. Monitoring the stability by dialysis an initial loss of 10-15 % and a subsequent linear decrease were observed. The daily loss could

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be reduced from 3.8 % to 1.0 % by the addition of ascorbic acid to the dialysis buffer. After 8 days. 82 % of the initial activity still remained in the vesicles. Only perrhenate was found in the dialysate.

5. The tetraamine-complexes [Re02(en)2]Cl-2H20 and [Re02(l,4.8.11-tetra-azaundecane)]Cl were synthesised and characterised. The ligand mtp, a derivative of tetraazaundecane with two propionic acid groups, could not be anchored into the liposome bilayer. This occured because the coupling of mtp to SA was not successful.

6. A direct enzymatic mei.iod to determine remaining detergents in lipo­somes was developed, requiring only a simple dilution step.

The goal of making liposomes that could carry a mixture of 186Re and 188Re in therapeutic doses of 10 mCi was reached, when the lipophilic /?ep/)os-complex was incorporated during the liposome production. The size of these liposomes can be varied by changing the detergent used thus making them useful in therapies such as radiosynoviorthesis of the knee.

- 9 -

Liste der Abkürzungen

Y

äps

cpm cps

DC diars dipy DMF DMPE DMSO DSPC dmtu DP DPPA DTPA

E° El 00 EA EDTA EHDP en eV Gy

HEDP HPLC

IBCF IR L/D LLS

MAG3

MDP MG MLV mtp mts n NA NMR

PA

Radioaktivitätszeichen, d.h. diese Substanz ist radioaktiv

Aminomethylpolystyrol

Zerfälle pro Minute Zerfälle pro Sekunde

Dünnschichtchromatogramm o-Phenylen-bis-(dimethylarsin) Dipyridyl Dimethyliormamid 1.2-Bis-(dimethylphosphino)-ethan Dimethylsulfoxid Distearoylphosphatidylcholin Dimethylthioharnstoff Diphenylphosphat Diphenylphosphorylazid Diethyltriaminopentaessigsäure

Stand.^rdreduktionspotential Eilecithin El00 Elementaranalyse Ethylendiaminotetraessigsäure Ethan-(l-hydroxy-l,2-diphosphonat) Elhylendiamin Elektronenvolt

Gray (= 100 rad)

l-Hydroxy-(ethyliden)-diphosphonat Hochdruckflüssigkeitschromatographie

Isobutylchloroformiat Infrarotspektroskopie

Molares Verhältnis von Lipid zu Detergens Laserlichtstreuung (» Laser Light Scattering)

Mercaptoacetylglycylglycylglycin Methylendiphosphonsäure Molekulargewicht Multilamellare Vesikel 2,12- Dimethy 1-2,5,9,12- tetraazatridecan- 5,9- di- Propionsäure 4-Methyl-3-thiosemicarbazid

Neutron Neutronenaktivierung Kernresonanzspektrum (- Nuclear Magnetic Resonance)

Phosphatidylsäure

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PBS 7.4 Pc PC PE PEt3

PPh3

py

Rf Rephos RES RP

SA S.D. SM SUV

tet tmtu tu

UV/Vis

Phosphatpuffer pH 7.4 50 mM Papierchromatogramm Phosphatidylcholin Phosphatidylethanolamin Triethylphosphin Triphenylphosphin Pyridin

Ratio of fronts Oxodichloroethoxy-bis-(triphenylphcsphin)-rhenium(V) Retikuloendotheliales System Reverse Phase

Stearylamin = Octadecylamin Standardabweichung Sphingomyelin Kleine unilamellare Vesikel (- Small Unilamellar Vesicles)

2.3,2-tet - 1.4.8,11-Tetraazaundekan Tetramethylthioharnstoff Thioharnstoff

Spektroskopie im ultravioletten/sichtbaren Bereich

Erwähnte Elemente:

Ag As Au Br Co Cr Cu Dy Er Fe Ir I

Silber Arsen Gold Brom Kobalt Chrom Kupfer Dysprosium Erbium Eisen Iridium iod

Lu Mn Mo Ni Os P Pb Pd Pm Pr Pt S;i

Einheiten der Radioaktivität:

Die internationale SI-Einheit der Radioaktivität ist das Bequerel (Bq) in [s -1]. Gemäss Bundesgesetz über das Messwesen darf das Curie (Ci) als Einheit mit eingeschränktem Anwendungsbereich im Strahlenschutz und in der Medizin weiter verwendet werden. Die Umrechnung lautet:

1 Ci - 3.7-1010 Bq - 37 GBq 1 jxCi - 3.7-104 Bq - 37 kBq 1 mCi - 3.7-107 Bq - 37 MBq 1 nCi - 3.7-101 Bq - 37 Bq

Lutetium Mangan Molybdän Nickel Osmium Phosphor Blei Palladium Promethium Praseodym Platin Zinn

Re Rh Ru S Ta Tb Tc Te V W Xe Y

Rhenium Rhodium Ruthenium Schwefel Tantal Terbium Technetium Tellur Vanadium Wolfram Xenon Yttrium

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1 Einleitung

1.1 3-Strahler in der Nuklearmedizin 1.1.1 Physikalische Gegebenheiten des ß-Zerfalls 1.1.2 Effekte der ^Strahlung auf das Gewebe und ihre Anwendung

1.2 Geschichte des Elementes Rhenium

1.3 Eigenschaften von Rhenium 1.3.1 Physikalische Rhenium-Eigenschaften 1.3.2 Die Chemie von Rhenium 1.3.3 Daten der radioaktiven Rheniumisotope ,8*Re und ,MRe

1.4 Anwendung von Rhenium in der Nuklearmedizin 1.4.1 Rückblick 1.4.2 Aussicht

1.5 Liposomen als Träger von (J-Strahlern 1.6 Zielsetzung

i.i ß-Strahler in der Nuklearmedizin

1.1.1 Physikalische Gegebenheiten des ß-Zerfalls

Bei einem ß"-Zerfall wandelt sich ein Neutron im Atomkern in ein Proton um, wobei ein Elektron abgegeben wird. Die maximale Energie dieses Elektrons (auch ß-Tei!chen genannt) entspricht dem Unterschied der Atommassen vor und nach dem ß-Zerfall. Meistens wird ein Teil der Energie in einem Neutrino abgeführt, so dass die ß-Energie kleiner als das theoretische Maximum ist. Darum sehen wir bei ß-Strahlem auch ein kontinuierliches Spektrum der Energie von Null bis zu einem entspre­chenden Maximum. Die mittlere Energie ist etwa ein Drittel der maximalen Energie. Sehr häufig entsteht beim ß~-Zerfall ein Tochternuklid in einem angeregten Zustand. Die maximale Energie für ein ß-Teilchen ist somit die Eneigiedifferenz zwischen dem Anfangszustand und dem angeregten Zustand des Kernes.

Im umgekehrten Prozess, wenn der Kern ein extranukleares Elektron ein­fängt, wird ein Proton in ein Neutron umgewandelt. Dieser Elektronenein­fang E führt nicht direkt zur Abstrahlung von Partikeln, aber es resultiert eine nicht vollständig gefüllte innere Schale.

So können also beide Zerfallsprozesse zu einem angeregten Zustand des Kernes führen. Diese überschüssige Energie wird durch Abgabe von einem oder mehreren y-Ouanten oder durch direkte Emission eines Elek­trons aus der Schale, einem sogenannten (internen) Konversionselektron e", abgegeben. Diese Konversionselektronen können von der K-, M-oder L-Schale kommen und sind monoenergetisch mit einer kinetischen Energie, die der Energie der entsprechenden y-Strahlen nach Abzug der Bindungsenergie des Elektrons entspricht.

- 12 -

Sowohl beim Elektroneneinfang als auch bei dei Elektrcnenkonversion können die inneren Schalen durch Elektronen aus einer höheren Schale aufgefüllt werden, was zur Abgabe von Röntgenstrahlung führt. Eine an­dere Möglichkeit ist die direkte Abgabe eines Elektrons, eines sogenann­ten Auger-Elektrons. Diese Elektronen hatten dann die Energie dei ent­sprechenden Röntgenstrahlung minus der Bindungsenergie des Elektrons. ß~-Zerfall oder Elektroneneinfang können also von y-Strahlung. Röntgen­strahlung oder Emission von Konversions- und Auger-Elektronen begleitet sein!

1.12 Effekte der ß-Strahlung auf das Gewebe und ihre Anwendung

Die heutigen Radionuklidlherapien basieren im Unterschied zu den diag­nostischen Verfahren fast ausschliesslich auf der Verwendung von ß-Strahlem (Review und Lehrbuch: Haiben 1987). Allgemeine Verwendung finden 13ll bei Hyperthyroidismus und Schilddrüsenkrebs, 3aP bei Polycy­themia vera und zur palliativen Knochenkrebsbehandlung. 198Au bei rheumatoider Arthritis in den Gelenken (Synoviorlhese). Mehr und mehr werden die genannten Radionuklide aber durch bis jetzt noch relativ unbekannte Elemente ergänzt oder sogar verdrängt. Ihre Vorteile sind meist physikalischer Art. Die Ganzkörperbelastung wird durch kleinere y-Anteile vermindert, die Reichweite kann optimiert und die Bestrah­lungsdauer dank kurzer Halbwertszeit minimiert werden. Beispiele solcher ß-Strahler sind 67Cu, 83Br. 90Y, 109Pd. 121Sn, 127Te. t42Pr, 143Pr. 165Dy. 169Er, ,fl6Re und ,8aRe Adelslein und Kassis 1987) sowie zusätzlich 35S. 77As, inAg. 149Pm, 161Tb und *77Lu Andres et al. 1986).

Je höher die Energie der Teilchen, umso grösser ist die Reichweite der ß-Strahlung. Diese ist alleine abhängig von der Teilchenenergie und der Dichte des umgebenden Materials. Im Gewebe kann die Reichweite in mm durch Multiplizieren der maximalen Energie in MeV mit dem Faktor 0.2 abgeschätzt werden.

Reine ß-Strahler können ausserhalb des Gewebes nur indirekt nachge­wiesen werden. ß-Strahler, die zusätzlich y- Photonen emittieren, haben den Vorteil, dass die weitreichende y-Strahlung dazu verwendet werden kann, die Verteilung der Radionuklide sowie ihre Menge zu bestimmen. Normalerweise trägt diese nur unbedeutend zur Strahlenbelastung des Zielgewebes bei, sofern ihr Anteil und ihre Energie nicht zu gross ist.

- 13 -

12 Geschichte des Elementes Rhenium

Die Geschichte des mit einem Vorkommen von 7-10~a % in der Erdkruste seltensten Elementes mit der Ordnungszahl 75 begann im Jahre 1869, dem gleichen Jahr, als das Periodensystem der Elemente aufgestellt wurde. Mendelejew beschrieb darin in der 7. Nebengruppe die zwei noch nich. entdeckten Elemente Ekamangan (Z-43) und Dwimangan (Z=75) (Mende-lejeff 1891). Es sollte aber noch bis 1925 dauern, bis Walter Nodüack und Ida Tacke (später Frau Noddack) zusammen mit Otto Berg nach aufwen­digen Aufreinigungsverfahren von russischem Platinerz und Columbit im Röntgenspektrum die 5 Linien des Elementes 75 fanden (Noddack et al. 1925). Nach der Heimat Frau Noddacks, dem Rheinland, wurde das ge­fundene Metall Rhenium (lat. Rhenus, der Rhein) benannt. Es ist das zu­letztgefundene stabile Element des Periodensystems.

Bis ins Jahr 1929 arbeitete das Ehepaar Noddack aus Molybdänit M0S2 insgesamt 1 g reines Rhenium auf und begann damit, Chemie zu be­treiben. Das dabei entwickelte industrielle Verfahren wird auch heute noch zur jährlichen Weltproduktion von ungefähr 10 Tonnen Rhenium verwendet. Dabei wird beim Rösten der Kupfer-Molybdän-Erze das bei 362*C flüchtige Re207 durch Elektrofilter aus den Abgasen gewonnen.

Ausser im Düieskasganit. der chemisch als Pb4Re3Mo3Si6 geschrieben wird, tritt Rhenium in keinem Mineral in einer so hohen Konzentration auf, dass es in der Summenformel erwähnt werden müsste (Pokiowskaja 1976).

1.3 Eigenschaften von Rhenium

1.3.1 Physikalische Rhenium-Eigenschaften

Natürlich vorkommendes Rhenium hat eine Atommasse von 186.2 und be­steht aus den beiden stabilen Isotopen 185 (37.4 %) und 187 (62.6 %).

Im Periodensystem steht es in der siebten Nebengruppe VIIB (siehe Ta­belle 1). Seine Eigenschaften wurden durch Vergleich mit seinen Nachbarn Wol­fram und Osmium von Noddack et al. 1925 ziemlich genau vorhergesagt. Rhenium ist mit ?\ kg pro Liter das viertdichteste Element. Der Schmelz­bzw. Siedepunkt wird nur noch von Wolfram übertroffen. Rhenium ist diesem gegenüber aber viel plastischer. Dank seiner grossen Zugfestig­keit und seinem kleinen thermischen Ausdehnungskoeffizienten wird es als idealer Werkstoff in Massenspektrometerfilamenten, zusammen mit

- 14 -

V B

23V Dichte

Smp./Sdp.

VI B

41 Nb

73Ta

24 Cr

4211 Mo

74 W 19.3

3410/ ,5930

VII B

2öMn 7.43

43 11.3

;TC

21.0 3180/8900

2öFe

44 Ru

760S 22.6

3000/SSOO

VIII 3

27CO t 2B

45

77Ir

46

78

Mi

Pd

Pt 22.5 i 21.-1

2454 /53001 TC0.--J53O

Tat*ll* 1 P w i o d r n q p t m a u m g mit dm f. Nabtngnppt

Wolfram und Molybdän in Legierungen oder auch In Pt-Re- Katalysatoren (Rheniform®) zur Benzinherstellung verwendet. Die Elektronenkonfiguration von Rhenium ist [Xe]4f145d56s2, seine Elek-tronegativität beträgt 1.9.

1.32 Die Chemie von Rhenium

Metallisches Rhenium ist an der Luft völlig oxidationsunempfindlich, erst ab 300*0 kann eine merkliche Oxidation beobachtet werden. Von Salz-, Fluss- und Schwefelsäure wird Rhenium wie Platin unter normalen Be­dingungen nicht angegriffen, H2O2 und Salpetersäure oxidieren es zu HRe04.

Rhenium liegt in den Oxidationszahlen -III sowie allen zwischen -I und +VII vor (siehe Tabelle 2). Im Unterschied zu Mangan, welches als stabil­sten und charakteristischsten Oxidationszustand +11 hat, besteht die Rhe­niumchemie vorwiegend in der Chemie des +1V- und speziell des +V-Oxidationszustandes. Perrhenat (ReCV) ist viel weniger oxidierend als Permanganat (MnCV), KReCu ist daher als Ausgangsprodukt die wichtig­ste Rheniumverbindung. Es kristallisiert wasserfrei in Form von farblosen, tetragonalen Bipyramiden (Löslichkeit bei RT 9.9 g/1, bei 100t 104.4 g/1). Charakteristisch für die Re(+IU)-Verbindungen und ihrer Halogene ist die Tendenz, Metall-Metall-Bindungen einzugehen. Auch im Oxidationszu­stand +IV wurden solche Komplexe nachgewiesen.

Eine gute Übersicht über die Rheniumchemie (sowie den Gruppenpartner Technetium) geben Earnshaw und Greenwood 1987 sowie Cotton und Wilkinson 1988.

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Chalkogene:

Halogene:

Oxohalogene:

CO-Komplexe:

Div. Komplexe:

+VH '.!

-V -IV

•Vi! -Vi -V

•III

+v;i • VI +v

-in -i 0

+i +ii +m

•IV • v

•VI

Re207-2H2C, R e O r

R e 0 3

Re2O s

Re0 2 . ReS~. ReSe;.

ReF7

ReF6. PeCi6

ReF5. ReU5. RePr5

ReF4. ReC»4. ReBi4, Rel4

Re3Cl9. rte3Br9. Re3lo. r ^ e 2 C ! 6 ] 2 -

ReOF5, R e O r 3 . i e C / ' . R0O3G. Re03Br ReOF4. ReC ":i4> ReOBr4

ReOF3

[?3(CO),j3-[KeXCOsj-

Re2(CO)io

K5[Re(CN)6]. [ReCDMPE)3]* Re(diars)2Cl2

Re2Cl6(PEt3)2. Re(C2Ph2S2)3 [Re(DMPE)2Cl2]

+

ReCUCdiars) [Re02en2]Cl-2H20. ReOCl3(dipy) Re(C3N2S2), Re(MAn3) Re02(mesityl)2

Tabelle 2 Bsiapitl* von voTkonunanten Rhtniumvwbindungan «uf vandüadimn Oxidatiana-ftuffcn.

1.3.3 Eigenschaften der radioaktiven Rheniumisolope 186Re und lflaRe

Diese beiden Radionuklide können dank ihrer günstigen Neutronenein­fangsquerschnitte ohne Aufwand in einer (n.Y)-Reaktion durch Bombar­dieren mit Neutronen erhalten werden (siehe Tabelle 3). Das Produkt ist dabei immer getragen, d.h. bei Erreichen der Sättigungsaktivität (am Reak­tor Saphir) ist maximal jedes 314. Atom ein 186Re-Atom bzw. jedes 2519. Atom ein 188Re-Atom. 188Re kann nach (2n,Y)-Neutronenaklivierung von 186W als Zerfallsprodukt von 188W trägerfrei gewonnen werden.

Unter Abgabe eines Elektrons zerfallen die beiden Radioisotope mit einer Halbwertszeit von 16.98 Stunden (188Re) bzw. 90.64 Stunden (,86Re) in das stabile Tochternuklid Osmium-188 bzw. den a-Strahler Osmium-186.

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Mittlere/maximale ß-Energie*

Mittlere/maximale Reichweite im Gewebe

Benötigte Radioaktivitätsmen­ge für eine Dosis von 50 Gy

Wichtigste Y-Linie (Ausbeute)7

Halbwertszeit*

Spezifische Aktivität

Trägerfreie Herstellung

Herstellung mittels Neutro­nenaktivierung

Neutroneneinfangsquer­schnitt 0

Sättigungsaktivität im Reaktor Saphir («D-ö-lO^n-cnT^s"1)

Dosisleistungsgleichgewichts­konstante Ai*

186Rhenium 349.3 keV/1.07 MeV

1.6 mm / 5.0 mm

193.65 MBq = 5.234 mCi

137.2 keV (9.5%)

90.64 h

6.38-1015 Bq/g = 185'880 Ci/g

Nein 1 8 5 R e _ D J U 1 8 6 R e

112-10-24 cm -2

(von 185Re)

2.18-1013 Bq/g - 591.2 Ci/g

0.73g-rad/(;iCi-h)

1MRhenium 764.2 keV / 2.12 MeV

3.9 mm / 11.0 mm

449.77 MBq = 12.156 mCi

155.0 keV (15.0 %)

16.98 h

3.63-1015 Bq/g - 981'679 Ci/g I6b]fj 2n.T^ lflfl^y | £ l 8 8 R e

1 8 7 R e - n J U l 8 8 R e

74.6-10'24 cm -2

(von 187Re)

1.44-1013 Bq/g - 389.6 Ci/g

1.66 g-rad/^Ci-h)

Tabt.il« 3 Wichtigrt» phjtikalifch» DMwi dar Mdm radioaktiven Rhanrumtotopa » * • und "•Ra. 'nach Kocher 1981, #nach Adelstein und Kassis 1987

Die ß~-Partikel werden mit einer mittleren Energie von 349.3 respek'ive 764.2 keV emittiert, ihre mittlere Reichweite im Gewebe beträgt dadurcii für 186Re 1.6 mm, für 18aRe 3.9 mm.

»|Re s'ab» (n.v) , 90-64h

' » « •

e (7.8 %)

122.6 keV

«W jiafeiL

ß" (92.2 *) \

767.S keV

630.3 keV

137.2 keV

t?*Os 2- i<y y

Schema 1 Vatainfaehtai ZarfallaKhama von Rharüum-166 (aus Lederer und Shirley 1978) Bei den instabilen Isotopen ist die Halbwertszeit angegeben, die Energien in LkeVJ stellen die wichtigsten y-Linien dar. e ist der Zerfall durch Elektroneneinfang.

- 17 -

Die Herstell- und Zerfallswege der beiden Rheniumisotope sind in Sche­ma 1 und 2 dargestellt. Die wichtigsten y-Linien sind die 137.2 keV-Linie von 188Re mit einer Ausbeute von 9.5 % sowie die 155.0 keV-Linie von 186Re mit einer Ausbeute von 15.0 %.

»9-45 4

V

» T R e

JtäfeU. Cn.Y) , 16.98h

W* N»

\»

\

1086.4 keV

931.3 keV

633.0 keV

478.0 keV

: _ 155.0 keV

• . . , . stabil 1MOs

Schema 2 Vereinfacht«» Zarfallaachana m Rhanhnn-168 (aus Lederer und Shirley 1978)

i.4 Anwendung von Rhenium in der Nuklearmedizin

1.4.1 Rückblick

Aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften sind die beiden Rheniumiso­tope sehr geeignete Kandidaten zur therapeutischen Anwendung. Ihre Strahlungsreichweite befähigt sie dazu, die Zellen von aussen abzutöten, ohne dass die Umgebung stark geschädigt wird. Der geringe Anteil an Y-Strahlung mit derselben Energie wie bei Technetium lässt eine gleich­zeitige Ortung und Therapieüberwachung mit gebräuchlichen y-Kameras zu, die Halbwertszeiten schliesslich sind ideal bezüglich Strahlenschutz und therapeutischer Wirksamkeit. Trotz dieser günstigen Charakteristiken wurde erst in Einzelfällen von einem Einsatz in der Nuklearmedizin be­richtet (siehe Tabelle 4). Beim Einsatz in der Radiosynoviorthese ersetzt das lfl6Re-Sulfat-Kolloid das ursprünglich verwendete 198Au, da dieses eine zu grosse y-Belastung für den Körper darstellt. Mit Rhenium treten keine allergischen Probleme mehr auf. Bei dieser Anwendung gibt es keine strahlentechnischen Proble­me. Der einzige Schwachpunkt ist die Instabilität des kolloidalen Trägers, d.h. innert 3 Tagen werden 10-15 % der Radioaktivität herausgespüli

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186Re-Kolloid

186Re-Phosphonat (186Re-HEDP)

Radiosynoviorthese von mittel-(, ossen Gelenken (Ellbogen. Schulter. Hüfte. Knöchel. Hand­gelenke) Sekretierende Gliomazyste

Skeletterkrankungen, bei Knochenmetastasen (palliativ)

Delbarre et al. 1973 Deckart et al. 1978 Bahous und Müller 1976 Bandilla 1981

Schaub et al. 1979

Weuinger et al. 1984 Ketring 1987 Maxon et al. 1989

TabtU« 4 TharapautiKte Varwandung von mR» in dar NuklaanMditfn. Über Therapie­versuche mit ,MRe wurde noch nichts veröffentlicht, vermutlich wegen der noch mangeinden Verfügbarkeit des Radioisotopes.

(Deckart et al 1978). Zudem treten bei einem Viertel der Patienten vorüber­gehende Reizungen im Gelenk auf (Deckart et al. 1988). Knochentumore werden mit positiv geladenen Tc-Komplexen diagnosti­ziert. Rhenium und Technetium sind bezüglich der Chemie und dem in vivo-Verhalten sehr ähnlich (siehe 42). Tc- oder Re-Komplexe mit den gleichen Ugandan reichern sich also in den gleichen Geweben, speziell den Knochenmetastasen, an. Daher kam auch die Idee, Rheniumkom­plexe direkt als Radiotherapeutikum gegen Knochentumoren zu verwen­den.

1.42 Aussicht

In Zukunft wird sich die Anwendung von ,86Re und ,88Re oder auch de­ren Mischungen ausweiten, vor allem seit die Herstellung eines iflaW/188

Re-Generators beschrieben wurde. Roodt et al. 1989 und Callahan et al. 1989 beschrieben einen Generator, der prinzipiell dem heute verwendeten Mo/Tc-Generator entspricht. Radioaktives Perrhenat kann in konstanter Menge über mindestens 20 Tage täglich eluiert werden, der 188W-Anteil im Eluat soll etwa 10"6 % betragen. Dieser 188W/188Re-Generalor könnte sich zu einem Standardgerät der Nuklearmedizin entwickeln. Sogar be­währte Methoden wie die Behandlung mit 131Jod könnten durch eine 188Re-Behandlung abgelöst werden, falls das Problem der chemischen Bindung an die gewünschten Proteine, speziell an Antikörper, stabil gelöst wird. Dank der viel kürzeren Halbwertszeit von lfl8Re würde die Strahlen­belastung für Patienten und Personal sinken, die Aufenthaltsdauer im Spital würde kürzer. Die wesentlich kürzere Abklingzeit würde auch Probleme mit dem radioaktiven Abfall verringern.

Die Komplexbildung von Rhenium mit Liganden, welche momentan zur Diagnose von Knochentumoren und Metastasen Verwendung finden, könnte ein neuer Weg in der Therapie werden. Erste Versuche in dieser

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Richtung wurden von Mathieu et al. 1979. Eisenhut 1962, Weininger et al. 1984. Deutsch et al. 1986 und Ketring 1987 durchgeführt mit den Liganden EHDP. DMPE. HEDP und MDP. Diese Komplexe reichern sich in Herz und Knochen an. Mit anderen Liganden lässt sich vielleicht die Organspezifi­tät auf weitere Gewebe ausweiten. Der Einsatz von zielgerichteten Trägern für radioaktives Rhenium könnte die Einsatzmöglichkeiten in Zukunft noch ausweiten. Die Therapiemetho­den werden dadurch spezifischer.

1.5 Liposomen als Träger von ^-Strahlern

Liposomen, welche erstmals von Bangham und Home 1964 beschrieben wurden, sind Phospholipidvesike! in der Grösse von 20 nm bis ungefähr 10 jim. Sie bestehen aus einer oder mehreren Phospholipiddoppelschich-ten, welche ein wässriges Innenvolumen umschliessen. Sie bilden damit ein bioabbaubares und trotzdem stabiles, nicht irritierendes, wenig oder gar nicht immunogenes und untoxisches Carriersystem. welches einen zu transportierenden Stoff entweder in der Lipidphase oder im wässrigen Innenvolumen enthalten kann. Dieser ist dadurch mehr oder weniger vor enzymatischem und chemischem Angriff und Abbau geschützt. Ein gros­ser Vorteil ist weiter, dass pro Vesikel Tausende von Zielmolekülen trans­portiert werden können.

Grösse und Lipidzusammensetzung, eiwas weniger auch die Ladung, ha­ben einen entscheidenden Einfluss auf das in vivo Verhalten von Lipo­somen (Bellenberg 1980). Liposomen von mehreren >im Grösse bleiben in der Lunge stecken Hunt et al. 1979). Kleinere Vesikel bis hinunter zu 20 nm Durchmesser dagegen landen unweigerlich in der Leber (sowie der Milz und allgemein in allen zum RES gehörenden Zellen). Mittels gewis­ser Glykoside wie z.B. Lactosylceramid oder Asialofetuin kann die Aufenthallszeit im Blut auf weniger als eine Stunde verkürzt werden, die Liposomen reichern sich noch spezifischer in der Leber an Spanjer und Scherphof 1983, Harn et al. 1988). Cholesterinhaltige SUV's welche die Lipide DSPC oder SM enthalten, zirkulieren bis über 20 Stunden im Blut und sind daher eigentliche Depotarzneiformen Allen und Cabizon 1988). Eine Übersicht über das Schicksal von Liposomen in vivo wurde von Senior 1986 herausgegeben.

