clase 1 - enzimología clínica
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Enzimología clínica
Química Clínica II
-2013-
Enzimología clínica
Aplicación del conocimiento de
las enzimas al diagnóstico,
tratamiento y pronóstico de una
enfermedad.
Enzimas
• Moléculas de naturaleza
proteica que catalizan
reacciones químicas,
energéticamente favorables.
• Poseen similar composición
y estructura que las demás
proteínas.
• Son afectadas por los
mismos factores físicos y
químicos.
Generalidades de las enzimas
•Poseen propiedades catalíticas •Aumentan la velocidad de reacciones químicas in vivo e in vitro. •Se encuentran en membrana, núcleo, citoplasma y organelos subcelulares (mitocondrias, lisosomas, núcleo, etc.)
Poder catalítico de las enzimas
Definiciones •Apoenzima: enzima inactiva por falta de componente no proteico.
•Holoenzima: complejo formado por una enzima más un componente no proteico asociado.
•Cofactores: sustancias no proteicas asociadas, necesarias para la actividad catalítica de una enzima (Mg+, Cl-, Zn2+, K+)
•Coenzima: moléculas orgánicas asociadas necesarias para la actividad catalítica de una enzima
Cosustratos: NADP+, fosfato de piridoxal
Grupos prostéticos: grupos fuertemente unidos, considerados parte estructural de la enzima.
...Definiciones
•Metaloenzimas: enzimas con iones metálicos fuertemente unidos. •Sitio activo: lugar en la enzima donde puede llevarse a cabo la catálisis de un sustrato específico. •Sitio alostérico: cavidad distinta al sitio activo que puede enlazar moléculas reguladoras (cofactores).
Propiedades de las enzimas
• Son efectivas en pequeñas
concentraciones
• No son modificadas por la
reacción que catalizan
• Afectan la velocidad de la
reacción para alcanzar el
equilibrio.
• No todas las enzimas son
exclusivas de un solo tejido.
• La alteración de la
concentración sérica de
éstas, orienta sobre los
tejidos afectados
• Cada enzima posee
isoenzimas características.
Desnaturalización
•Uniones de metales pesados al sitio activo •Cambios de temperatura extremos •Adición de ácidos o bases fuertes •Cambios de pH •Cambios de presión •Rayos ultravioleta •Cambios en la concentración de sales •Detergentes •Solventes orgánicos
Clasificación y nomenclatura
de las enzimas
• EC (Enzime commission)
• IUB (International Union of Biochemestry)
• Sistema de nomenclatura (1961)
– Sustrato en el que la enzima actúa
– Reacción catalizada
– Coenzima que participa en la reacción
• Acepta nombres triviales (más prácticos)
Codificación numérica EC
EC 1.1.1.27 (LACTATO DESHIDROGENASA)
• 4 números separados por puntos
– 1. Clase de enzima (oxidorreductasa)
– 1. Grupo sobre el que actúa (-CH)
– 1. Coenzima o aceptor (NAD+ o NADP+)
– 27. Número de orden de la enzima
Clases de enzimas
1. Oxidorreductasas
2. Transferasas
3. Hidrolasas
4. Liasas
5. Isomerasas
6. Sintetasas
Oxidorreductasas
• Transferencia de electrones/redox
A-red + B-ox ↔ A-ox + B-red
• Sus nombres comunes incluyen las
palabras:
• Deshidrogenasas, reductasas, oxidasas,
peroxidasas
Transferasas
• Transferencia de un grupo distinto al
hidrógeno (amino, carboxilo, glucosilo,
metilo o fosforilo) de un sustrato a otro.
• A-X + B ↔ A + B-X
• Ejemplo:
• ALAT, quinasas, transcarboxilasas
Hidrolasas
• Ruptura de enlaces C-O, C-N con la
adición de moléculas de agua
A-B + H2O ↔ A-OH + B-H
• Ejemplo:
• FAL, amilasa, ureasa, pepsina, quimotripsina,
peptidasas y esterasas
Poco uso clínico
Liasas
• Hidrolizan uniones C-C, C-O y C-N por eliminación, con formación de un doble enlace.
• Adición de grupo al doble enlace (sintasa)
A + B ↔ AB (sintasa)
AB ↔ A + B (liasa)
Isomerasas
•Cambios
estructurales o
geométricos en
una molécula.
ABC ↔ CAB
Ligasas (sintetasas)
Dos moléculas son unidas, con la hidrólisis
del pirofosfato del ATP
A + B + ATP ↔ AB + ADP + Pi
Poco uso clínico
Mecanismo catalítico de las enzimas
• Concentración del sustrato
– Constante de Michaelis-Menten (1913) Km
Factores que afectan las
reacciones enzimáticas
Gráfica de Lineweaver-Burk
• Concentración de la enzima
– Siempre y cuando la concentración de
sustrato no sea limitante.
