citogenetica 2
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Citogenetica 2. La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l ’ analisi citologica dei cromosomi al microscopio. Ferguson-Smith. Lezione 2. Analisi del cariotipo. 1) Allestimento della coltura. 2) Preparazione dei vetrini. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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Citogenetica 2
La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l’analisi citologica dei cromosomi al microscopio. Ferguson-Smith Lezione 2
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1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini
Analisi del cariotipo
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sangueperiferico
terreno dicoltura
48-96h
proliferazione
colchicina(ultimi 30’)
centrifugazione
pelletrisospeso
Ipotonica (20’)
centrifugazione
pelletrisospeso
fissativo
centrifugazioni (2-3)
fissativorisospensionein poco fissativo
allestimento delpreparato
Allestimento del preparatofitoemoagglutinina(stimola la crescita)
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1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini
Analisi del cariotipo
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Creano un’alternanza di bande chiare e scure lungo l’asse del cromosoma specifica per ogni coppia di omologhi.
Colorano una regione specifica di alcuni o di tutti i cromosomi
C-bande : tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabilidei cromosomi 1,9,16,Y
Metodi colorazione differenziale
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1-3 gruppo A 4-5 gruppo B
X-6-12 gruppo C
13-15 gruppo D 16-18 gruppo E
19-20 gruppo F Y-21-22 gruppo G
Cariotipi a confronto
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utilizzando la mostarda di quinacrina......QM-banding pattern
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DAPI e QM
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C-bande
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G-bande
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G QM G QM
HSA1HSA1
HSA14HSA14
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R-bande
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1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini
Analisi del cariotipo
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by GP&NA
Ottimama…..
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by GP&NA
Puo’essere anche cosi’...Cromosomi non ben riconoscibili, difficili anche dacontare.Scartare! (potendo)
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by GP&NA
.. O cosi’ Troppo contrattipero’ si puo’ usareper contarli.Scartare! (potendo)
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by GP&NA
Selezione delle metafasi
Sufficiente Si possono contarePuo’ essere utile peranalizzare i cromosominon sovrapposti
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Discreta
by GP&NA
Si possono contare, e anchese ci sono alcunesovrapposizioni,si possono analizzare
Selezione delle metafasi
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by GP&NA
Selezione delle metafasi
Buona Si possono contare, e anchese ci sono alcunesovrapposizioni,la morfologia deicromosomi e’buona
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1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL NUMERO CROMOSOMICO
2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA’
3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE
by GP&NA
Come si fa il cariotipo?
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10
1611
9
46
by GP&NA
Fare il cariotipo
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CARIOTIPO IN QM (indicare il bandeggio)
by GP&NA
Cariotipo ordinato
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Diagramma
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46,XX - cariotipo normale Femminile
46,XY - cariotipo normale Maschile
Questo modo di scrivere ci da’ due informazioni:- numero totale dei cromosomi (46)- sesso dell’organismo
47,XY,+21Maschio con 47 cromosomi (invece di 46) ed un cromosoma 21 in piu’ (sindrome di Down)
46,XX,del(14)(q23) del=delezione
46,XY,dup(14)(q22q25) dup= duplicazione
46,XX,r(7)(p22q36) r=ring (cromosoma ad anello)
Terminologia
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doppia elicadi DNA
A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A T
osservazionedel vetrino
A T C G G T A T C C T A
T A GG C A T A G G A T
denaturazione
cromosomasul vetrino
sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo
ibridazione della sonda suicromosomi denaturati sul vetrino
ATC G G
TAT C C T A
A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A TTT A GG C A T A G G A
FISH
A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A T
A T C G G T A T C C T A
T A GG C A T A G G A T
denaturazione
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Principio della fluorescenza
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by GP&NA
filtro di emissione
specchio dicroico
filtro
di e
ccitazio
ne
obiettivo/condensatore
fotografiaCCD camera
Lampada a vaporidi mercurio
Elaborazione alcomputer
FISH : microscopio a fluorescenza
Osservazioneal microscopio
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Cromosomi 1. denaturati2. colorati con DAPI
by GP&NA
FISH: metafase in DAPI
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Sonde puntiformifluorescenti
FISH: segnali
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Sovrapposizione dell’immagine della sonda sull’immagine del DAPI
FISH: merge
![Page 33: Citogenetica 2](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081419/56814f5a550346895dbd0a6d/html5/thumbnails/33.jpg)
SONDE PER FISHSONDE PER FISH
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DAPIDAPI
SONDASONDA
MERGEMERGE
WCWCPPWCWCPP
![Page 35: Citogenetica 2](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081419/56814f5a550346895dbd0a6d/html5/thumbnails/35.jpg)
PCPCPPPCPCPP
DAPIDAPI
SONDASONDA
MERGEMERGE
![Page 36: Citogenetica 2](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081419/56814f5a550346895dbd0a6d/html5/thumbnails/36.jpg)
BAC chr1BAC chr1 BAC chrXBAC chrX
SONDE PUNTIFORMISONDE PUNTIFORMISONDE PUNTIFORMISONDE PUNTIFORMI
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COIBRIDAZIONE DI 2 SONDECOIBRIDAZIONE DI 2 SONDE
PUNTIFORMI PUNTIFORMI
COIBRIDAZIONE DI 3 SONDECOIBRIDAZIONE DI 3 SONDE
PUNTIFORMIPUNTIFORMI
![Page 38: Citogenetica 2](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081419/56814f5a550346895dbd0a6d/html5/thumbnails/38.jpg)
COIBRIDAZIONE DI 2 SONDECOIBRIDAZIONE DI 2 SONDE
PUNTIFORMI CON WPCPUNTIFORMI CON WPC