ciclo celular

Ciclo CelularCiclo Celular

El ciclo celular es una serie El ciclo celular es una serie ordenada de eventos ordenada de eventos macromoleculares que lleva hasta macromoleculares que lleva hasta la división celular y a la la división celular y a la producción de dos células, cada producción de dos células, cada una conteniendo un número una conteniendo un número idéntico de cromosomas a la idéntico de cromosomas a la célula madre.célula madre.

El ciclo celular es una serie El ciclo celular es una serie ordenada de eventos ordenada de eventos macromoleculares que lleva macromoleculares que lleva hasta la división celular y a la hasta la división celular y a la producción de dos células, cada producción de dos células, cada una conteniendo un número una conteniendo un número idéntico de cromosomas a la idéntico de cromosomas a la célula madre.célula madre.

ObjetivosObjetivos

1.1. Mostrar como la unión de varios estudios Mostrar como la unión de varios estudios independientes generó el conocimiento independientes generó el conocimiento base sobre el ciclo celular.base sobre el ciclo celular.

2.2. Presentar diferentes técnicas moleculares Presentar diferentes técnicas moleculares utilizadas para la disección de los utilizadas para la disección de los mecanismos de control de un proceso mecanismos de control de un proceso fisiológico, en este caso el ciclo celular.fisiológico, en este caso el ciclo celular.

3.3. Mostrar el conocimiento actual la Mostrar el conocimiento actual la regulación del ciclo celular en plantas.regulación del ciclo celular en plantas.

4.4. Transducción de señales de los Transducción de señales de los principales reguladores de crecimientoprincipales reguladores de crecimiento

IntroducciónIntroducción

1.1. Teoría Celular, 1838, Schleiden y SchwanTeoría Celular, 1838, Schleiden y Schwan1.1. Todos los organismos están compuestos de célulasTodos los organismos están compuestos de células2.2. Toda célula se origina a partir de otra célulaToda célula se origina a partir de otra célula

2.2. ¿Cómo originar célula nueva?¿Cómo originar célula nueva?1.1. Información de cómo realizarloInformación de cómo realizarlo2.2. Capacidad de síntesis de todos los Capacidad de síntesis de todos los

componentes (duplicar todo)componentes (duplicar todo)3.3. Mecanismo de control del procesoMecanismo de control del proceso

1.1. AvanceAvance2.2. Asegure la fidelidad del procesoAsegure la fidelidad del proceso

G1 12 horasS 6 horasG2 6 horasM 0.5 horas

Rae, P. N., & Johnson, 1970 Johnson and Rae, 1970

1. Orden de etapas2. Núcleo emite instrucciones3. M: induce a G1, S, G2 a

avanzar en orden (ALTERNAMIENTO)

4. Etapas deben finalizar antes de iniciar otras (TERMINACIÓN)

5. S induce G1 a duplicar ADNl6. S no induce a G2 a replicar

Block a re-duplicación

Experimentos de Fusión de células de Mamíferos:

Análisis bioquímico del ciclo Análisis bioquímico del ciclo celular celular (estudio en células (estudio en células

embrionarias)embrionarias)

Xenopus laevis

• Células grandes 1mm• Posible obtener en gran

número, 1 hembra produce miles

• Gran número en espacio reducido

• Gran número en corto tiempo• Divisiones iniciales son

sincronizadas

Ciclo de vida de Xenopus laevis

Células del Folículo

Detiene en Metafase II

DESCUBRIMIENTO DEL MPFMPF

(FACTOR DE PROMOCIÓN DE LA MITOSIS/MADURACIÓN)

Masui, Y., & Markert, C. L., 1971.

Gerhart, ., Wu, M., & Kirschner, M.J. ,1984

Medición de MPF en proceso de oocito a blástulaMedición de MPF en proceso de oocito a blástula

MPF también induce mitosis

Actividad MPF independiente de

ensamblaje del huso (nodoconazole)

síntesis de DNA (afidicolina)

Xlt: independiente del estado del núcleo!???

