citrus leprosis virus

Detección de Citrus Leprosis Virus tipo nuclear (CiLV-N) mediante RT-

PCR en plantas de cítricos. Alanís-Martínez, E. I.1, Rojas-Martínez, R. I.2, Otero-Colina, G.2,

Robles-García, P. L.3,1ENECUSAV-SENASICA. 2Instituto de Fitosanidad, Colegio de Postgraduados,3 Dirección General de

Sanidad Vegetal, SENASICA. [email protected]

Detección de Citrus Leprosis Virus tipo nuclear (CiLV-N) mediante RT-PCR en plantas de cítricos. Alanís-Martínez, E. I., Rojas-Martínez, R. I., Otero-Colina, G., Robles-García, P.

XV Congreso Internacional y XL Congreso Nacional de la Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C. (SMF)

ANTECEDENTES

•La leprosis de los cítricos es una enfermedad endémica de varios países de Sudamérica que se ha diseminado considerablemente hacia el norte (Bastianel et al., 2010).

•Es considerada una de las enfermedades más destructivas que afectan a los cítricos en América (Rodrigues, 2003 ).

Tomado de “SISTEMA NACIONAL DE VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA FITOSANITARIA (SINAVEF) 2012. FICHA TECNICA LEPORSIS DE LOS CITRICOS C. DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL.CNRF, MEXICO D.F. 27p”



ANTECEDENTESEstá asociada a tres virus distintos.

Citrus Leprosis Virus tipo Citoplásmico (CiLV-C1 y CiLV-C2)

A Novel Virus of the Genus Cilevirus Causing Symptoms Similar to Citrus LeprosisAvijit Roy, Nandlal Choudhary, Leon M. Guillermo, Jonathan Shao, Ananthakrishnan Govindarajulu, Diann Achor, G. Wei, D. D. Picton, L. Levy, M. K. Nakhla, John S. Hartung, and R. H. BrlanskyPhytopathology 2013 103:5, 488-500

Citrus Leprosis Virus tipo nuclear (CiLV-N) o Transmitidos por ácaros del género Brevipalpus (Acari:

Tenuipalpidae).

Sitios donde se acumulan las partículas virales en las células infectadas: Citoplasma (C) Núcleo (N) (Rodrigues et al., 2003).



Tomado de Bastianel M.; Freitas-Astúa J.; Kitajima E.W.; Machado M. A. The citrus leprosis pathosystem. Summa Phytopathologica, v.32, n.3, p.211-220, 2006.

•Ambos virus ocasionan lesiones locales redondas a elípticas con un punto central de color marrón oscuro, rodeado por un halo clorótico en frutas, hojas y ramitas.

Citoplásmico

Nuclear



Síntomas típicos de leprosis en plantas de naranja de Tabasco



ANTECEDENTESConsiderados miembros tentativos de la familia Rhabdoviridae (Kitajima et al., 1972).

CiLV-C: Evolutivamente relacionados con los Tobamovirus [miembro provisional de una nueva familia de virus de plantas, (Pascon et al. 2006)].Creación del género Cilevirus (Locali-Fabris et al., 2006).

Detección de CiLV-C por RT-PCR: genes de la proteína del movimiento (MP) y de la replicasa (Rep). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Detección de CiLV-C en muestras de naranja empleando los primers MP. 1 y 18: Marcador de peso molecular 50 Pb, 2: Control Negativo.

No aplicable para la

detección CiLV-N.

CiLV-C y CiLV-NSon virus diferentes que no comparten secuencias de nucleótidos (Freitas et al.,

2005). Detección de Citrus Leprosis Virus tipo nuclear (CiLV-N) mediante RT-PCR en plantas de cítricos.

Alanís-Martínez, E. I., Rojas-Martínez, R. I., Otero-Colina, G., Robles-García, P. XV Congreso Internacional y XL Congreso Nacional de la Sociedad Mexicana de Fitopatología, A.C. (SMF)

ANTECEDENTES

CiLV-C :Ha mostrado mayor prevalencia.

CiLV-N:Fue detectado solo en una región de Panamá y en pocos lugares de São Paulo y Rio Grande, en Brasil (Saavedra de Domínguez et al., 2001; ; Chagas et al., 2006; Freitas-Astúa et al., 2004; Kitajima et al., 2004)JUSTIFICACIÓN E HIPOTESIS•En México, en 2011 se observaron síntomas característicos de leprosis en plantas de traspatio en los estados de Querétaro y Jalisco.



Lima, Toliman-Querétaro

Naranja dulce, Tabasco.



JUSTIFICACIÓN E HIPOTESIS

•Los resultados negativos del análisis por RT-PCR para la detección de CiLV-C sugirieron la presencia del tipo nuclear (CiLV-N).

•Observación de partículas virales por microscopia electrónica: Otero Colina comunicación personal ( Memorias: Plagas cuarentenarias de los cítricos, Jalisco 2012).OBJETIVO

Desarrollar una metodología utilizando RT-PCR para la detección del virus.





