Ciklodextrinek alkalmazásafolyadékkromatográfiás módszerekben

Dr. Szemán JuliannaCyclolab Ciklodextrin Kutató-Fejlesztő Laboratórium Kft.

1097. Budapest, Illatos u. 7. cyclolab@cyclolab.huwww.cyclolab.hu

� Befolyásolja a szelektivitást

� Királis felismerőképesség

� Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben

� Ciklodextrin tartalmú folyadékkromatográfiás állófázisok

A ciklodextrinek szerepe

Statisztikusan szubsztituált származékok

� A homológok/izomerek száma rendkívül nagy

� Jellemzők: szubsztitució fok (DS) és a szubsztituensek eloszlása

� A batch-to-batch reprodukálhatóság rendkívül fontos.

Batch 1

0

5000

10000

15000

20000

25000

5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25

Group A

Group B

Group C

1

2

3

4

Batch 2

0

5000

10000

15000

20000

25000

5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25

1

2

3

4

5

Group A

Group BGroup C

Batch 3

0

5000

10000

15000

20000

25000

5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25

Group A

Group B

Group C1

2

3

4

5

CMBCD batch-to-batch reprodukálhatósága

A ciklodextrin kiválasztása

� Oldhatóság – alap CD-nél probléma

� Elválasztandó anyag – molekulaméret, funkciós csoportokSingle isomer vagy statisztikusanszubsztituált

� Ár

Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben

�Fordított fázisú töltet, vizes eluens

�Függ az elválasztandó anyagtól

� k: 10-15 MeOH-víz < 50%

�RP állófázisok: C18, C8, C4, CN

�Töltet típustól is függ (C tartalom, end-cap)

J. Szemán et al. J. Chromatogr. A 728 (1996) 423

Ciklodextrinek alkalmazása az eluensbenAz állófázis kiválasztása

P. Zarzycki et al. J. Chromatogr. A 955 (2002) 71-78

Szerves oldószer hatásaMeOH, EtOH, IPA, ACN, (THF)

� a komplex stabilitási állandóra� solute - állófázis kölcsönhatásra

Ciklodextrinek alkalmazása az eluensbenAz eluens összetételének szerepe

Norgestrel elválasztás, szelektivitás változás a szennyezőkre is!M. Gazdag et al. J. Chromatogr. 450 (1988) 145

Puffer hatása

� pH

� ionerösség

� puffer kation-anion

� ionpárképzés éskomplexképzés

0

2

4

6

8

10

12

0 2.5 5 10 20

CMBCD [mg/ml]

k, R

s

Rs

k

Ciklodextrinek alkalmazása az eluensbenCD koncentráció hatása

Aminoetil-benzodioxán származék elválasztása karboximetil-BCD-vel

Aminoetil-benzodioxán származék elválasztása karboximetil-BCD-vel

J. Szemán et al. J. Chromatogr. A 728 (1996) 423

Ciklodextrinek alkalmazása az eluensbenA szubsztitúciós fok hatása

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

0 2 4 6 8 10

DS

Rs

0

5

10

15

20

25

0 2 4 6 8 10

DS

k

Rs k

Különbözőőőő szelektivitású CD származékok együttes használata (CE-ben elterjedt)

�HPLC: barbiturát enantiomerek elválasztásaαCD és permetilezett-BCD(TRIMEB) keverékkel

�TRIMEB szerepe az állófázis módosítása:csökken a retenció, kevesebb oldószer kell, ezért jobb az enantiomer elválasztás

R. Nowakovski et al. J. Chromatogr. A, 782, 1-11, 1997

Ciklodextrinek alkalmazása az eluensbenCD keverékek használata

Szelektivitás növelése nem királis anyagoknál

6.853

22.974

10.313

8.406

11.65217 mg/ml HPGCD

15.821

50.175

51.110

24.351

22.909

FLN: Flunisolide

BRFLN: Bromoflunisolide

FLNAL: Flunisolide alcohol

DS: Desonide

CLDS: Chlorodesonide

Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben

5 mg/ml DIMEB

Ciklodextrinek alkalmazása az eluensbenGyógyszerkönyvi példa

Pharmeuropa 20.1 (2008. január)

Iloprost, Polar related substances

Mobile phase:mix 330 ml of acetonitrile R1 and 670 ml of a 12 g/lsolution of β-cyclodextrin R adjusted to pH 2.0 with phosphoric acid R.