Motor del ciclo celulatodas las reacciones que inducen la activación o inactiviación de MPF

Eventos secundariosEventos inducidos por la

act.o inactiv. de MPF

Motor del CC

Alta MPF

Baja MPF

Eventos secundarios

Eventos secundarios

Descubrimiento de la CICLINA

Evans, T., Rosenthal, E. T., Youngblom, J.. Distel, D.. & Hunt, T.1983

Evidencias de estudios Evidencias de estudios bioquímicos bioquímicos

Ambos ensayos (exp. de inyección y de fusión) prueban que Ambos ensayos (exp. de inyección y de fusión) prueban que las células mitóticas tiene un factor inductor dominante las células mitóticas tiene un factor inductor dominante

Oocitos, MPF oscila aún si DNA no está replicado, no en Oocitos, MPF oscila aún si DNA no está replicado, no en exp. de fusiónexp. de fusión

Se creyó que ambos sistemas poseían regulación diferente.Se creyó que ambos sistemas poseían regulación diferente.

Sistema de inyección en oocytos (maduración) permitió Sistema de inyección en oocytos (maduración) permitió tener un sistema para purificar MPF pero:tener un sistema para purificar MPF pero:

MPF difícil de purificarMPF difícil de purificar Experimento era difícil de realizarExperimento era difícil de realizar Se creía que control de meiosis era diferente de mitosisSe creía que control de meiosis era diferente de mitosis

Análisis genético del ciclo Análisis genético del ciclo celularcelular

(estudio en levaduras)(estudio en levaduras) Dos tipos de levadurasDos tipos de levaduras

Saccharomyces cerevisiae (pan, vino, cerveza) levadura Saccharomyces cerevisiae (pan, vino, cerveza) levadura de fisiónde fisión

Schizosaccharomyces pombe (cerveza pombe) levadura Schizosaccharomyces pombe (cerveza pombe) levadura de gemaciónde gemación

VentajasVentajas Rápido crecimiento (división cada 90 min)Rápido crecimiento (división cada 90 min) Medio de crecimiento sencilloMedio de crecimiento sencillo Genoma pequeñoGenoma pequeño Fácil de detectar etapas del ciclo celular (tamaño de gema)Fácil de detectar etapas del ciclo celular (tamaño de gema)

Inicio de gemación coincide con paso por INICIO (START)Inicio de gemación coincide con paso por INICIO (START) UnicelularesUnicelulares Sistema ampliamente estudiado desde 1960’sSistema ampliamente estudiado desde 1960’s

Diferencias con células Diferencias con células embrionariasembrionarias

Se detectan dos Puntos de Control Se detectan dos Puntos de Control Entrada a S, regula tamaño de célulaEntrada a S, regula tamaño de célula Entrada a M, chequea duplicación del ADNEntrada a M, chequea duplicación del ADN

Mitosis es cerrada (no se rompe memb. Mitosis es cerrada (no se rompe memb. Nucl.Nucl.

Ensamblaje de huso inicia antes de finalizar Ensamblaje de huso inicia antes de finalizar duplicación de DNAduplicación de DNA

Difícil detectar el ingreso MDifícil detectar el ingreso M Tamaño de gema indica etapa del CCTamaño de gema indica etapa del CC

Schizosaccharomyces pombe (cerveza pombe)Schizosaccharomyces pombe (cerveza pombe) levadura de gemación levadura de gemación Budding yeastBudding yeast

Budding yeast

Identificación de Identificación de mutantes del CCmutantes del CC

32 mutantes cdc “cell division cycle”

Budding yeast

Mapa de MutantesMapa de Mutantes

Hartwell, L. It, Culotti. J., P J. R., & Reid, 1974

Budding yeastv

•Proteína esencial para el avance del CC

•No permite ingreso a S, este punto del cc se define como INICIO (START), no permite ningún evento secundario

•Luego de este punto la célula esta comprometida a completar el CC

•La célula coordina crecimiento y motor del cc

•La célula evalúa estado nutricional, si es pobre detiene CC (diferente a embriones)

Budding yeast

Quién es cdc28?Quién es cdc28?

Tendrá alguna Tendrá alguna relación con MPF?relación con MPF?

