clase adn dra gotti
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Analisis de ADN. Aplicacion de la Biologia Molecular en la Justicia
Civil y CriminalDra Adriana Silvia Gotti
Bioquimica.Directora del Centro de Estudios Biomoleculares y Genetica ForenseCEBYG.Posadas . MisionesLAC _Corrientes
El Paradigma
La prueba de ADN• A partir del descubrimiento de zonas variables en el ADN , y la posibilidad de emplearlas para identificación humana a
mediados de la década del 80 , la certeza en los estudios de paternidad y de
identificación criminal se incremento a más del 99,99% .
Reseña Histórica
• Abril de 1985 _se resuelve el primer caso judicial mediante el estudio de Huellas Digitales genéticas o Fingerprinting .Gran Bretaña.
• Junio de 1985 una corte civil Inglesa acepta la evidencia de ADN en un caso de Paternidad discutida.
• Octubre de 1986 se produce el debut de esta prueba en la identificación criminal comprobándose la inocencia del principal sospechoso en un caso de violación y muerte.
• 1987 _Las pruebas de ADN son admitidas como evidencias en las Cortes criminales de Gran Bretaña y Estados Unidos.
• 1988 se desarrollan amplificaciones de ADN por PCR.(polymerase Chain Reaction.(Biología Molecular)
• 1989 _a raiz de dudosos resultados en un caso criminal realizados por Lifecodes Corp se discute en EEUU la validez Científica de la prueba de ADN.
• 1990 The U. S. Congress Office of Technoly Assessment concluye que la identificación de individuos basada en la prueba de ADN es Científicamente válida, siempre que se disponga de la certeza metodológica de su realización
Aplicación de los Estudios de ADN en la Justicia Civil y penal.
Dra Adriana Silvia Gotti
Bioquimica
Especialista en genetica Forense
Núcleo
Citoplasma
MembranaPlasmática
La célula
El núcleo
Contiene toda la información genética y regula su expresión
Composición y Estructura del ADN
• Desoxirribosa (azúcar de tipo pentosa)
• Un grupo Fosfato
• Cuatro tipo de Bases Nitrogenadas (Citosina,Timina,Adenina y Guanina)
NUCLEÓTIDO
• Cada Subunidad de ADN formada por una Desoxirribosa, un grupo fosfato y una base nitrogenada se denomina NUCLEÓTIDO
La doble Hélicede ADN
El “ADN” como almacén de información
Los cromosomas
Pares de bases
DNA
cromosoma
Celula
Nucleo
Histonas
GENES
• Unidad Básica de la HERENCIA
• Están contenidos en los CROMOSOMAS
• Formados por ADN
La secuencia del ADN está estructurada en codones de 3 nucleótidos. Se pueden distinguir:
•Genes o secuencias codificantes, que contienen la infomación para sintetizar proteínas.
•Secuencias no codificantes, que incluyen secuencias reguladoras de la expresión (promotores, intrones, …).
Genoma es el conjunto de todos los genes de un organismo.
Los genes, unidades de información
PROYECTO DEL GENOMA HUMANO
• “Manual de instrucciones de los seres humanos”
• 3 mil millones de bases nitrogenadas
Implicaciones del diagnóstico genético
• Identificar portadores de enfermedades hereditarias y tumores malignos.
• Aplicaciones en la medicina forense
• Investigaciones sobre paternidad
Identificación visual
IDENTIFICACION HUMANAIndividuos vivos Cadáveres
• Exámenes generales: datos fisonómicos, sexo, peso, talla, cabello, color de ojos y piel, marcas.
• Registro de voz.
• Trazado caligráfico.
• Huellas dactilares.
• Huellas genéticas.
• Métodos bioquímicos
• Diagnóstico de especie.
• Datación de los restos.
• Exámenes generales.
• Elementos extrínsecos.
• Caracteres patológicos, naturales o traumáticos.
• Identidad radiográfica y dental.