Naranja dulce

Toronja

Limón Persa

Naranja agria

Mandarina

Lima

Limón mexicano

Toronja

MATERIALES Y METODOSSe utilizaron plantas de diferentes especies y/o variedades de cítricos (dulces y ácidos) con síntomas característicos de leprosis colectados en cuatro localidades de Querétaro y cinco de Jalisco Naranja

AgriaNaranja Dulce

Limón Persa

Toronja



Mandarina

Lima

Naranjo Agrio

Limón Mexicano

Naranja NavelMATERIALES Y METODOS



MÉTODOS•Extracción de RNA de lesiones en hoja, tallo y fruto, Kit FastPure RNA (TAK 9190)

•Síntesis de cDNa con Oligo dT (Invitrogen).

•PCRPCR con iniciadores degenerados (LPROT1/ LPROT5 y LPROT1/LPROT3 )

Dirigidos a regiones conservadas del gen L polimerasa de Rhabdovirus . Amplifican un fragmento de 693 y 240 nucleótidosCondiciones de amplificación reportadas por Posthuma et al. (2002).

Amplificaciones obtenidas con los primers LPROT1-LPROT5 de muestras de Naranja Dulce, Mandarina, Naranja Agria y Naranja Navel.

700 PB700 PB

100 pb ND2H ND2C MaC NAH M aH NNH ND2H ND2C MaC NAH MaH NNH 1KB



MÉTODOSSecuenciación. •Los productos de PCR se secuenciaron a través de la empresa Macrogen .

•Las secuencias obtenidas mostraron similitud el virus de la mancha de orquídea (Orchid Fleck Virus, OFV) (GenBank)

Localized chlorosis or ringspot on leaves of different orchid types: a and b caused by orchid fleck virus (OFV), respectively, on Miltonia sp. and Cattleya sp. c and d in Jumellea sp. and Coelogyne sp. Tomado de Kubo et al., 2009.



MÉTODOS•Las secuencias obtenidas del fragmento de 693 nucleótidos se alinearon con el programa Mega5 incluyendo las secuencias del Orchid Fleck Virus (OFV).

•Con la herramienta Primerquest de IDT se diseñó un par de oligos dirigidos a sitios polimórficos de la región conservada del gen L polimerasa.



MÉTODOS•Los nuevos primers diseñados (LEPF-LEPR) amplifican un fragmento de 383 pb.

•Se evaluaron nuevamente con las diferentes muestras.

Productos de PCR obtenidos con los primers MP a partir de cDNA sintetizado con oligodT. J1 a J8 corresponden a muestras de naranja agria (hoja, tallo) y limón mexicano procedentes de Jalisco.



100pb (-) J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 100pb

PCR con los primers OFV a partir de cDNA sintetizado con oligodT. Muestras de naranja agria (hoja, tallo) y limón mexicano (tallo) procedentes de Jalisco.

MÉTODOS•Considerando que las secuencias obtenidas con los iniciadores LPROT se alinearon con secuencias del virus de la mancha de orquídea (Orchid Fleck Virus, OFV), el cDNA también se sometió a PCR utilizando los iniciadores reportados por Kubo et al., (2009).

•Este par de iniciadores amplifica un fragmento de 326 bp.



RESULTADOS Y CONCLUSIONES• A partir de secuencias obtenidas de la región

conservada del gen L Polimerasa, se diseñó un par de oligos denominados LEPF-LEPR.

• Este set de oligos mostró resultados positivos para 27 de 32 muestras procedentes de Querétaro y en las 27 muestras de Jalisco.

1 al 16 A. Muestras de procedentes de Jalisco. Lima Chichona Hoja: 1, 1A, Lima Chichona2 Hoja: 2, , Lima Chichona2 Tallo: 3, Mandarina Hoja: 4, mandarina Tallo: 5, Toronja Hoja: 6, Tallo: 7, Toronja2 Hoja: 8, Tallo: 9, Naranja Agria 1 Hoja: 10, Tallo: 11, Naranja Agria2 Hoja: 12, Tallo: 13, Naranja Agria3 Hoja: 14, Tallo: 15, Naranja Agria4 Hoja: 16, 16A. 17 y 18 muestras procedentes de Veracruz: Naranja Dulce Hoja: 17, Tallo: 18,.



RESULTADOS Y CONCLUSIONES

• La leprosis de los cítricos es una enfermedad causada por virus diferentes.

• Se ha confirmado la presencia de Citrus Leprosis Virus-C en muestras de naranja duce procedentes de Tabasco, Veracruz y Chiapas mediante RT-PCR (secuencia del fragmento obtenido).

• Detección de un Rhabdovirus con alta similitud con Orchid Fleck Virus en muestras con síntomas característicos de leprosis en diferentes especies de cítricos del estado de Querétaro y Jalisco.



PROXIMOS PASOS…DETECTAR AL VIRUS EN VECTOR



AGRADECIMIENTOS

Ing. Juan Bautista Castillo, Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Querétaro Tec. Edgardo Rubio Maldonado, Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Querétaro Ing. Flavio Gutiérrez Casas , Comité Estatal de Sanidad Vegetal de JaliscoBiol. Eufrosina Cora Valencia, ENECUSAV.

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