Zusammenfassend heisst das, dass das RES als Zielgewebe ideal ist für Liposomen. Die Leishmaniosetherapie mit Liposomen, welche Antimon-haltige Arzneistoffe enthalten (Croft 1986) oder neuerdings auch mittels SA-haltigen Liposomen ohne zusätzliche Wirkstoffe (Yoshihara et al. 1987) ist die einzige systemische Anwendung, welche aufgrund des natür-

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liehen Lebertargetings und der beobachteten verminderten Toxizität der Therapeutika allen anderen Behandlungsmethoden überlegen sind und kurz vor der Einführung stehen. Oft wird auch ein Targeting der Liposomen mittels Antikörpern, welche kovalent an die Membran gebunden sind, erwähnt. z.B. zum Auffinden von kleinen, schlecht erreichbaren Tumoren oder zum Aufspüren von Metastasen. Dieser Ansatz scheiterte aber bis jetzt immer an der Unmög­lichkeit, die Lipidmembranbarriere(n) zum Zielgewebe zu überwinden. In vitro mag das bei Versuchen mit Zellkulturen und genügend langer Inku­bationszeit gelingen, in vivo konnten aber noch keine positiven Resultate verzeichnet werden. Ein Targeting im Blutbett aber wurde schon von mehreren Autoren erwähnt. So konnten Harsch et al. 1981, Singhal und Gupta 1986 und Peeters et al. 1988 in vivo erfolgreich mit Antikörpern gekoppelte Liposomen an die Erythrozyten dirigieren, Smirnow et al. 1986 fanden eine erhöhte Menge von mit Antikollagen-Antikörpern sowie Fi-bronectin beladenen Liposomen an Orten mit Kapillarschäden.

Erfolgsversprechend ist dagegen die stationären Anwendung wie z.B. beim intrakavitären Einsatz in den Gelenken zur Therapie der rheumatoi­den Arthritis. Was die Liposomen für dieses Einsai/gebiet zusätzlich at­traktiv macht ist die Tatsache, dass die krankhaft wuchernden Synovial-zellen phagozytierende Zellen sind.

Die bis jetzt einzige therapeutische Anwendung von ß-Strahler-haltigen Liposomen war denn auch der Einsatz von 51Cr-Liposomen (Sledge et al. i977) sowie von 171Lu-Liposomen (Bard et al. 1985) zur Radiosynoviorthe-se, d.h. dem Abtöten der Synovialzellen mittels Radionukliden in Kniege­lenken von Hasen. Das grösste Problem war dabei die zu grosse Leckra­te aus dem Gelenk, we'che die Autoren mit einer zu wenig stabilen Ver­ankerung des Cholesterin- EDTA's in der Liposomenmembran erklärten (die ß-Strahler waren dabei an dieses EDTA-Derivat kompiexiert). Knight et al. 1988 sieht als einzige Abhilfe die Verwendung eines lipophileren Komplexes, der in der Lipidphase der Liposomen gebunden sein soll.

Stabilitätsprobleme aufgrund der in den Liposomen eingeschlossenen Radioaktivität wurden von keinem Autor erwähnt. Spezielle Literatur über Membranschädigungen und deren genauen Mechanismus im Zusammen­hang mit ß"-Strahlung ist sehr dürftig. Wie Edwards et al. 1984 in einer Review über die "Effekte der ionisierenden Strahlung auf Biomembran­struktur und Funktion" schreibt, wurden bis jetzt erst die yStrahlungsef-fekte, und zwar in für therapeutische Zwecke viel zu hohen Dosen, un­tersucht. Es ist sehr schwierig, die beiden Strahlenarten bezüglich Wir­kung direkt zu vergleichen, die Charakteristiken sind zu verschieden. Die führende Rolle bei der Bildung von Radiolyseprodukten im Liposom spielt aber ebenfalls das Hydroxylradikal 'OH, welches ein sehr starkes Oxidationsmittel ist. Kuropteva et al. 1986 bestrahlten während 12 Tagen

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Liposomen aus Eigelb-Lecithin mit einer 60Co-Quelle mit der enormen Gesamtdosis von 1347.8 kGy. Im Aussenvolumen war radioaktives Eu3+

enthalten, welches bei allfälligen Membranschädigungen in das Innere der Liposomen diffundieren konnte. Mittels NMR wurde aber keine S-Shift festgestellt, d.h. die Europiumionen blieben an der Aussenseite des Vesi-kelbilayers. Hingegen war die Absorption im UV bei 233 nm auf etwa den doppelten Wert erhöht, das heisst es entstanden zusätzliche Doppel­bindungen, welche auf Lipidperoxidation infolge der radioaktiven Strah­lung zurückzuführen sind.

Über die Stabilität von radioaktiven Liposomen bei den hier anvisierten Dosen von ~50 Gy ist daher aus der Literatur keine Vorhersage möglich, beim fertigen Präparat muss die Stabilität individuell bestimmt werden.

i.6 Zielsetzung

Dank ihres natürlichen Targetings drängen sich Liposomen für die Be­handlung von Leberkrankheiten geradezu auf. Auch für intrakavitäre Therapien scheint das Trägersystem "Liposom" geeignet. Daraus ergab sich folgende Zielsetzung:

Im Hinblick auf eine Behandlung von Lebeitumoren und/oder Lebermetastasen oder zw Radiosynoviorthese sollen Liposomen definierter Grösse hergestellt werden, die radioaktives Rhenium in therapeutischen Mengen und stabiler Form enthalten. Das Bela­den der Liposomen soll zudem einfach und effektiv sein.

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2 Herstellung und Charakterisierung der Liposomen

2.1 Einleitung

22 Material und Methoden 2.2.1 Lipide und Chemikalien 2.2.2 Liposomenherstellung

2.2.2.1 Herstellung mittels Ultraschall 2.2.2.2 Herstellung mittels Gelfiltration

2.2.3 Charakterisierung der Liposomen 2.2.3.1 Grössenmessung mittels Laserlichtstreuung 2.2.3.2 Grössenmessung mittels Elektronenmikroskopie 2.2.3.3 Phospholipidanalytik mittels HPLC 2.2.3.4 Restdetergensgehaltsbestimmung

2.2.3.4.1 Prinzip 2.2.3.4.2 Materialien und Methode 2.2.3.4.3 Resultate und Diskussion

2.3 Resultate 2.3.1 Liposomencharakteristik 2.3.2 Charakteristik der Gelfiltratirn

2.4 Diskussion

2.1 Einleitung

Liposomen können durch viele verschiedene Methoden hergestellt wer­den: Mittels Ultraschall (Saunders 1962. Bangham und Hörne 1964 Ether-oder Ethanolinjektionsmethoden (Deamer und Bangham 1976, Batzri und Korn 1973), Detergensentfernung mittels Dialyse (Kagawa und Racker 1971, Milsmann et al. 1976) oder Phasenumkehr durch Evaporation des lipophilen Lösungsmittels (Szoka und Papahadjopoulos 1978). Jede dieser Methoden hat ihre Vor-, aber auch Nachteile. In den Zusammenstel­lungen von Schreier 1982 oder Lichtenberg und Barenholz 1988 werden sie diskutiert.

Um die gewünschte Therapieaktivilät eines Gemisches von lö6Re/lfl8Re in Liposomen einzuschliessen wurde eine Methode gesucht, die schnell, einfach und standardisiert homogene Liposomen liefert. Mit einer unkom­plizierten Methode bleiben auch die Probleme des Strahlenschutzes und der Kontaminationen minimal. Ideal ware auch, wenn die gleichen Vesikel für verschiedenartige einzuschliessende radioaktive Substanzen verwen­det werden könnten. Die einfachste Methode um homogene Liposomen herzustellen ist die Behandlung einer Phospholipidsuspension mit Ultraschall. Dabei werden die ungeordneten multilamellaien Bilayerschichten durch Einbringen von Schwingungs-Energie in immer kleinere Multilayervesikel aufgespalten, um dann schliesslich als kleine unilamellare Liposomen von 20-40 nm Durchmesser, den sogenannten SUV's zu enden.

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Mit dieser Methode wurde der Einschluss von Perrhenat-Anionen unter­sucht.

Brunner et al. 1976 hatten gezeigt, dass bei der Gelfiltration von gemisch­ten Mizellen stabile unilamellare Liposomen ents'ehen. Sie stellten aus Eier lecithin und Natriumcholat im molaren Verhältnis von 1:1 auf einer Sephadex-G50-Säule Liposomen mit einem mittleren Durchmesser von 30 nm her. Enoch und Strittmatter 1979 variierten diese Methode, indem sie eine gemischte Mizelle aus Natriumdesoxycholat und Eierlecithin im Ver­hältnis von 1:2 durch Gelfiltration über eine Sephadex-G25M-Säule in Liposomen überführten. Die mittlere Grösse betrug etwa 100 nm im Durch­messer. Diese Methode wurde auf eine Sephadex-G25M -Fertigsäule PD10® adaptiert und zum Einschluss von Rheniumkomplexen verwendet.

Der grösste Vorteil der Detergensdialyse ist die genaue Kontrolle der ki­netischen Parameter, wodurch in der Grösse sehr homogene unilamellare Liposomen entstehen. Die Vesikelgrösse kann durch Variation des ver­wendeten Detergenses, des Lipides (und damit oft auch der Lipidla-dung), der Dialysiergeschwindigkeit und der Lipidkonzentration zwi­schen 30 nm bis 10 jim Durchmesser gewählt werden (siehe Tabelle 9).

Verwendetes Detergens

Natriumcholat Natriumcholat Natriumdesoxycholat Natriumtrichloroacetat Methyl-a-D-glucopyranosid n-Heptyl-ß-D-glucopyranosid n-Hexyl-ß-D-glucopyranosid Octyl-ß-D-glucopyranosid Octyl-ß-D-glucopyranosid Octyl-ß-D-glucopyranosid n-Octyl-tetraoxyethylen

Grösse

-55 nm -40-140 nm -100 nm 10-20 Jim 10-100 Jim 80-180 nm -60 nm -180 nm 200-1000 nm 150-440 nm 600-950 nm

Literaturstelle

Milsmann et al. 1978 Zumbühl und Weder 1981 Enoch und Strittmatter 1979 Oku und MacDonald 1983 Oku et al. 1982 Schwendener et al. 1981 Schwendener ei al. 1981 Zumbühl und Weder 1981 Philippot et al. 1983 Schwarz et al. 1988 Bonanomi 1987

Taballt 8 Variation dar Lipcaoraanfliaawi in dar Dataiganadialyaa- odar Galftltrationttaehnik durch den Einsatz von verschiedenen Detergentien.

Ebenso wie bei der Liposomenhersteliung mittels Detergensdialyse kann die Grösse der Gelfiltrationsliposomen durch Verwendung derselben De­tergentien in gewissem Masse verändert werden.

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22 Material und Methoden

22\ Lipide und Chemikalien

Zur Liposomenherstellung wurde das Eierlecithin E100 und E80 der Lipoid KG (Ludwigshafen. BRD) verwendet. Das Lipid E100 wies einen PC-Gehalt von 98.0 % auf und war mit 0.1 % DL-a-Tocopherol stabilisiert. Als Verunreinigungen waren < 0.5 % unpolare Lipide sowie ungefähr 0.8 % Lyso-PC enthalten. Das Lipid E80 enthielt 81 % PC. 8.0 % PE und ebenfalls 0.1 % Vitamin E. Daneben waren 2.0 % Lyso-PC. s 0.3 % Lyso- PE, 2.5 % Triglyceride, s 2.5 % SM und 2-3% Wasser enthalten. Ethanol, Methanol sowie Chloroform in p.a.-Qualität zur Lipidfilmherstel-lung sowie n-Hexan und Propan-2-ol in HPLC-Oualitat zur Phospholipid-gehaltsbestimmung wurden von Fluka AG (Buchs. CH) bezogen. Die Natriumsalze der Cholsäure (puriss.), Taurocholsaure (purum) und De-soxycholsaure (purum) stammten ebenfalls von Fluka AG, ebenso alle Salze zur Pufferherstellung.

Der zur Liposomenherstellung sowie auch zur Stabilitätsbestimmung ver­wendete, im folgenden PBS 7.4 genannte 50 mM Phosphatpuffer, hatte einen pH von 7.4 und eine Ionenstärke von 0.308 (gemessen auf einem Osmometer 5100 C der Firma Wescor (Logan, Utah, USA). Er setzte sich folgendermassen zusammen:

KH2P04 1.354g, Na2HP04-2H20 7.219g, NaCl 4.862g. Aqua bidest. ad 1 1

222 Liposomenherstellung

222.1 Herstellung mittels Ultraschall

SUV's wurden durch Beschallen einer Phospholipidsuspension mit einem Ultraschallstab hergestellt (Huang 1969)-.

43 mg E100 (-54.1jimol) wurden in Ethanol gelöst, das Lösungsmittel am Rotavapor RE/A (Büchi, Flawil, CH) in einem 25 ml Rundkolben bei 37t abgedampft und 30 Minuten bei 0.1 Torr getrocknet. Dem Lipidfilm wur­den 3.0 ml PBS 7.4 zugegeben und am Rotavapor ohne Vakuum wäh­rend 30 Minuten suspendiert. Die milchige Suspension wurde 40 Minuten in einem 10 ml Reagenzglas mit einem Branson Sonifier 450 mit Mikroiip (SKAN AG, Basel, CH) mit einer Ausgangsleistung von 105 Watt (Einstel­lung Output Control 4.5, Duty Cycle 70%) beschallt, wobei die Suspension klar wurde. Das Reagenzglas wurde mit Eiswasser gekühlt.

- 26 -

Zur Abtrennung des freien Perrhenates und zur Bestimmung des in die Liposomen eingeschlossenen Perrhenates wurde die Liposomensuspen-sion über eine Sephadex-G25M-Fertigsäule PD10® (Pharmacia. Uppsala. Schweden) gelfiltriert. Die Stabilität des Liposomeneinschlusses nach 36 Stunden bei RT wurde durch nochmalige Gelfiltration auf einer PD10®-Säule bestimmt.

2222 Herstellung mittels Gelfiltration

Zur Herstellung der Liposomen wurden die Detergentien mittels Gelfil­tration entfernt (Enoch und Strittmaller 1979. Brunner et al 1976) (siehe Schema 3). Eine typische Herstellungsvorschrift lautet wie folgt: 43 mg E100 (54.1 jimol) in 2 ml Ethanol. 30 mg Natriumdesoxycholat (72.4jimol) in 1 ml Methanol sowie der entsprechende Rheniumkomplex in 2 ml Chloroform wurden in einen 50 ml Rundkolben gegeben und das Lösungsmittel am Rotavapor in einem 50 ml Rundkolben bei 37*C abge­dampft und 30 Minuten bei 0.1 Torr getrocknet. Der Lipidfilm wurde mit 2.0 ml PBS 7.4 aufgelöst, es bildete sich eine klare Mischmizelllösung. 500^1 dieser Lösung wurden auf eine mit 20 ml PBS 7.4 vorgespülte Sephadex-G25M-Fertigsäule PD10® gegeben, nach Trockenlaufen wur­den 2.25 ml Puffer dazugegeben. Die nächsten 3.0 ml wurden als "Lipo-somenfraktion" direkt in einem sterilen 10 ml Vial gesammelt und im Kühl­schrank bei 4 t gelagert. Die Lösung war klar und hellblau opaleszent. Die PD10®-Säulen wurde mit weiteren 20 ml PBS 7.4 gespült und dann wiederverwendet (eventuelles Abklingenlassen der verbleibenden Radio­aktivität auf der Säule).

Das molare Lipid/Detergensverhältnis betrug immer 0.75.

22.3 Charakterisierung der Liposomen

225.1 Grössenmessung mittels Laserlichtstreuung

Prinzip: Bings und Nicoli 1984 beschrieben Theorie und Methodik der dynamischen Laserlichtstreuung. Diese bekannte Methode beruht darauf, dass ein Laserstrahl an den Partikeln (in diesem speziellen Falle Liposo­men) in einer Probe gestreut wird. Vereinfacht gesagt beruht die Melhode auf folgendem Prinzip: Je grösser die Teilchen sind, umso träger ist ihre Diffusionsbewegung und umso kleiner sind die Fluktuationen der Streu-lichtintensitäl, welche in einem 90°-Winkel zur Probe mit einem Photonen-

27

Natriumdesoxy-E100 cholat ^ _

o— / # V

\ 1/ Rephos

Rota vapor t

PBS 7.4

500ul

gemischte Mizelle

« L i p « -I M M

Vorlauf (-2.75. ml) 2.75.-5.75. ml

Spülung (5.75.-22. ml)

Schema 3 ArbeitMblauf der HerateUung ton GeUUtratiomUpoaoman auf einer Sephadex-G25M Fertigsaule PD10*. E100 wurde in Ethanol. Natriumdesoxycholat in Methanol und Rephos in Chloroform gelöst. Die PD10» wurde mit 20 ml PBS 7.4 vorgespult. Das Auftra­gen der Mischmizelle gilt als Start (0. ml). Der Durchfluss ist ungeregelt und betragt 2-3 ml pro Minute.

- 28 -

Zählrohr delektiert werden. Dieses analoge Streulichtsignal wird digitalisiert, einem Korrelator zugeleitet und in eine Korrelationsfunktion umgewandelt. Die darin enthaltenen Informationen über die Partikelgrössenverteilung werden durch Laplace-Transformaüonen zurückgewonnen und es wird eine Verteilungskurve erstellt (Müller und Müller 1963). Bestimmung: Routinemassig wurden die Liposomen auf eine Lipidkonzen-tration von -2 mg/ml eingestellt, in ein 6x50 mm Glasmessröhrchen (Dis­posable borosilicat glass culture tube) von Kimble (Skan AG, Basel. Schweiz) keimfiltriert und auf einem Nicomp 370 / Autodilute Submicron Particle Sizer (Nicomp Instruments, Santa Barbara, CA, USA) gemessen. Die Proben wurden im Vesikelmodus mit einer Zählrate von 400 kHz bei 23t bestimmt. Das Nicomp-Modell 370 führte gleichzeitig eine Gauss- und Ni-comp-Verteilungsanalyse aus, wobei bei unimodaler Verteilung die Gausswerte, bei Mehrfachverteilungen die Nicomp-Werte verwendet wur­den. Die LLS-Messungen wurden von Rainer Naeff, Kurt Müller, Barbara Hae-berlin, Rolf Gerber und Matthias Mütsch am Pharmazeutischen Institut der ETH Zürich ausgeführt.

22.3.2 Grössenmessung mittels Elektronenmikroskopie

Die Eleklronenmikroskopie erlaubt nicht nur eine Aussage über die Grös­se der Liposomen, sondern auch über den lamellaren Aufbau der Vesi-kel. Beim hier verwendeten Gefrierbruchverfahren nach Müller et al. 1980 wurden die Liposomen in einem Propan-Jet-Freezer eingefroren und ge­brochen. Diese Proben wurden mit einem Philips EM 311. Elektronenmikro­skop untersucht.

Die Präparationen und Aufnahmen wurden von Dr. E. Wehrli am Institut für Zellbiologie der ETH Zürich ausgeführt.

223.3 Phospholipidanalytik mittels HPLC

Natürliche Lecithine wie die am häufigsten verwendeten Eierlecithine oder Soyalecithine stellen keine einheitlichen Verbindungen dar (siehe 2.2.1). Hauptbestandteile sind PC, PE und PA, d.h. die Analysenmethode muss in der Lage sein, diese zu trennen. Eine grosse Schwierigkeit ist dabei, dass jedes dieser Phosphatidylglyceride dank der Fettsäurezu­sammensetzung in sich nicht einheitlich ist. Es muss also ein System gefunden werden, welches die Phospholipide nach dem hydrophilen

- 29 -

'Kopf teil und nicht nach dem lipophilen 'Schwanz teil auftrennt. Die hier verwendete Methode geht auf Arbeiten von Nasner und Kraus 1981 zu­rück und wurde von Naeff 1988 auf die Liposomenanalytik angepasst. Da das in dieser Arbeit verwendete Eierlecithin El 00 kein PA und PE enthielt, konnte die HPLC-Vorschrift etwas vereinfacht werden, indem der bei Naeff 1988 verwendete Acetatpuffer mit pH 3.9 durch steriles Wasser ersetzt wurde.

Analysenbedingungen:

mobile Phase: n-Hexan/Isopropanol/Aqua steril. (8:8:1) stationäre Phase: LiChrospher Si 100, lOjim

250 mm x 4 mm 0 (Knauer. Bad Homburg. BRD) Fluss: 1.6 ml/min Probenschleife: 100 jil; jeweils 50 jxl wurden von Hand injiziert HPLC-Pumpe-. Beckmann 110A Detektor: Spektrophotometer Uvikon 720LC (Kontron. Zürich, CH)

bei einer Wellenlänge von 210 nm

Probenvorbereitung:

Die Liposomendispersion wurde am Rotavapor bei 3TC eingedampft und 30 Minuten bei 0.1 Torr getrocknet. Der Rückstand wurde in der mobilen Phase aufgelöst, so dass ein Lipidgehalt von 1-3 mg pro ml mobiler Pha­se erreicht wurde. Je 50 \i\ wurden injiziert und analysiert. Als Standard wurde El 00 eingesetzt. Laut Müller 1989 war die Linearität der HPLC-Analytik bei einem Injektionsvolumen von 50 \i\ im Bereich von 1.0 - 3.5 mg pro ml geprüft und bestätigt worden.

Retentionszeilen:

- PC 8.4 min

- PE 2.8 min

- SA 2.4 min

- Cholesterin 2.1 min (Front, eine Aussage über den Cholesteringehalt ist mit dieser Methode nur in einem Bereich von ±15 % machbar)

- Natriumdesoxycholat 2.8 min (zusammen mit PE)

Nach der Analyse wurde die Säule während 30 Minuten mit dem Lauf­mittel regeneriert, wobei die Fliessgeschwindigkeit 3 ml/min betrug.

- 30 -

22.3.4 Restdetergensgehaltsbestimmung

223.4.1 Prinzip

Bei der Herstellung von Liposomen mit einer Detergensentfernungsmetho-de bleibt immer ein gewisser Anteil des Detergens in der Liposomen-membran. Da Detergentien im Blut hämolysierend wirken können (Asanger 1983) muss der Restdetergensgehalt bekannt sein.

Die hier verwendeten Gallensäurederivate wurden enzymatisch nach der Methode von Mashige et al. 1981 bestimmt. Alle an der Sa-Hydroxylgrup­pe nicht konjugierten primärenGallensäuren wie Cholsäure und Cheno­desoxycholsäure sowie deren Taurin- und Glycinderivate Tauro-, Glyko-, Taurochenodesoxy- und Glykochenodesoxycholsäure sowie auch die sekundärenGallensäuren Desoxycholsäure und Lithocholsäure (sowie deren Taurin- und Glycinderivate) können damit quantitativ gemessen werden.

Die Reaktion verläuft nach Schema 4.

HD""' - - N

3ot-Hydioxy-Gall«ni*ure \

3ot-Hydioxy-Steroid-Dehydiogenase

NADHfH4

3-Keto-Gallenrtur*

't^b Nitro-Tttranlium-Blau (grib)

Semma 4 Prinip dm •nijrmatiwrwn Btctimmung vor. 3a-HjdroRH3tilmaluradtrivstan dargestellt am Beispiel der Desoxycholsäure.

Das gebildete NADH+H* wird in der Farbreaklion bei 550 nm nachge­wiesen, das gelbe Nitrotetrazoliumblau wird nach der Reduktion tiefblau.

- 31 -

22.3.42 Materialien und Methode

Der Merckotest*Gallensäuren (Merck Diagnostica, Darmstadt. BRD. Be­stell-Nr. 14352) wurde modifiziert, so dass er direkt zur Bestimmung von Gallensäuren und deren Salze in Liposomen verwendet werden konnte. Ein Extraktionsschritt ist nicht notwendig.

Durchführung: Die Liposomenprobe wurde mit PBS 7.4. der 1 % Tween 20 (Fluka. Buchs. Schweiz) enthält (PBS/Tween). auf idealerweise ~200 jimol Galiensäure pro Liter verdünnt. Gleichzeitig wurden Eichlösungen mit 40. 150 und 350 jimol Gallensäure pro Liter hergestellt:

• 350 jimol/1: Lyophilisat • 10.00 ml PBS/Tween (- Stammlösung) • 150 jimol/1: 937.5 /xl Stammlösung + 1.25 ml PBS/Tween • 40 jimol/1: 387.1 jil Stammlösung + 3.00 ml PBS/Tween

Das Lyophilisat wurde hergestellt durch Gefriertrocknung vcn 1 ml einer 3.5 millimolaren Gallensäurelösung (Natriumcholat. Natriumtaurocholat so­wie Natriumdesoxycholat) in einem sterilen 10 ml Penicillinfläschchen.

Pro Probe wurden je zweimal 50 jxl PBS/Tween in die Vertiefungen der Flachbodenmikrotiterplatten (Nunc Immuno Plate I-96F, Roskilde. Däne­mark) vorgelegt, je 50 ul der zu bestimmenden Probe (oder Eichlösung) dazupipettiert sowie 150 jxl des Proben-Reagenzgemisches (RW) oder 150 jil des Leer wert-Reagenzgemisches (LW) dazugegeben. Bei der Be­stimmung von Taurocholat und Cholat wurde 90 Minuten bei Raumtem­peratur, bei der Bestimmung von Desoxycholat 150 Minuten bei 2>TC in­kubiert und dann sofort bei einer Wellenlänge von 550 nm auf dem Spektrophotometer (Easy Reader EAR 400, SLT Labinstruments, Österreich) die Absorption gemessen. Die Nettoabsorption entspricht der Differenz der Proben- und der Leerwert-Absorption (Nettoabsorption = RW - LW). Eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen reicht für 3 Eichpunkte (3fach-Bestimmung) plus 19 Proben bei Dop.jelbestimmungen oder 13 Proben bei Dreifachbestimmungen.

Aus der Eichgerade wurde der Gehalt an Gailensaure(salz) in umol/1 er­halten (-A), eine Umrechnung in mg Gallensäure(salz) pro ml Liposomen (=B) erfolgte nach:

A >xmol/l * Verdünnungsfaktor « MG Gallensäure « 10"& - B mg/ml |

223.4.3 Resultate und Diskussion

Die Messungen sind im Bereich von 15-500 >imol Gallensäuren(salze) pro Liter PBS/Tween linear (siehe Figur 1). Optimal ist ein Gehalt zwischen 50-250 jimol/1.

- 32 -

Absorption bei 550 nm 1,40 |

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Gehalt an Detergens [umol/ll

—— Natrium-desoxycholat + Natrium-taurocholat - * - Natrium-cholat

Figur 1 Bchkum dK w n d i M m n Galten*«]» Natriumcholat (Regressionskoeffizient R-0.9999). Natriumtaurocholat (R«0.9999) nach 90 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur sowie Natriumdesoxycholat (R-1.0000) nach 150 Minuten Inkubation bei 3TX:.

Die einzelnen Messungen untereinander sind sehr genau reproduzierbar (Standardabweichung < 3%, im Bereich 50-250 jimol/1 < IX), daher genü­gen in den meisten Fällen (d.h. in Routinebestimmungen) Doppelbestim­mungen. Die Mikrotiterplatten ergeben einen sehr homogenen Untergrund, ihre Leerabsorption schwankt zwischen 0.039 und 0.037.

Das von Merckotesl^Gallensäuren benutzte Stoppreagens (0.1 % HCl) ist nicht nötig, da die ganze Mikrotiterplatte im Spektrophotometer innert 10 Sekunden gleichzeitig mit den Eichpunkten gemessen wird. Die genann­ten Inkubationszeiten braucht es, um bei den höheren Gallensäurengehal-ten die Reaktior zu vervollständigen. Da aber auch die Leerwerte später nachdunkeln (dieser Vorgang ist auch abhängig vom Alter der Enzymlö­sung) und damit die Standardabweichungen grösser werden, sollte die Inkubationszeit nicht um mehr als 2 Stunden verlängert werden.

Eichlösungen können bei 4t: bis einen Monat aufbewahrt werden, eben­falls die gelösten Leerwert- und Probenreagenzgemische, ohne dass eine Einbusse der Enzymaklivität erfolgt (Merck beschreibt nur eine Haltbar­keitsdauer der Enzymlösungen von einer Woche).

Trübe Liposomenlösungen ergeben immer einen zu kleinen Detergensge-halt. Die Phospholipide sowie die Gallensalze müssen mit Tween 20 mi-zelliert sein, sonst erreicht die 3a-Hydroxy-Steroid-Dehydrogenase nicht alle Detergensmoleküle. Abhilfe schafft eine grössere Probenverdünnung

- 33 -

oder eine zusätzliche Zugabe von Tween 20. Bei einer Liposomenkon-zentration von mehr als 5 mg/ml reicht der lftge PBS/Tween-Puffer nicht mehr aus. Triton X100 als mizellierendes Detergens im Puffer kann nicht genommen werden. Es wird nur etwa die Hälfte an Diformazan gebildet, die Eich­kurve ist nicht linear.