• Métodos bioquímicos.
METODOS BIOQUIMICOSEvalúan fenotipo Evalúan genotipo: ADN
• Grupos sanguíneos: ABO, RH, MNS, Duffy, Lewis.
• Proteínas plasmáticas: haptoglobina, 1-antitripsina, transferrina.
• Enzimas eritrocitarias: fosfatasa ácida eritrocitaria, adenilato kinasa, PGM, ADA.
• HLA: Antígenos de histocompatibilidad.
• Minisatélites: sondeos de locus múltiple y locus único.
• Microsatélites: métodos de PCR.
• Variantes de secuencia: HLA-DQPolymarker, genoma mitocondrial.
ADN
• Existen regiones codificantes, que contienen la información para la síntesis proteica, y no codificantes.
• Dentro de las no codificantes existen regiones polimórficas.
• Existen alrededor de 3 x 106 sitios polimóficos en nuestro genoma.
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
Nuclear- 2 copias por célula- Heredado 50 % de cada progenitor - Único para cada individuo
Tipos de ADN en genética forense
Mitocondrial- ~1000 copias/célula- Herencia materna - No es único para cada individuo
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
Tipos de ADN según su TRANSMICIÓN
1. Nuclear: 50% padre + 50% madre- altísimo poder discriminación - recombinación
2. Mitocondrial: 100% madre poder discriminación limitado
3. Cromosoma “Y”: 100% padre poder discriminación limitado
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
POLIMORFISMOS
De secuencia:
Individuo 1: ……GTACGGTACGT……Individuo 2: ……GTACCGTACGT……
Individuo 1: ……GTACGGTACGT……Individuo 2: ……GTACGTACGT……
De longitud:
Individuo 1: ……(AATG) (AATG) (AATG)…… 3 repeticiones
Individuo 2: ……(AATG) (AATG)…… 2 repeticiones
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
ADN nuclear
1. Unidades: 3000 millones x 2 23 pares de cromosomas
2. Herencia mixta: padre y madre
3. Dos copias por célula (núcleo)
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
Longitud de las unidades de repetición
STRs
Dinucleótidos: CA
Trinucleótidos: AAT
Tetranucleótidos: AGAT
Pentanucleótidos: AATGT
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
Marcadores forenses
Altamente polimórficasElevado grado de heterocigosidad genética
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
Vía de Herencia del ADN del cromosoma “Y” (representa el 2% del genoma humano)
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS STRs DEL CROMOSOMA “Y”
- Investigación Biológica de la paternidad
- Criminalística
- Estudios de Identificación Genética
- Estudios sobre el origen y evolución de las poblaciones
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
ADN mitocondrial
1. Unidades: 16.569 pb
2. Herencia materna
3. de 100 a 10.000 copias por célula 10 a 100 mitocondrias por célula 10 a 100 copias por mitocondria
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
Vía de herencia del ADN mt
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
ADNmt
- Técnicas de PCR y secuenciación automática
- Altamente polimórfico
- Alto número de copias
- Herencia estrictamente materna
- Se conoce con exactitud la secuencia de todos sus nucleótidos
- Tasa de evolución entre 5 y 10 veces mayor que un gen nuclear
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
ORGANIZACIÓN GENÓMICA
Sólo el 10% es ADN no codificante
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
MUTACIONES
ADNmt acumula un numero de mutaciones superior al ADN genómico
Normal
Sustitución
Deleción
Inserción
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
Sustituciones
Transiciones Py-Py: C>T T>C
Pu-Pu: A>G G>A
Transversiones C>A T>G G>C A>T A>C G>T C>G T>A
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
HETEROPLASMIA: coexistencia, debida a mutaciones, de dos o más poblaciones de ADNmt en un individuo
HETEROPLASMIA DE SECUENCIA
heteroplasmia intercelular
heteroplasmia intramitocondrial
heteroplasmia intracelular
HOMOPLASMIA: misma secuencia en todas las moléculas de ADNmt
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
HETEROPLASMIA DE LONGITUD
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIAPREPARACIÓN DE LA MUESTRA
EXTRACCIÓN DEL ADN
CUANTIFICACIÓN
AMPLIFICACIÓN POR PCR
PURIFICACIÓN PCR
SECUENCIACIÓN
PURIFICACIÓN SECUENCIACIÓN
ANÁLISIS DE DATOS
ELECTROFORESIS
DRA. GOTTI ADRIANA SILVIA
USO DEL ADNmt EN GENÉTICA FORENSE
1. Identificación de restos antiguos
2. Identificación de restos cadavéricos (desastres en masa)
3. Identificación de vestigios mínimos - pelos sin bulbo - manchas biológicas mínimas y parcialmente degradadas
4. Estudios de relaciones familiares vía materna
Polimorfismos de Longitud
Alelo 1
Alelo 2
Sitio de Restricción Sitio de Restricción
Unidad de Repetición
Tipos de Polimorfismos de Longitud.
