Universidad de CaraboboFacultad de Ciencias de la Salud

Escuela de Ciencias Biomédicas y TecnológicasDepartamento de Ciencias Morfológicas y Forenses

Asignatura: Morfología Microscópica

Prof. Mayra Jiménez

Unidad I. Introducción al estudio de la Histología y Morfología Celular

Objetivo General: Especificar las herramientas que utiliza la histología para el estudio ultraestructural de tejidos y de la célula como unidad morfológica y funcional del organismo

Contenido: • Histología. Concepto y aplicaciones Científicas y clínicas.

• Tecnica Histológica. Etapas en la preparación de tejidos para su estudio al microscopio óptico y electrónico.

• Histoquímica y Citoquímica

• Microscopía. Tipos de Microscopios y aplicación. Microscopio óptico: partes y funcionamiento. Microscopio electrónico: de transmisión y de barrido.

¿Qué es la Histología?

Etimológicamente: histo= tejido logos: estudio

⌂ Es la rama de la biología encargada del análisis microscópico de la anatomía celular y tisular de los tejidos biológicos.

⌂ Marcello Malpighi es reconocido como el fundador de la Histología

⌂ Las primeras investigaciones histológicas se hicieron en el siglo XVII gracias a la invención del microscopio óptico por Antonio Van Leeuwenhoek

¿Qué es la Anatomía?

⌂ Es el estudio de la forma y la estructura de los organismos vivos organizados

⌂ Anatomía Macroscópica: estudio de las estructuras observables a simple vista

⌂ Anatomía Microscópica: es aquella que requiere de auxiliares ópticos

¿Qué es la Citología? o biología celular es una disciplina académica que se encarga del estudio de las células en cuanto a lo que respecta a las propiedades, estructura, funciones, organelos que contienen, su interacción con el ambiente y su ciclo vital.

Célula: Unidad morfológica y funcional de todo ser vivo. Es el elemento de menor tamaño que puede considerarse vivo. Ejm:

Tejido: agrupación de células con la misma función

Órgano: unidad funcional mayor compuesto por distintos tipos de tejido

Sistema de Órganos: conjunto de órganos con funciones relacionadas

La Histología representa un nexo de unión entre la bioquímica, la fisiología, la anatomía, la genética, la clínica y la patología.

Obtención de la muestra de material humano: El material humano puede provenir de tres fuentes: Las necropsias, las biopsias y las piezas operadas.

De estas, sólo la primera puede darnos material normal; las dos últimas proporcionan tejidos patológicos.

-Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadáver. Para histología normal es necesario que se trate de un cadáver fresco y que no haya sido atacado por ninguna lesión, por lo menos el órgano que se quiere estudiar.

Biopsias: son trozos de tejido que se obtienende un sujeto con vida con el objeto deestudiarlos al microscopio y efectuar un diagnóstico histopatológico.

Piezas operadas: los tejidos que han sido extraídos de las intervenciones quirúrgicas, generalmente tumores u órganos inflamados, también pueden darnos material de investigación.

Fundamentos Generales de la Preparación Histológica de los tejidos

1.- Obtención de la muestra: mediante extirpación de pequeños fragmentos de tejido (humano o animal)

2.- Fijación: Su propósito es mantener la morfología del tejido lo más parecida posible a lo que ésta tenía antes de hacer la extracción. (formaldehído al 37%)

Métodos: Químico → inmersión

Físico: congelación

La formalina no preserva todos los componentes de la célula y los tejidos

Fundamentos Generales de la Preparación Histológica de los tejidos

3.- Deshidratación: proceso por el cual se elimina completamente el agua de la muestra para que se pueda embeber adecuadamente el tejido en aquellos medios de inclusión que no sean hidrosolubles. (Alcohol etilíco en concentraciones crecientes)

4.- Aclaramiento: proceso por el cual se consigue la sustitución del agente deshidratante por una sustancia miscible con el medio de inclusión. (Xilol)

5.- Infiltración (Impregnación) Proceso que tiene por objeto “rellenar o infiltrar” completamente la muestra histológica con el medio que se va a usar para la imbibición del tejido. (Baños sucesivos de parafina fundida)

Fundamentos Generales de la Preparación Histológica de los tejidos

6.- Encastramiento del tejido y confección de los bloques: consiste en la obtención de un bloque sólido de tejido más medio de inclusión, mediante el enfriamiento lento a 10-15ºC: El bloque sólido se llama TACO