– La velocidad de reacción será proporcional a
la concentración de la enzima.
• pH
– Depende del origen fisiológico de la enzima.
– Cualquier cambio de pH puede afectar la
actividad biológica de la enzima por cambios
de estado iónico de los aa en el sitio activo.
Factores que afectan las
reacciones enzimáticas
• Temperatura
– A mayor temperatura mayor velocidad de
reacción (hasta la desnaturalización de la
enzima).
– Por cada 10º C la velocidad de reacción
aumenta un 100%
– La temperatura de reacción óptima depende
del medio fisiológico de cada enzima.
– El proceso de congelación inactiva
reversiblemente a las enzimas.
– 25, 30 y 37º C.
Factores que afectan las
reacciones enzimáticas
• Cofactores
– Entidades no proteicas que deben enlazarse
a las enzimas para que éstas se activen.
– Activadores: iones metálicos (calcio, hierro,
magnesio, manganeso, zinc y potasio); iones
no metálicos (cloro y bromo).
– Si se encuentran en exceso pueden inhibir la
reacción.
– Coenzimas: vitaminas y fosfatos de
nucleótidos.
Factores que afectan las
reacciones enzimáticas
• Inhibidores
– Competitivos: cuando la sustancia se une
físicamente al sitio activo de la enzima y
compite con el sustrato por éste sitio activo.
– No competitivos: cuando la sustancia se une
a la enzima en un lugar distinto al sitio activo.
– Inhibición acompetitiva: la sustancia se une
al complejo enzima-sustrato. A mayor
cantidad de complejos, mayor inhibición.
Factores que afectan las
reacciones enzimáticas
Inhibición
competitiva
Inhibición no
competitiva
Inhibición
acompetitiva
¿Qué se mide en el laboratorio respecto a las enzimas?
A. La cantidad de enzima presente en el suero.
B. La velocidad a la que se lleva a cabo una reacción catalizada por la enzima.
C. La cantidad final de producto formado por la enzima.
RESPUESTA
B. La velocidad a la que se lleva a cabo una reacción catalizada por la enzima.
"...De los varios miles de enzimas presentes en
plasma, la medición de la concentración de una
sola enzima, aún cuando esté presente en un
valor muy elevado, es menor que el límite
detección para la mayoría de los ensayos
químicos de proteínas. El parámetro más fácil de
medir y que está biológicamente relacionado a
muchas condiciones clínicas es la cantidad de
actividad catalítica de la enzima y cómo cambia
con el tiempo." Química Clínica de Kaplan.
Actividad enzimática
•Cantidad de sustrato que es convertida a
producto por unidad de tiempo bajo
condiciones definidas.
•Es un parámetro más fácil de medir que
la concentración de una enzima y está
directamente relacionado con la misma.
•Biológicamente está relacionada a
muchas condiciones clínicas.
Principio del análisis
La concentración de enzimas en suero es muy
baja, sin embargo, dada su eleva capacidad
catalítica, es posible determinar su actividad y
suponer que ésta es proporcional a su
concentración.
El estudio de las enzimas en el laboratorio se basa
en la demostración “in vitro” de la actividad
catalítica.
Medición de la
actividad enzimática
•Se puede medir mediante:
•Cuantificación del incremento en la
concentración de producto.
•Disminución en la concentración de sustrato.
•Reducción en la concentración de coenzima
•Aumento en la concentración de coenzima
alterada.
Medición de la
actividad enzimática
•No debe haber inhibidores
•Controlar variables que afectan la
velocidad de reacción
•pH constante por medio de amortiguadores
•Temperatura constante durante todo el
ensayo dentro del rango de 0.1º C. (25, 30 ó
37º C).
•Tiempos de incubación exactos.
Medición de la
actividad enzimática
•Se utilizan regularmente 2 métodos:
•Tiempo fijo: se incuba la reacción por un
tiempo determinado, luego se detiene
mediante la adición de un ácido débil y se
cuantifica el producto, coenzima, etc.
•Cinético: se hacen mediciones múltiples
(normalmente cambios de absorbancia) a
intervalos de tiempo específicos (30 a 60
segs) o en forma continua.
Medición de la
actividad enzimática
•La EC definió las Unidades Internacionales
para estandarizar un sistema de medición de
enzimas.
•UI = cantidad de enzima que cataliza la
reacción de un micromol de sustrato por
minuto, en condiciones específicas de
temperatura, pH, sustratos y activadores.
•Regularmente se expresa UI/L aunque el
Sistema Internacional utiliza el katal (mol/s).
Fases de la actividad enzimática
• Fase de retardo (fase lag)
– Ocurre justo después de mezclar los reactivos con la
muestra.
– Ocurre el encuentro y acoplamiento de sustrato y
enzima.
