chuong 2-sac ky lỏng
TRANSCRIPT
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINHKHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
NỘI DUNG CHƯƠNG 2
2.1. Nguyên tắc và phân loại các phương pháp sắc ký lỏng
2.2. Pha tĩnh và pha động trong sắc ký lỏng
2.3. Thiết bị trong sắc ký lỏng và sắc ký lỏng cao áp
2.4. Ứng dụng của sắc ký lỏng
2.1. Nguyên tắc và phân loại các phương pháp sắc ký lỏng
GIỚI THIỆU VÀ PHÂN LOẠI
ĐỘ PHÂN CỰC CỦA PHA
• Pha thường hay còn gọi là pha thuận
(normal phase): pha tĩnh phân cực
dung môi không phân cực
• Pha đảo (reverse phase): pha tĩnh không
phân cực dung môi phân cực
Sắc ký lỏng – lỏng (LLC)sắc ký lỏng - rắn (SLC)
• SLC: Pha tĩnh là chất rắn, phổ biến nhất là silicagel pha này thuộc dạng pha thường
• LLC: Pha tĩnh là chất lỏng có phủ một lớp chất rắn bảo vệ (giống cột nhồi trong GC)
• Pha tĩnh trong LLC có thể phân cực hoặc không phân cực, pha động thì ngược lại
• LLC ít được sử dụng
CỘT ÁP SUẤT THẤP
• Áp suất thấp: cột mở (open tubular), cho đến nay vẫn còn sử dụng loại cột này tuy nhiên chỉ tách được các mẫu tương đối đơn giản– Đường kính– Cột: > 1cm– Hạt > 37m
CỘT ÁP SUẤT CAO
• Cột kín, hạt nhỏ và đồng nhất (< 12m)
• Độ phân giải cao nhưng thiết bị đắt
• Áp suất lên tới 5000 psi
THUẬN LỢI CỦA HPLC
Chap 4 : LIQUID CHROMATOGRAPHY IN COLUMN I- Introductory classifications
Example of high speed HPLC
Example of high resolution HPLC
Example of high sensitivity HPLC
BẤT LỢI CỦA HPLC
Isocratic và gradient elution
• Isocractic elution: chế độ chạy đẳng dung môi
• Gradient elution: chế độ chạy theo chương trình dung môi, thông thường sẽ thay đổi từ hệ dung môi có năng suất rửa giải thấp tới cao. – Sử dung cho những mẫu phức tạp– Hỗn hợp các chất có ái lực khác nhau– Giảm được thời gian phân tích
Chap 4 : LIQUID CHROMATOGRAPHY IN COLUMN I- Introductory classifications
Analysis of a complex mixture :
Isocratic modeGradient mode
First few peaks : too close of dead peak
too strong mobile phase
Last peaks : short and broad, long tR
too weak mobile phase
Solution = gradient elution
Begin with a weaker solvent and gradually increase the solvent strength
Resolution of ealier peaks improved
Widths of later peaks drecreased and heights increased
2.2. Pha tĩnh và pha động trong sắc ký lỏng
PHA TĨNH
Silica gel
• Đường kính của hạt• 1 - 12m (nhỏ hơn
GC)• Cỡ hạt từ 5 – 400nm• Kích thước hạt nhỏ
áp suất cột tăng cho cột ngắn lại
Average velocity
Pressure drop (bar)
Flow rate
PHA ĐẢO
Synthesis of RP Packings
RP Column Preparation
Common RP Packings
RP Mechanism (Simple)
PHA ĐỘNG TRONG HPLC
BẢNG SO SÁNH ĐỘ MẠNH CỦA DUNG MÔI TRÊN NỀN Al2O3
Một số thông tin về dung môi
QUAN HỆ GIỮA CÁC CHẤT HẤP THỤ KHÁC
Những thông số quan trọng trong pha đảo
• Độ mạnh của dung môi
• Sự chọn lựa dung môi
• pH của pha động
• Hoạt tính của silanol
Độ mạnh của dung môi
• Nước là dung môi yếu
• Tăng dung môi hữu cơ giảm tR
• Dung môi HC này phải hòa tan trong nước
Hiệu quả tách của dung môi
ảnh hưởng của pH
• Ảnh hưởng của hợp chất ion hóa
– Axit hữu cơ
– Bazơ hữu cơ
• Trong HPLC-RP cần phải ngăn chặn quá
trình này
• Cần thiết phải điều chỉnh đúng giá trị pH
pH ảnh hưởng tới tR
1. Salicylic acid
2. Phenobarbitone
3. Phenacetin
4. Nicotine
5. Methylampohetamine
30x0.4 cm C-18, 10 m, 2 mL/min, UV 220 nm
Snyder and Kirkland, Introduction to ModernLiquid Chromatography, Wiley, 1979, p. 288.