Saccharomyces cerevisiae (levadura Saccharomyces cerevisiae (levadura común)común)Levadura de fisión (método de Levadura de fisión (método de división)división)Fission yeastFission yeast

Fission yeastFission yeast

Regulación del tamañoRegulación del tamaño

División ocurre siempre a un tamaño dadoDivisión ocurre siempre a un tamaño dado Longitud del ciclo celular es mayor en Longitud del ciclo celular es mayor en

células hija que en células madre (By).células hija que en células madre (By). Falta de nutrientes detiene CC en INICIO Falta de nutrientes detiene CC en INICIO

ByBy y en ENTRADA A MITOSIS en y en ENTRADA A MITOSIS en FyFy

Lo anterior refleja una evaluación del Lo anterior refleja una evaluación del ambiente externo para permitir la ambiente externo para permitir la continuación del CCcontinuación del CC

Enzimas que controlan CCEnzimas que controlan CC

2 modelos:2 modelos: Xenopus, motor del CC sin control, Xenopus, motor del CC sin control,

embriog.embriog. Levaduras, alto regulación del CC, Levaduras, alto regulación del CC,

somáticasomática Mutantes:Mutantes:

wee1wee1 cdc 25cdc 25

Wee1+Wee1+

wee1- (ts): wee1- (ts): Mutante de FyMutante de Fy células se dividen a un tamaño menorcélulas se dividen a un tamaño menor Posible inhibidor de avance del CC hasta alcanzar Posible inhibidor de avance del CC hasta alcanzar

tamaño adecuado, al mutarse pierde su actividad tamaño adecuado, al mutarse pierde su actividad como inhibidor como inhibidor

Actividad en INICIO o en ENTRADA A MITOSISActividad en INICIO o en ENTRADA A MITOSIS Al aumentar temperatura se da explosión de M no de S, Al aumentar temperatura se da explosión de M no de S,

se elimina control de tamaño para M, ahora punto de se elimina control de tamaño para M, ahora punto de control es en INICIOcontrol es en INICIO

Se reflejan 2 puntos deControl:

ENTRADA A MITOSIS

INICIO


cdc25+cdc25+

cdc25 (ts): cdc25 (ts): Mutante de FyMutante de Fy Detienen ciclo antes de M pero continuan Detienen ciclo antes de M pero continuan

creciendocreciendo Mutación puede ser rescatada por wee1- Mutación puede ser rescatada por wee1-


cdc2+cdc2+

cdc2 (ts): cdc2 (ts): Mutante de FyMutante de Fy Detienen ciclo antes de M pero continuan Detienen ciclo antes de M pero continuan

creciendocreciendo Mutación no puede ser rescatada por Mutación no puede ser rescatada por

ninguna otra mutaciónninguna otra mutación


Detiene en G2

Mutacióndominante

cdc13 mismo fenotipo que cdc2 ts

Russell, P., & Nurse, P. (1987).

Clonaje de genes por complementaciónClonaje de genes por complementación

La unión de ambos estudiosLa unión de ambos estudios

Integración de By y FyIntegración de By y Fy

Es posible complementar cdc2 con Es posible complementar cdc2 con cdc28 y viceversacdc28 y viceversa

63% de identidad en la secuencia de aa63% de identidad en la secuencia de aa Cdc2 ENTRADA A MITOSIS y Cdc2 ENTRADA A MITOSIS y

cdc28 INICIO ?cdc28 INICIO ? Homólogo de cdc2 en humanos, capaz Homólogo de cdc2 en humanos, capaz

de rescatar cdc2 Fy => sistema de rescatar cdc2 Fy => sistema conservadoconservado

Integración de mutantes y Integración de mutantes y MPFMPF

Se logra purificar MPF Se logra purificar MPF 1 L huevos pocos ug de MPF1 L huevos pocos ug de MPF 2 bandas 34 KDa y 46 KDa2 bandas 34 KDa y 46 KDa

Se supuso que era cdc2 y cdc13 Se supuso que era cdc2 y cdc13 (ciclina)(ciclina) Anticuerpos lo demostróAnticuerpos lo demostró

MPF tenía actividad kinasaMPF tenía actividad kinasa Sustrato Histona H1Sustrato Histona H1

La ciclina y el ciclo celularLa ciclina y el ciclo celular

Es la ciclina la única proteína involucrada Es la ciclina la única proteína involucrada en la oscilacion del CCen la oscilacion del CC

Sistema Sistema in vitroin vitro de ciclo celular de ciclo celular

Murray, A. W., & Kirschner, M. W.(1989)

Adición de mRNA de ciclina es capaz de restaurar divisionesAdición de mRNA de ciclina es capaz de restaurar divisiones

ANTISENSE mRNA

Eliminación de un fragmento Eliminación de un fragmento de 90 aa (caja de de 90 aa (caja de destrucción) del terminal destrucción) del terminal amino del gen de ciclina: amino del gen de ciclina: destrucción necesaria para destrucción necesaria para salir de mitosis.salir de mitosis.