– Su duración variable (aunque sonpocos segundos).
• Fase lineal
– La formación de producto es constante en esta fase.
– En esta fase se realizan los ensayos.
Fase de agotamiento de sustrato
– La velocidad de reacción disminuye hasta anularse
.
Fases de la actividad enzimática
Actividad enzimática
para el diagnóstico
• La enzima debe estar presente en fluidos
corporales.
• Debe ser fácil de analizar (automatización).
• Deben existir diferencias significativas entre las
concentraciones en estado patológico y no
patológico
• Debe mantenerse estable por un tiempo
prudencial.
Enzimas como marcadores
• Las enzimas del plasma se pueden
clasificar en 2 grupos:
• Enzimas específicas del plasma
• Enzimas no específicas del plasma
• Enzimas de secreción
• Enzimas del metabolismos intermediario
Enzimas como marcadores
• Enzimas específicas del plasma:
• Tienen una función específica en el plasma.
• Están presentes en concentraciones más altas
en el plasma que en los demás tejidos.
• Entre estas se encuentran las enzimas de la
coagulación (pseudocolinesterasa, ferroxidasa
y fosfolipasa).
• Se sintetizan en el hígado y sirven como
marcadores de daño o disfunción hepática
cuando su concentración disminuye.
Enzimas como marcadores
• Enzimas no específicas del plasma:
• No tienen una función específica en el plasma.
• Están presentes en concentraciones más
bajas que en los demás tejidos.
• Regularmente no están activas porque hay
una deficiencia de activadores y cofactores en
el plasma.
Enzimas como marcadores
• Enzimas no específicas del plasma:
• Enzimas de secreción:
• Enzimas secretadas desde las glándulas exocrinas
(páncreas y próstata)
• Algunas provienen de la mucosa gástrica.
• Son de utilidad clínica cuando sus valores se
encuentran fuera del rango de referencia.
• Se elevan en sangre por sobreproducción o por
excreción bloqueada.
• Disminuyen por necrosis del tejido que las produce.
Enzimas como marcadores
• Enzimas no específicas del plasma:
• Enzimas del metabolismo intermediario
• Circulan en concentraciones bajas comparadas
con las concentraciones presentes en los tejidos.
• Regularmente se observan elevaciones cuando
existe daño inflamatorio o necrótico en los tejidos
que las producen.
• Su disminución no tiene significancia clínica.
• Algunos ejemplos de estas enzimas son: CK, LDH,
ALAT y ASAT.
Factores pre-analíticos que afectan
la medición de actividad Tiempo de muestreo adecuado
Las enzimas no poseen ciclos circadianos.
Su concentración varía según el inicio de la condición
clínica (aguda y crónica).
Factores pre-analíticos que
afectan la medición de actividad
Condiciones de almacenamiento
Las muestras deben almacenarse a bajas
temperaturas porque las enzimas tienden a aumentar
su actividad conforme el tiempo
Sexo
Raza
Edad
Ejercicio físico
Factores analíticos que afectan
la medición de actividad
• Evitar ciclos de congelamiento-
descongelamiento.
• Evitar muestras con hemólisis y lipemia.
• Separar sueros rápidamente.
• Evitar estasis venosa durante extracción
sanguínea.
• Transportar a bajas temperaturas.
ISOENZIMAS O ISOZIMAS
• Múltiples formas de una enzima que
catalizan la misma reacción bioquímica
• Diferencias:
– Estructura polipeptídica
– Distinta afinidad por sustratos y cofactores
• Similitudes:
– Tamaño molecular
ISOENZIMAS
Aclaración importante:
• Izoenzimas: se refiere a productos
genéticamente distintos.
• Isoformas: se refiere a las modificaciones
postraduccionales de una misma enzima.
• Propiedades enzimáticas
• Capacidad de ser inhibidas por agentes específicos
• Constantes Km
• Reactividad con diferentes sustratos.
• Propiedades físicas
• Estabilidad térmica y carga.
• Propiedades bioquímicas
• Composición de aminoácidos y reactividad inmunológica
Diferencias entre isoenzimas
• Dímero: proteína compuesta de dos
subunidades.
• Heteropolímero: compuesto polimérico con
más de un tipo de subunidades.
• Homopolímero: compuesto polimérico en el
cual todas las subunidades son idénticas.
Definiciones
Diferentes formas de isozimas
• La enzima puede estar compuesta de 2
subunidades distintas A y B (dímero).
–AA (Homodímero)
–BB (Homodímero B)
–AB (Heterodímero AB)
– Las 3 formas son anteriores son
isoenzimas.
– Este sucede en el caso de CK, la cual
tiene 3 isoenzimas MM, MB, BB
Funciones distintas que
dependen de:
• Factores microambientales
de los organelos
intracelulares en las que se
encuentren.