Sử dụng dung dịch đệm
• Ph của dung dịch đệm chọn sao cho
– Sử dụng được: pH = pKa ± 1
– Tốt nhất là: pH = pKa
• Tính đệm phải yếu (100 mM hoặc nhỏ hơn)
• Kiểm tra tính tan của chúng
MỘT SỐ ĐỆM PHỔ BIẾN
Buffer compatible with detectorCommon concentration of buffer : 10-50 mM
Hoạt tính của silanol
• RP chiếm khoảng 50% nhóm –OH của silicagel
• Có tính axit yếu
Bề mặt Silica
CÁCH CHỌN DUNG MÔI
• Độ phân cực thích hợp
• Độ nhớt thấp
• Tương thích với detector
• Tính bay hơi
Cột của một số hãng
MỘT SỐ KÝ TỰ VIẾT TẮT
• ODS: octadecylsilylated
• TMS: trimethylchlorosilane
• THF: tetrahydrofolate
MỘT SỐ VÍ DỤ
• Sườn silica gel
• ODS - silica gel
• TMS – silica gel
ION PAIR HPLC (IPC)
Chap 4 : LIQUID CHROMATOGRAPHY IN COLUMN II- Classification of HPLC modes
Distinction between : - short alkyl chain ion pair reagents as sodium octanesulfonate
- long alkyl chain ion pair reagent as sodium dodecylsulfate, hexadecyl
trimethyl ammonium bromide : surfactant properties and CMC
‘surfactant’ or ‘soap’ chromatography
2 proposed mechanisms :
- first model : ion pairs formed in mobile phase nonionic moieties
with the same behavior than other molecules in RPLC (distribution
between stationary and mobile phase)
SM + CIM (CI-S)M
SM + CIS (CI-S)S
S : solute
CI : counterion
VÍ DỤ
Chap 4 : LIQUID CHROMATOGRAPHY IN COLUMN II- Classification of HPLC modes
Most common ionic sites (cation and anion types) :
Cation exchanger Anion exchanger
Strongly acidic weakly acidic
sulfonate
--SO3-
sulfopropryl (SP):
--CH2CH2CH2SO3-
carboxylic
--CO2-
Carboxymethyl (CM)
--CH2CO2-
Strongly basic weakly basic
IVry ammonium I, II, III protonated
amine--NR3
+
triethylmammonium
--N(CH3)3+
Diethylaminoethyl (DEAE)
--CH2CH2N+H(CH2CH3)2
--N+HR2
Limit of usable pH for weak exchangers :
- 6 for cation resins
- 8 for anion resins
Capacity of resins determined by number of ionic sites on the resin: typical
values 2-5 mequiv/g small enough samples
2.3. Thiết bị trong sắc ký lỏng và sắc ký lỏng cao áp
THIẾT BỊ HPLC
DUNG MÔI
• Tất cả các dung môi trong HPLC phải là dạng “grade”.
• Khi sử dụng phải lọc qua cục lọc 0.2m
• Việc lọc sạch dung môi giúp kéo dài tuổi thọ của cột và bơm.
• Đuổi khí trước khi sử dụng, vì các bọt khí khi qua cột và detector sẽ gặp vấn đề
BỘ TIÊM MẪU(INJECTOR)
• syringe: kim tiêm
• Loop
• injector
SYRINGE
LOOP
INJECTOR
LOAD (the sample loop)
Inject (move the sampleloop into the mobilephase flow)
INJECTOR
INJECTOR
CỘT BẢO VỆ (GUARD COLUMN)
CỘT PHÂN TÍCH
CÁC LOẠI CỘT
BƠM CAO ÁP
DETECTOR HPLC
Electrochemical
8%Others
5%Refractive
Index 5%
DETECTOR UV-VIS
DETECTOR HUỲNH QUANG
DETECTOR DAD
DETECTOR MS
2.4. Ứng dụng của sắc ký lỏng