Inhibición de síntesis de Inhibición de síntesis de proteínaproteínacicloheximidacicloheximida

Mitad de interfaseInicio de interfase

Ciclina requerida para entrar en M

Incremento de MPF depende de otros factores

Más ciclina no acelera CC

Más MPF si acelera CC

Más cdc25 si aceleraMenos wee1 si acelera

FosforilaciónFosforilación

La modificación más común de postTDLa modificación más común de postTD Actúan sobre aa-OHActúan sobre aa-OH Activa o inactiva proteínasActiva o inactiva proteínas Participa en cascada de señalesParticipa en cascada de señales 3 tipos: Ser/Thr, Tyr y Ser/Thr/Tyr3 tipos: Ser/Thr, Tyr y Ser/Thr/Tyr Diferentes Kinasas diferente sustratoDiferentes Kinasas diferente sustrato

Wee1 solo actúa sobre cdc2Wee1 solo actúa sobre cdc2 MPF actúa sobre muchos sustratosMPF actúa sobre muchos sustratos

Las proteínas pueden tener varios sitios de Las proteínas pueden tener varios sitios de fosforilaciónfosforilación

Fosfatasas: también clasificadas por su especificidad Fosfatasas: también clasificadas por su especificidad aaaa

Mutante del cdc2 en residuo Tyrosina 15al parecer es un sitio de regulación negativase divide en un tamaño menorno responde a daños en DNA

Cdc2: también fosforilado en Thr 161regulación positiva

Cdc25 -: detiene ciclo en G2muestra alta fosforilación de

Tyr15en cdc2 F15D: no puede

ejercer fosforilaciónes fosforilado para activarse

Degradación de la ciclinaDegradación de la ciclina

Se requiere para inactivar MPFSe requiere para inactivar MPFSe asocia a moléculas de ubiquitinaSe asocia a moléculas de ubiquitinaUbiquitina es activada por MPFUbiquitina es activada por MPFLos residuos de ubiquitina se unen a caja de destrucciónLos residuos de ubiquitina se unen a caja de destrucción

Autocontrol de MPF

Estructura deMembranaNuclear: filamentos de lamina

Sustratos de MPF

¿Tarea,otros sustratos?

Mutantes en otras kinasasotras kinasas

Wee1: fosforila Tyr 15Mik1: fosforila Tyr 15 (redundante)Wee1-mik1: catástrofe

Aspergilus nidulans:Aspergilus nidulans:

Nim: never in mitosisNim: never in mitosis Bim: blocked in mitosisBim: blocked in mitosis

nimA: kinasa, actividad alta en mitosis y luego caenimA: kinasa, actividad alta en mitosis y luego cae nimA++: entrada temprana en M, aún sin duplicar DNAnimA++: entrada temprana en M, aún sin duplicar DNA nimA-: ciclo se detiene en G2, pero mantiene alta MPFnimA-: ciclo se detiene en G2, pero mantiene alta MPF

nimT: homólogo de cdc25nimT: homólogo de cdc25 nimT-: baja MPF, detiene ciclo en G2nimT-: baja MPF, detiene ciclo en G2 nimT: alta actividad kinasa de nimAnimT: alta actividad kinasa de nimA

nimA y MPF: se requieren para MnimA y MPF: se requieren para M

O’Donnell, K., Pu, R. T., & Osmani, (1991).

Actividad kinasa asociada a NimA y mitosisActividad kinasa asociada a NimA y mitosis

Ciclo Celular en MamíferosCiclo Celular en Mamíferos

Kaldis y Aleem, 2005

Concepción comúnCDK2 + CYC A or CYC E en G1/SCDC2 + CYCB en Mitosis

NuevoCDC2 + CYCE, B o A en G1/SCDC2 o CDK2 en G1/S

Hartig and Beck, 2005

Ciclo Celular en PlantasCiclo Celular en Plantas

Hartig and Beck, 2005

Jager et al., 2007Jager et al., 2007

Plantas: 49 ciclinas, 10 clases: A, B y D en CCPlantas: 49 ciclinas, 10 clases: A, B y D en CC CDK´s: A, BCDK´s: A, B

CDKA/CYCD y CDKB/CYCDCDKA/CYCD y CDKB/CYCD CDKA: constitutiva, genera actividad Kinasa en G1CDKA: constitutiva, genera actividad Kinasa en G1 CDKB: actividad kinasa en S y MCDKB: actividad kinasa en S y M