Opálos eluens, kiválás

Előőőőnyök• A szelektor minősége és koncentrációja könnyen változtatható• Olcsó oszlopok ill. olcsó adalékok használhatók

Hátrányok• A szelektor zavarhatja a detektálást (UV, MS)• A szelektor igény viszonylag nagy• (A szelektor minősége változó lehet)

Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben

Ciklodextrin tartalm ú állófázisok

Ciklodextrin tartalm ú állófázisok • a kereskedelemben • az irodalomban leírt

Ajánlott irodalom:

• Chiral Separations, Methods and Protocols; G. Gübitz és M.G. Schmid

• CYCLOBOND handbookhttp://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/hplc/columns/chiral/cyclobond.html

• www.cyclodextrin.net (Armstrong cikkek)

Fordított fázisú elválasztás- ugyanazok az optimálási paraméterek érvényesek, mint az eluensben használt (oldószer, puffer , pH, ionerősség, hőmérséklet)

Polar-organikus mód- Acetonitril/metanol/ecetsav/trietilamin mozgófázis

Normál fázisú elválasztás- Hexan/Ipa, EtOH

Ciklodextrin tartalm ú állófázisok

Az állófázis előőőőállítás szempontjai- a szelektor minőőőősége- a szilikagélhez kötés módja - a szilikagél minőőőősége- a szabad szilanolok mennyisége

Mono-szubsztituált CD-származék immobilizálásának előnyei:

A jól definiált, izomertiszta származékolószerrel- homogén felület- monomer borítottság (víz kizárásával történik) érhető el

Saját fejlesztésűűűű királis állófázisok(Natursep)

Az állófázis előőőőállítása

• A CD származék reakciója trietoxi-szilil-propil-izocianát• Vizmentes közegben kötés a szilikagélhez• Szabad szilanolok: trimetil szilil endcap• Az állófázis minőségének ellenőrzése (NMR)

Metanol : TEAPbuffer (pH3) = 35:65 ill *54,5% MeOH

A szilikagél minőőőőségének hatása – Királis teszt - warfarin

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5

mAU

0

10

20

30

40

DAD1 A, Sig=200,4 Ref=360,100 (L:\HPLC3\HPLC3 2008\ENANTIOMER\ENA0226\2008-02-26 2\WRF2.D)

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

mAU

-20

0

20

40

60

80

DAD1 A, Sig=200,4 Ref=550,100 (L:\HPLC3\HPLC3 2008\ENANTIOMER\ENA0909\2008-09-09 4\WRF2.D)

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

mAU

0

2.5

5

7.5

10

12.5

15

17.5

DAD1 A, Sig=205,4 Ref=550,100 (D:\DOC\KIRÁLI~1\HPLC3_~2\ENANTI~1\ENA0326\WRF5.D)

min0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

10

20

30

40

50

60

DA D1 A, Sig=205,4 Ref=550,100 (D:\DOC\KIRÁLI~1\HPLC3_~1\ENA NTI~1\ENA1215\WRFE11.D)

MN

Fuji – kis boritottság!!ExsilHypersil

15,7*

15,2

17,8

9,2

tR

11 0001,151,7Macherey-N.