Bei dieser enzymatischen Methode sollten alle Gallensauren austauschbar sein. d.h. bei Beachtung der verschiedenen Inkubationszeiten könnte für alle Gallensäurenderivate die gleiche Eichsubstanz (z.B. Natriumcholat) genommen werden. Wie Figur 1 aber zeigt, sind nur Cholat und Desoxy-cholat gleichwertig, die Taurocholateichkurve hat generell eine um 4-6% kleinere Steigung. Allein durch dio verschiedenen Qualitäten der Gallen­salze ist das nicht erklärbar (Tabelle 6).-

Natriumcholat purissum

Natriumdesoxycholat purum

Natriumtaurocholat purum

-98% (nichtwässrige Titration). H20 -2%

-97% (NT), <2% Cholsäure. H20 2-5%

~99% (DO, enthält noch Cholsäure und Taurin; Formelangabe erwähnt +aq!

TabaU« 6 OMmikaUanbMchnibung am d m Fhika-Katalog (Buchs. Schweiz)

Mashige et al. 1981 verwendeten Natriumglykocholat als Standard. Die Wiederfindungsrate der verschiedenen Gallensalze bezogen auf diesen Standard (gemessen in Blutserum bei einer Konzentration von 50 jimol/l) lag bei 88-106 %. Aus den Resultaten der Figur 1 sowie von dieser Litera­turstelle her empfiehlt es sich, die Eichkurven jeweils mit dem verwende­ten Gallensalz aufzunehmen. Die cc-Hydroxy-Steroid- Dehydrogenase (3a-HSD) ist sehr spezifisch. In der Lösung anwesendes PC, PE, SA, a-Tocopherol und Cholesterin stören nicht.

2.3 Resultate

2.3.1 Liposomencharakteristik

Die Liposomen, welche wie unter 2.2.2 beschrieben hergestellt wurden, können mit den Parametern von Tabelle 7 charakterisiert werden.

- 34 -

Gehall an E100 Gehalt an Natriumdesoxycholat Durchmesser (nach Gauss ± ! S.D.

Anzahlsverteilung Volumenverteilung

Ultraschall-liposomen

8.5 mg/ml -

28.0*15.4 nm 45.3*25.1 nm

Gelfiltrations­liposomen 1

3.8 mg/ml 0.25 mg/ml

64.1±19.8 nm 88.1 ±27.3 nm

Gelfiltrations­liposomen 2

3.8 mg/ml 0.25 mg/ml

54.2±17.9 nm 77.4±25.5 nm

Tabelle 7 Wichtigst» Parameter dar mit Ultraschall oder per Gelfiltration hergestellten Liposomen. Gelfiltrationsliposomen 2 enthalten noch 0.3 mg Rephos pro ml Liposomen.

Das elektronenmikroskopische Bild (siehe Bild 1) bestätigte die mittlere Grösse der Gelfiltrationsliposomen von 50-70 nm. Es wurden nur unila­mellar Liposomen gefunden.

Bild 1 ElektronenmikroekopiichM Bild der Liposomen hergestellt durch Gelfiltration mit einem mittleren Durchmesser von 50 • 70 nm. ^• | 50 nm

Die Gelfiltrationsliposomen waren sehr homogen (siehe Figur 2 und 3). die Volumenverteilung der Ultraschallliposomen war aufgrund einiger we­niger Riesenliposomen schlechter. Die Slabilität der Gelfiltrationsliposomen war sehr gut, auch nach einem Jahr Lagerung im Kühlschrank bei 4 t sahen die Liposomen noch gleich

- 35 -

Liposomengrösse in [nm]

18.7 21.6 25.0 28.9 33.4 38.5 44.5 51.4 59.4 68.6 792 91.4 105 122 140 162 187 216 250 289 334

-

-I--

| u : WM *•* WMWMWM i w

• • • • • • • ».*

• ^ • ^ • • B <U • • • • IO.« • M •»

-

n*

too

V*

i i i i i

20 40 60 80

Relatives Volumen [%] 100 120

Figur 2 G master» VolunwrwKtrtlung ctor Gvlffltraüaraliposoaicn 1

Liposomengrösse in [nm]

14.0 16.2 18.7 21.6 250 28.9 33.4 38.5 44.5 51.4 59.4 68.6 79.2 91.4 105 122 140 162 187 216

--

I- 0.4

1 '•• • • M

• • M • 2.7 r °-7

--

« j

WMWMMMM »>

• 1 21.2

1 1 i

100

i i 20 40 60 80

Relative Anzahl [%] 100 120

Figur 3 SauM'fdw Araahlmrtollung ctor OtlffltrtHonslipoMfMn 1

- 36 -

aus wie nach Herstellung. Ihr Durchmesser änderte sich nicht signifikant. Als Beispiel: Die Liposomen der Charge AI 80 hatten nach der Herstellung eine Grösse von 57.6±17.6 nm (Gauss Anzahl) und 78.0*23.8 nm (Gauss Volumen), welche nach 13 Monaten laut Messung mit 56 5± 17.8 nm und 78.0±24.4 nm praktisch unverändert waren.

2.32 Charakteristik der Gelfiltration

Diese vorgepackten Sephadex-G25M-Säulen haben eine Höhe von 5 cm und ein Bettvolumen von 9.1 ml. Sie wurden vor dem Gebrauch jeweils mit 20 ml PBS 7.4 gespült, um die Aufbewahrungslösung bestehend aus 0.9 % NaCl sowie 0.5 % Merthiolate® (- Thiomersal) und 0.1 % Berol® (Naphthalol) als Konservantien durch den gewünschten Puffer zu ersetzen. Auch die Pyrogenität wurde durch diese Massnahme vermindert.

Pro trockenem Gramm Sephadex-G25M werden ~4 mg Natriumdesoxy-cholat zurückgehalten, d.h. die Kapazität einer Säule PD10® für das De-tergens beträgt ~8 mg.

Der Verdünnungsfaktor der Fertigsäule beträgt laut Pharmacia 1.4. Das trifft aber nur beim Entsalzen einer proteinhaltigen Lösung zu; die Gelfil­tration einer gemischten Mizellösung ist ein dynamischer Vorgang. Bei der Herstellung von Liposomen sind in den ersten beiden Millilitern der

5 0 i Anteil [%]

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Gelfiltrationsfraktionen [ml]

Natriumdesoxycholat E100 E S Cholesterin

Figur 4 Charaktortetaung am Lipornnm mittete Oalfiltration auf einer Sephadex-G23M-Fertigsäule PD10«. Es wurden 500 p\ der Mischmizelllösung aufgetragen und mit PBS 7.4 eluiert. Der 3. bis und mit 5. ml war die opaleszent-blauliche liposomenhauptfraktion.

- 37 -

"Liposomenfraktion" 88% des eingesetzten Phospholipides E100 enthalten (Figur 4). Werden Liposomen mit Cholesterin hergestellt, sind in den er­sten beiden Millilitern ebenfalls 88% des 3H-Cholestenns vorhanden (siehe Figur 4). Die restlichen 12% des Lipides kommen in den nächsten 3 ml. Cholesterin und E100 werden vollständig in die Liposomenfraktion einge­schlossen, die Wiederfindungsrate bei der Analyse betrug 100% bzw. 93%. Die Desoxycholatkinetikkurve zeigt ein Maximum im 4. ml. d.h. mit der Liposomenhauptfraktion, nimmt dann im optisch immer noch opaleszent-bläulichen 5. ml etwas ab und wird dann schliesslich als Desoxycholat-anion auf einem Plateau in den nächsten 15 ml aus der PD10® heraus­gespült.

2.4 Diskussion

Die Ultraschall-Liposomen sahen schön klar aus. Durch längeres Be­schallen konnte die Homogenität noch verbessert werden. Die Grösse der Vesikel ging bis auf 20 nm hinunter; im LLS-Nicomp-Au'jdrucK zeigten sich aber immer noch vereinzelte grössere Fraktionen. Der Vorteil dieser Methode ist die sehr einfache Probenvorbereitung. Das Lipid kann einge­wogen und mit der wässrigen Phase aufgeschlämmt werden; weiteres Mi­schen ist bei der hohen Energie des Ultraschallstabes unnötig.

Andererseits aber ist es möglich, auf einer käuflichen Sephadex-G25M-Säule PD10® innert 10 Minuten 3 ml homogene und (bei 4*C gelagerte) für mindestens 1 Jahr stabile Liposomen mit einer Grösse von 60-80 nm her­zustellen. Die Grössenverteilung ist etwas breiter, als wenn die Liposomen mit demselben Detergens Natriumdesoxycholal in einer Dialysierzelle her­gestellt werden. Der Grund ist wahrscheinlich die viel schnellere Kinetik. Boi der Detergensdialyse bilden sich die Liposomen über Stunden, auf der Säule dauert es nur 5 Minuten.

Die Verdünnung der aufgetragenen 500 p\ Mischmizelllösung auf 3 ml Liposomen ist relativ hoch. Das rührt auch daher, dass die Kapazität der PD10® voll ausgeschöpft wird. Das Auftragvolumen ist relativ klein, bei unsorgfältigem Auftragen können noch trockene Flecke auf der Säulen­oberfläche verbleiben. Mit einer längeren Säule (mehr als 20 cm x 2 cm 0) kann der Verdünnungsfaktor von 6 auf ~ 2 heruntergebracht werden (bezogen auf das Liposomenvolumen, in welchem 88 % des Lipides ge­funden werden). Leider ist keine doppelt so lange Fertigsäule mit Se-phadex-G25M erhältlich, sie müsste selbst hergestellt werden. Falls für ei­ne therapeutische Anwendung eine kleinere Menge an Injektionsvolumen benötigt wird, könnte durch Optimierung der Säulenmasse die Liposo-

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menkonzentration erhöht werden. Mit anderen Worten: Das Volumen, in dem sich die fertigen Liposomen befinden, könnte noch um den Faktor 3 verkleinert werden. Der Restdetergensgehalt ist ungefähr gleich gross wie bei den Liposo­men, die durch Detergensdialyse hergestellt wurden. Es scheint, dass diese Desoxycholat-Anteile fest im Liposom verankert sind, da zusätzli­che Gelfiltrationen den Detergensgehalt nur noch geringfügig verringern.

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3 Einschlug von Perrhenat in die Liposomen

3.1 Einleitung 3.2 Materialien und Geräte 3.3 Methoden

3.3.1 Herstellung der YRe04"-Lösung 3.3.2 Liposomenherstellung mit Perrhenateinschluss 3.3.3 Stabilitätsbestimmung mittels Gelfiltration

3.4 Resultate und Diskussion 3.4.1 Herstellung der YRe04"-Losung 3.4.2 Perrhenat-Einschluss in Ultraschall-Liposomen 3.4.3 Stabilität der Ultraschall-Liposomen

3.i Einleitung

Das Beschallen von Phospholipidsuspensionen ist eine der einfachsten Methoden, um relativ homogene Liposomen herzustellen. Gibt man nun die einzuschliessenden wasserlöslichen Substanzen im Puffer gelöst zum trockenen Phospholipid, so werden sich diese gleichmässig in der Was­serphase verteilen. Bei der Liposomenbildung entsteht ein sog. Liposo-men-Innenvolumen V,, das durch die Liposomenmembran vom Aussenvo-lumen Va abgekapselt wird. Nach der Entfernung des in der äusseren Wasserphase gelösten freien Stoffes z.B. durch Gelfiltration oder Dialyse erhält man mit der gewünschten Substanz gefüllte Liposomen. Je nach verwendetem Lipid sind sie mehr oder weniger dicht, d.h. die wasserlös­liche Substanz bleibt mehr oder weniger gut im Innern der Vesikel ge­fangen.

Aufgrund der Berechnungen von Huang und Mason 1978 sind Daten über die Abmessungen von Liposomen bekannt. Ihre Bilayerdicke be­trägt danach 37Ä, das spezifische Volumen eines PC-Moleküls ist 1253 A3. Daraus kann jetzt bei einem bekannten Durchmesser der Liposomen Vj berechnet werden. Hausei 1985 stellte ebenfalls Berechnungen an, durch welche bei verschiedenartigen Lipidarten die Anordnung und die Aus­dehnung des Bilayers vorausgesagt werden kann.

32 Materialien und Geräte

Das verwendete inaktive Dirheniumheptoxid (ReaOz) puriss. war von fluka AG (Buchs, Schweiz), die Reaktionsgefässe Reactivial* wurden von Pierce (Rockford, Illinois, USA) geliefert.

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Die Radioaktivitätsmessungen von ia6Re und 188Re wurden auf folgenden Geräten ausgeführt:

LKB Multigamma 1260* Veenstra VDC-202*

GeLic

Mediae Dose Calibrator*

Mess­

einheit

cpm MCi

jiCi

jiCi

Wert

gemessen

2-106cpm 4.5jzCi

lOjiCi ll.luCi

real

10>iCi»0.37MBq 10;iCi-0.37MBq

10MCi-0.37MBq

10jiCi-0.37MBq

Faktor

11.1° 2.2

1.0 0.9

Die in eps umgerechneten cpmx 11.1 ergeben die tatsächliche Anzahl MBq.

Der als Standard dienende Germanium(Lithium)-Detektor (-GeLi) (Harshaw Chemie. De-Meern. Holland) misst Zerfalle pro Sekunde, wobei dann die Radioaktivitätsmenge über die Formel

tatsächliche Aktivität in Bq gemessene Aktivität [eps] (Detektorwirkungsgrad E> (y-Anteil)

berechnet wird. Der Detektionswirkungsgrad für den Messabstand von 500 mm zum Mess­kristall ist E' 2.8902-10-2«Ey"08™. wobei Ey die Energie der Y-Linie in tkeVJ ist. Die nachgeschaltete Elektronik besteht aus einer Computeranlage ND66 (Nuclear Data Instru­mentation. Schaumburg. Illinois. USA).

Ain der Einstellung für 67Ga. Der VDC-202 ist von Veenstra Instrumenten (b.v. Peext. Hol­land), die dazugehörige Messkamruer von Capintec Inc. (Mont Valey. New Jersey. USA).

*LKB Wallac. Turku. Finnland Dieses Gerät wird im folgenden nur kurz als Y-Counttr bezeichnet.

*in der Einstellung für ial Das Gerät ist von Nuclear Chicago (Kontron Medical. Zürich. Schweiz).

3.3 Methoden

33.1 Herstellung der YReQ4~-Lösung

1.4 mg Dirheniumheptoxid Re2C>7 (2.93>imol) wurden in eine Quarzglas­ampulle 50 mm x 6 mm 0 eingeschmolzen und im Reaktor Saphii mit Neutronen beschossen. Nach der Bestrahlung wurde das Quarzglasröhr-chen in ein mit Scotchband umwickeltes und mit 2.5 ml PBS 7.4 gefülltes 4ml-Reactivial* gestellt und mit einem kräftigen Hammerschlag auf einen Metallstab mit Gummiabdichtung zersplittert (das Scotchband ist unbe­dingt nötig, sonst zerspringt das Reactivial®-Quarzglas). Re2C>7 wurde durch Drehen des Gefässes während 5 Minuten vollständig gelöst. Die Lösung wurde durch einen 0.22jim-Filter keimfiltriert und gleichzeitig von

- 41 -

den Glasscherben befreit. Die Arbeiten wurden in einer Kapelle hinter Blei- und Plastikabschirmung ausgeführt, so dass die Dosisleistung nicht mehr als 0.5 mrem pro Stunde betrug.

3.3.2 Liposomenherstellung mit Perrhenateinschluss

Die Liposomen wurden wie unter 222.1 beschrieben hergestellt, mit dem einzigen Unterschied, dass zu den 3.0 ml Puffer PBS 7.4 noch lOOjil YRe04~ (2.34-10-7 jxmol) mit einer Radioaktivität von ~0.2 MBq zugege­ben wurden, bevor damit der Lipidfilm hydratisiert wurde.

3.3.3 Stabilitätsbestimmung mittels Gelfiltration

Die frisch hergestellten Liposomen wurden 2 Tage in dicht verschlosse­nem Gefäss bei Raumtemperatur gelagert, danach 1 ml auf eine PD10® aufgetragen und mit 20 ml PBS 7.4 gelfiltriert. Im 3.-5. ml kam die "Lipo­somenfraktion", nachher das freie Perrhenat. Das Verhältnis von einge­schlossenem YReC>4" der Liposomenfraktion zum freien YRe04~ in Prozent gibt einen Hinweis auf die Stabilität. Ein Einschluss von 100% wäre maxi­mal, d.h. kein YPerrhenat würde aus den Liposomen frei.

3.4 Resultate und Diskussion

3.4.1 Herstellung der YReQ4"-Lösung

Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um eine Lösung von YRe04~ zu erhalten:

* Bestrahlung von metallischem Rhenium mit Neutronen und an­schliessender Oxidation zum Re(VII) mittels 30%iger Wasserstoff­peroxidlösung

* Neutronenaktivierung eines erhältlichen Perrhenates wie z.B. Kali­um- oder Natriumperrhenates oder der Perrhensäure

* Bestrahlung von Dirheniumheptoxid mit Neutronen und Lösen des Anhydrides mit PBS 7.4

Es wurde die 3. Methode gewählt, da sie die meisten Vorteile bietet:

* sehr gute Löslichkeil von Re2C>7 (hygroskopisch!) * keine Neutronenaktivierung weiterer unerwünschter Atome (wie z.B.

K, Na)

- 42 -

• es braucht keine Oxidationsmittel. d.h. diese müssen auch nicht entfernt oder neutralisiert werden (überschüssiges H2O2 zur Oxida­tion des Re° oxidiert auch Liposomen)

• keine Kontaminationsgefahr, da YRe04~ sofort in Lösung vorliegt

Die Aktivität der Probe am Bestrahlungsende kann mit

A, « NA • o • <D • (l-e - r p r )

berechnet werden. Dabei ist $ der Neutronenfluss des Reaktors in [n-cm"2-s"i], 0 der Einfangsquerschnitt in [cm-2] (wobei die Einheit barn = 10~24 cm"2 gebräuchlich ist). NA die Anzahl der bestrahlten Re-Atome, t die Bestrahlungszeit und tj/2 die Halbwertszeit des beobachteten Re­Atoms. Bei dem hier zur Neutronenaktivierung verwendeten natürlichen Gemisch der Isotope 185Re und i87Re im Verhältnis von 37.4 zu 62.6 wird die Radioaktivität als Summe der Aktivitäten der Radioisotope lfl6Re und iaaRe gemessen:

Atotal " AiflftRefj) + A iae R e ( t )

Die berechneten Radioaktivitäten stimmten mit den gemessenen überein (siehe Tabelle 8). Die grössten Fehlerquellen sind die genaue Positionie­rung der Probe im Reaktor (und damit die genaue Einhaltung von $), die Eichung des zur Radioaktivitätsmessung verwendeten GeLi's sowie die der Messung vorangehende unumgängliche Verdünnung der Probe.

Datum

12.8.87 26.10.87 30.11.87

19.1.88 12.2.88 6.7.88

Einwaage Re207 [mg]

1.6 1.3 1.5 1.2 1.8 1.1

t Ch]

5.60 2.50 5.70 9.52 4.97

45.00

[n-cm"2-s" i ]

5.46-1013 5.61-1013 2.44-1013 2.81-1013

5.58-1013 6.61-1013

Gesamtaktivität [mCi] theor.

86.0 26.0 28.1 40.6 68.2 251.1

gemessen

94.9 25.5 33.9 35.9 72.0 -320

l f l 6Re- Anteil theor.

15.7% 15.0% 15.7% 16.5% 15.5% 23.9%

gem.

16.4% 17.7% 17.9% 18.5% 18.0% 24.0%

Tabtll« 8 GcgwaterittUung du gwwwim und brachntfrn NA «bügn Proton Ite)Or im Reaktor Saphir nach der Bestrahlungszeit t bei einem Neutronenfluss 4>.

3.42 Perrhenat-Einschluss in Ultraschall-Liposomen

Nach dem Beschallen wurden die Liposomen zur Bestimmung des einge­schlossenen YPerrhenates über eine PD10® gelfiltriert. Im Schnitt waren 6979 cpm in der Liposomenfraktion, d.h. nur 0.64% der eingesetzten

- 43 -

YRe04 -Totalmenge waren in den Liposomen eingeschlossen. Die Liposomen hatten eine Grösse von 28.0*15.4 nm (Gauss'sche An­zahlsverteilung) und eine Konzentration an El00 von 8.5 mg/ml. Berech­net man nun nach Huang und Mason 1978 das theoretische Einschluss­volumen für diese Parameter (siehe Figur 5). so erhält man ein Innenvolu­men von 0.534%.

V = 0.75-7t T 3

Vi = Va - VBiIayer - 3.11-107 A3

Anzahl PC-Moleküle pro Liposom - 24841 Anzahl Liposomen pro Mol PC - 2.42-1019

» Vi pro ml Liposomen = 5.34jil - Innenvolumen - 0.534X

Figur 5 Berechnung dec Lipoeaineninnenvorumenf fur die durch Ultraschall-Behandlung her­gestellten und mit vRe04" gefüllten Liposomen von 28.0 nm 0 und einer E100-Konzentration von 8.5 mg/ml (10.7>tmol PC pro ml Liposomen). Nach Huang und Mason 1978 wurde die Bilayerdicke mit 37 A und das Volumen eines PC-Moleküls mit 1253 A3 eingesetzt.

Der berechnete und der tatsächlich gemessene Wert stimmen gut überein, Abweichungen sind die Folge der Ungenauigkeit in der Berechnung we­gen der nicht ganz engen Grössenverteilung der Ultraschall-Liposomen.

Der theoretisch mögliche Einschluss ohne jegliche Anreicherung wird also erreicht!

3.4.3 Stabilität der Ultraschall-Liposomen

Die gesamte Radioaktivität wurde bei der Bestimmung der Stabilität mit­tels Gelfiltration in der Fraktion vom 6.-20. ml gefunden, d.h. es liegt nach 2 Tagen Icein liposomal eingeschlossenes YRe04" mehr vor. Die Lipid-membran der El00-Liposomen ist offensichtlich durchlässig für Perrhenat-ionen. Eine Stabilisierung könnte eventuell durch Inkorporation von Cho­lesterin oder Verwendung eines aushydrierten Lipides, das gegenüber der Ultraschallbehandlung nicht empfindlich ist, erreicht werden.

- 45 -

4 Einschlug von Rhenium in DTPA-SA-Liposomen

4.1 Einleitung

4.2 Vergleich von Rhenium und Technetium

4.3 Material und Methoden 4.3.1 Chemikalien und Material 4.3.2 Liposomenherstellung 4.3.3 Beladen von DTPA-SA-Liposomen mit ««"Tc 4.3.4 Stabilitalsbestimmung von «»ntTc-DTPA-SA-Liposomen mittels Dialyse 4.3.5 Beladen von DTPA-SA-Liposomen mit YRe

4.4 Resultate und Diskussion 4.4.1 •wnTc-DTPA-SA-Liposomen 4.4.2 Stabilität der "mTc-DTPA-SA-Liposomen 4.4.3 "»"Re-DTPA-SA-Liposomen

4.4.3.1 Reduktion von Re04" 4.4.3.2 Komplexierung von Rhenium an DTPA-SA-Liposomen

4.4.4 Problematik der Reduktion von Re(VII)

4.i Einleitung

Wie in Kapitel 3 gezeigt wurde, ist YReC>4~ nicht geeignet, um von Lipo­somen eingeschlossen und transportiert zu werden. Perrhenatanionen sind sehr klein, in ElOO-Liposomen sind sie zu wenig stabil gefangen, sie lea-ken.

Abhilfe könnte durch eine Fixierung des Rheniums an die Liposomen-membran geschafft werden. Dies kann über eine Ankergruppe gesche­hen, welche einerseits sehr stark an oder im Liposomenbilayer hält und andererseits das radioaktive Rhenium stabil komplexiert.

Als Ankergruppen werden längere CH-Ketten, vorzugsweise Stearylketten (Cia) verwendet. Die Inkorporation dieser lipidlöslichen Substanzen bei der Liposomenherstellung in den Bilayer geschieht problemlos. Laut Yoshi-haia et al. 1987 ist die Herstellung von Liposomen mit maximal 25 mol% SA möglich. Ein Anteil von 10 molfc hat sich bei den hier verwendeten Lipiden und Herstellungsmethoden als problemlos erwiesen. SA-haltige Liposomen sind toxischer als reine Phospholipidvesikel (Mayhew et al. 1987) Bei der Derivatisierung ändern sich aber die Eigenschaften des vorher positiv geladenen Liposoms. Da die Voluminas, die benötigt werden, nur einige ml betragen, ist die Toxizität auch im ungünstigsten Fall als gering anzu­sehen.

Für Schwermetallatome gibt es viele Komplexbildner. Die wegen ihrer hohen Stabilitätskonstanten meistverwendeten, aber nicht sehr spezifi­schen sind EDTA und DTPA. Siebter 1985 klärte die Struktur eines dioxo-verbrückten Rhenium-EDTA-Komplexes auf; mittels Rönigenstrukiuranalyse erhielt er H2EDTA-Re02Re-EDTAH2.

- 46 -

Zur Verwendung in Liposomen hat sich ein DTPA-SA-Konjugat als sehr brauchbar herausgestellt, die Stearatkette ist in der Membran sehr stabil verankert (siehe Literaturübersicht in Tabelle 9). Die genaue Struktur des Komplexes mit DTPA ist noch unbekannt, grundsätzlich ist DTPA aber ein achtzähniger Ligand. Kabalka et al. 1987 schlugen aufgrund von Elementar­analysedaten und physikalischen Gegebenheiten eine Struktur für das dreiwertige Gadolinium als komplexiertes Gd-DTPA-SA mit einer Koordi­nationszahl von 8 vor. Zusätzliche PbO-Anlagerungen könnten die Koor­dinationszahl aber noch erhöhen (siehe Figur 6).

Autor

Eckelman et al. 1975

Hnatowich et al. 1981

Rahman 1986

Kabalka et al. 1987

Wagner und Baffi 1987

Kabalka et al. 1988

Schwendener et al. 1989

Goto et al. 1989

Titel, Bemeikungen

"New compounds: fatty acid and long chain hydrocarbon derivatives containing a strong chelating agent", erstmalige Synthese

"Labeling of preformed liposomes with 67Ga and 99mTc by chelation"

Patent: "Liposomes"; DTPA-SA und Cardiolipin-haltige SUV's geben eingekapseltes Doxorubi­cin mit ~3% pro Stunde langsam frei

"Gadolinium-labeled liposomes: targeted MR contrast agents for the liver and spleen"

Patent: "Dried sacs of amphiphilic compounds with attached marker and ligand for use in specific binding assays"; Herstellung eines kompetitiven Digoxin-Immunoassays mit lipo­somal gebundenem Eu3+-DTPA-SA

"Gd-labeled liposomes containing para­magnetic amphipathic agents: Targeted MRI contrast agents for the liver"

"Small unilamellar liposomes as magnetic resonance contrast agents loaded with para­magnetic Mn-, Gd- and Fe-DTPA-slearate complexes"

"Liposomes prepared from synthetic amphi-philes. Their Technetium Labeling and Stability"

Tabtll« 9 Litwaturtlbroicht obff di» Vwwmdung dw DTPA-SA-KonJugatM.

Beim Rhenium und beim Techneth .n (siehe 42) ist die Situation noch viel schwieriger. Es ist zwar möglich, einen Tc-DTPA-SA-Komplex herzustel­len, jedoch gelang bis jetzt aie Isolation eines einheitlichen Produktes

- 47 -

noch nicht. Alberto 1988 schlägt für den Tc-DTPA-SA-Komplex eine dimere Struktur vor, wobei die freien Carboxylgruppen ein weiteres Tech-netiumion komplexieren, d.h. es bildet sich ein polymerer Komplex aus (siehe Figur 6). Anders ist die Situation bei " m Tc. Dort gelingt es, durch Reduktion von Pertechnetat mit Sn(+II) in Gegenwart von DTPA einen ein­heitlichen, vermutlich monomeren Komplex herzustellen. Der Unterschied liegt in den viel kleineren Konzentrationen an Tc mit ungefähr 10"8 bis 10"n mol/1. Konzentrationen bei denen "Tc schon nicht mehr nachweis­bar wäre. Dies macht die "Faltgeschwindigkeit" des DTPA's um das Tc-Atom herum anscheinend viel schneller als die Treffwahrscheinlichkeit mit einem zweiten Technetiumatom, es kann so also ein definierter Komplex ausgebildet werden. Levin et al. 1980 bestimmten für den nicht näher charakterisierten 99mTc-DTPA-Komplex eine Komplexbildungskonstante mit einem log K von 26.3.