VNTR
Minisatélites
Locus Múltiple
Locus Específico
Microsatélites Locus Específico PCR/PAGE o automatización
Southern
Southern
PCR /Agarosa
Evolución de los Sistemas de Identificación Molecular
• 1985 Minisatélites Locus Múltiple Jeffreys.• 1987 Minisatélites Locus Específico Nakamura.• 1989 HLA-Dq Higuchi.• 1991 Microsatélites (STRs) Edwards.• 1992 Secuenciación de mtDNA HVRI y II
Ginther.• 1993 STRs del Cromosoma Y Roewer.
1985 Minisatélites Locus Múltiple Jeffreys.
• Alto Poder Discriminativo.
• Patrones fenotípicos.• Baja reproducibilidad
entre laboratorios.
1987 Minisatélites de Locus Específico _NAKAMURA
• Constituyen los marcadores más eficientes en estudios en los que la calidad y cantidad de ADN no son restrictivos.
1991_Microsatélites o STRs.
• Herramienta indispensable para la investigación forense.
• Gran número de STRs disponibles.
• Alta sensibilidad.• Evaluación manual o
automatizada.
Análisis automatizado de STRs
1989 HLA-Dq Higuchi.
• Poder Discriminativo muy limitado (equivalente a un grupo sanguíneo).
• Muy sensible.• Utilidad actual escasa
o nula.
1992_Secuenciación del ADN mt.GINTHER
• Permite el rastreo de la línea materna.
• Gran sensibilidad debida al alto número de copias, reducido tamaño y estructura circular.
Análisis de Minisatélites.
• Transferencia de Southern.
• Gran capacidad discriminativa.
• Requiere integridad y alta concentración de ADN.
• Optimo para estudios de paternidad.
• Económica.
Dra .Adriana Silvia GottiCentro de Estudios Biomoleculares y
Genetica Forense. Posadas . Misiones Argentina
Amplificación de DNA in vitro:PCR (Polymerase Chain Reaction)
ObjetivosConocer:
• Los fundamentos de la técnica de amplificación de DNA por PCR
• Usos y aplicaciones de la PCR
• Ventajas y desventajas de la PCR
• Métodos de secuenciación de DNA
PCR Polymerase Chain Reaction
•Es la amplificación de DNA in vitro por medio de la polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador.
•El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA.
•Se realiza la amplificación de un segmento específico de DNA, teniendo poco material disponible.
Polimerasa Chain Reaction: Reacción en Cadena de la Polimerasa
• Fue diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1987.
• Ganó el premio Nóbel de Química en 1993 por su invento.
• Utilizo la reacción PCR para amplificación del gen de -hemoglobina humana, y el diagnóstico prenatal de anemia falsiforme.
Termociclador
La PCR se realiza en un “Thermo Cycler” Termociclador.
Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.
• 1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.
-Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a 40 segundos –el tiempo depende del tamaño del genoma-
El proceso de “PCR” incluye 3 pasos básicos que se repiten 25 veces o más:
2. Apareamiento o “anneling”:• Los cebadores “primers” previamente
diseñados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores según sea el caso.
3. Polimerización o Extensión.
Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el espacio
comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos
trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De
estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las
hebras de DNA moldee
Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos (puede variar según sea
necesario)
Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.
En la PCR hay una amplificación exponencial
Reactivos necesarios para PCR:• Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl
(pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2.• MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se
usa 25mM -Es un cofactor para la función de la polimerasa-
• dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
-La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb, necesitamos más concentración de dNTPS para el de 5500pb.
-Generalmente, se usa una concentración de 200M de cada uno.
Reactivos necesarios para PCR:• Cebadores “primers”: Son secuencias cortas de
nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a concentración de 1M-
• DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.
El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng.
• Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reacción.
ADYUVANTES DE LA PCR• Son elementos que mejoran el rendimiento y la
especificidad de la PCR.
• Se usa DMSO, glicerol o BSA.
• El adyuvante más utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 µg/µl el BSA incrementa la eficiencia de la PCR y actúa como una proteína captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa
•En un principio, la polimerasa de DNA que se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero esta es sensible a alta temperatura, por lo que había que añadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.
•Se reemplazo la enzima por la de la bacteria “Thermus aquaticus” conocida como Taq pol
Polimerasa
Análisis de la Muestra
• La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético.
• Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.
Análisis de la Muestra• La posterior visualización se puede realizar con
bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de
plata, fluorescencia, radioactividad Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800 pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas (primers inespecíficos se pegan a varios sitios)
Análisis de la Muestra
• En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas por endonucleasas
• Hibridación, Southern Blot
Se puede amplificar directamente de:
– ADN genómico
– cDNA (RT-PCR)Aplicaciones
Detección de agentes infecciosos como: hepatitis B y C, papiloma virus, HIV, entre otros Análisis de DNA de cualquier organismo vivo o muerto, análisis de fósilesMutagénesis dirigida (cambios en la información contenida a través de “primers” con mutaciones)Investigación forensePruebas de paternidad
Aplicaciones
• Ejemplo de un caso de criminalística resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida.
• Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V)
Criminalística
Utilidad del PCR
Ventajas del “PCR”
• A partir de una muestra pequeña de ADN se puede
obtener una cantidad considerable para el estudio que
se vaya a realizar.
• El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y
análisis.
• Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo
o muerto.
• Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense,
diagnósticos, análisis prenatales, etc.
Desventajas del “PCR”• Se puede reproducir solamente partes del genoma en
donde se conoce por lo menos una mínima secuencia
de 20 – 40 pb.
• Se necesitan “primers” específicos que sean
complementarios al fragmento que se desea sintetizar.
• La polimerización puede tener errores al sintetizar el
ADN
• Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del
mismo investigador o de cualquier otro)
Materiales Para PCR
• Termociclador “Thermo
cycler”
• Microcentrífuga
• Micropipetas de 2, 20 y 200 ul
• Microtubos para “PCR”,
estériles
• Puntas estériles
• Agua destilada, desionizada y
estéril
• ADN molde (ADN en estudio)
• Primer Forward y Reverse
• dNTP’s (dATP, dTTP, dCTP,
dGTP de [25 μM] c/u)
• 10X buffer para PCR
(Solución amortiguadora para
“PCR”)
• MgCl2 (25 mM)
• BSA
• Polimerasa Taq
Herencia del DNA mitocondrial
•Amplificaremos una region hipervariable. Genoma de 16571 pares de bases: Hebra pesada (H), Hebra liviana (L). Primer Directo H34, primer reverso L15829
Procedimiento para extracción del DNA genómico (previamente
realizado)• Se realizó un frotis bucal
• El contenido del hisopo “swab” se resuspende en 1000ul de NaCl 0.9%
• Centrifugar por 5 minutos a 7K
• Descarta sobrenadante
• Resuspender el precipitado “pellet” en 500ul de chelex al 10%
• Incubar a 100˚C por 20 minutos
• Centrifugar por 5 minutos a 7K
• Tomar el sobrenadante ( DNA en solución)
• Dejar la muestra a -20 grados hasta cuando se va a trabajar con ellaNota: El chelex actúa como agente desestabilizador de membranas y quelante.