28 0001,061,3Fuji

21 0001,142,4Exsil

30 0001,193,7Hypersil

NαRs

Warfarin 0.1% R szennyezés

Analitikai elválasztások PMMBCD oszlopon

Clopidogrel0.5% R szennyezés

Permetrinsav NaproxenO

CH3

CH3

O

OH

CH3CH3

ClClO

OH

Rs: 1R-cis/1S-cis: 2.21S-cis/1R-trans: 2.41R-trans/1S-trans: 4.4

1S-trans

1R-trans1S-cis1R-cisRs:

1R-cis/1S-cis: 2.21S-cis/1R-trans: 2.41R-trans/1S-trans: 4.4

1S-trans

1R-trans1S-cis1R-cis

N

Cl

S

O

O

CH3

O

OH

O

CH3

O

min0 5 10 15 20 25 30

mAU

0

20

40

60

80

100

120

DAD1 A, Sig=200,4 Ref=360,100 (O:\ENA1103\TRP2.D)

Permetilezett BCD oszlop

Hidroxipropilezett BCD oszlopRs: 4,93

Rs: 2,06

DAD1 A, Sig=200,4 Ref=360,100 (Z:\DATA\ENA1103\TROPASAV_ELU011.D)

OH

O

OH

Tropa sav

Permetilezett és hidroxipropilezett BCD-sállófázisok összehasonlítása

0.1 % TEA-foszfát puffer, pH: 3,5 – metanol, 0,7 ml/perc, 25 ºC

KK üüllöönbnböözzőőőőőőőő CDCD--s s áállll óóffáázisok elvzisok elváálasztlasztóókkéépesspessééggéének nek öösszehasonlsszehasonlííttáásasa

KUMARINOKKUMARINOK

Anyag BCD HPBCD PMBCD CMBCD

Acenokumarol 0.75 0.83 2.14 0.62

Fenprokumon 1.13 1.04 0.78 1.61

Warfarin 0.46 1.47 2.94 0.50

O

OH

O

O

CH3

N

O

O

O

OH

O

CH3

O

OH

O

O

CH3

0.1 % TEA-foszfát puffer, pH: 3,5 – metanol, 0,7 ml/perc, 25 ºC

KK üüllöönbnböözzőőőőőőőő CDCD--s s áállll óóffáázisok elvzisok elváálasztlasztóókkéépesspessééggéének nek öösszehasonlsszehasonlííttáásasa

Anyag Képlet BCD HPBCD PMBCD CMBCD

Fenoprop 0.00 0.00 2.37 0.00

2,4-DP 0.87 0.63 0.50 0.00

Mecoprop 1.09 0.48 1.40 0.00

O

CH3

O

OH

Cl

Cl

Cl

O

CH3

O

OH

Cl

CH3

O

CH3

O

OH

Cl

Cl

0.1 % TEA-foszfát puffer, pH: 3,5 – metanol, 0,7 ml/perc, 25 ºC

KK üüllöönbnböözzőőőőőőőő CDCD--s s áállll óóffáázisok elvzisok elváálasztlasztóókkéépesspessééggéének nek öösszehasonlsszehasonlííttáásasa

Anyag Képlet BCD HPBCD PMBCD CMBCD

Cisz-permetrinsav 0.00 1.21 2.33 0.00

Transz-permetrinsav 1.21 0.76 4.66 0.00

Tropasav 0.61 4.18 2.06 n.a.

Terbutalin 1.78 2.54 0.00 1.90

Fluoxetin 1.39 1.80 2.33 n.a.

CH3CH3

ClClO

OH

OH

O

OH

OH

OH NH

OHCH3

CH3CH3

FF

F

O NHCH3

Phenprocoumon enantiomerek (R>S) forditott elúciója BCD és PMBCD oszlopokon, UV és polarimetriás detektálással.

O

OH

O

CH3

KK üüllöönbnböözzőőőőőőőő CDCD--s s áállll óóffáázisok elvzisok elváálasztlasztóókkéépesspessééggéének nek öösszehasonlsszehasonlííttáásasa

Szemipreparativ elválasztásWarfarin 1 mg

-0.02

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0 10 20 30 40 50 60

Time (min)

WR

F (

mg/

ml)

1R : 0.52 mg Purity: 95.2%1S : 0.42 mg Purity: 95.2%