Tc-DTPA-Dimer

Cd-D TPA -SA -Komplex H 3 7 C i g N H 3

Figur 6 DTPA-Kotnpl«» *W\ Tc und GA Die Struktur eines polymeren Tc-DTPA-Komple-xes wurde von Alberto 1988 vorgeschlagen, diejenige des Gd3*-Komplexes mit DTPA-SA von Kabalka et al. 1987.

- 48 -

42 Vergleich von Rhenium und Technetium

Rhenium steht im Periodensystem zusammen mit Mangan und Technetium in derselben Gruppe VIIB. Infolge der sogenannten Lanthanidenkontraktion zeigen Re und Tc ein ähnliches chemisches Verhalten. Mn hingegen weicht beträchtlich davon ab: Die 14 Elektronen des 4f-Orbitals des Rheniums schirmen die zugehörigen 14 positiv geladenen Protonen schlecht ab. weil sie zwischen den 4d-Orbitalen mit 10 Elektronen und den 5d-Orbitalen mit 5 Elektronen aufgefüllt werden. Dadurch wirkt auf die 5d-Elektronen eine grössere effektive positive Ladung ein und sie werden näher zum Kern gezogen. Die Grösse dieser Orbitale wird also kleiner als erwartet, Tc und Re werden dadurch ähnlich gross. Techne­tium hat einen Atomradius von 1.358Ä, Rhenium einen von 1.373Ä, ihre Ionenradien der Oxidationsstufe VII betragen 0.56Ä bzw. 0.53Ä. Auch Bindungslängen wie z.B. die Metall-Cl-Bindung in [Tc(IV)Cl6]

2" und [Re(IV)Cl6]

2" sind mit 2.35±0.0lA identisch.

Diese Tatsachen lassen uns für Tc- und Re-Komplexe also gleiche (oder sehr ähnliche) Grösse, Form, Dipolmoment, Ladung, Ionenmobilität, Lipo-philie und mehr erwarten. Als Folge davon wird das biologische Verhal­ten ebenfalls ähnlich sein.

Um aber das chemische oder biologische Verhalten der beiden zu ver­gleichen ist es sehr wichtig, die grundsätzlichen Unterschiede zu kennen:

1 Rhenium ist viel schwieriger zu reduzieren als seine Technetium-Ana­loga, das Standardreduktionspotential Eo der Tc-Komplexe (wie Tc04~, oder auch mit NCS", DMPE oder diars) ist immer ungefähr 100-300 mV grösser als das von Rhenium Deutsch et al. 1986), der Oxidationszu-stand spielt dabei keine Rolle. Die im Handbook of Physics and Che­mistry 1974/75 in der Tabelle "Elektrochemische Reihe" auf Seite D120-D125 aufgeführten Standardreduktionspotentiale betragen für Tc +0.738 Volt und für Re +0.51 Volt für die Reaktion:

Tc04" (Re04_) + 4 H* - 3 e" «r-* Tc02 (Re02) - 2 H20

2 Rhenium-Komplexe sind in höheren Oxidationsstufen thermodynamisch stabiler. Die praktische Auswirkung davon ist die kleinere in vivo-Sia-bilität der Re-Komplexe, d.h. mit der Reoxidation zum Perrhenat muss in stärkerem Ausmass als mit der oxidativen Pertechnetatbildung ge­rechnet werden.

3 Rhenium hat ein grösseres Ligandfeldsplitting, die Substitution am Me­tallzentrum ist also langsamer für Re. Es kann erwartet werden, dass Synthesen via Ligandaustausch mehr Zeit benötigen als es bei Tc der Fall wäre; eventuell müssen auch harschere Reaktionsbedingungen gewählt werden (Libson et al. 1989).

- 49 -

4 Das in einem Mo/Tc-Generalor produzierte 99rnTcC>4" ist fast tragerfrei. Je nach Alter des Molybdäns ist das Verhältnis von 99mTc zu "Tc im frischen Eluat 1-.9 bis 1:2.3 (Huber 1986). Diese Lösungen sind ungefähr 10"7 bis 10~fl molare 99rnTc04~-Lösungen. 186Re und iaaRe aber werden durch Neutronenbeschuss im Reaktor erzeugt. Die Konzentrationen des getragenen Rheniums liegen im Bereich von 10"3 mol/1. d.h. zur The­rapie geeignete Lösungen enthalten etwa 1-2 mg Rhenium pro 10 ml Lösung.

Als grobe Faustregel könnte man also sagen, falls eine chemische Reak­tion mit Technetium durchgeführt werden kann (z.B. eine Reduktion oder eine Komplexbildung), so ist die Chance gross, dass es auch mit Rhe­nium abläuft. Ist hingegen der Erfolg mit Technetium ausstehend, wird Rhenium noch mehr Probleme geben.

Es wurde versucht, Liposomen, welche DTPA-SA in der Membran verankert enthalten, mit einer Mischung von 186Re und iaaRe zu markieren und zu bestimmen, wie stabil Rhenium an die Vesikel gebunden bleibt. In einem ersten Schritt wurde 99™Tc an dieselben Vesikel komplexiert.

4.3 Material und Methoden

4.3.1 Chemikalien und Material

Die Pertechnetatiösung 99mTcCV wurde aus einem Molybdän-Techne-tium-Generator Ultratechnekow® (PSI, Radiopharmaka. Villigen, CH) täglich frisch eluiert, die Trägerlösung war sterile O.Pftge Natriumchloridlösung. DTPA-SA war ein Geschenk von Reto Schwendener (Unispital Zürich) und war nach Hnatowich ei al. 1981 hergestellt worden. Zur Dialyse wur­de ein Mini-Lipoprep* (DIANORM Geräte, München, BRD) mit einer offe­nen 1 ml-Dialysezelle verwendet, als Dialysemembran diente eine Zellu­losemembran derselben Firma mit einer Molekularausschlussgrenze von lO'OOO und einer Schichtdicke von 10 pm (Typ 10.16). Zur Trennung der Tc- und Re-Komplexe wurde Papierchromatographiepapier Whatman Nr. 3 (Bender + Hobein, Zürich, Schweiz) verwendet.

Der Boratpuffer 8.0 bestand aus Borsäure 6.853 g, NaOH 1 mol/1 55.4 ml, HCl 0.1 mol/1 446 ml und Aqua desl. ad 1.0 1.

Ascorbinsäure (Vitamin C), Kaliumjodid (KI), Natriumtetrahydroborat (NaBH4), Hydrazin (N2H4), Natriumdithionit (NaS2C>4), Natriumpyrosulfat (Na2S208), unterphosphorige Säure (H3PO2) sowie tu, dmtu und tmtu waren alle in der reinsten verfügbaren Qualität von Fluka AG (Buchs, Schweiz).

- 50 -

4.32 Liposomenherstellung

Das genaue Vorgehen ist unter Punkt 2.2.2.2 (Seite 21) beschrieben, die verwendeten Einwaagen sind:

Leerliposomen-. L/D=1.0 E100 43 mg (54.1 /xmol) in 2 ml EtOH Natriumdesoxycholat 22.4 mg (54.1 jimol) in 1 ml MetOH PBS 7.4 2 ml

DTPA -SA -Liposomen.- L/D=1.0 E100 43 mg (54.1 jimol) in 2 ml EtOH Natriumdesoxycholat 14.4+8 mg (54.1 jimol) in 1 ml MetOH DTPA-SA 4 mg (4.5 jimol) in 2 ml warmem EtOH

mit 8 mg Natriumdesoxycholat gelöst PBS 7.4 2 ml

Die DTPA-SA-Liposomen waren mit einem Durchmesser von 71.7±20.3 nm (Anzahlsverteilung nach Gauss ± 1 S.D.) und 93.3 ± 26.4 nm (Volumenver­teilung nach Gauss ± 1 S.D.) etwas grösser als die Vergleichsliposomen mit 64.1 nm und 88.1 nm (siehe Punkt 2.3.1).

4.3.3 Beladen von DTPA-SA-Liposomen mit 9,?mTc

Die zur Reduktion des Tc(VII) benötigte Zinnlösung wurde jeweils frisch hergestellt durch Lösen von 10 mg SnCl2-2H20 in 10 ml mit N2 durch-spülter 0.1N HCl (4.4-10"3 mol/1).

Variante h Durch Zugabe von 20 \i\ 0.1N NaOH wurden 1 ml DTPA-SA-Li­posomen (mit ~3.9-i0"7 mol DTPA-SA) auf einen pH von 10.5 eingestellt und dann 100 jzl 99mTc04" in 0.97. NaCl (-10"11 mol) und 10 ;xl Sn2*-Lö-sung (4.4-10"8 mol) dazugegeben. Nach 30 Minuten Inkubation bei RT wurden die Liposomen auf einer PD10® gelfiltriert, die Fraktionen gesam­melt und im y-Counter ausgezählt.

Variante Z Zu 1 ml DTPA-SA-Liposomen (mit ~3.9-10~7 mol DTPA-SA) wurden 100 jrt 99mTc04" in 0.9% NaCl (~10"n mol) und 10 ;il Sn2+-Lö-sung (4.4-10~a mol) gegeben, 30 Minuten bei RT inkubiert und an­schliessend auf einer PD10* gelfiltriert. Die Fraktionen wurden gesammelt und im y-Counter ausgezählt.

Das molare Verhältnis von Technetium zu Zinn betrug bei beiden Varianten 1 zu 4500. Von der Inkubationslösung sowie von der Liposomenfraktion wurden 10 )i\ auf einen Chromalographiepapierstreifen (1 cm x 20 cm) aufgetragen und während 45 Minuten mit Acetonitri!/H20 (5:2) Chromato­graphien.

- 51 -

4.3.4 Stabilitätsbestimmung von 99mTc-DTPA-SA-Liposomen mittels Dialyse

1 ml Leerliposomen (als Vergleichsliposomen ohne Komplexbildner) sowie 1 ml DTPA-SA-Liposomen wurden mit der unter Punkt 4.3.3 beschriebenen Methode (Variante 2) mit 99mTc markiert. Sobald der erste opaleszierende Tropfen aus der Sephadexsäule kam. wurden 1.0 ml Liposomen gesammelt und in einer offenen 1 ml-Zelle des Mini-Lipoprep® gegen 800 ml PBS 7.4 dialysiert. Die Zellulosemembran wurde vor der Dialyse 30 Minuten in PBS 7.4 quellen gelassen und gleichzeitig das Glyzerin ausgewaschen. Im Dialysewasser wurde über einen Tag das austretende radioakti\e 99mTc gemessen durch Auszählen von jeweils 3 x 2 ml im yCounter. Die Mess­resultate wurden durch Mitmessen einer 99mTcCV-Lösung mit anfänglich ~ 1 Mio cpm zerfallskorrigiert, um die Abnahme der cpm infolge der kurzen Halbwertszeit von 6 Stunden auszugleichen.

4.3.5 Beladen von DTPA-SA-Liposomen mit YRe

Zu 1 ml DTPA-SA-Liposomen (mit 4.8-10"7 bis 9.5-10"7 mol DTPA-SA) wurden 100 ;il YRe04~-Lösung in PBS 7.4 (1.2-10"7 bis 1.2-10"10 mol) und bis 30 mg SnCl2-2H20 in 0.1N HCl (5-10"8 bis 1.3-10"4 mol) gegeben. 3 bis 120 Minuten bei RT inkubiert und anschliessend auf einer PD10® gelfiltriert. Die Fraktionen wurden gesammelt und im y-Counter ausge­zählt.

Die benötigte Menge an Reduktionsmittel, die Inkubationszeit, die erfor­derliche Temperatur sowie die molaren Verhältnisse wurden in einem Vorversuch evaluiert. Die Liposomen wurden dabei durch Phosphatpuffer ersetzt. Von der Lösung wurden nach der Inkubation 10 ul auf einen Chromatographiepapierstreifen (1 cm x 20 cm) aufgetragen und während 45 Minuten mit Acetonitril/H20 (5=2) Chromatographien. Die am Start ver­bleibende Fraktion war ReC>2, Perrhenat wanderte an die Front.

4.4 Resultate und Diskussion

4.4.1 99mTc-DTPA-SA-Liposomen

Die Markierungsversuche von DTPA-SA-haltigen Liposomen sind in Ta­belle 10 zusammengefasst. Da abweichende Säulenlängen verwendet wurden, sind die verschiedenen Fraktionen nicht in Millilitern angegeben, sondern wurden in vier Gruppen aufgeteilt. In Figur 7 findet man anhand der PD10® die Fraktionenaufteilung: Vom 2.75. bis zum 4.75. ml kommt die

- 52 -

Liposomenfraklion. darauf folgt bis und mit 8. ml die Zwischenfraktion, danach das Pertechnetat. Nicht näher charakterisierte Fällungen, ev. Kol­loide oder Oxide des Technetiums zusammen mit den Zinnkolloiden verbleiben auf dem Gel in der Säulenfraktion. In Figur 7 fällt auf. dass bei den Vergleichsliposomen. also denjenigen ohne DTPA-SA im Bilayer. eine breite Bande etwa 1 nu später als die Front der Liposomenfraktion erscheint und bis an den Beginn des Per-technetates langsam abfällt. Leider fallen die beiden Fraktionen im 4. ml

Experi­ment

Kommen­tar

Radioaktivität auf der Gelfiltrationssäule [%] Lipo somen

Zwi-schen-frak-tion

Te04- Säule

Radioaktivität auf dem Pa-pierchromatogramm [%] Start RfO.O

Front Rf 1.0

andere

Variante 1

Test

D2/3

D3/0.5

D3/3.5

nur Tc04

Vergleich

DTPA-SA

PBS 7.4

Vergleich

DTPA-SA

Vergleich

DTPA-SA

-

16.8

66.9

43.8 ±7.4

46.1 ±2.6

77.1 ±3.9

22.3

10.9

-

24.6

5.4

40.18 ±4.0

32.1 ±3.5

5.6 ±0.2

3.6

4.1

100

14.8

5.2

2.5

1.4

5.6

51.5

74.0

-

43.9

22.6

-

50.3*

53.5*

29.3* 38.5*

93.5

8.6*

15.8*

70.7* 61.5*

-

-

-

-

-

Variante 2

D5/1

D5/2

D5/3

Vergleich

DTPA-SA

Vergleich

DTPA-SA

Vergleich

DTPA-SA

38.9

78.9

52.7

75.6

32.9

87.6

58.1

3.5

44.9

4.1

0.5

10.7

0.3

11.9

84.8*

33.8*

82.0* 62.5°

22.9* 29.8°

8.1*

14.9*

8.1* 28.7°

15.5*

-

37.2* (Rf 0.10) -

-

46.1* (Rf0.07) 15.41* 48.9° (Rf 0.07)

TaMl« 10 Ifarktenmgmuuoht von DTPA-SA-haltigm Lipomnan mit w m T c bei pH 10.5 (Variante 1) oder in PBS 7.4 (Variante 2). Alle Werte sind Mittelwerte von Doppelbe­stimmungen, D3 ist eine Dreifachbestimmung ± 1 S.D. Nähere Angaben siehe unter 4.3.3.

A PC der Liposomenfraktion ° PC der Liposomenfraktion nach Dialyse * PC der Zwischenfraktion

- 53 -

Radioaktivität [uCi]

1 2 3 4 6 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 PD10

Gelfiitrationsfraktion [ml]

Figur T RacKoaktMtttmwtflung nach Galfiltrarian von DTPA-SA-Liposomen, welche vor­gängig während 30 Minuten in einer Sn2*- und "mTc04"-haltigen Lösung inkubiert wur­den.

l H DTPA-SA-Liposomen Q DTPA-SA-Liposomen, aber ohne Sn-Zugabe (-*Tc04")

\Z\ Leerliposomen

zusammen, zur vollständigen Trennung könnte ein anderes Gelmaterial verwendet werden (z.B. Sephadex G75 SF). Diese Zwischenfraktion verhält sich im Pc wie reduziertes Tc04" (siehe D3/0.5, PBS 7.4; d.h. der Reduk­tionsversuch während 0.5 Stunden ohne Liposomen in der Lösung). Sehr wahrscheinlich entsteht polymeres, teilweise kolloidales TCGY Da die Fraktion kurz nach der Front aus der Säule eluiert, müssen die Teilchen ein MG von einigen Tausend haben (Sephadex G25M hat eine Aus-schlussgrösse von 5000).

Längere Inkubationszeiten scheinen die Effizienz der Markierung wieder zu verschlechtern, siehe D3/3.5h. Eventuell wären sogar noch kürzere In­kubationszeiten von Vorteil. Das Problem liegt auch hier bei der Reoxi-datL.i zum Pertechnetat: Das Reduktionsmittel wird in neutraler Lösung durch Luftsauerstoffeinfluss gefällt (Zinnhydroxide) und stört (siehe Diskus­sion unter Punkt 4.4.4).

Der Einschluss mit Variante 1. d.h. der Markierung unter basischen Bedin­gungen, liefert Einschlussraten in die Liposomenfraktion bis 77.1%. Die Streuung ist relativ gross und vor allem zeitabhängig. Bei Variante 2 wird die Markierung bei neutralem pH von 7.4 ausgeführt und die Markierungs­ausbeute steigt auf 75-90%. Diese Methode hat also Vorteile gegenüber der Variante 1 und sie ist einfacher, da keine pH-Änderung mehr nötig ist.

- 54 -

Wahrend Liganden wie 2,3,2-tet zur Markierung einen pH von >9 benöti­gen Bläuenstein et al. 1985), findet die ideale Komplexbildung von DTPA im neutralen bis leicht sauren Bereich statt. Liposomen ohne den Liganden, enthalten ebenfalls 30-50% Radioaktivität in der Liposomenfraktion. Laut Pc besteht diese Fraktion aus mehr als 80% TCO2 und ungefähr 8% TcCV. Im Vergleich dazu enthalten die DTPA-SA-Liposomen etwa 30% TCO2, sehr regelmässig etwa 15% Tc04" und 40-50% Tc-Komplex. Die Trennung des TcC>2 und des Tc-Komplexes auf dem Pc ist schwierig, da ihre Rf-Werte mit 0.00 und 0.07-0.10 sehr nahe beieinan­der liegen. Es wurden verschiedene Laufmittel und Mengenverhältnisse mit Acetonitril, Wasser, Chloroform. Ethanol ausprobiert. Das schliesslich verwendete Laufmittel ACN/H2O (5:2) war das geeignetste. Es muss klarge­stellt werden, dass der Anteil an komplex-gebundenem Tc eventuell grösser und der Anteil an TcC>2 um den entsprechenden Betrag kleiner sein könnte. Zur weiteren Charakterisierung müsste eine Elektrophorese er­wogen werden.

4.4.2 Stabilität der 99mTc-DTPA-SA-Liposomen

Eine Stabilitätsbestimmung nittels Dialyse sollte weiteren Aufschluss über die Bindungsart im Liposom und die Hauerhaftigkeit des Tc-DTPA-Kom-plexes geben. Ist das 99mTc als TcC>2 oder als Tc-DTPA-SA-Komplex im Bilayer eingeschlossen?

1 ml der mit Tc beladenen Liposomen von Experiment D5/3 (siehe Ta­belle 10) mit oder ohne DTPA-SA im Bilayer wurde gegen 800 ml PBS 7.4 dialysiert (Figur 8). Die DTPA-SA-Liposomen verlieren die Radioaktivität linear nach der Gleichung yi - -1.2269x + 99.88 (n= -0.9972), d.h. nach 40.65 h ist die Hälfte der Radioaktivität aus den Liposomen verschwunden. Alle Werte wurden auf eine Referenzzeit bezogen, um die Abnahme durch den radioaktiven Zerfall einzuberechnen. Die Liposomen ohne DTPA-SA hingegen verlieren Technetium anfänglich sehr schnell, nach 1.5 h sind noch etwa 30% der Anfangsaktivität in den Liposomen enthalten. Die Gerade der zweiten, linearen Phase berechnet sich als y2 - -0.43956X + 32.874 (r2- -0.9980) mit einer Halb-Abdialysierzeit von 37.39 h.

Von den Liposomen ohne DTPA-SA gehen innerhalb von 1.5 h zwei Drit­tel der Radioaktivität weg. Vermutlich wird locker an die Membran gebun­denes Technetiumoxid weggespült. Das Pc der Liposomen vor der Dialyse ergab mehr als 80 % TcÜ2, d.h. bei einem Grossteil dieses abdialysierten 99mTc muss es sich um dieses Oxid handeln. Eine Pc-Analyse der Liposo­men ohne DTPA-SA nach d'ir Dialyse ergab, dass immer noch 62.5% der Gesamtaktivität " TcC>2 war; nach Herstellung muss also verschieden stark gebundenes 99mTcC>2 vorhanden gewesen sein. Ein Teil war nur locker

- 55 -

Radioaktivität in den Liposomen [%]

60 - • ^

40 \ -

20

Q I i i i 1 1 i 1 . . . .

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Dialysezeit [h]

—— DTPA-SA-Liposomen —1~ Leerliposomen

Figur 8 StabilitltriMttlmmung von an DTPA-SA-LipoMnun komptadert« »""Tc mittels Dialyse von 1 ml der DTPA-SA-Liposomen (eingesetzte Radioaktivität 485 JJLCI) oder von 1 ml Liposomen ohne den Komplexbildner DTPA-SA (eingesetzt 176 >tCi) gegen 800 ml PBS 7.4.

an die Oberflache der Liposomen adsorbiert, ein weiterer 99mTc-Anteil war wahrscheinlich zwischen den Lipidketien eingelagert und wurde dann langsam durch Reoxidation in 99mTc04~ umgewandelt und weggespült. Die Zeit, bis die Hälfte der Radioaktivität aus den DTPA-SA-Liposomen abdialysiert war, entsprach mit 40.65 h ziemlich genau den 37.39 h der Liposomen ohne DTPA-SA. Die beiden Kurven laufen nach zwei Stunden parallel, was mit einer oberflächenkontrollierten Pertechnetatbildung er­klärt werden könnte; d.h. die konstante Gesamtliposomenoberfläche kon­trolliert die 02-Diffusion in den Bilayer und damit die Pertechnetatbil­dung.

Da im Pc auch bei den DTPA-SA-Liposomen immer Tc02 vorhanden war, setzt sich die Radioaktivitätsabnahme möglicherweise auch bei diesen aus zwei linearen Prozessen zusammen:

1. Eingeschlossenes TCO2 wird mit der gleichen Kinetik wie bei den Li­posomen ohne DTPA eliminiert.

2. Zusätzlich wird das DTPA-gebundene Technetium stetig oxidiert (y3 = -0.78734-x + 67.101). Diese Gerade wurde aus y2 + y3 - yi berechnet.

Mil anderen Worten, Tc ist etwas weniger stabil an DTPA-SA gebunden als TcÜ2 in der Membran.

Die genaue Lage des radioaktiven Technetiums im Liposom könnte über die Bestimmung der transversalen Relaxationszeit T2 im NMR geklärt wer­den.

- 56 -

4.4.3 YRe-DTPA-SA-Liposomen

4.4.3.1 Reduktion von ReQ4"

In einem Vorversuch wurde festgestellt, ob und wie Perrhenat mit der Oxidationsstufe VII reduziert werden kann. Dazu wurde eine YRe04~ -Lö­sung in PBS 74 mit wechselnden Mengen SnCl2-2H20 und verschiede­nen Temperaturen unterschiedlich lang inkubiert und der Anteil an gebil­detem Rheniumoxid ReÜ2 gemessen. Figur 9 zeigt, dass es einen sehr grossen Zinnüberschuss braucht, bis überhaupt Re(IV) gebildet wird. Auch bei einem lOOOfachen molaren Überschuss übersteigt der ReC>2-Anteil nie 50X. Längere Inkubationszeiten und erhöhte Temperatur erhöhen die Aus­beute an ReÜ2. Die drei Bestimmungen mit den höchsten Rheniumoxid­anteilen bei 130 jimol Sn2+ zeigen auf dem Pc Mehrfachpeaks im Bereich von Rf-0.00 bis Rf-0.20. Es könnte sich dabei um Rheniumoxide in anderen Oxidationsstufen handeln. Im Gegensatz zu Technetium, das nach Cotton und Wilkinson 1988 nur Tc02 und TC2O7 bildet, kommen nach derselben Literaturstelle Rheniumoxide in allen Oxidationsstufen von +III bis -»-VII vor. Einzelne schräg ansteigende Peaks deuten darauf hin. dass eventuell Rheniumoxide auf dem Pc disproportionieren und der Re02-Anteil dann liegenbleibt.

Anteil Rheniumoxid bei Rf-0.00 [%]

60 p

4 0 -

3 0 -

2 0 -

10 -

1 10 100 Reduktionsmittel Sn(ll) (Mmol]

- — 30 Min btl RT - t - 2 h bei RT - * - 17 h bei RT

° 3 Min bei 66 C - * - 30 Min btl 65 C 0 S Min bat 66 C

Figur 9 Vorvtnuch air Emütttung dw wr Reduktion von RherüumCVH) erforderlichen Sn(II> Menge. Es wurden lOOjxl Perrhenatlösung (0.13 Mmol) zu 1 ml PBS 7.4 gegeben und zwi­schen 0.3 und 30 mg SnCl2-2HäO in 10^1 0.1N HCl dazugegeben.

- 57 -

In diesem Vorversuch wurde klar, dass zur Reduktion ein mindestens lOOOfacher Überschuss an Zinn nötig ist. Da Rhenium im nanomolaren bis mikromolaren Bereich vorliegt, werden immer mg-Mengen an Zinnchlorid benötigt.

4.4.32 Komplexierung von Rhenium an DTPA-SA-Liposomen

In Tabelle 11 sind die Versuche aufgelistet, Rhenium mit liposomal veran­kertem DTPA bei einem pH von 7.4 zu komplexieren. Nur bei 2 Versu­chen gelang es. 0.5 bzw. 1.5 % der eingesetzten Radioaktivität in die Li-posomenfraktion zu bringen. In einem Pc von D9/5 wurde aber weder ein Rheniumkomplex noch ReÜ2 gefunden. Bei den vorliegenden Bedin­gungen scheint die Erwärmung der Lösung nötig zu sein. Durch Experi­ment D8/2 wird ersichtlich, dass Liposomen nach längerer Inkubationszeit bei hoher Temperatur zerstört werden, die Phospholipide fallen zusam­men mil den Zinnkolloiden aus.

D6/2

D6/1

D8/1

D8/2

D8/2

D9/1

D9/2

D9/3

D9/5

D9/5

DTPA-SA

[mol]

-

9.5-10-7

9.5-10" 7

-

9.5-10" 7

9.5-10~7

4.8-10"7

4.8-10~7

-

9.5-10"7

YReOr

[mol]

1.3-10-0

1.3-10"8

1.3-10" 7

1.3-10" 7

1.3-10"7

1.2-10-10

0.6-KT10

0.6-icr10

1.2-10~10

1.2-10"10

SnCl2

[mol]

1.1-10"5

1.1-10"5

1.310-*

1.3-10"4

1.3-10"4

5-KT8

5-10_a

5-KT7

5-10"6

5-10"6

SnCl2 *ReOi

1200

1200

1000

1000

1000

416

832

4160

41'600

41'600

Zeit

[min]

40

40

10

45

45

20

20

20

5

5

Tem­pera­tur

RT

RT

6 0 t

6 0 t

6 0 t

RT

4 5 t

4 5 t

5 5 t

5 5 t

Pc Re02 Re04

_

1 Komplex 1 - f -

PD10® Lipos-anteil

-

-

1.5 %

1 klare Lösung, laut \ LLS W n Liposomen 1 mehr messbar!

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

+

+

-

-

-

0.1 %

0.5 %

Tabelle 11 Reduktion von VRt04" mit verschiedenen Mengen von Sn(II) und Komplexie­rung der reduzierten Rheniumspezies an DTPA-SA.

Eine stark konzentrierte Zinnchloridlösung, welche nach dem Vorversuch zur Reduktion nötig ist. kann in der Wärme Liposomen zerstören (siehe Tabelle 11, Experiment D8/2). Bei Zugabe zu einer kalten Liposomenlö-sung bleibt die Grösse der Liposomen gleich, es erscheint aber eine zu­sätzliche Teilchenfraktion bei ~10 nm (Detektionsgrenze des LLS-Gerätes). Dabei kann es sich um Mizellen, noch wahrscheinlicher aber um Zinn­oxid- und Zinnhydroxid-fällungen handeln.