Diagrama de la extracción del DNA genómico (previamente realizado)
Procedimiento para amplificar el DNA (PCR)
• Añada los siguientes reactivos en el orden indicado:
Cantidad (ul) Componente
10.3 Agua estéril (dH2O)
3.0 MgCl2 25mM
0.5 BSA 100X
1.5 2.5 Mm de dNTPs
1.0 Primer H34. 5’-3’
1.0 Primer L15829. 3’-5’
2.5 Buffer 10X
0.2 Taq pol
5.0 DNA en estudio
Mix 117.3
Mix 22.7
Total: 25 ul
• Condiciones para reacción en el
termociclador:
1 ciclo : 94°C por 2.5 minutos.
32 ciclos: 94 °C por 30 segundos
54 °C por 1 minutos
72 °C por 70 segundos
1 ciclo: 72 °C por 10 minutos
• Lleve a reaccionar en el
termociclador.
Secuenciación de DNAMétodo enzimático de terminación de cadena
(método dideoxi de Sanger)• Polimerización interrumpida de ADN• Se lleva a cado polimerización de ADN en
presencia de derivados dideoxi que detienen la polimerización en diferente momento, obteniéndose fragmentos de diferente tamaño.
• Se examinan en electroforesis, se “lee” secuencia directamente del gel
Método dideoxi de Sanger
Método dideoxi de Sanger (2)
Método dideoxi de Sanger (3)
Método secuenciación automática
Electroferograma de la secuenciación automática
Geles de secuencia
Secuencia automática Secuencia Manual
Direcciones de animaciones
• Dirección PCR
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.html
• Dirección de secuenciación
http://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03-EstructuraDelGenoma/animaciones/secuencia.swf
TOMA Y CONSERVACION DE MUESTRAS PARA ANALISIS DE
ADN.
Obtención de las Evidencias.Obtención de las Evidencias.
• Constituye el punto crítico para la resolución de una causa judicial.
• Cada Servicio de Investigación Forense deberá establecer claros protocolos para la manipulación, transporte y conservación de las evidencias.
• Cualquier manipulación inadecuada permitirá a la defensa invalidar los resultados del análisis.
Lugar del Hecho = Quirófano !
Conservación de muestras de sangre.
• Soportes adsorbentes.
• Conservación a temperatura ambiente.
• Largo tiempo de conservación.
• Permite generar un banco de muestras.
Otras evidencias
CASO: VIOLACION
• Sangre de sospechoso/ s.
• Evidencias: hisopados, prendas, pelos, uñas, etc.
• Sangre de la víctima.
Prendas
SI NO
Hisopados
IMPORTANTE: En el análisis previo de las evidencias se debe considerar la
disponibilidad de muestras para análisis de ADN.
MATERIAL CADAVERICO
Los restos humanos como evidencia para el análisis de ADN
Requisitos Para la Conservación de Evidencias.
• Material cadavérico fresco: congelado -20C.• Material cadavérico descompuesto: en mezcla de sales
(hasta 2 meses), congelado si el periodo es mayor• Material Cadavérico esqueletizado: conservar a
temperatura ambiente, en sobres limpios, luego de lavados.
Se debe evitar en todos los casos el empleo de fijadores con formol.
Cadáveres reducidos
Tiempo de muerte aproximado: 1,5 años
Cadáveres Quemados
Cadáveres Saponificados
Tiempo de muerte aprox 8 años Tiempo de muerte aprox 1,5 años
Cadáveres en los Primeros Estadíos de Descomposición
Cadáver conservado
• Conservado desde su muerte en cámara fría (8 meses).