CiclinasCiclinas CYCD5: pico en G1CYCD5: pico en G1 CYDD4: pico en G1/SCYDD4: pico en G1/S CYCD++: G1 se acortaCYCD++: G1 se acorta Regulación de CYCD:Regulación de CYCD:

CYCD3: muy inestable v1/2: 7.5 min x ubiq, transducción CYCD3: muy inestable v1/2: 7.5 min x ubiq, transducción de señales (nutrientes, hormonas)de señales (nutrientes, hormonas)

CYDD2: más estable, regulada a nivel de actividad de CYDD2: más estable, regulada a nivel de actividad de kinasakinasa

Regulación de CDKRegulación de CDK Por asociación a ciclinaPor asociación a ciclina Por fosforilación (CAK: CDK Por fosforilación (CAK: CDK

activ.kinasas)activ.kinasas) CDKD/CYCHCDKD/CYCH CDKFCDKF Inhibidores de CDK (KRP´s)Inhibidores de CDK (KRP´s)


ENTRADA en SENTRADA en S

CYCD/CDKA inactiva RB (via P)CYCD/CDKA inactiva RB (via P) CYC D se une a RB vía motivo LxCxECYC D se une a RB vía motivo LxCxE RB asociado a diferenciaciónRB asociado a diferenciación

RBRB RB/E2F:inactiva a E2FRB/E2F:inactiva a E2F RB fosforilado no puede inactivar E2F (se da duplicación del ADN)RB fosforilado no puede inactivar E2F (se da duplicación del ADN)

E2FE2F Factor de ElongaciónFactor de Elongación Activos durante S asociados a Activos durante S asociados a endoreduplicaciónendoreduplicación Regulan genes de sintesis y replicación de DNARegulan genes de sintesis y replicación de DNA 5700 genes con sitios de unión para E2F (20 % genoma)5700 genes con sitios de unión para E2F (20 % genoma) TiposTipos

E2F heterodiméricoE2F heterodimérico DPDP E2F monomérico (indep de RB)E2F monomérico (indep de RB)

ELP, E2Fd, E2Ff, E2F, DELELP, E2Fd, E2Ff, E2F, DEL


Modelo de la Transición G1/SModelo de la Transición G1/Sen plantasen plantas

Dewitte and Murray, 2003

Ciclinas tipo ACiclinas tipo A

10 tipos en Arbd, 3 subclases: A1, A2 y A310 tipos en Arbd, 3 subclases: A1, A2 y A3 Expresión secuencial A3 -> A1 -> A2Expresión secuencial A3 -> A1 -> A2 CYCA3/CDKA: requerida p´re-entrar CC en CYCA3/CDKA: requerida p´re-entrar CC en

SS A1 y A2 durante S y G2/MA1 y A2 durante S y G2/M


G2/MG2/M

Control ppal por CYCBControl ppal por CYCB Arbd: 9 tipos, 3 subclases B1, B2, B3Arbd: 9 tipos, 3 subclases B1, B2, B3 TC alta en G2 y pico al inicio de MTC alta en G2 y pico al inicio de M TC regulada por MybA1, A2 y BTC regulada por MybA1, A2 y B

MybA1 y A2: activadoresMybA1 y A2: activadores MybB: represorMybB: represor


Ciclinas tipo BCiclinas tipo B

Los niveles muy regulados por proteólisis Los niveles muy regulados por proteólisis en metafase/anafaseen metafase/anafase

CYCB++: daños en mitosisCYCB++: daños en mitosis CDKA/CYCB: colocaliza en PPB, huso, CDKA/CYCB: colocaliza en PPB, huso,

cromatina, fragmoplasma: dinámica de cromatina, fragmoplasma: dinámica de microtúbulosmicrotúbulos

No se ha indentificado homólogos deNo se ha indentificado homólogos de Wee1 identificado en plantasWee1 identificado en plantas cdc25: no ¿regulación?cdc25: no ¿regulación?


Estudio de genes del CC en Estudio de genes del CC en plantasplantas

http://http://jxb.oxfordjournals.org/cgi/reprint/51/352/1789

http://jxb.oxfordjournals.org/cgi/reprint/51/352/1789

http://jxb.oxfordjournals.org/cgi/reprint/51/352/1789

ciclo celular

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