Fazit: DTP A-SA-Liposomen können bei mehr als tausendfachem Zinnüber-schuss und bei Temperaturen von mehr als 55TT Rhenium komplexieren. Da aber die Ausbeute bei den angewendeten Bedingungen zu klein ist und die Liposomen zerstört werden, muss nach einer anderen Markierungs-methode gesucht werden. Eventuell könnte auch schon markierte DTPA-SA bei der Liposomenherstellung verwendet werden, die schnelle und v.a. für Einzelherstellungen brauchbare Gelfiltrationsmethode ist dafür gut geeignet.

4.4.4 Problematik der Reduktion von Re(VII)

Die geringe Komplexbildung ist auf die Schwierigkeiten zurückzuführen, das Re(VII) zu den benötigten Re(lV) und/oder Re(V) zu reduzieren. 99mTc04" ist leicht reduzierbar. die unter Punkt 4.3.3 verwendete 4.4-10"3 molare Sn(H)-Lösung im etwa 1000-5000 fachen molaren Über-schuss ist etabliert und wird von den verschiedensten Autoren verwen­det. Oft wird diese "Standardmethode" in der Literatur einfach nur als "Sn-Methode" bezeichnet.

Zur Reduktion von Rhenium wird allgemein die SnQD-Reduktion verwen­det, wahrscheinlich aufgrund fehlender Alternativen.

Nachteile der Sn-Methode: Wie in Figur 9 gezeigt, sind zur Reduktion von YRe04_ sehr grosse molare Sn2+-Überschüsse nötig. Man kann ei­gentlich nicht mehr von Lösungen sprechen, bei 30 mg SnCl2*2H20 in 50 ß\ HCl muss man von Aufschlämmungen reden. Eine Erwärmung der Lösung beschleunigt die Reduktion. Eine 0.044 molare SnC^-Lösung [100 mg SnCl2-2H20 werden in 1 ml 0.1N HCl gelöst und davon 100 jil in 1 ml PBS 7.4 gegeben] hat einen pH von * 1. Liposomen ertragen solche H+-Ionenkonzentrationen nur kurzfristig (siehe Tabelle 11, Punkt D8/1), Proteine gar nicht, da -S-S-Brücken reduziert werden können. Proleine werden dadurch denaturiert und verlieren ihre biologische Aktivität. Bei solchen tiefen pH's können auch keine Amine mehr komplexiert werden, das Optimum liegt für Komplexe wie tet und mtp im alkalischen Bereich. Die Lösungen müssten also gepuffert werden, was bei obigen hohen SnCl2-Konzentrationen nicht mehr möglich ist. Im neutralen und basi­schen pH-Bereich bilden sich Zinnkolloide und fallen aus. Gelfiltrationen mit solchen Mischungen sind schwierig: An die Liposomen werden Oxide adsorbiert und verfälschen dadurch das Resultat durch Vortäuschen von grösseren YRhenium-Einschlüssen.

Um diesen Mängeln der Sn-Reduktion auszuweichen, wurden einige weitere mögliche Reduktionsmittel getestet und die von der Literatur be­kannten auf ihre Eignung überprüft. Alle Methoden sind aber mit mehr oder weniger grossen Nachteilen behaftet:

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HiPQg: Die unterphosphorige Säure hat ein Eo von -0.51 V für die Reak­tion H3PO2 + H* + e" -*—^ P + 2H20. Bei der Synthese von [Re-Halö]2" mittels Kochen in HCl oder HBr wird sie erfolgreich verwendet (Wan und Thompson 1963). In einer auf pH 5 eingestellten Lösung gelang es Quadn und Wessels 1986 aber nicht. DTPA mit 186Rhenium zu markieren.

NaS?Q*: Natriumdithionit hat ein Eo von -1.12 V bei der Reaktion 2 S032"

+ 2 H20 + 2 e" *s-^ S2042- + 4 OH". Quadri und Wessels 1986 kom-

plexierten Rhenium bei pH 9 mit proteingekoppeltem DTPA. Sie erhiel­ten eine maximale Kopplungsausbeute von 18.2%, wobei jedoch nur maximal 25% davon biologisch aktives 186Re-DTPA-HSA war. Der Rest war denaturiertes Protein.

Na SoOi;: Mit Natriumthiosulfat (74 mg/ml) konnten in Boratpuffer 8.0 innert 10 Minuten maximal 4.0% ReÜ2 gebildet werden. Längere Inkubations­zeilen verringerten die Ausbeute wieder.

KL Nach Schriver et al. 1978 kann in konzentrierter Salzsäure mit Perrhe-nat Rheniumhexachlorid gebildet werden. Bei der Herstellung von [ReC^]2" konnten aber die entsprechenden Banden im UV nicht nachgewiesen werden, die Lösung wurde sofort braun. Durch in conc. HCl immer anwesendes CI2 wurde das Jodid zum Jod oxidiert, färbte die Lösung und störte dadurch den Nachweis des Re(lV). Eo von I2 • 2 e" *r—* 2 1" beträgt 0.535 V. d.h. theoretisch sollte dieser Redoxprozess nicht ablaufen!

Vitamin G Pertechnetat kann mit Vitarain C (-Ascorbinsäure) bis zum Tc(V) reduziert werden, Oxidationsstufe IV wird aber nicht erreicht. Die Inku­bation von einer 10%igen Vitamin C-Lösung mit YRe04" ergab auch nach 1 h und bei 50tT kein Anzeichen von reduzierten Rheniumspezies auf dem Pc. Die Lösungen hatten einen pH von ~3. Mittels Zugabe des Komplexbildners 2,3,2-tet wurde getestet, ob eine eventuell vorhandene Spezies mit Oxidationsstufe V gebunden werden konnte. Dies war nicht der Fall, auch bei Erhöhen des pH's auf 8.0 mittels NaOH 1 mol/1 nicht, d.h. auf dem Pc wurden 100% der eingesetzten Radioaktivität als Perrhe-nat bei Rf-0.96 gemessen. Laut Karlson 1980 beträgt Eo von Vitamin C +0.06 V.

NaBH4= Natnumtetrahydroborat wurde von Levin el al. 1980 zur 99™Tc04~ -Reduktion verwendet. Eo beträgt -1.24 V für die Reaktion H2BO3" + 5 H20 + 8 e~ *—» BH<" + 8 OH", es sollte also auch für Rhenium genügen. Nachteilig ist, dass die Reaktion, welche innert 15 Minuten vor sich geht einen tiefen pH von 1.2 benötigt.

- 60 -

NaF-U: Hydrazinhydrochiorid ist ein starkes Reduktionsmittel und wird bei Schriver et al. 1978 zur vollständigen Reduktion des Perrhenates bei der Kalium-hexabromo-rhenat(IV)-Synthese verwendet. Die Inkubation einer Perrhenatlösung während 40 Minuten in PBS 7.4 und bei RT er­gaben eine Ausbeute von 1% ReC>2 (auf dem Pc-Streifen gemessen).

Thioharnstoffliqanden: Im stark sauren pH-Bereich ist tu und seine me-thylierten Analoga, dmtu und tmtu (siehe Figur 10), in der Lage. Per-technetat zu reduzieren und gleichzeitig zu komplexieren. In neutraler Lösung verlieren diese Substanzen aber ihre reduzierenden Eigen­schaften. Beim "Tc wurden die oktaedrischen Tc(HI)-Komplexe Tc(tu)63+. TctdmtuV* sowie der Tc(V)-Komplex mit der Struktur TcO(tmtu)43+ von Abiams et al. 1983 und Abrams et al. 1984 hergestellt und mittels Röntgenspektren analysiert. Die Komplexe sind in wässriger Lösung bei höheren pH-Werten nicht stabil, könnten aber als Zwischenstabilisatoren der Oxidationsstufe +V bei der Komplexierung von Polyaminliganden verwendet werden. Zollinger et al. 1986 fand bei der Reduktion von 99rnTc(V mit ]u in 0.5 molarer HCl schon nach 5 Minuten weniger als 5% Pertechnetat, es wird v.a. Tc02 gebildet. Bei Erhöhung auf pH 10 und Umsetzen mit 2.3.2-tet entsteht zur Hauptsache wieder 99mTc04~. es wurde nur sehr wenig des gewünschten Komplexes gefunden. Die Pertechnetat-Reduktion mit dmtu geht sehr langsam vor sich, auch nach einer Stunde ist immer noch etwas Pertechnetat vorhanden. Gibt man zu einer solchen Lösung eine mit Natriumhydrogencarbonat ge­pufferte Lösung eines Polyamins und hebt den pH auf 10 an, so wer­den über 90 % Komplexbildung erreicht. tmtu reagiert unter den gleichen Bedingungen etwas schneller, es werden über 80 X Komplexbildung erreicht. Sein Nachteil ist aber die schwere Löslichkeit in Wasser, d.h. es ist notwendig in 50%iger ethano­lischer Lösung zu arbeiten. Zollinger et al. 1986 versprechen sich von den noch nicht untersuchten Thioharnstoffderivaten Methylthiourea und Trimethylthiourea eventuell noch optimalere Eigenschaften.

H-N—L—NH-,

tu

' H 3 \ U /"I

dmtu

Figur 10 Struktur dir Thiorttmrtfltalf«!»

H-,l tmtu

TH, 3

Die Reduktions- und'Stabilisierungseigenschaften dieser Thioharnstoff-liganden auf Rhenium in den Oxidationsstufen +V und +1V wurden bezüglich Rhenium noch nicht untersucht, versprechen aber ahnliche Resultate.

- 61 -

Fazit: Es scheint noch keinen geeigneten Reduktionsmittelersatz für das als Standardmethode verwendete SnCb zu geben. Am hoffnungsvollsten sind die Thioharnstoffliganden dmtu und tmtu, in Bezug auf Rhenium sind sie aber noch zuwenig untersucht, zwischen Reduktion und Komplexie-rung ist ein pH-Wechsel nötig. Die anderen besprochenen Reduktions­mittel sind nur bei tiefem pH brauchbar (H3PO2. KI. NaBH4). ergeben nur eine geringe Ausbeute (N2H4. Na2S2Ü4 und Na2S20s) oder reduzieren Re04" überhaupt nicht (Vitamin C).

- 63 -

5 Herstellung verschiedener Tetraaminkomplexe mit Rhenium

5.1 Einleitung

5.2 Analysengeräte und Chemikalien

5.3 Methoden 5.3.1 Synthese von Rephos 5.3.2 Synthese eines Rephos Isomeres 5.3.3 Synthese von [Re02(en)i]Cl und [Re02(en)j]PF6 5.3.4 Synthese von [Re02(2.3.2-tet)]Cl 5.3.5 Synthese von mtp-SA

5.3.5.1 Gemischte Anhydrid-Methode 5.3.5.2 Diphenylphosphorylazid-Methode

5.4 Resultate und Diskussion 5.4.1 Analyse des grünen /?ep/ios-Komplexes 5.4.2 Analyse des violetten Rephos -Komplexes 5.4.3 Analyse der [ReOjCen^] -Komplexe 5.4.4 Analyse des iReOji2.3,2-tet)]Cl-Komplexes 5.4.5 Resultate der mtp-SA-Synthese

5.4.5.1 Gemischte Anhydrid-Methode 5.4.5.2 Diphenylphosphorylazid-Methode

5.5 Zusammenfassung

s.i Einleitung

Da sich die Komplex-Bildung von Rhenium mit DTPA als schwieriger her­ausstellte als erwartet, musste ein spezifischerer Ligand gefunden wer­den. Auch das leidige Reduktionsproblem sollte auf elegante Weise um­gangen werden. Es bot sich die Bildung eines hochstabilen Rhenium­komplexes über den Austausch von weniger affinen Ligandgruppen an. Rhenium bildet auf der fünfwertigen Stufe stabilere Komplexe als Tech­netium. Insbesondere die Reduktion zu vierwertigem Rhenium ist schwie­riger, d.h die Rheniumkomplexe sind auf der Stufe +V stabilisiert. Bläuen­stein 1977 untersuchte die Stabilität der Komplexe von verschiedenen Kat­ionen mit Tetraaminliganden. Diese hatten die allgemeine Formel

H2N-(CH2)2-NH-(CH2)n-HN-(CH2)2-NH2 mit verschieden langen C-Ketten als Brückenglieder, die Abkürzung der Liganden ist 2,n,2-tet. Alle untersuchten Kationen bildeten mit 2.3,2-tet die stabilsten Komplexe. Die spektrophotometrischen Untersuchungen am Beispiel von Cu2* und Ni2+ zeigten, dass bevorzugt quadratisch planare Komplexe entstehen. Bläuenstein et al. 1985 stellten mit Technetium einen positiv geladenen Komplex [Tc02(2,3,2-tet)]+ her und untersuchten die Verteilungs- und Eliminationskinetik bei intravenöser Gabe. Die erhoffte Anreicherung in definierten Geweben der Ratte wurde nicht festgestellt, der positive Komplex wurde schnell über die Nieren ausgeschieden. Der Komplex blieb stabil, d.h. er zersetzte sich in vivo nicht. Der sehr ähnli-

- 64 -

che Komplex CTc02(en)2]+ hingegen zeigte bei der Analyse des Urins fünf verschiedene Radioaktivitätspeaks.

Aufgrund der Inertheit und der grossen Stabilität dieses Technetiumkom-plexes war es naheliegend, einen ebensolchen Komplex mit Rhenium zu bilden. Johnson et al. 1964 beschrieben die Synthese von verschiedenen Rheniumkomplexen über die Zwischenstufe von fünfwertigen Komplexen wie z.B. ReOCls2-. Um die Kinetik der ganzen Reaktion abschätzen zu können, wurde daher zuerst der erstmals von Lebedinskii und Ivanov-Emin 1943 synthetisierte Komplex [Re02(en)2]Cl- 2H2O über die Zwi­schenstufe eines Triphenylphosphin-Rhenium-Komplexes Rephos) her­gestellt. Darauf sollte das Rheniumequivalent zum Tc-2,3,2-tet-Komplex hergestellt werden (siehe Schema 5).

Re207 HC1 c o n c - . HRe04

PPna. E t Q H

TF1 [ReOgCenhlCl [ReChCZSl-teOJCl

Schema 6 Synth»*» von R*pho§ und dm «n- und 2,3 ,2-t»t-Kanpl«*«n von Rhenium

Huber 1988 beschrieb die Herstellung eines 2,3,2-tet-Derivates, an deren beiden mittleren Stickstoffatome je eine Propionsäuregruppe gekoppelt war (mtp). Diese Säuregruppe ist geeignet um Proteine anzukoppeln, auch Phospholipide können kovalent daran gebunden werden. Die Mar­kierung mit Technetium wurde durch Substitution des Pyridins im frisch hergestellten [Tc02(py)4]Cl in einer wässrigen Ligand-Lösung mit pH 10.5 durchgeführt, die Ausbeute war ~90 %.

Es sollte also ein mtp-SA-Derivat hergestellt werden, welches in der Li-posomenmembran verankert werden kann. Rhenium wird darauf vom Li­ganden komplexiert. Die Synthese wurde mit zwei verschiedene Methoden ausgeführt (siehe Schema 6).

- 65

JDH HD

y\A SA

mtp

\_J~\/i~~\ [DPPA-Methode' r/V

DPPA

* 2SA

gemischtes Anhydrid

\ "^Trielhyl-

amin

918 *37 9l8H37

/NA

mtp-SA

Schnna 6 Synthwmiiuclw «on mtp-SA

32 Analysengeräle und Chemikalien

Alle verwendeten Lösungsmittel sowie Phosphorsäure-diphenylester-azid (DPPA), Ethylendiamin puriss. (en), Triphenylphosphin puriss. (PPh3), Dirhe-niumheptoxid (Re2C>7) puriss., N,N-Dimethylformamid (DMF), Isobutylchlo-roformiat (IBCF), Dimethylsulfoxid (DMSO) und Triethylamin puriss. waren von Fluka AG (Buchs, CH). Natriumhexafluorphosphat (NaPF$) wurde von Aldrich Chemie (Milwaukee, Wisconsin, USA), \,4,8,11-Teiraazaundekan (2,3,2-tet) von Strem Chomioals (Newburyport, MA, USA) bezogen. 2,12-Di-methyl-2,5,0,12-tetraazatridecan-5,°-di-propionsäure (mtp) war ein Ge­schenk von Gabriel Huber (Institut für anorg. Chemie ETHZ). Die Ninhy-drinlösung war von Sigma (St. Louis, USA).

Es wurden DC-Platten Kieselgel 6OF254 sowie Reversed-Phase Fertigplat­ten RP-8 F2S4S von Merck (Darmstadt. D) verwendet. Zui Schmelzpunktbestimmung wurde ein Büchi 510 (Büchi. Flawil, CH) verwendet.

Die UV- und Visible-Spektren wurden auf einem Lambda 3. UV/Vis-Spektrophotomeier mit R100A Recorder von Perkin Eimer (Überlingen. D) aufgenommen. IR-Spektren wurden mit Pressungen auf einem Perkin Eimer Infrarot-Spek-trophotometer 298 aufgenommen, wobei jeweils 1-1.5 mg Probe pro 150-200 mg KBr eingesetzt wurden. Die lH-NMR-Spektren des grünen /?ep/?os-Komplexes wurden von Ga­briel Huber auf einem WM-250 Gerät von Bruker bei 250 MHz mit CDC13

als Lösungsmittel erstellt. Das violette /?ep/?os-Isomer wurde auf einem Bruker HX-90E bei 90 MHz gemessen. Die chemische Verschiebung 8 ist in ppm angegeben und bezieht sich auf Tetramethylsilan als Referenz. Die Anzahl der H-Atome wurde aus den Integralen bestimmt.

Die Elementaranalyse des flep/ios-Komplexes auf C, H. O, P und Cl wur­de von Jürg Reust (Sandoz, analytische Forschung und Entwicklung. Ba­sel) durchgeführt.

Die Neulronenaktivierungsanalyse wurde von Gomez Sixto Bajo im Reak­tor Saphir am Paul Scherrer Institut PSI (Villigen, CH) durchgeführt, wobei 6.0 bzw. 6.7 mg des grünen bzw. violetten Rephos-Komplexes sowie 50>il einer Re2C>7-Standardlösung (48.9 mg/ml H2O) auf ein Filterpapier getropft und getrocknet in ein kleines Polyethylen-Döschen einge-schweisst wurden. Per Rohrpost wurden diese Dosen ins Neuironenbom-bardement des Reaktors (2-1013 n-cm~2-s_1) plaziert und wahrend 10 Minu­ten bestrahlt. Die Y~Messung erfolgte nach 43 Stunden im GeLi.

5.3 Methoden

5.3.1 Synthese von Rephos

813 mg Re207 (1.68mmol) wurden in einem mit N2 begasten 50 ml Spitz­kolben mit Kühler mit 1.25 ml HCl conc. versetzt und mit 6.25 ml Ethanol verdünnt. 3.125 g PPh3 (11.91mmol) in einer gesättigten Lösung von heis-sem Ethanol wurde zur rückflussierenden Perrheniumsäure gegeben und für 3 Minuten zum Sieden erhitzt. Grüne Kristalle wurden von der noch heissen Lösung abgenutscht, zweimal mit heissem Ethanol gewaschen und ergaben das grüne kristalline Produkt Äep/ios.

- 67 -

5.32 Synthese eines Rephos- Isomeres

5 ml Ethanol wurden zu einer Lösung von 200 mg Rephos in 10 ml Chlo­roform gegeben und 30 Minuten inkubiert. Die Farbe wechselte von grün nach violett. Die Lösungsmittel wurden daraufhin am Rotavapor abge­dampft. Das Produkt war grau.

5.3.3 Synthese von [ReQ2(en)2]Cl und [Re02(en)2]PF6

Zu einer Suspension von 200 mg Rephos (237.3 ^mol) in 5 ml Ethanol wurden 400 jul Ethylendiamin (5.9 mmol) gegeben und 1 Stunde rück-flussi rt.

Der Niederschlag wurde in 4 ml H20 gelöst Variante A: und in 4 ml heftig gerührtes Ethanol filtriert. Der daraufhin

entstehende schwach gelbliche Niederschlag [Re02(en)2]Cl-2H20 wurde abfiltriert, mit Ether und Ethanol gewaschen und am Vakuum getrocknet.

Variante B: mit 100 mg NaPFe (595.4 |imol) versetzt und in 4 ml heftig gerührtes Ethanol filtriert. Die sofort entstehenden gelblichen Kristalle [Re02(en)2]PF6-2H20 wurden abfiltriert, mit Ether und Ethanol gewaschen und am Vakuum getrocknet.

5.3.4 Synthese von [Re02(2,3,2-tet)]Cl

Zu einer Suspension von 200 mg Rephos (237.3 jimol) in 5 ml Ethanol wurden 533 yi\ 2,3,2-tet (3.26 mmol) gegeben und für 1 Stunde rückflussiert. Nach Filtration auf einer Nutsche G4 mit Filtrierpapier wurde ein hellgel­ber Niederschlag [Re02(2,3,2-tet)]Cl erhalten und mit wenig Ethanol ge­waschen.

5.3.5 Synthese von mtp-SA

5.3.5.1 Gemischte Anhydrid-Methode

I: 6.2 mg mtp (17 ^mol) wurden in 300 ;il DMSO gelöst, 10 jzl Triethylamin (110 Mmol) und 5.3 mg (39 ^mol) IBCF dazugegeben und bei 10t 45 Minuten inkubiert.

II: 12 mg SA (44.3 >xmol) wurden in 1 ml n-Propanol und 500 ul Ethanol gelöst, mit 10 jil Triethylamin (110 jimol) vermischt, zu Reaktionsgemisch I gegeben und bei O t weitere 2 Stunden inkubiert.

- 68 -

Von der Mischung wurde ein DC mit Ethanol/H20/HAc (29:1:1) aufge­nommen und (nach Beobachtung im UV-Licht bei 366 und 254 nm) mit l%iger CuCb-Lösung (Gewicht/Volumen) in lOXiger NaOH besprüht und 2 Minuten auf 100t erhitzt. Nach Abzeichnen der blauen, weissen und gel­ben Flecke wurde die DC-Platte mit Ninhydrinlösung SIGMA® besprüht und nochmals 2 Minuten auf 100t erhitzt. Die darauf erscheinenden braunen Flecken zeigten die Anwesenheit von primären Aminen.

Die Mischung wurde am Rotavapor getrocknet (Abdampfen des Triethyl-amins und des Ethanols) und hierauf nach Zugabe von 2N NaOH in Ether extrahiert. Die Etherphase wurde darauf noch mit 2N H2SO4 ausgezogen, worauf alle Fraktionen mittels DC und IR charakterisiert wurden.

5.3.52 Diphenylphosphorylazid-Methode

26 mg mtp (72.2 jimol) in 1.0 ml DMF gelöst wurden bei 4 t mit 35.8 ptl DPPA 2 Stunden inkubiert. Zur braun/roten Lösung wurden sodann 44.76 mg SA (166.1 jimol) in 5 ml Dichlormethan gegeben. Die sich sofort bil­dende Fällung wurde bei Raumtemperatur unter Rühren wieder in Lö­sung gebracht. Diese Lösung wurde nach 2 h Inkubation mittels DC auf einer RP8-Platte mit dem Lauf mittel Ethanol/NaOH 2N (29.2) aufgetrennt und die ausgekratzten Banden mittels IR charakterisiert.

5.4 Resultate und Diskussion

5.4.1 Analyse des grünen /?ep/70s-Komplexes

Der grüne Komplex wurde in einer Ausbeute von 88.3% erhalten (2.50 g). Johnson et al. 1964 beschrieben eine Ausbeute von 65%. Diese Kristalle begannen bei 187t zu schmelzen und verkohlten bei 196t vollständig.

Der durch NA bestimmte Gehalt an Rhenium im Komplex von 22.30% ent­spricht dem erwarteten Anteil von 22.10%, die Abweichung liegt innerhalb des Ablesefehlers von der Einwaage her (die kleinste Einheit der Analy­senwaage ist 0.1 mg, d.h. die nicht mehr angezeigten ±0.04 mg des Komplexes entsprechen einer Abweichung auf den Gehalt von ±0.2%).

Die EA von sauerstoffhaltigen Schwermetallkomplexen ist immer proble­matisch, da flüchtige Schwermetalloxide entstehen. Die flüchtigen Rhe­niumoxide verfälschen das Resultat und stören dabei auch die Bestim­mung der anderen Elemente. Die vorliegende EA (siehe Tabelle 12) be­stätigt in diesen Grenzen das Vorhandensein des Rephos -Komplexes, weitere Aussagen sind nicht möglich. Der Re-Anteil wurde als der noch fehlende Elementanteil zum Total von 100 % berechnet.

- 69 -

Methode

NA

EA

IR

UV/Vis

'H-NMR

theoretisch

22.10 %

Cl 8.4%

O 3.8%

P 7.4%

C 54.2%

H 4.2%

Re 22.1%

910* (grün) 953* (grün)

909A(grau) 946A (grau)

Rephos GRÜN

22.30 %

8.95% 4.50% 8.05% 54.25% 3.9% 20.35% (berechnet)

910 i(OCH2) 953 v(Re=0) 970 1350 S(CH3) sy 2860, 2920 | v(CH) st 2970 J sowie vollständig all

£225max- 4 8 3 4

£267max" 3666 E385Schulter~ 126.4

e735max= 4 .9

0.16 (t, 3) 0.86 (?. 0.2) 1.24 (t, 0.5) 1.57 (s. 2) 2.53 (q, 2) 3.71 (q, 0.3) 7.42 (m, 18) 7.78 (m. 12)

Rephos VIOLETT

21.60 %

9.10% 4.05% 8.20% 53.75% 4.15% 20.75% (berechnet)

910 953 -

1350 2860, 2920 | 2970 J

9 PPh3-Banden!

S225max- 4 ° 3 2

&267max' 3 5 1 6

£385Schulter"* 50.5

E535max~ 15-1

0.15 (t. 3) -

1.20 (t. 1) -

2.50 (q, 2) 3.70 (q, 0.6) 7.40 (m, 18) 7.75 (m, 12)

Tabell» 12 ZunmiMmtfjUung dw AruüjMdattn der beiden Asffar-Inowre. Alle Berech nungen basieren auf dem Komplex ReOCljCOEtXPPhj^ mit einem MG von 842.7. IR: Die Wellenzahlen sind in cm'1 angegeben. UV/Vis: Die molare Extinktion e hat die Einheit nvVmol (die alte Einheit von e war 1000 cmVmol. d.h. die neuen Einheiten sind um den Faktor 10 kleiner als die alten). 'H-NMR: Die chemische Verschiebung S ist in ppm angegeben, der Wert in Klammer be­deutet die Anzahl der H-Atome. s bedeutet Singulett. t Triplett, q Quartett und m ist ein Multiplen. Die Neutronenaktivierung, die Elementaranalyse sowie die spektroskopischen Methoden wur­den wie unter 5.2 beschrieben ausgeführt.

•nach Johnson et aJ. 1964 Anach Chatt und Rowe 1962 (1. Erwähnung dieses Komplexes als graue, plattenähnliche,

diamagnetische Kristalle; in Chloroform löst er sich VIOLETT)

- 70 -

Das IR (siehe Figur 12) des Rephos-Komplexes zeigt eine starke Bande bei 953 cm"1, welches nach Johnson et al. 1964 die typische (Re=0)-Valenzschwingung ist. Ein Fehlen dieser Bande bedeutet immer, dass eine Rhenium-Oxo-Verbindung nicht vorhanden ist, die Bande kann je nach Substituent des Rhenium-Komplexes zwischen 930-985 cm-1 lie­gen. Die für den Ethoxo-Komplex typische Bande bei 910 cm"1 ist vor­handen und wird einer (OCH2)-Deformationsschwingung zugesprochen. Die restlichen Banden sind diejenigen des Triphenylphosphins. welche im /?ep/?os-Komplex abgesehen von kleinen Intensitätsveränderungen voll­ständig erhalten bleiben. Im sichtbaren Spektrum zeigt eine Rephos-Lösung in Dichlormethan bei 735 nm ein Maximum mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 4.9 m2/mol. Das bei einer Wellenlänge von 730 nm absorbierte purpurfarbige Licht zeigt eine beobachtete grüne Komplementärfarbe, d.h. die Messun­gen des sichtbaren Sp .ktrums stimmen mit den von Pretsch et al. 1986 erwähnten Farben übeiein.