• Factores macroambientales
por la demanda metabólica
y energética de los tejidos
que las produzcan.
Principales
isoenzimas:
• Creatinkinasa
• Lactato
deshidrogenasa
• Fosfatasa alcalina
• Fosfatasa ácida
Finalidad de las isoenzimas
• Dímero formado de subunidades M o B
• Cataliza en forma reversible la siguiente reacción:
Creatina + ATP ↔ fosfato de creatina + ADP
• Principalmente citoplasmática
• No atraviesa la barrera hematoencefálica (85,000 Da)
– CK-MM: tejido muscular adulto
– CK-BB: cerebro
– CK-MB: miocardio
Creatinkinasa
Creatinkinasa
• CK total:
◦ [ ] en casos de: infarto, traumatismos,
inyecciones IM, intervenciones quirúrgicas,
hipotiroidismo, embolia, diabetes, entre otras.
• CK-MB:
◦ [ ] compatible con daño cardíaco. Inicia el
aumento 3-6 h 12-24 recuperación 24-72
CK-MB
[ ] :
– Necrosis del músculo cardiaco (infarto)
– Falla congestiva cardíaca
– Intervenciones cardíacas
– Distrofia muscular (Duchene)
– Polimiositis
↓ [ ] :
– Sexo: F < M
– Pacientes hospitalizados
• Electroforesis (método de referencia)
• Cromatografía de intercambio iónico
• Inmunoensayos
– Radioinmunoensayo (RIA)
– Inmunoinhibición
Métodos para cuantificar/detectar
isoenzimas de CK
Según el método:
– Unidades por litro (UI/L)
– Kilounidades por litro (KU/L)
– Nanogramos por mililitro (ng/mL)
– Microgramos por mililitro (μg/mL)
– % diferencial entre CK/CK-MB
– Índice de CK-MB (mayor utilidad)
Dimensionales
• Cataliza la reducción de piruvato a lactato
• Tetrámero de subunidades M y H
• 5 isoenzimas
• LD1 y LD2: corazón y eritrocitos
• LD3: corteza renal, pulmón, linfocitos,
bazo y páncreas
• LD4 y LD5: hígado y músculo esquelético.
Lactato deshidrogenasa
Distribución tisular de isoenzimas de LDH
Lactato deshidrogenasa
Su concentración aumenta en casos de:
◦ Lesión miocárdica
◦ Miopatías
◦ Traumatismos musculares
◦ Embolia pulmonar
◦ Hemólisis
◦ Enfermedades hepáticas y renales
◦ Leucemia
◦ Shock
Se expresa en:
– Mucosa intestinal
– Hígado
– Hueso
– Riñón
– Placenta
Posee 3 isoenzimas
ALP-I, ALP-L y ALP-P
• En RN y niños, la
mayor parte de la
FAL serológica
proviene del hueso
• En el adulto: hueso,
hígado, riñón,
intestino
Fosfatasa alcalina
• Causas fisiológicas
de aumento:
– Crecimiento
– Deficiencia de
vitamina D
– Embarazo (2 meses
postparto)
– Post menopausia
• Causas patológicas
de aumento:
– Ictericia obstructiva
– Hiperparatiroidismo
– Osteomalacia
– Raquitismo
– Metástasis óseas
– Fracturas
Fosfatasa alcalina
• Centrifugar la mx antes de 30 minutos
• Procesar el mismo día - 30 %
• Su actividad disminuye con el uso de
anticoagulantes (muestras de plasma).
• Fármacos:
– actividad: alopurinol, anticonvulsivantes,
antineoplásicos, isoniazida, fenobarbital,
anticonceptivos orales,
– ⇊: calcitrol, nitrofurantoína, oxalatos.
Fosfatasa alcalina
Fosfatasa no específica que presenta
máxima actividad alrededor de pH 5.0
Fosfatasa ácida
• Se encuentra en los lisosomas de casi todas las células, pero principalmente en:
Hígado
Bazo
Plaquetas, eritrocitos, leucocitos
Glándula prostática (FAP)
Testículo
Vejiga
Páncreas
Fosfatasa ácida
Se observa aumento en su [ ] en:
– Procesos malignos de próstata
– CA con metástasis ósea (pulmón, páncreas, células
renales, hueso, mama, vejiga)
– HPB (Hipertrofia prostática benigna)
– Anemias: hemolítica-megaloblástica
– Mononucleosis
– Osteoporosis
– Prostatitis
Fosfatasa ácida
Fosfatasa ácida
• Es muy inestable en suero separado y a
temperatura ambiente.
• Se debe congelar si no se va a procesar
inmediatamente.
• Suele elevarse 48 hrs post tacto rectal.
• Se utiliza con fines forenses en los casos de
violación como evidencia legal del asalto
sexual.