Cadáver Momificado
• Tiempo de muerte aprox. 16 años.
• Inhumado en nicho.• Proceso de
momificación espontáneo.
Tejidos Conservados
• Ciertos tejidos se conservan debido a condiciones ambientales durante periodos prolongados.
• Material muscular con más de 10 meses entre escombros de una explosión.
Huesos quemados con más de 10 Años
Recibidos En proceso
Material de elección en casos de cuerpos muy descompuestos o reducidos
Identificación Molecular de Restos Fragmentados
En ciertos casos el análisis del ADN cadavérico puede ser superfluo
• Si la persona es reconocible.
• Si se dispone de identificación adecuada (huellas dactilares, etc.).
• Si no hay rastros de dudosa procedencia.
En otros puede ser de gran utilidad.
Interpretación de resultados
Violación
E S
Violación
E SV
E SV
Violación
EA SV EB
Violación
EA SV EB
Violación
EA SV EB
Violación
Análisis de una Violación
EvidenciaFrac. femenina
EvidenciaFrac. masculina
Víctima
Sospechoso 1
Sospechoso 2
Match Match Match
Algunos casos de identificación por
ADN
Análisis de ADN en restos humanos provenientes de
desastres en masa
1992
Toma de muestras del atentado
1993
Santo Tomé (1993).
• Análisis efectuado en 1995.
• Restos óseos y dentales quemados.
• Identificación por comparación con un grupo familiar.
Los Y-STRs dieron la primera pista.
El ADNmt permitió confirmar la matrilínea.
• La secuenciación de las HVR I y II permitió correlacionar a la madre con los supuestos restos de su hijo.
1994
Atentado a la AMIAVista general
Atentado a la AMIA.Muestras
Atentado a la AMIA.Resultados
Atentado a la AMIA.Resultados
Atentado a la AMIA.Resultados
Atentado a la AMIA.Resultados
1999
Accidente Aéreo de LAPA
1999 ACCIDENTE AEREO
1999 ACCIDENTE AEREO
CRISTÓBAL COLÓN
Dra. Adriana Silvia Gotti
Dra. Adriana Silvia Gotti
1. Teoría genovesa clásica:-hermanos del mismo padre y madre
2. Teoría genovesa renovada:-hermanos del mismo padre y diferente madre
3. Teoría mallorquinista-hermanos de la misma madre y diferente padre
CRISTÓBAL COLÓN
?
?
CRISTÓBAL COLÓN
Dra. Adriana Silvia Gotti
Carlos de Evreux, Príncipe de Viana
Dra. Adriana Silvia Gotti
CRISTÓBAL COLÓN
Dra. Adriana Silvia Gotti
Dra. Adriana Silvia Gotti
1506
1509
Dra. Adriana Silvia Gotti
Cuba
República Dominicana
Dra. Adriana Silvia Gotti
Caribe
1544
Dra. Adriana Silvia Gotti
Dra. Adriana Silvia Gotti
Dra. Adriana Silvia Gotti
Caribe
1544
1795
1898
Dra. Adriana Silvia Gotti
Sevilla 1898
Dra. Adriana Silvia Gotti
Dra. Adriana Silvia Gotti
Dra. Adriana Silvia Gotti
1. Teoría genovesa clásica:-mismo padre y madre
2. Teoría genovesa renovada:- mismo padre y diferente madre
3. Teoría mallorquinista- misma madre y diferente padre
Dra. Adriana Silvia Gotti
CRISTÓBAL COLÓN
Dra. Adriana Silvia Gotti
Dra. Adriana Silvia Gotti
Dra. Adriana Silvia Gotti
Dra. Adriana Silvia Gotti
Dra. Adriana Silvia Gotti
Dra. Adriana Silvia Gotti
Dra. Adriana Silvia Gotti