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I - L-J • _ . • • '

i i l • > > *—t—i—i—ui.t—i—i—1—4—i-L*—i l__i—i—lil—.*—

Figur 11 'H-NMR-Sptktrum dM grQnan Rtphot-Komplum. aufgenommen in CDC13 auf einem Biuker WM-250 bei 250 MHz.

- 71 -

Im 'H-NMR (siehe Figur 11) sind die beiden Rephos-Isomeren nicht von­einander unterscheidbar. alle Verschiebungen sind gleich gross. Bei 0.16 ppm erscheint das Triplett von Re-O-Ob-CI-b. bei 2.53 ppm das dazu­gehörende Re-0-CH2~CH3 der koordinierten Ethoxogruppe. Bei beiden Isomeren erscheint auch freies, nicht koordiniertes O-CH2-CH3 mit dem Triplett bei 1.24 und dem Quartett bei 3.71 in 3-6x kleinerer Intensität. Die 30 aromatischen Wasserstoffatome erscheinen bei 7.42 ppm (18 H-Atome in meta- und para-Stellung) und bei 7.78 ppm (die weniger stark abge­schirmten 12 H-Atome in ortho-Stellung). Im NMR des grünen Rephos war bei 1.57 ppm noch etwas Wasser ent­halten, bei 0.86 ppm erschienen Spuren einer unbekannten Bindung.

5.42 Analysedaten des violetten Rephos- Komplexes

Das violette Isomere wurde in einer Ausbeute von 100% erhalten (200 mg). Der Vergleich der beiden Isomere mittels EA. NA sowie der Schmelzpunkt­bestimmung ergab keinen signifikanten Unterschied der beiden Komplexe. Dem violetten Isomer fehlte das im grünen Komplex im UV/Vis gemessene Maximum bei 735 nm. Der einzige Unterschied im IR besteht in einer fehlenden Bande des violetten Isomeres bei 970 cm-1 (siehe Figur 12). Im ]H-NMR wurden dieselben Verschiebungen und Wasserstoffsignale wie im grünen Rephos gemessen.

1600 noo 1200 1000 800 600

Figur 12 IR-Sprttrum der teidtn Aptar-lMOwran grün (untere, dünnere Linie) und violett. Einziger Unterschied ist das Verschwinden der Bande bei 970 cm"1 im violetten Isomer.

- 72 -

Die Konfiguration der Triphenylphosphingruppen kann mit diesen Metho­den nicht näher charakterisiert werden. Giaziani et al. 1985 bestimmten die molekulare Struktur des violett-grauen Komplexes als 6-fach koordi­niertes oktaedrisches Rheniumatom mit trans -ständigen Chlor- und eben­falls trans -ständigen PPh3-Gruppen.

5.4.3 Analyse der [Re02(en)2]*-Komplexe

Mit den eingesetzten 200 mg Rephos (237.3 ;imol) kann eine maximale Ausbeute an [Re(en)202]Cl-2H20 von 97.28 mg erhalten werden. Mit der zuerst durchgeführten Methode A konnten nur 5.14 % (5 mg) des mikro­kristallinen, braun- gelblichen [ReC>2(en)2]Cl-Komplexes auf dem Filterpa­pier der Nutsche gesammelt werden. Nach Zugabe von NaPF6 zur etha-nolisch/wässrigen Lösung wurden 54.5 mg einer gelblichen Fällung von [ReC>2(en)2]PF6 erhalten, was einer Ausbeute von 47.5 % entsprach. Die totale Ausbeute betrug demzufolge 52.6 %. Diese Ausbeute könnte durch Verwendung eines anderen Lösungsmittels und einer geeigneteren Um-kristallisation (siehe auch [Re02(2.3.2-tet)]Cl-Analyse 5.4.4) oder einer neuen und besseren Herstellungsmethode über den Oxotrichlorobis-(triphe-nylphosphin)-rhenium(V)- Komplex nach Parker und Roy 1988 erhöht werden.

Der [Re02(en)2]Cl-Komplex beginnt sich bei 215*0 braun zu verfärben, wird bei 220*0 dunkelbraun und verkohlt schliesslich bei 240*0, ein ei­gentlicher Schmelzpunkt ist nicht feststellbar. Das in PBS 7.4 aufgenommene UV/Vis-Spektrum zeigte bei 438 nm ein Maximum mit einem e von 2.43 m2/mol. Murmann et al. 1966 beschrieben ein Absorptionsmaximum bei 440 nm mit einem e von 2.01 m2/mol.

Im [ReC»2(en)2]Cl-Komplex liegen die beiden Oxogruppen einander in einem Winkel von 178.4 Grad gegenüber, der Abstand zum Re-Atom be­trägt 1.75 Ä Glowiak et al. 1972). Dies führt zum Auftreten einer Absorp­tionsbande bei ca. 800 cm-1, welche einer asymmetrischen Streckschwin­gung des trans-Re02*-Teils zugesprochen wird.

Methode

UV

IR

Literaturangabe

£440nm(max)" 201 mVmol

814 cm"' D

[Re02(en)2]Cl-Daten

£213nm(max)" 2°7.0 mVmol E253nm(maxr 1 0 5 - 8 m 2 / m o 1

£275nm(Schulterr 5 8 - 8 mVmol E439nm( ax)" 2-43 m2/mol

814 sl(Re-O) cm-1

TaMlt 13 ZuaamiMMttUung dar Analynndatan dts [fteOrftnfeDCl-KomplMM. °nach Johnson et al. 1964 "nach Murmann et al. 1966

- 73 -

Diese breite und sehr starke Bande wurde bei 814 cm"1 gefunden, in Übereinstimmung mit Johnson et al. 1964. Wie erwartet wurden im Bereich von 3300-2900 cm"1 die Streckschwingungen der NH2-Gruppen. bei 1585 cm-1 und 1450 cm-1 deren Deformationsschwingungen gefunden.

5.4.4 Analyse des [ReQ2(2,3,2-tet)]Cl-Komplexes

Der hellgelbe mikrokristalline [Re02(2,3.2-tet)]Cl wurde nur in einer Aus­beute von 12.0 % (15.9 mg) auf dem Filterpapier gesammelt. Durch Wahl eines anderen Lösungsmittels wie z.B. Isopropanol könnte die Ausbeute verbessert werden. Der Komplex ist in heissem Ethanol, in welchem die Reaktion durchgeführt wurde, zu gut löslich (3 mg in 500 jil). Die sehr gute Wasserlöslichkeit des [ReO2(2,3,2-te0]Cl-Komplexes (>5 mg pro 10 pl Wasser) trägt ebenfalls zu dieser schlechten Ausbeute bei. 2.3,2-tet ist sehr hygroskopisch, der dadurch sehr schwer zu vermeidende Wasseranteil in der Lösung könnte reichen, um eine grosse Menge [Re02(2,3,2-tet)]Cl zu lösen.

Die Bildung des tet-Komplexes geht sehr schnell: Sofort nach 2.3.2-tet-Zugabe verändert sich die grüne /?ep/)os-Aufschlämmung in einen weiss-gelblichen Niederschlag, das weitere Erhitzen der Lösung bewirkt nur noch eine Farbänderung der Ethanollösung nach braun.

Das Schmelzverhalten ist gleich wie beim [ReC>2(en)2]Cl, der Komplex wird bei 220*C bräunlich, bei 230t dunkelbraun und verkohlt schliesslich bei 250t.

Das UV/Vis-Spektrum entspricht demjenigen von [ReC>2(en)2]Cl. die mola­ren Extinktionskoeffizienten sind sehr ähnlich.

Auch das IR entspricht fast dem Ethylendiamin-Re-Komplex. Die Streck­schwingung der Re-O-Gruppe wurde aber in zwei Banden bei 810 und 790 cm"1 aufgespalten. Das deutet auf eine geringere Symmetrie des Komplexes hin, das heisst die beiden trans-ständigen Oxogruppen lie­gen sich nicht mehr genau gegenüber wie beim [ReC>2(en)2]Cl.

Methode

UV

IR

LiteraturangabeD

810 cm"' 790 cm-'

[Re02(2,3,2-tet)]Cl-Daten

£213nm(max)" 285.7 mVmol

£253nm(max)" 1 0 1 < ? m* / m o 1

£275nm(Schulter)* 5 0 0 m'/mol

£436nm(max)" 2 1 4 m k / m o 1

810 cm'1 st(Re-O)

790 cm"'

Tatell« 14 ZunnuMMttllung dar Analynndattn dw [R*Orf2£,2-ttt)]Cl-KomplMM. anach Parker und Roy 1988

- 74 -

5.4.5 Resultate der mtp-SA-Synthese

5.4.5.1 Gemischte Anhydrid-Methode

Beim Zusammengeben des durch IBCF gebildeten gemischten Anhydri­des in DMSO (Lösung I) mit der ethanolischen SA-Lösung (Lösung II) entstand sofort eine weisse Fällung, welche erst beim Erwärmen des Ge­misches auf über 50tT wieder verschwand. Es scheint sich dabei um ein Schmelzen des in der Gesamtmischung nicht mehr so gut löslichen SA's zu handeln.

Das erhaltene Gemisch wurde nach nebenstehendem Schema ausge­schüttelt. Dieser Prozess führte nicht zum reinen Produkt, es war immer eine Grenzschicht (siehe Phase D) vorhanden, welche das Aus­schütteln erschwerte. Die Schwie­rigkeiten wurden wahrscheinlich durch das grenzflächenaktive Produkt mtp-SA verursacht und durch das immer noch vorhande­ne SA verstärkt.

Mittels DC-Analyse der Syntheseedukte und -produkte konnte kein Fleck eindeutig dem gewünschten Produkt mtp-SA zugeordnet werden (siehe Figur 13).

Synthesemischung \

Rotavapor \

Entwicklung:

ffp>. Rötlichbraun nach xi> Besprühen mit Nin-

hydrinlösung und 2 min Erhitzen

UV 366

UV 254

Blau nach Be­sprühen mit CuClj/NaOH-Lösung

Gelb nach Erhit­zen der Cu- be sprayten Platte

o

Figur 13 DCdn Synthm von mtp-SA mitttla dtr gmiifchtan Anhydrld-tfethodt. Laufmittel Ethanol/H20/HAc (29:1:1). Laufzeit 2 h auf einer Silicagelplatte 60p254-

- 75 -

Die im Gemisch gefundenen Flecken konnten SA (Rf=0.88), DMSO (Rf=0.66) und mtp (Rf=0.OO) zugeordnet werden. Bei Rf=0.84 erschien im UV254 eine Substanz, die in die Zwischenschicht D ausgeschüttelt werden konnte. Das Besprühen der Platte mit der Cu2+-haltigen Lösung Hess den Fleck aber nicht in Erscheinung treten. Das bedeutet, dass diese Sub­stanz - im Unterschied zu mtp - keinen gefärbten Kupferkomplex bilden kann. Entweder handelt es sich also nicht um mtp-SA oder die wachsar­tigen Stearatderivate überdecken das Produkt, so dass keine Farbreaktion stattfinden kann.

Ein IR dieser Phase D ergab eine Aufnahme, die einem SA-Spektrum ohne die Schwingungen der primären Aminogruppe entsprach. Zusätzlich war eine mittelstarke, breite Bande bei 1660 cm-1 und eine bei 1540 cm"1

vorhanden. Normalerweise werden dort die assoziierten Amidbanden 1 und [[ gefunden. Die in Pietsch et al. 1966 ebenfalls erwähnte out of pla-ne'-Schwingung des Amid II bei ~700 cm"1 wurde bei 690 cm"1 gefun­den. Eine normalerweise vorhandene Streckschwingung der NH-Gruppe im Bereich 3100-3500 cm"1 war aber nicht vorhanden. All diese Banden weisen auf eine Säureamidbindung hin. umsomehr als die IR von mtp und SA in diesen Gebieten keine Maxima aufweisen.

Fazit: Es sieht so aus, als ob die gewünschte Kopplung von mtp und SA teilweise stattgefunden hat, die reine Substanz konnte aber durch Aus­schütteln oder DC nicht rein isoliert werden. Auch Trennungen mit lipo-phileren Laufmitteln wie Chloroform waren wenig erfolgreich.

5.4.52 Diphenvlphosphorvlazid-Methode

Bei der Herstellung des mtp-Stearates mit der gemischten Anhydrid-Me­thode wurden in der Reaktionsmischung immer unlösliche Substanzen gefunden. Um dies zu verhindern wurde eine Methode gesucht, bei der die Kopplung vollständig in Lösung ablaufen sollte. Es wurde schliesslich die von Shioin et al. 1972 zur Peptidsynlhese benutzte, modifizierte Curtius-reaktion verwendet. Der einzige Unterschied bestand in der Verwendung von Dichlormethan als Lösungsmittel für die Aminokomponente SA anstelle von DMF (siehe Schema 6, S. 65).

Im DC wurden sechs verschiedene Flecken gefunden, wobei diejenigen mit Rf-Werten zwischen 0.00 und 0.45 ineinander übergingen (siehe Fi­gur 14). Die Zuordnung der Flecken im DC ist nicht ganz einfach, die Reprodu­zierbarkeit auf der Reverse Phase Platte ist schwierig, die Rf-Werte schwanken immer etwa ±10%. Eventuell ist das auf intermolekulare Wech­selwirkungen der Cia-Kette des Produktes mit den lipophilen Edukten SA und DPPA sowie mit DP zurückzuführen.

- 76 -

^ 0 . 9 1

l$8o.85

(gl 0.60

P + + >•>

SU DPPA ntp

.' "'

I \*j Triet

®0.87

+

DP

c (

r*— t r

\ t-. Produkt

\o.7i

~

J 9

|0.4£

0.00

Entwicklung:

m

W

Rötlichbraun nach Besprühen mit Nin-hydrinlösung und 2 min Erhitzen

UV 366

UV 254

Blau nach Be­sprühen mit CuCl2/NaOH-Lösung

Figur 14 DC dar Synthase von mtp-SA mittel« der Diphenylphosphorylazid-Methode. Lauf­mittel Ethanol/2N NaOH (29:2). Laufzeit 2 h auf einer RP-8-Platte. vorbehandelt durch 15 min Erhitzen bei 120t:.

Beim Rf-Wert von 0.87 scheint es sich um eine Mischung des Eduktes SA und des Nebenproduktes DP zu handeln. Das IR bestätigte diesen Be­fund (siehe Tabelle 15). Beim Rf-Wert von OJl handelt es sich um DPPA. Das IR bestätigte dies, es hat ebenfalls noch DP dabei (Bande bei 3060 cm"1). Am IR fällt auf, dass noch ein Säureamid vorhanden sein muss, es fehlen keine der schon unter Punkt 5.4.5.1 erwähnten Banden. Die CH-Schwingung bei 720

"NReferenz

Rf-WertX

0.87

0.71

0.^5

0.01-0.44

0.00

SA (-CH) 2960, 2920 2860. 1470 720

alle sw

alle ssw

-

-

alle sw

mtp 2960. 2920 2860. 1740 1470. 1190

-

alle sk

alle ssw

alle ssw

alle sk

DP 3060. 1590 1490. 690

alle sk

alle sk

-

~

DPPA 2170. 1590 1490. 685

-

alle sk

-

-

—

-NHCO-3500-3100 1640. 1540 -700

1640 sw

3280. 1635 1550. 690

-

-

3350 (breit) 1630, 1545 (~700 fehlt)

andere

1260. 1080 1020. 800

1260. 1080 880. 790

1260, 1080 880. 790

Tabtll« 15 lR-Vargteich dtr mittel« DC getrennten Produkte und Edukte dar mtp-SA-Syn-theee (DPPAMethode) nach Auskratzen der Bahnen und Extraktion der Substanzen. In der ersten Zeile sind die Wellenzahlen der Referenzspektren in cm"1 angegeben, sw schwach, ssw sehr schwach, sk-stark.

- 77 -

cm-1 deutet auf eine Kohlenstoffkette mit mehr als 4 C-Atomen hin, d.h. es muss sich dabei um den Stearylrest handeln. Bei einem Rf-Wert von unter 0.8 kommt normalerweise kein freies SA mehr vor. Dies sowie die vorhandene Amidbindung bei dem Rf-Wert von 0.71 lassen auf das Pro­dukt mtp-SA in dieser Fraktion schliessen. Es sind aber noch Verun­reinigungen von DPPA und DP vorhanden. Die beiden Fraktionen mit den Rf-Werten von 0.45 und 0.01-0.44 sehen sehr ähnlich aus und enthalten beide die stärksten Banden des mtp so­wie einige Zusatzbanden. Eventuell handelt es sich dabei um Abbaupro­dukte des mtp.

Bei der Fraktion mit dem Rf-Wert 0.00 handelt es sich vor allem um mtp, die starke Bande bei 1740 cm-1 kann einer noch vorhandenen Carbon­säure zugeordnet werden. Die starken Banden der (Neben-)produkte mit dem Rf-Wert von 0.01-0.45 sind ebenfalls vorhanden. Zusätzlich erschei­nen Säureamidbanden. diejenige bei ~700 cm-1 fehlt. Die CH-Deforma­tionsschwingung bei 720 cm"1 ist vorhanden. Auch in dieser Fraktion 0.00 könnte als das gesuchte Produkt mp -SA vorhanden sein.

Fazit; Die Kopplung von mtp und SA scheint aufgrund des 1R und der bei der Reaktion stattfindenden Farbänderung zu erfolgen. Wie unter Punkt 5.4.5.1 gelingt aber die Trennung und Aufreinigung des Produktes mittels DC oder Ausschütteln nicht. Abhilfe könnte ev. durch Vermindern von SA auf einen ~l.lmolaren Überschuss bezüglich mtp geschafft wer­den, die Abtrennprobleme wären dann nicht vorhanden. Es käme auch eine Herstellung über ein mtp-Anhydrid und darauffolgendes Kochen der Substanz mit SA in Chloroform über 1-2 Tage in Frage, das Produkt wäre eine Fällung. Eckelmann et al. 1975 und Hnatowich et al. 1981 stellten auf diese Art EDTA-SA her.

5.5 Zusammenfassung

Die Synthese des grünen Oxodichloroethyoxybis-(triphenylphosphin)-Re(V)-Komplexes Rephos ist einfach und schnell, ein Austausch der Liganden mit Ethylendiamin oder mit dem Tetraaminkomplex 2,3,2-tet in ethanolischer Lösung geht sehr gut. Dies deutet auf eine grössere Stabilität der Rhenium-Tetraamin-Komplexe hin. Das violette Isomer, laut Literatur der trans -stän­dige Komplex, kann aus dem grünen hergestellt werden.

Der nächste Schritt, ein in Liposomen verankerbares mtp-SA zu synthetisie­ren, gelang noch nicht. In der Syntheselösung konnte die Amidbildung wohl nachgewiesen werden, die Aufreinigung und Isolierung des gewünsch­ten mtp-Stearates war aber nicht erfolgreich. Ein alternativer Herstellungs­weg wäre die mtp-Anhydrid- Bildung mit nachfolgender SA-Kopplung. Auf ähnliche Weise wurde in der Literatur schon EDTA-SA synthetisiert.

- 79 -

6 Herstellung von Melhylthiosemicarbazidkomplexen mil Rhenium

6.1 Einleitung 6.2 Material und Methoden

6.2.1 Chemikalien 6.2.2 Synthese von Polystyrol-mts 6.2.3 Markierung des Polystyrol-mts mit YRher;um 6.2.4 Stabilitatsbestimmung von aps-mts-YRhenium

6.2.4.1 Stabilitatsbestimmung mittels Zentrifugation 6.2.4.2 Stabilitatsbestimmung mittels Dialyse

6.2.5 Herstellung von SA-mts 6.2.5.1 Versuch 1: Reaktion in der Schmelze 6.2.5.2 Versuch 2: Reaktion in Lösung

6.3 Resultate und Diskussion 6.3.1 Bindung von Rhenium an polystyrolgebundenes mts 6.3.2 Stabilitätsbestimmung von Remis 6.3.3 Herstellung von SA-mts

6.3.3.1 Versuch h Reaktion in der Schmelze 6.3.3.2 Versuch 2: Reaktion in Losung

6.4 Zusammenfassung

6.i Einleitung

Wie unter 4.4.3 gezeigt wurde, ist es sehr schwierig, Rhenium (oder auch Technetium) unter physiologischen Verhältnissen zu komplexieren. Oft wird daher der Weg über einen Hilfskomplex gewählt. Der hochaffine Li-gand wird dabei an die Zieistrukiur (Protein, Liposomen etc.) gekoppelt und dann zusammen mit dem an Hilfsliganden gebundenen Rhenium in­kubiert. Das in der richtigen Oxidationsstufe vorliegende Rhenium wird dadurch an den Hauptliaanden ausgetauscht.

Als Hilfskomplexbildner werden im Falle des Technetiums und Rheniums vorwiegend Citrat, Tartrat, Cyanid, ev. abe. auch höher affine Liganden wie Ethylendiamin oder Triphenylphosphin (siehe 53) verwendet. Auch schwefelhaltige Liganden werden benützt. Thiosemicarbazid-Komplexe mit Technetium waren starker als erwartet; sie schienen sich eher als Haupt- denn als Hilfsligand zu eignen. Auch Wilkening et al. 1988 be­schrieb ähnliche N- und S-haltige Liganden zur Markierung von Protei­nen und speziell von Antikörpern als sehr vorteilhaft: Der Amido-Mercap-to-Komplex soll eine hohe Stabilität innerhalb eines grossen pH- und Temperaturbereiches aufweisen, die Chemie ist wohlbekannt und der Me­tamern, also hier Rhenium, reagiert nicht mit anderen funktionellen Grup­pen des Liganden. Diese sind daher frei für weitere Derivatisierungen. Dies waren auch die Gründe, einen solchen Rhei.iumkomplex zu bilden und dessen Stabilität zu untersuchen.

- 80 -

Um die prinzipielle Möglichkeit einer solchen Komplexbildung zu unter­suchen wurde vorerst ohne Liposomen mit einem polymeren Träger ge­arbeitet. Die hier verwendeten Aminomethyl-polystyrol-Kügelchen haben eine Grösse von 200-400 mesh. Sie enthalten eine definierte Menge von primären Aminen an der Oberfläche, welche mit verschiedenen funktionel­len Gruppen eines gewünschten Liganden derivatisieit werden können. Rhenium kann danach von diesen Liganden unter optimalen Bedingun­gen komplexiert werden. Die entstehenden Verunreinigungen und Ne­benprodukte werden einfach durch Spülen mit dem entsprechenden Lösungsmittel entfernt. Da diese Polymerkügelchen gut zentrifugierbar sind, ist auch das Abtrennen der gebundenen von der freien Radioakti­vität kein Problem. Das Ziel war also. Rhenium über ein Thiosemicarbazidderivat an ein Poly­mer (als Modellträger) zu binden und die Stabilität dieses Komplexes zu bestimmen. Es wurde der Ligand mts gewählt, welcher über eine Glyoxal-brücke als Semicarbazon mit aps gekoppelt werden kann (siehe Schema 6). Bei guter Komplexstabilität sollte dieser Ligc J an SA gekoppelt, in Liposomen eingebaut und mit Rhenium markiert werden.

H H

c-c' Glyoxal

aps-glyoxal

Aminomethyl-poly-styrolkügelchen aps H2N - N B - /

aps-mts

mts NH—CH3

Sehtma 6 HMitelhmj von fMtkSrparpbundHMm Ligandtn mt» über eine Glyoxalbrucke. mts ist in der Lage, einen 3-zahnigen Komplex mit Rhenium zu bilden (wahrscheinlich mit den S-. N,- und N^-Atomen des Thiosemicarbazonderivates).

b i Material und Methoden

621 Chemikalien

Die Aminomethyl-polystyrolkügelchen (aps) enthielten ~0.6 mmol Amin pro Gramm Polymer. SA wurde in pract. Qualität (85-90 % Octadecylamin sowie

- 81 -

10-15 % Hexadecylamin) ebenfalls von Fluka AG (Buchs, Schweiz) erhalten und zweimal mit Ethanol umkristallisiert. Die Glyoxallösung 40 % in H2O (~8.8 mol/1. pract.), Kalium-Natrium-tartrat (KNaC4H4CV4H20) puriss. p.a.. wasserfreies Zinnchlorid (SnCIa) purum sowie HCl und NaOH waren alle von Fluka AG. 4-Methyl-3-thiosemicarbazid (mts) war von Aldrich (Milwau kee, Wisconsin, USA).

622 Synthese von Polystyrol-mts

1.0 g aps (~0.6 mmol -NH2) wurde mit 1 ml 0.1 N HCl aufgeschlämmt und mit 1 ml Glyoxallösung 40 % (~8.8 mmol) versetzt. Die Mischung wurde 10 Minuten am Rotavapor rotiert, abgenutscht und mit Wasser gewaschen. 210 mg mts (2 mmol) wurden in 5 ml 0.1 N HCl gelöst und zum noch feuchten Polymer gegeben. Dieses wurde dabei langsam gelb. Es wurde 30 Minuten rotiert, abgenutscht, mit 0.1N HCl gewaschen. Gravimetrisch bestimmt blieben 60.4 mg Ligand am Polymer hängen, was einer Kapa­zität von 0.47 mmol Ligand pro Gramm Polymer entspricht.

62.3 Markierung des Polystyrol-mts mit YRhenium

Variante h 50 mg aps-mts (~22 ;imol Ligand) (pH 10) 5 Ml YRe04" (3.7 nmol)

5 mg KNa-tartrat 10 jil NaOH 1 N 35 M1 SnCl2-Lösung (2 oder 20 mg SnCl2 in 10 ml H20)

Variante Z 50 mg aps-mts (~22 Mmo' Ligand) (pH<7) 5 M1 YRe04" (3.7 nmol) oder 20 jil YRe04" (430 nmol)

5 mg KNa-tartrat 10 Ml PBS 7.4 35 Mi SnCl2-Lösung (20 oder 230 oder 2300 mg SnCl2 in

10 ml H20)

Die Lösungen wurden der Reihe nach in ein Reagenzglas gegeben und 5-30 Minuten lang inkubiert. Darauf wurden 2 ml PFS 7.4 dazugegeben, geschüttelt, 5 Minuten mit 2000 g zentrifugiert, Überstand und Polymerkü-gelchen separier! und im yCounter gemessen. Die zwei Methoden un­terscheiden sich nur durch ihren pH, Variante 1 war basisch und Variante 2 neutral bis leicht sauer,

- 82 -

62.4 Stabililätsbestimmung von aps-mts-YRhenium

62.4.1 Stabilitälsbestimmung mittels Zentrifugalion

Zum Rückstand wurden 2 ml PBS 7.4 gegeben und unter Drehen des verschlossenen Reagenzglases bei Raumtemperatur (ein Teil auch bei 37t:) inkubiert. Nach ? Stunden (vgl. Tabelle 16, "Stabilität") wurde das Röhrchen 5 Minuten bei 2000 g zentrifugiert, Rückstand und Lösung separiert und diese im Y~Counter gemessen. Das Verhältnis Radioaktivität des Rückstandes zur gesamten Aktivität ergab dann den Radioaktivitäts­anteil am Polymer, der in der Tabelle 16 "% Kopplung an aps" genannt wird. Je höher dieser Anteil war, umso stabiler war das YRhenium an den Liganden mts gebunden.

Nach dieser Messung wurde der Überstand verworfen. Dabei handelte es sich laut Pc nur um wasserlösliches YRe04". Zu den Polymerkügelchen wurden erneut 2 ml Puffer gegeben und auf dem Schüttler weiterinkubiert, gegebenenfalls folgten weitere Stabilitätsbestimmungen zu einem späteren Zeitpunkt.

62.42 Stabilitätsbestimmung mittels Dialyse

Von der Lösung aus Experiment S (siehe Tabelle 16) wurde der Rück­stand nach der Markierung mit 1 ml PBS 7.4 aufgeschlämmt, in eine offe­ne 1 ml Dialysierzelle pipettiert und gegen 800 ml Phosphatpuffer PBS 7.4 dialysiert. Im Dialysierpuffer wurden jeweils 3 x 2 ml entnommen und im y-Counter gemessen. Die an den Polymerkügelchen verbliebene Ra­dioaktivität wurde berechnet und mittels eines externen Standards zer­fallskorrigiert. Dies war die aps-gebundene Radioaktivität (siehe Figur 15).

62.S Herstellung von SA-mts

62.S.1 Versuch 1= Reaktion in der Schmelze

370 mg SA (1.4 mmol) wurden zu 2.5 ml 70t heissem 40 %igen Glyoxal (17.2 mmol) gegeben und unter Rühren geschmolzen. Nach 5 Minuten wurde eine Probe entnommen und mit Ninhydrin auf noch vorhandene Nri2-Gruppen getestet, der Nachweis war negativ. Nach Abkühlen der Lösung wurde das ausfallende SA-glyoxal abgenutscht und mit H2O ge­waschen (Stufe 1). 160 mg mts (1.54 mmol) wurden in 3 ml H2O gelöst, zum SA-glyoxal gegeben und zusammen 20 Minuten erwärmt. Beim Erkalten •fiel ein bräunliches Wachs aus (Stufe II). Mit Ethanol/H20/HAc (29:1:1) wurde daraufhin eine DC-Analyse durchgeführt

- 83 -

6232 Versuch 2-. Reaktion in Lösung

Zu 2.5 ml Glyoxal 40% (17.2 mmol) wurden 10 ml Ethanol gegeben und 370 mg SA (1.4 mmol) in 40 ml Ethanol (warm gelöst) während 10 Minu­ten aus einer Bürette zugetropft. Die Lösung wurde leicht gelblich, es fiel aber nichts aus. Nach 72 h Inkubation war der Aminnachweis mit Ninhy-drin negativ. Die Lösung wurde am Rotavapor eingedampft, 4x mit Was­ser aufgeschlämmt, geschüttelt, abzentrifugiert (30 Minuten mit 2000 g) und der Überstand (-* Glyoxal) verworfen (Stufe I). 71 mg mts (675 ;imol) wurden in 20 ml kaltem Ethanol gelöst und zu 211 mg SA-glyoxal (~675 jimol) in 5 ml CHCb dazugetropft. Nach 5 Minuten wurde die Lösung rot, nach 1 Stunde entstand ein hellbraun-weisser Niederschlag (Stufe II).

6.3 Resultate und Diskussion

6.3.1 Bindung von YRhenium an polystyrolgebundenes mts

Die Resultate wurden in Tabelle 16 zusammengefasst.

Die Variante 1 mit Reduktion und Komplexierung des Rheniums in basi­schem Milieu ergibt eine um höchstens 1.4 % höhere Kopplungsausbeute (maximal 96.2 % im Versuch 0) als die Variante 2. Die Reaktion kann also direkt im Phosphatpuffer stattfinden, was eine Vereinfachung und verrin­gerte Belastung für die Liposomen hinsichtlich ihrer Anwendung bedeutet.

Die Zugabe von KNa-tartrat zur Markierungsmischung bewirkt eine kurz­fristige Stabilisierung der Zwischenspezies Re(+V), es werden dadurch eine höhere Kopplungsausbeute und weniger Nebenprodukte, v.a. auch weniger ReC>2 erhalten.

Die Inkubationsdauer muss mindestens 30 Minuten betragen (siehe Versu­che M, O, P). Wie schon unter 42 erwähnt, verläuft die Komplexbildung von Rhenium bedeutend langsamer als von Technetium. Dort reichen schon 5 Minuten, um eine Ausbeute von 93-96 % zu erzielen.

Die Reduktion geht bei mindestens lOOfachem molarem Überschuss von Sn2+ schneller. Bei hohen Rheniummengen abei (Versuche R, S) genügt schon ein lOfacher Überschuss. Die Sn-Lösung ist weiss (Zinnhydroxid­fällungen). Durch die grosse SnCl2-Menge wird der pH stark gesenkt, was d'e Reduktion von Rhenium beschleunigt.

- 84 -

Experiment Markierungsbedingungen

Ink.zeit [min]

YRe04-[nrr.ol]

Sn2+

[nmol] Sn/YRe

Resultate

Kopplung Stabilität0

anaps[%] [%]

Variante 1 (pH -10)

Vorversuch

N

0

5

5

30

3.7

3.7

3.7

37

370

370

10

100

100

43.8

52.0

96.2

88.8 (4h) 98.8 (70h) 98.5 (95h)

92.7 (4h) 95.8 (70)-; 96.3*(226h)

92.1 (16h) 9 3 0 (64h) 89.3*(232h)

Variante 2 (pH s 7.4)

M

0

P

R

S

Kontrolle9

— _ 1

5

15

30

30

30

30

3.7

3.7

3.7

430

430

3.7

370

370

370

4300

43'000

370

100

100

100

10

100

100

60.0

88.7

93.4

93.4

94.8

22.0

81.9 (4K 94.7 (7^h) 89.1*(226h)

90.5 (2h) 92.7 (66h) 89.3*(230h)

91.9 (16h) 92.6 (64h) 91.8 (232h)

90.6 (lh) 90.6 (17h) 91.2 (42h) 89.9 (141h) 87.9'(206h)

- Dialyse

13.2 (10 min) 0.1 (20 min)

Tabtllt 16 Marktaung won an AminopoJjwtyrolkQgalchan gakoppalttm Mathjrlthiotamioarba-4d mit mit radioaktivem Parrhsnat YR*04 . Genaue Kopplungsbedingungen und Ausbeute­bestimmungen siehe 6.2.3 und 6.2.4. •Dieser Wert wurde nach Inkubation bei 37°C wählend 72 h gemessen. vZur Leerwertbestimmung wurden Polystyrolkügelchen ohne mts verwendet. °Jede vorhergehende Radioaktivitatsmessung von YRe-mts-aps wird als 100 X gerechnet.

6.3.2 Stabilitälsbeslimmung von Re-mts

Figur 15 zeigt, wie stabil Rhenium an die Polymerkügelchen veranken ist. Während des ersten Tages gehen 40 % der Radioaktivität weg, während der nächsten 7 Tage folgt ein linearer YRheniumverlust durch die Dialy-siermembran. Die Gleichung der zweiten, sehr stabilen Phase war y2 --1.0616X + 59.3342, pro Tag desorbieren also etwa 1.0 % der Radioaktivität vom Festkörper.

- 85 -

aps-gebundene Radioaktivität 1%) 100* —

80

60

40

20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 Zeit [Tage]

Figur 15 Stabilitatobastiininung dar Bindung von Rhanium an apa-mts. Die Polystyrolkügel-chen aus Versuch S (TabaUa 16) wurden mit 1 ml PBS 7.4 in einer offenen Dialysierzelle gegen 800 ml Puffer dialysiert und die entwichene Radioaktivität (^Perrhenat) in der Puf­ferlösung gemessen (Dreifachbestimmung). In der Kurve ist die noch in den Polystyrolküge^-chen verbliebene Radioaktivität in % der Gesamtaktivität (zerfallskorrigiert) aufgezeichnet.

Die Stabilitätsbestimmung per Zentrifugation stimmt mit der Dialysebestim­mung mit ±15 % überein. Als Beispiel: Die aps-Fraktion aus Versuch R enthielt, nach 206 Stunden mittels Zentrifugation bestimmt, noch 59.2 % der "Kopplungsausbeute an aps-mts". In Versuch S waren nach 190 Stunden noch 51.3 % der Radioaktivität in der Dialysierzelle enthalten.

6.3.3 Herstellung von SA-mts

6.33.1 Versuch 1: Reaktion in der Schmelze

Ausfallendes braunes SA-Glyoxal hatte einen Schmelzpunkt von 58t:. Das IR entsprach SA ohne dessen primäre Amino-Schwingungen bei ~3300 cm"1, d.h. die CH-Schwingungen sind alle sehr stark vorhanden bei 2850, 2920, 2950, 1470 und 720 cm"1. Bei 1730 cm"1 erscheint zusätz­lich eine Aldehydbande.

Schon beim Lösen von mts roch es stark nach Schwefelwasserstoff H2S. Beim Erwärmen fiel gelber Schwefel aus, mts selber ist also nicht sehr stabil in wässriger Lösung. Die Instabilität ist pH- und Temperatur-abhän­gig, bei tiefen pH-Werten zerfällt mts schneller.

- 86 -

Im DC blieb am Start eine UV254-aktive und mit Jod anfärbbare Substanz zurück, welche mit Ninhydrin nicht violett wurde. Rotes Dinitrophenylhydra-zon konnte ebenfalls nicht gebildet werden. Primäre Amine sowie Aldehyd­gruppen waren also nicht mehr vorhanden. Die Ausfällung wurde in Ethanol erhitzt und abfiltriert. Der Schmelzpunkt dieser nur in DMSO und DMF löslichen Substanz wurde nach Lösen in DMSO (1 mg in 250 /zl). Verdünnen mit destilliertem Wasser und Abzentrifugieren und Trocknen der Fällung mit 254*C bestimmt. Eine 'H-NMR-Analyse erhärtete schliesslich den Verdacht, dass in der Stufe I in der wachsähnlichen Fällung noch Glyoxal eingeschlossen gewesen sein musste. Bei der Zugabe von mts bildete sich darauf leichter ein Dimer von mts als das SA-mts-Konjugat. Die Verschiebungen im JH-NMR konnten sehr schön den Protonen -Chfo (2.95 ppm, dublett. 6 H), -N2H- (8.51 ppm, dublett, 1 H). -CH- (7.37 ppm. singulett, 2 H) und -N4H- (11.77 ppm, singulett, 1 H) zugeordnet werden. Es handelte sich also eindeutig um 1.2-Bis-(N4-methylthiosemicarbazono)ethan. Barry et al. 1967 hatten einen Schmelzpunk! von 248t: gemessen. Im DC wurden keine anderen Produkte gefunden, auch in der ethanoli­schen Lösung, die zur Aufreinigung des Dimeres verwendet wurde, nicht.

6.6.32 Versuch 2= Reaktion in Lösung

Bei Raumtemperatur benötigte die Reaktion 3 Tage, bis sämtliche Amino-gruppen des SA's umgesetzt wurden. Das ethanolische Lösungsmittelsy­stem scheint sich zur SA-glyoxal-Synthese zu eignen. Bei diesen Bedin­gungen ist die Halbacetal- und Acetalbildung keine Konkurrenzreaktion. Das Zwischenprodukt Glyoxalstearat (Stufe I) wurde in einer Ausbeute von 48.3 % (211 mg) erhalten und entsprach in 1R und DC dem Imin von Versuch 1.

Der Farbumschlag bei der Zugabe von mts deutet auf eine Produktbil­dung hin. Mittels DC-Analyse konnte aber das gewünschte Produkt nicht isoliert werden, es wurde einfach eine Mischung von mts, SA und SA-glyoxal gefunden.

6.4 Zusammenfassung

Das Modell Polystyrolkügelchen-Ligand ist sehr gut geeignet um die Sta­bilität eines Rheniumkomplexes abzuklären. Eine Synthese kann dank des einfachen Trennverfahrens in optimalem Lösungsmittel durchgeführt wer­den. Der grösste Vorteil dieses Modells ist wohl die Zentrifugierbarkeit, d.h. alle Abtrennschritte sind sehr einfach.

- 87 -

Nach einer halben Stunde Inkubation in PBS 7.4 bei RT wurden maximal 94.8 % des radioaktiven Rheniums an die Polystyrolkügelchen gebunden. Die Reaktion bei pH 10 ausgeführt ergibt keine Vorteile. Nach einem an­fänglichen Verlust von 40 % der Radioaktivität am 1. Tag war die Stabili­tät im folgenden gut, pro Tag desorbierten kontinuierlich nur noch 1.0 %. Da mts als dreizähniger Ligand schon recht stabil ist, verspricht ein vier-zähniger wie z.B. der Re(V)-Komplex mit 4.5-Dithioacetamidopropanoat (Wilkening et al. 1988) noch mehr. Quadratisch planare Tetraaminkomple-xe wie z.B. [ReC>2(2,3,2-tet)]Cl oder ein Re-mtp-Komplex sollten nochmals eine um mehrere Zehnerpotenzen grössere Komplexbildungskonstante besitzen. Die Synthese von SA-mts gab grosse Probleme, die Isolation des Produk­tes gelang nicht. Die Vorstufe SA-glyoxal konnte charakterisiert werden, die anschliessende Kopplung mit mts war aber nicht erfolgreich. Mögli­cherweise wäre es einfacher, die Kopplung direkt am Liposom durchzu­führen. Zuerst würde mts und Glyoxal im Verhältnis 1:1 gekoppelt und nachher zu den aminhaltigen Liposomen (welche z.B. PE oder SA im Bilayer enthalten) gegeben. Die Reaktion dieser Bindung verläuft ausser­ordentlich schnell, wie bei der Kopplung von aps an mts innerhalb weni­ger Minuten. Der aktivierte Ligand, welcher eine Aldehydgruppe aufweist, reagiert selektiv mit den Aminogruppen. Im neutralen pH-Bereich ist diese Reaktion etwas langsamer, könnte aber immer noch eine gute Methode zur Kopplung sein. Das einzige Problem dabei ist die Bildung des mts-Dimeres l,2-Bis-(N4-methylthiosemicarbazono)ethan, das aber vollständig wasserunlöslich ist und daher abzentrifugiert werden könnte.

- 89 -

7 Einschluss des flepto-Komplexes in Liposomen

7.1 Einleitung 7.2 Methoden

7.2.1 Synthese von "* Rephos aus YPerrhenat 7.2.2 Neutronenaktivierung des inaktiven tfepAas-Komplexes 7.2.3 Herstellung von Liposomen mit ^Rephos 7.2.4 Stabilitatsbestimmung der yRephos-Liposomen mittels Dialyse

gegenüber Phosphatpuffer und Vollblut

7.3 Resultate und Diskussion 7.3.1 Synthese von "* Rephos aus YReO^" und Liposomcneinschluss 7.3.2 Neutronenaktivierung des inaktiven Rephos -Komplexes 7.3.3 Liposomeneinschluss des ^Rephos -Komplexes nach Neutronen­

aktivierung 7.3.4 Stabilität der Y/?epAos-Liposomen

7.4 Dosisberechnungen mit l86Re und IMRe 7.4.1 Grundlagen 7.4.2 Beispiel-Dosisberechnung für eine Radiosynoviorthese mit

einer Mischung von lwRe und 1MRe

7.1 Einleitung

Bei der Synthese der Rhenium-Tetraamin-Komplexe fiel auf, dass der Übergangskomplex Rephos im Gegensatz zu den positiv geladenen en-und tet-Komplexen ungeladen und in Wasser völlig unlöslich war. Die Idee lag also nicht fern, den Oxodichloroethoxy-bis-(triphenylphosphin)-rhenium(V)-komplex direkt in die lipophile Phase der Liposomen zu brin­gen. Dieses Vorgehen hatte den Vorteil einer schnellen Synthese, eine spezielle Ankergruppe wäre nicht nötig und das gebundene Rhenium wäre nicht nur an der äusseren Oberfläche der Liposomen. Bei direktem Einbau in die Phospholipidschicht wäre der Komplex eventuell auch besser vor oxidativem Abbau geschützt. Eine Zugabe von Vitamin E brächte das Antioxidans in unmittelbare Nähe des Komplexes und könnte optimal wirken.

Es wurde daher versucht, die Rephos -Synthese (siehe S.3.1) radioaktiv durchzuführen. Zur Liposomenbildung wurde der Lipidfilm aus Phospholi­pid, Detergens und radioaktivem YRephos hergestellt, das restliche Vor­gehen war gleich wie beim inaktiven Prozedere (siehe 2222).

- 90 -

12 Methoden

72.1 Synthese von YRephos aus YPerrhenat

2.0 mg Re2Ü7 (4.13 jimol) wurden in einer Quarzglasampulle Typ Tantal während 42 Stunden bei einem Neutronenfluss von 6-1013 n-cm-2-s_1 im Reaktor Saphir (PS1, Villigen) bestrahlt und in ein Stück Polyethylen-schlauch (Wandstärke 3 mm) gebracht, der beidseitig einen HPLC-Poly-ethylenschlauch (0 2 mm) angeschlossen hatte. Mittels eines Hammers wurde die Quarzglasampulle von aussen zersplittert. Von der einen Seite her wurde das YRe207 mit einer Schlauchpumpe mit 4 ml Ethanol hinaus­gewaschen. Die Lösung tropfte in ein dicht verschlossenes Reactivial® 4 ml mit Teflonrührer, welches in einem Heizblock auf 90t: gehalten und mit N2 durchblasen wurde. Den Gefassausgang bildete eine 3. Kanüle mit Schlauch, welche den Ethanoldampf in ein Gefäss mit 0.1 N NaOH (zum Schutz gegen allfällige flüchtige YPerrheniumsäure) ableitete. Die Pumpen­geschwindigkeit wurde so eingestellt, dass das Reactivial® immer unge­fähr 100-200 jxl Ethanol enthielt.

Nach erfolgter Aufkonzentrierung wurde zum selben Gefäss eine Lösung von 4.1 mg Triphenylphosphin (15.6 jimol) und 2.0 ^1 HCl conc. in 100 pl Ethanol gegeben, das Reactivial® mit einem neuen Deckel dicht ver­schlossen und 3 Minuten bei HOt gekocht. Durch einen 5 ^m-Kanülen-filter wurde der Alkohol mit einer 1 ml-Spritze abgesaugt, zweimal mit je 200 ^1 heissem Ethanol gespült und schliesslich 500 ;il Dichlormethan CH2CI2 dazugegeben. Das Produkt Rephos löste sich sofort, wurde wieder aufgesaugt und zur Lipidfilmherstellung (723) verwendet.

122 Neutronenaktivierung des inaktiven Rephos-Komplexes

1.4 mg Rephos wurden in eine Quarzglasampulle Typ Kobalt (längeres Röhrchen) eingeschweisst (Vorsicht, zu grosse Hitze zerstört den Kom­plex) und im Reaktor Saphir (PSI, Villigen) während 44.53 Stunden bei einem Neutronenfluss von 5.843-1013 n-cm"2^"1 bestrahlt. Die Quarzglas­ampulle wurde daraufhin in ein mit normalem, durchsichtigen Scotch-band umwickeltes Reactivial® 4 ml gestellt (ohne Klebband zerspringt das Reactivial®) und mit einem Hammerschlag zersplittert. Mit einer Spritze wurden mit 3 x 1 ml CH2CI2 der Rephos gelöst, herausgespült, mittels der Keimfilterkanüle 0.22 im von Glasscherben befreit und direkt zur Misch-mizellherstellung verwendet.

- 91 -

72.3 Herstellung von Liposomen mit YRephos

43 mg E100 (54.1 \imo\) in 2 m! Ethanol. 30 mg Natriumdesoxycholat (72.4 jxmol) in 1 ml Methanol sowie 1.4 mg Rephos in 3 ml CH2CI2 wurden in einen 50 ml Rundkolben gegeben und das Lösungsmittel am Rotavapor bei 37t; abgedampft und 30 Minuten bei 0.1 Torr getrocknet. Der Lipidfilm wurde mit 1.5 ml PBS 7.4 aufgelöst, es bildete sich eine klare Mischmizell-lösung. 500 jj.1 dieser Lösung wurden auf eine mit 20 ml PBS 7.4 vorge­spülte Sephadex-G25M-Fertigsäule PD10® gegeben. Nach Trockenlaufen wurden 2.25 ml Puffer dazugegeben. Die nächsten 3.0 ml wurden als "Liposomenfraktion" direkt in einem sterilen 10 ml Fläschchen gesammelt. Die Liposomen hatten eine Grösse von 54.2±17.9 nm (siehe Tabelle 7, Seite 29).

72.4 Stabilitätsbestimmung der YRephos -Liposomen mittels Dialyse gegenüber Phosphatpuffer und Vollblut

1 ml der "Liposomenfraktion" wurde in einer offenen 1 ml Dialysezelle gegen 800 ml Phosphatpuffer PBS 7.4 dialysiert.

Zur Abklärung, ob ein anwesendes Antioxidans einen positiven Effekt auf die Stabilität hat, wurde dem Puffer in einer 2. Dialyse 1 % Ascorbinsäure beigegeben und mit NaOH auf pH 7.4 eingestellt.

Zum Dialyseexperiment mit "ollblut wurden 200 p\ Liposomen mit 800 p.\ Vollblut gemischt, in die Dialysezelle pipettiert und während 8 Tagen ge­gen 800 ml Vollblut dialysiert.

Im Dialysat wurde jeweils die freigewordene Radioaktivität gemessen.

7.3 Resultate und Diskussion

7.3.1 Synthese von YRephos aus YReQ4~ und Liposomeneinschluss

Diese Synthese war im Prinzip die gleiche wie unter 5.3.1 beschrieben. Da aber die Ausgangsmengen mit nur 1-2 mg Re2Ü7 viel kleiner waren, die Synthese für eine angestrebte Therapiedosis von 10-20 mCi YRhenium aber mit einer Anfangsradioaktivität von 200-300 mCi startet, gestaltete sich das Ganze wegen den notwendigen Strahlenschutzvorkehrungen komplizierter, funktionierte aber gut. Da aber doch recht viele Schritte nötig sind, müsste die Synthese bei häufiger Durchführung wegen der Strahlendosis in die abgeschlossene Box verlegt und mit Manipulatoren

- 92 -

durchgeführt werden. Als Strahlendosisbeispiel: Das Halten des Rundkolbens mit der Mischmi-zelle mit einer Radioaktivität von 100 mCi darin ergibt eine maximale Fin­gerdosis von 28 rem/h bzw. 324 rem/h für 186Re bzw. ,ö8Re. Durch die Anbringung eines Polyolefin-SchrumpfSchlauches (Dicke 1.2 mm) um den Rundkolben (Glasdicke 2.5 mm) herum wird die ß~ -Strahlung total absor­biert. Die dabei entstehende Bremsstrahlungsdosis muss noch zur Gam-madosis dazugezählt werden, beträgt aber nur einige wenige Prozente davon. Die erlaubte Handdosis für beruflich strahlenexponierte Personen beträgt laut Strahlenschutzverordnung vom 30. Juni 1976 im Quartal 40 rem.

Die nach Beigabe dieses Komplexes hergestellten Liposomen hatten die physikalischen Eigenschaften wie Liposomen ohne diesen Komplex (unter 2222 beschrieben). Der Einschluss an YRephos war aber sehr unterschied­lich, er betrug in 45 Bestimmungen zwischen 0 bis 20.87 % (siehe Figur 16), die Resultate waren nicht reproduzierbar.

Rephos-Einschluss in Liposomen [%]

*

* *

i « t t i i i i i i i i t i t i » i i i i t i t i t i i i i i i i i i i i i i i i i t

1 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Versuchsnummer

* Grüne Lösung * Dunkle Verfärbung

Figur 16 H*r*Ml«iMehlu» von YRq*to$ in Lipomnen bei der Herstellung auf einer Sepha dex-Saule. Die Komplexe waren durch Synthese aus YRe04~ hergestellt worden.

Es fiel aber auf, dass bei der Gruppe mit den höchsten Einschlüssen, d.h. bei den Versuchen 1, 2, 6 und 8-11 sich die alkoholische ElOO/Desoxycho-latlösung bei der Zugabe der grünen Rephos -Lösung dunkel verfärbte. Sehr wahrscheinlich wurde dabei das violette trans -Isomere von Rephos gebildet, welches dann stärker mit dem Liposomenbilayer assoziierte als das grüne Isomer. Mangels analytischer Methoden zur Trennung der bei-

- 93 -

den Isomere, speziell bei den vorhandenen Tracermengen, konnte diese Beobachtung aber nicht schlüssig bewiesen werden. Das Stabilitätsverhalten wurde bei 15 dieser Versuche untersucht, nach 7 Tagen Dialyse waren im Schnitt noch ~30 % der Radioaktivität in den Li­posomen enthalten. Faak Aufgrund des nicht reproduzierbaren, geringen Einschlusses und der nicht sehr guten Stabilität eignen sich diese Liposomen nicht für eine Anwendung. Das ganze Prozedere ist relativ kompliziert, der Aktivitäts­verlust an eingesetztem YRhenium ist zu gross.

7.32 Neutronenaktivierung des inaktiven Rephos-Komplexes

Bei der Analyse des Rephos-Komplexes (siehe 5.4.1) wurde der Rhe­niumgehalt per NA gemessen. Könnte nicht der ganze Komplex auf die­selbe Art und Weise radioaktiv gemacht werden?

Für alle im Rephos vorhandenen Atome wurde theoretisch berechnet, wel­che radioaktiven Produkte in welchen Mengen bei der Beschiessung mit Neutronen entstehen (siehe Tabelle 17). 3H und 14C können nicht nachgewiesen werden, die Einfangsquerschnitte sind zu klein, ihre Halbwertszeiten zu gross. Alle radioaktiven Sauerstoff­spezies haben Halbwertszeiten im Sekundenbereich, nach der Bestrah­lung sind sie nicht mehr nachweisbar. MP entsteht in messbaren Mengen. Dieses radioaktive Phosphorisotop in den entstehenden geringen Mengen stört aber nicht, da es ebenfalls ein ß-Strahler ist, seine maximale Energie liegt zwischen den beiden gewünschten Rheniumisotopen. Falls 32P an Ort und Stelle verbleibt oder z.B. in die Knochen eingebaut wird, müssen die daiaus resultierende Dosen genauer berechnet werden. Bei einer Ausscheidung des Komplexes mit den Liposomen ist die Belastung sehr gering. **C1 ist ein sehr harter ß-Strahler und entsteht in relativ hohen Mengen. Dank seiner kurzen Halbwertszeit genügt es, vor der Verwen­dung des Komplexes 10 Halbwertszeiten, d.h. ungefähr 7 Stunden abzu­warten. Obwohl 36C1 einen hohen Einfangsquerschnitt für Neutronen auf­weist, ist dank seiner langen Halbwertszeit fast keine Radioaktivität mehr messbar. 186Re und 1MRe machen dank ihrer grossen Einfangsquerschnitte den grössten Anteil an der entstehenden Radioaktivität aus.

Eazüi Anhand der theoretischen Berechnungen erscheint es möglich, ei­nen für eine ß-Strahler-Therapie geeigneten Rheniumkomplex durch Neutronenaktivierung des ganzen Komplexes herzustellen.

- 94 -

Edukt

»H aH

**c **C

16Q

» O

»•o

31p

"ci

3TC1

" • R e

" * R e

— i

0

[lO-Wcnr1

- barn] 0.332

0.0005

0.0034

0.C009

0.0002

0.235

0.0002

0.180

43

0.428

112

1.6+73

r— -

Isoto­penan­teil

99.985 X

0.015 X

98.90 %

1.10 %

99.762 X

0.038 %

0.200 X

100.0 %

75.77%

24.53%

37.40%

62.60%

Edukt-anteil

58.6

5.9 ng

749.9

8.3

53.2

102.9

89.3

28.9

115.7

Pro­dukt

2H 3K

»3C

" C

17o 18Q

19Q

32p

36C1

38C1

l f l 6Re

193.6 | l f l 8 R e

Halb­werts­zeit

12.3 a

5730 a

27.1 s

14.3 d

3-105a

37.2 m

90.6 h

17 h

Strah­lung [MeV]

ß 0.02

ß 0.2 kein Y

ß 3.3

Y ß 1.7 kein y

ß 0.7 kein y

ß 4.9

Y ?

Y 0.137

ß 2.1 Y 0.155

Radioaktivität nach Neutronenaktivierung in [Bq]

OBq

0 Bq

OBq

1.808 MBq

45.3 Bq

11763 MBq

707.52 MPq

2276.3 MBq

in [Ci]

48.9 MCi

Y

3179 M Q

19.12 mCi

61.52 mCi

Taballa IT Auftratand» radioaktiv* botos» nach aar Nautronanaktivianing dw garaan Rap/XB-Kamftom. berechnet für die Charge 028. Eingesetzte Menge Rephos 1.4 mg. Bestrah-iungszeit 44.53 h. Neutronenfluss 5.843-lO11 n-cm"J-s"'.

Resultafe Nach der NA halte der grüne Rephos -Komplex die Farbe nach gräulich-dunkel gewechselt, beim Lösen in Dichlormethan erschien aber die grüne Farbe wieder. Schmelzpunkt und IR entsprachen der inaktiven Substanz. In einem DC wurden neben dem Komplex noch 11.5 % YRe04" gefunden. Es wird also nur ein geringer Teil des Komplexes bei der Neutronenaklivierung oxidiert und damit zerstört. Dieser Anteil, welcher bei der nachfolgenden Gelfiltration zur Liposomenhersteilung abgetrennt wird, stört aber nicht.

7.3.3 Liposomeneinschluss des ^Rephos-Komplexes nach Neutronenakli­vierung

Die Versuche zur Herstellung von YRephos-Liposomen durch Bestrahlung des inaktiven Komplexes und nachfolgendem Einbau sind in Tabelle 18 zusammengefasst.

- 95 -

Versuch

016

025a

025b

026a

026b

027a

027b

028a

028b

028c

Einschluss

[X]

43.04

47.10

45.19

53.45

53.18

47.49

47.02

38.28

41.67

38.31

Lipidkonz. fertiger Li­posomen T mg/ml]

5.6

5.6

5.6

5.6

5.6

5.6

5.6

4.8

4.8

4.8

Rephos-konz. der Liposomen [mg/ml]

0.35 5.9MoK

0.35 5.9Mo«

0.35 5.9MolX

0.47 T.QMott

0.47 7.9Mo«

0.67 11.2Mo«

0.67 11.2MO«

0.06 1.2Mol*

0.06 1.2MoIt

0.06 \2UolX

Tragerung

(YRe/Re)

3.4-10-8

1.6-10"7

1.6-10"7

4.7-10" 6

4.6-10" 6

12-10-6

2.2-10"6

1.3-10"4

1.3-10"*

1.3-10"4

Aktivitäts-konz. der Liposomen [jiCi/ml]

0.40

2.08

2.03

91.26

89.67

55.79

54.82

1'440

1'646

1'515

Tabelle 10 ZüNunmifataUung des Bmohhane von nautramnaktMifltm YRtpttot in LipoMtMit Der Einschluss in [XJ ist der Radioaktivitatsanteil der auf die Sephadexsaule aufgetragenen Mischmizelle (-100X). welcher in der Liposomenfraktion gefunden wird.

Der maximale Einschluss betrug 53.45 % in die Liposomenfraktion, der gemittelte Einschluss war 45.46 % ± 5.33 % und war somit reproduzierbar. Es wurde damit im Schnitt mehr als doppelt soviel YRephos in die Lipo­somen eingeschlossen als beim maximalen Wert, der nach Synthese des rRephos aus YRe04- erreicht wurde. In Schema 8 sind anhand der Bestrahlung und Liposomenherstellung der Charge 028 das genaue Vorgehen sowie die entstehenden radioaktiven Abfälle aufgeführt. Ein noch(mehr)maliges Spülen des Reactivial® mit CH2C12 könnte den radioaktiven Abfall zusätzlich verkleinern. Die Reste der gemischten Mizelle am 50 ml Rundkolben sind ohne Spülen nicht entfernbar, ein Verdünnen der Mischmizelle kommt aber aus Gründen der Liposomenherstellung auf der PD10*-Säule nicht in Frage.

7.3.4 Stabilität der YRephos -Liposomen

In allen 3 Dialysen zur Stabilitätsbestimmung (siehe Figur 17) wurde am ersten Tag ein Radioaktivitätsverlust von 15-20 % gefunden, ein gewisser Anteil YRephos schien nur schwach mit den Liposomen assoziiert zu sein. Darauf folgte eine lineare Phase: Die Stabilität der YRephos-Liposomen gegenüber normalem Phosphatpuffer war am kleinsten, pro Tag verschwan­den 3.8 % YRephos aus den Liposomen, nach 7 Tagen waren noch 59.6 % in den Vesikeln enthalten. Bei der Dialyse gegen einen Vitamin C-hal-tigen Puffer (1 % Antioxidans) betrugen die Verluste noch 1.0 % Radioakti-

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Radioaktivität:

78.3P mCi - 2899 MBq*

integr. Neutronenfluss 9.34* 10'8 n/cm2

Neutronenaktivierungsdauer 44.53 h 1.4 mg Rephos

»«•Re/»*Re-3.1725/l (um 1600)

Total 50.69 mCi - 1875.5 MBq*

38.4* Abfall« Spritze 0.16mCi-5.9 MBq* Reactivial» 7.21mCi-636.7 MBq* Rundkolben 2.0<?mCi'77.3 MBq*

, t , 30.75 mCi - 1137.7 MBq*

39.4S Brachtuai in die Liposomen

, L _ _ 13.05 mCi - 483.0 MBq*

in 9ml Liposomen Schan» 8 Zeitlich« Ablauf dar Hmtelhing dar mit msphw gafOlltan Lipomman und ge­nau* RadtoaktTfitaaWans anhand der Liposomencharge 028 • gemessene Radioaktivität bezogen auf das Herstellungsende (144S) •berechnete Radioaktivität bezogen auf das Ende der Neutronenaktivierung (0203)

vität pro Tag. Ein Pc bestätigte, dass die im Dialysat gefundene Radio­aktivität chemisch in der Form als Perrhenat vorlag. Der Grund der Insta­bilität von flep/)os-Liposomen ist damit auf die Reoxidation des Re(V) zum Re(VH) zurückzuführen. Dies hat einen Zerfall des Rephos -Komplexes zur Folge, das entstehende Re04" löst sich in der wassrigen Phase. Ein Schutz gegen die Reoxidation könnte also durch ein Antioxidans in der wassrigen Phase (Ascorbinsäure) oder durch ein fettlösliches Antioxi­dans im Liposomenbilayer (a-Tocopherol) erzielt werden. Im verwendeten Lipid E100 sind schon natürlicherweise 0.1 % Vitamin E enthalten. Da Tocopherol wie der Rephos-Komplex in der Liposomenmembran einge­baut wird, kann es zu einer kompetitiven Verdrängung kommen. Bei der Liposomenherstellung mit 1 % Vitamin E war die Stabilität vermindert, nach 8 Tagen waren nur noch 16 % der Anfangsaktivität in den Liposomen. Liposomen ohne zusätzliches Tocopherol enthielten immerhin noch 44 %. Ein optimaler Vitamin E-Anteil müsste noch gefunden werden, ev. könnte Tocopherol auch durch ein viel v/irksameres Antioxidans wie u-Butyl-

Sehjälk

Neutronenaktivierung des Rephos-Kompiexes im Reaktor Saphir am

Paul Scherrer Institut (Villigen) 0531-02°3

Zerfall der kurzlebigen Radioisotope (v.a. 38CI)

Herstellung des Lipkifilmes mit Rephos. Phospholipid El 00 und

Natriumdesoxycholat

Herstellung der Liposomen durch Mizellierung des Lipidfilmes in PBS

und Gelfiltration auf einer PD10*:

Sammeln der Liposomenfraktionen

n oo_ 1 3 45

]400_]43o

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hydroxytoluol ersetzt werden. Eine gewisse Oxidation wird aber immer stattfinden, da beim radioaktiven Zerfall von YRhenium immer H2O2 entsteht, welches sich als potentes Oxidationsmittel sofort einen Reaktionspartner in. der Nähe sucht. Die Dialyse von YRephos-Liposomen gegen Vollblut war der Dialyse gegen Phosphatpuffer ohne die Ascorbinsäure ähnlich, in der linearen Phase betrug der tägliche YRheniumverlust 32 X.

40

20

0 1 1 1 1 1 1 1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Zeit [Tage]

Figur IT StabiUtttobsstiramung <tw Raphag-EhmMvmm in Liposomen mittels Dialyw - + - Dialyse von 1 ml Liposomen gegen 800 ml PBS 7.4 - o - Dialyse von 1 ml Liposomen gegen 800 ml PBS 7.4 mit IX Vitamin C - * - Dialyse von 200 p\ Liposomen • 800 >il Vollblut gegen 800 ml Vollblut

FflZit; In Vollblut werden ähnliche Stabilitätswerte wie in Phosphatpuffer erhalten, eine Anwendung in vivo scheint damit nicht ausgeschlossen. Eine weitere Stabilitätserhöhung durch Antioxidantien in der wässrigen Phase oder im Bilayer der Liposomen ist möglich.

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7.4 Dosisberechnungen mit 186Re und 188Re

7.4J Grundlagen

Bei einer allfälligen Therapie mit radioaktivem Rhenium als (J-Strahler muss natürlich die Dosis vor der Anwendung berechnet werden können. Daten dazu werden vom MIRD Komitee, dem Medical International Radi­ation Dose Comitee of the Society of Nuclear Medicine' zu den meisten existierenden Radionukliden herausgegeben. Die am meisten interessierenden Daten sind dabei die mittlere absorbierte Dosis D(rk«-rh)in der Einheit rad (1 rad - 0.01 Gy). d.h. die Dosis, die ein Zieiorgan n von einem Radionuklid, welches gleichförmig im Ouellenorgan ih verteilt ist. erhalt. D kann formuliert werden als

D(rk-rh)-li£- ?Äi-0j(rk^rh)

oder D(rk_rh) - Ah- lAi - *i(rk~rh) i

wobei Xh in jxCi-h die kumulierte Aktivität im Ouellenorgan rh. ntk in g die Masse des Zielorgans rk und A in g-rad-^Ci'^h"1 die Gleichge­wichtsdosiskonstante für ein Partikel i einer bestimmten Art und Energie darstellt. 0i(rk«-rh) un& $i(rk*-ih) schliesslich entsprechen dem absorbier­ten Anteil und dem absorbierten spezifischen Anteil der Energie im Zie­lorgan rjc für ein Partikel i. das im Ouellenorgan rh emittiert wurde. Die meisten biologischen Parameter, die zur Dosisbestimmung gebraucht werden, sind in der kumulierten Aktivität Ah enthalten. Die restlichen Parameter der obigen Gleichung beschreiben physikalische und anato­mische Eigenschaften. Es wurde daher in der Nuklearmedizin die "absor­bierte Dosis pro Einheit kumulierter Aktivität'' S eingeführt und definiert als

s(rk«-rh)- ?Ai-<I>i(rk«-rh)

Anhand eines Phantoms, d.h. einer Nachahmung eines 70 kg schweren Menschen mit durchschnittener Grösse, Dichte, Organgrössen, Form und Zusammensetzung wurde für die meisten Radionuklide die S-Werte be­rechnet und iabelliert. Die Dosis kann jetzt einfach berechnet werden mit

D(rk«-rh)" Äh • S ( rk^ rh)

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Fehler in der Dosisberechnung mittels der S-Tabellen können entstehen bei nicht gleichmässiger Verteilung der Radioaktivität im Organ (Anrei­cherung z.B. in einer gewissen Zellenart) sowie bei grossen Abweichun­gen der Organmassen von den 'Normalmassen', die den Berechnungen zugrunde liegen. Beim Einsetzen des absorbierten Anteils waren gewisse physikalische Interpolationen und Schätzungen nicht zu umgehen. Wenn man diese Punkte berücksichtigt, kann mit den tabellierten S-Werten sehr gut gearbeitet werden. Der einzige unbekannte Wert ist jetzt noch die kumulierte Aktivität im Quellenorgan, sie wird berechnet als

Ah- jAh(t) dt «»

Im Idealfall d.h. bei der sofortigen vollständigen Aufnahme eines Radio­nuklides in das Quellenorgan und Verbleiben an Ort, bis alle Aktivität abgeklungen ist, beträgt die akkumulierte Radioaktivität Ah den 1.44-fa-chen Wert der Ausgangsaktivitat At| multiplizier; mit der Halbwertszeit h/2. weil

7 -ln2-t Ah - jA,,-e tV2" dt

ti

Ah - 1.44 At|- t i / 2

Wenn Quellen- und Zielorgan ein und dasselbe sind, ist die Belastung der umliegenden Gewebe minimal; es kann die kleinst mögliche Radio­aktivitätsmenge eingesetzt werden. Auch die Verwendung der optimalen Strahlungsart kann die Belastung des umliegenden Gewebes und die Ganzkörperbelastung klein halten. Für 188Re wurde im MIRD Pamphlet 1975 eine S-Tabelle veröffentlicht; für ,d6Re ist noch keine erschienen. Christian Wernli (PSI, SU, Villigen) be­rechnete aber einige Daten (siehe Tabelle 19).

n Leber «-Leber)

4.10-10"4 rad/(|iCi-h) 9.44-10" « rad/(;iCi-h)

S( Pankreas •• Pankreas)

7.37-10"3 rad/(>xCi-h) 1.70-10-2 rad/(jiCi-h)

für lfl6Re für 1MRe

für lfl6Re für 188Re

mLeber - 1800 g

^Pankreas " 100 g

Tafcalla 19 AfeaorMarta Doris pro Einhalt akkumuliert« Aktivität 'S" för dia Radionuklldt "•Ra und "Hto aus dem MIRD Pamphlet 1975.

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7.42 Beispiel-Dosbberechnung für eine Radiosynoviorthese mit einer Mischung von ia6Re und 188Re

Für eine Radiosynoviorthese braucht es je nach zu behandelndem Gelenk Dosen im Bereich von 10-100 Gy. Daher wurden die Therapieliposomen für eine mittlere Dosis von 50 Gy ausgelegt. Zur Kniebestrahlung wird nach Zalutsky et al. 1988 eine Dosis von 90-100 Gy benötigt. Das Verteil­volumen betragt im Knie 100 ml, d.h. etwa 100 g (Neves et al. 1987). Weil für das Kniegelenk keine S-Werte vorliegen, können die Werte von S(Pankreas Pankreas) als Näherungswerte eingesetzt werden.

Beim Einsatz von reinem 186Re ware die Dosis

D = A- S - 1.44 • xjiCi • 90.64 h • 7.37-10"3 rad/jzCi-h = 5000 rad • x - 5234 MG

Mit 18aRe erhielte man auf die gleiche Weise eine einzusetzende Radio-ctktivitätdosis von 12'156 jiCi. Bei der Neutronenaktivierung wurde immer eine Mischung von 185Re und ,87Re bestrahlt. Das entstehende 186/188Rhe-nium-Gemisch, welches unter 12 und 73 in die Liposomencharge 028 eingeschlossen wurde, hätte beispielsweise am nächsten Tag (30 h nach Bestrahlungsende) um 800 Uhr morgens noch eine Totalaktivität von 7.611 mCi (186Re mit 2.656 mCi. lfl8Re mit 4.955 mCi). Dies hätte bei Verabrei­chung in das Knie eine Totaldosis von 46.15 Gy (25.55 Gy von 186Re und 20.60 Gy von 188Re her) zur Folge.

fazife Die angestrebte Dosis von 50 Gy wird durch rRephos- Liposomen erreicht. Durch Erhöhen des Anteiles an Rephos (Mol%) bei der Liposo-menbildung, durch Erhöhen der Liposomenkonzentration bei der Herstel­lung, durch Verringerung der Einschlussverluste und durch schnellere Anwendung des Präparates könnte die Dosis in derselben Menge Lipo­somen noch mindestens um einen Faktor 5 erhöht werden.

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8 Schlussdiskussion

Die beiden Radioisotope 18; <e und 168Re haben alle guten Eigenschaf­ten eines in der Nuklearmedizin brauchbaren ß-Strahlers. Ihre mittlere Reichweite von 2-4 mm im Gewebe ist günstig zur Behandlung von Tu­moren. Metastasen und anderen wuchernden Zellen. Die Kombination von radioaktivem Rhenium mit Liposomen vereint einen biologisch gut ver­träglichen Träger mit einem potenten (und bis jetzt noch zuwenig ge­nutzten) Therapienuklid.

Um zu stabilen Rhenium-Liposomen zu gelangen, können prinzipiell drei verschiedene Wege begangen werden (siehe Schema 9). Der erste ist das Füllen des wässrigen Liposomeninnenvolumens mit Rhenium. Der zweite ist die Inkorporation eines Ankermoleküls in den Bilayer. Dieses Molekül trägt eine funktionelle Gruppe, welche Rhenium binden kann. Der dntte Weg ist der direkte Einbau eines Rheniumderivates in die Membran.

Rhenium Re

ReOi

Liposomenherstellung mittels Ultrabeschallung

Re(DTPA)-SA

Re(mip)-SA

Liposomenherstellung mittels Gelfiltration

Scham« 9 Obmfeht fibtr dl» Ifethodm, mkt» sur HtnMlung von Rhrnium-Upotomtn möglich find und durohgrfQhrt wurdm.

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ai Einschluss von wasserlöslichen Rneniumderivaten in das Liposomen-Innere

Die stabilste Form von Rhenium ist das Perrhenat in der Oxidationsstufe VII. Dieses sehr gut wasserlösliche Anion wurde dem Puffer beigegeben, in welchem dann die Liposomen mittels Uitraschaii gebildet wurden. Diese SUV's enthielten den Anteil an Radioaktivität, welcher aus dem Verhältnis von Innen- zu Aussenvolumen zu erwarten war. Es fand also weder eine Anreicherung noch ein Ausschluss statt.

Mit der Lipidkonzentration von 8.5 mg pro ml wurde ein Einschluss von 0.64 % erzielt. Bei der gewünschten Therapiedosis von ~10 mCi müsste also mit mindestens 1-2 Curie Radioaktivität gearbeitet werden. Der Abfall wäre sehr gross, das Präparat müsste in einem Labor Typ A hergestellt werden. Die Aktivierungszeiten werden lang: Im Reaktor Saphir bei Voll­leistung (6-1013 n-crrT^s"1) müssten z.B. 5 mg Re2C>7 1 Woche lang be­strahlt werden, um 1.5 Curie zu erhalten. Für die praktische Anwendung hat diese Art Rhenium-Liposomen also keine Bedeutung. Himu kommt, dass die Stabilität dieser Liposomen sehr schlecht war. Nach 2 Tagen war keine Radioaktivität mehr im Inneren der Vesikel. Die Ultraschall-Behand­lung war möglicherweise zu lang und zu energiereich für das verwende­te, ungesättigte Lipid El 00. Die resultierenden Liposomen waren daher für die Permenatanionen durchlässig.

Ein Einschlussversuch der positiven und wasserlöslichen Komplexe [ReC>2(en)2]* und [Re02(2,3,2-tet)]+ wurde nicht unternommen. Es gab keine Anhaltspunkte, dass damit höhere Einschlussraten erzielt werden könnten. Diese positiven und kleinsten existierenden Rheniumionen hätten einen grossen Vorteil in vivo gegenüber dem Perrhenat: Sie reichern sich in keinem Gewebe an und werden schnell und unverändert über die Nieren ausgeschieden (Bläuenstein et al. 1985). Nach dem Liposomenab-bau und dem Freiwerden der Rhenium Verbindungen würde also keine radioaktive Belastung für den Organismus entstehen. Perrhenat dagegen reichert sich, wenn auch etwa zehn Mal weniger als Permanganat, in der Schilddrüse an (persönliche Muteilung von Prof. E. Deutsch).

62 Einbau einer Ankergruppe in die Liposomenmembran mit nachfolgender Kopplung von Rhenium

Dieser zweite Ansatz hat den Vorteil, dass man einen Anker verwenden kann, dessen Stabilität bekannt ist. Sehr oft wird SA verwendet, welches auch als ladungsgebender Membranbestandteil in der Liposomenherstel-lung verwendet wird. SA kann bis zu einem Anteil von 25 Mol% bezogen

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auf das Gesamtlipid mit einer Einschlussrate von bis zu 100 % eingebaut werden. Die Cjs-Kette von SA ist stabil in den Bilayer verankert, die primäre Aminogruppe kann leicht derivatisiert werden. Es wurden Liposomen mit 7.5 Molfc DTPA-SA hergestellt. Die Reduktion von zugegebenem 99rnTc04~ mit SnCb und die anschliessende Kom­plexbildung in der Oxidationsstufe V verlief schnell, bis zu 00 % der Ra­dioaktivität kam in der Liposomenfraktion. In einer Dialyse nahm der ge­bundene Anteil ünear sehr langsam ab. Mit der Ankermethode sind Tc-Liposomen also einfach und stabil herstellbar. Auf Liposomen mit DTPA-SA-Re trifft das (noch) nicht zu, das Hauptproblem ist dabei die Reduktion des Rheniums. Um die richtige Oxidationsstufe V zu erhalten kann mit SnCb reduziert werden. Die benötigten Zin^mengen waren aber zu gross. Teilweise wurden sogar die Liposomen zerstört. Die Anwendung von anderen Reduktionsmitteln wurde diskutiert; es scheint aber keine echte Alternative zu Sn2+ zu geben. Eine noch zu wenig untersuchte Methode, welche bei Technetium gut funktionierte, wäre die Verwendung eines Thioharnstoffderivates zur Reduktion. Tetraazakomplexe mit Tc sind unter den stabilsten Tc-Komplexen zu fin­den, das Zentralatom wird dabei quadratisch planar gebunden. Ein Rhe­niumkomplex mit 2,3.2-tet wurde synthetisiert, IR und UV entsprachen fast vollständig dem schon lange bekannten [Re02(en)2]Cl-Komplex. Ein von Huber 1988 hergestelltes tet-Derivat mit zwei funktionellen Carboxyl-gruppen, mtp, ergäbe an SA gekoppelt eine sehr stabile Bindung Re-mtp-SA-Liposom. Die Propionsäuren an den mittleren beiden Stickstoffen sollten die Komplexbindung nicht al schwächen. Eine mtp-SA-Synthese war nicht erfolgreich. Die Amidbindung wurde zwar nachgewiesen, die Isolierung des Produktes gelang aber nicht. Die langkettigen Edukt- und Produ'.ctmischungen ergaben immer Oberflächenprobleme, was die Aufrei­nigung solcher Mischungen stark erschwerte. Ein N- und S-haltiger Thiosemicarbazidligand, mts, bildete ebenfalls ei­nen erstaunlich stabilen Komplex, obwohl er nur dreizähnig ist. S-haltige Komplexbiidner haben den Vorteil, dass die Reaktionsbedingungen nicht so kritisch sind. Sie sind über weite Temperatur- und pH-Bereiche ein­setzbar. An einem Modell, d.h. kovalent an Aminomethylpolystyrolkügel-chen gekoppelt, wurden daher die Markierungsbedingungen und die Bindungsstabilität von mts erforscht. Sogar bei physiologischem pH wur­de durch Sn2+-Reduktion bis 94.8 % des Rheniums an die Polymerkügel-chen gekoppelt. Die nach einer noch zu eliminierenden Verlustphase ausgezeichnete Stabilität üess auch eine Anwendung in Therapielipo-somen sinnvoll erscheinen. Nach einem anfänglichen 40Xigen Verlust verschwand bei der weiteren Dialyse nur noch täglich 1 % der Radioakti­vität aus den Kügelchen. Der SA-mts-Anker konnte nicht synthetisiert wer­den, obwohl das Zwischenprodukt SA-glyoxal gebildei wurde, mts scheint in wässrige; Lösung nicht allzu stabil zu sein, es roch immer nach H2S.

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Für einen stabilen Einbau einer Ankergruppe in die Liposomen ist ein mtp-SA-Komplex am erfolgversprechendsten, wobei die Ankergruppe mit einer geeigneteren Methode an der Säuregruppe angehängt werden sollte. Trotz der beschriebenen Schwierigkeiten sollte der Einbau von Rhenium in Liposomen über einen mtp-Komplex weiter verfolgt werden, zumal das in vivo-Verhalten günstig sein müsste.

8.3 Einbau eines lipophilen Rhenium-Komplexes in die Liposomen-membran

Der als Zwischenstufe für die [Re02(en)2]\ [Re02(2.3,2-tet)]+ oder auch den noch nicht gebildeten [ReC>2(mtp)]+ synthetisierte flep/ias-Komplex ist in Wasser völlig unlöslich. Daher wurde er bei der Liposomenherstel-lung zu den Lipiden gegeben. Auf einer Gelfiltrationssäule wurden damit durch Detergensentfernung Liposomen hergestellt. Es konnten bis ^u muXimal 53.5 % eingeschlossen werden. Bei der Rephos -Synthese wurde eir violettes und ein grünes Isomer beobachtet. Der violette trans-Rephos scheint eine höhere Einschlussrate zu ergeben, die Bilayeraffinität scheint grösser zu sein. Mangels ar.^lytischer Methoden bei den vorhandenen kleinen Mengen konnte dieser Befund aber nicht schlüssig bewiesen werden. Die Stabilität dieser Rephos -Liposomen ist gut, das Hauptproblem ist die Reoxidation zum Perrhenat. Der Einsatz von Antioxidantien stabilisiert den Komplex entscheidend.

Die Methode zur /?ep/jos-Liposomen-HersteIlung ist einfach. Für einen Einsatz im Spital könnte die gemischte Mizelle im Labor mit der ge­wünschten Therapiedosis hergestellt werden. Vor der Anwendung müsste dann noch eine Gelfiltration über eine PD10® stattfinden, wobei die Liposomen entstehen und gleichzeitig das freie Perrhenat abgetrennt wird und auf der Säule verbleibt.

8.4 Ausblick

Die erfolgversprechendste Anwendung von Rephos -Liposomen ist der Einsatz für eine Radiosynoviorthese. Die Rephos -Liposomen können durch Verwendung eines anderen Detergenses, vorzugsweise n-Octyitetraoxy-ethylen, in die zur Knietherapie ideale Grösse von 600 nm gebracht werden. ZaJutsky et al. J988 beschreibt MLV's aus einei DSPC/SM-Mischung im Verhältnis 4:1 als noch idealer, die Leakage wird damit minimal.

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Die hergestellten Rephos -Liposomen enthalten die erforderliche Menge an Radionuklid. Eine weitere Aufkonzentrierung bis zu einem Faktor von 5 ist möglich, d.h. die Injektionsmenge kann auf die für die Knieinjektion gewünschten 3 ml optimiert werden. Bei einer baldigen Verfügbarkeit von ,88Re aus einem 188W/18aRe-Generator wird die Frage der möglichst hohen Lipidkonzentration der Liposomen nicht mehr so wichtig sein, da die Trägerung fast entfällt und viel höhere Nuklidkonzentrationen im Generator entstehen.

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Anhang

Zeifallsbeiechnunqen eines Gemisches von lfl6Re und 16flRe

Bei radioaktiven Zerfällen misst man immer eine momentane Radioaktivi­tät, d.h. die Angaben werden immer auf einen näher zu bezeichnenden Zeitpunkt bezogen. Hat man nun ein Gemisch von Radioisotopen, so ist einiger Rechenaufwand nötig, um aus den gemessenen Radioaktivitäts­mengen den momentanen oder einen zukünftigen Wert zu erhalten. Die Grundgleichung für den Zerfall eines Gemisches von lö6Re und 188Re lautet:

Totalaktivität S, - AktA + Aktg

. . . . -ln2-t/TA . . ., B -ln2-t/TB - Anteil A, - e * + Anteil B, • e a

wobei TA und TB die Halbwertszeiten von 186Re (-A) und 188Re (-B) sind, t ist die interessierende Zeit. Um nun die Radioaktivität zu einem beliebigen Zeitpunkt t zu erhallen, müssen der Endpunkt der Neutronenaktivierung to. das Verhältnis R von 186Re zu 188Re zu einem beliebigen Zeitpunkt \\ sowie die Summenakti-vitat S zu einer ebenfalls beliebigen Zeit \2 gemessen werden:

«o «i «2 i I 1 1 1 • Zeit

R S S,

Die Aktivitäten der gesuchten Radioisotopen zur gesuchten Zeit t be­rechnen sich nach:

Akt A, -R . s . eln2-(l,-t)/TA # eln2-(t2-t)/TA ßln2-(t2-t)/TB

p ln2-(t,-t)/TA ln2-(t2-t)/TB ln2-(t rt)/TB Jn2-(t2-t)/TA K * e • e ^ e * e

Akt S, - Akt A, + Akt Bt

Lebenslauf

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1960 geboren am 18. Juli in Bülach (ZH)

1967 - 1972 Primarschule in Klingnau (AG)

1972 - 1976 Bezirksschule in Klingnau

1976 - 1979 Kantonsschule in Baden (AG) mit Abschluss Matura Typus C

1980 Beginn des Pharmaziestudiums am Pharmazeutischen Institut der ETH Zürich

1982 - 1983 Praktikum in der Habsburgapotheke Dr. M. Brentano

in Brugg

1985 Staatsexamen als Apotheker an der ETH Zürich

1985 - 1986 Vertretung als Apotheker in verschiedenen Offizin­apotheken

1986 Beginn der Dissertation am Eidgenössischen Institut für Reaktorforschung EIR in Würenlingen unter der Leitung von Prof. Dr. H.G. Weder

1987 Ausbildung zum Strahlenschutzsachverständigen an der Schule für Strahlenschutz in Würenlingen, Besuch des Kurses "Einführung in die Labortierkunde" an der Universität in Zürich

1989 Abschluss der Dissertation am Paul Scherrer Institut PSl in Villigen in der Abteilung Radiopharmazie unter der Leitung von Prof. Dr. H.G. Weder