7.- Orientación de la pieza: para realizar el corte del tejido se monta el taco en el microtomo (aparato equipado con una hoja de acero) y se obtienen cortes sumamente delgados cuyo grosor para microscopía óptica varía entre 5 – 10 micrómetros

1milímetro = 1000 micrómetros

Fundamentos Generales de la Preparación Histológica de los tejidos

8.- Montaje: los cortes se colocan sobre láminas portaobjetos cubiertos previamente con capa de albúmina o gelatina

9.- Aclaramiento: Extracción de la parafina con xilol

10.- Rehidratación: desplazar el xilol por agua. Alcohol con agua en concentraciones decrecientes

11.- Tinción o Coloración: con colorantes histológicos en su mayoría en solución acuosa

Reducción de la pieza Fijación de la muestra Introducción en cassette de deshidratación

Deshidratación en alcoholes sucesivos

Penetración de la parafina 56-58ºC

Barras de Leuckart

Fundamentos Generales de la Preparación Histológica de los tejidos

Fractura del taco para cortar

Corte en microtomo

Bateria de coloración H&E

Fundamentos Generales de la Preparación Histológica de los tejidos

Correlación Clínica: Biopsias por congelación• Evaluar de inmediato el tejido obtenido durante el acto quirúrgico y el diagnóstico instantáneo determina el paso siguiente en la cirugía• Para identificar hallazgos intraoperatorios inesperados• Para saber si se ha extirpado toda la masa patológica y si el borde de la resección quirúrgica está libre de tejido enfermo• Se congelan fragmentos de tejido usando anhídrido carbónico comprimido o un líquido frío (isopentano) a una temp de -50ºC• Corte del tejido congelado en un criostato (cámara refrigerada que contiene un microtomo)• Montaje del corte en un portaobjetos • Tinción del corte: HE, azul de metileno y PAS• El proceso puede tardar 10 minutos y el resultado se comunica al cirujano inmediatamente

Histoquímica y Citoquímica

Se ocupan de investigar la actividad química que tiene lugar en las células y los tejidos. Se fundamentan en:• La unión específica de un colorante• El uso de anticuerpos marcados con un colorante fluorescente• La actividad enzimática inherente de un elemento constitutivo de las células

Composición química de las muestras histológicas• La composición química de un tejido listo para una coloración de rutina es difrente de la del tejido vivo• Los componentes que perduran son moléculas grandes que no se disuelven con facilidad con el fijador. Entre ellas: nucleoproteínas, proteínas intracelulares del citoesqueleto, proteínas extracelulares, complejos de fosfolípidos y proteínas (o carbohidratos) en las membranas.

Composición química de las muestras histológicas• Muchos componentes de los tejidos desaparecen durante la preparación de los cortes teñidos con H-E

• Los solventes disuelven los lípidos neutros• Las macromoléculas durante la fijación de rutina son:-Glucógeno, Proteoglucanos y glucosaminoglucanos

• Los componentes solubles, los iones y las moléculas pequeñas también desaparecen durante la preparaciónde las muestras incluídas en parafina: glucosa, sodio,cloro y susstancias similares

• Estos iones y pequeñas moléculas solubles no constituyen elementos morfogénicos hísticos sino que participan en los procesos de síntesis o en las reacciones celulares.

Coloraciones Utilizadas en Microscopía ÓpticaFundamento: Radica en la propiedad quetienen todos los tejidos para incorporar y fijar de modo variable diversas sustancias Coloreadas. Según su afinidad tisular:• Colorantes Básicos: poseen una carga globalpositiva (catiónicos), reaccionan con los componentes aniónicos de las células. Ej. Hematoxilina• Colorantes Ácidos: poseen una carga global negativa (aniónicos), reaccionan con los componentes catiónicos de las células. Ej. Eosina• Colorantes neutros: su carga global es neutra. Propiedad de colorear junta o separadamente diversas estructuras. Ej. Giemsa• Colorantes metacromáticos: colorantes básicos. Producen tonos de color totalmente distintos al que se espera por el colorante empleado• Colorantes Indiferentes: no poseen carácter ácido, básico o salino definido. Colorean mediante impregnación.

Coloraciones Utilizadas en Microscopía Óptica

Hematoxilina-Eosina (HE): utiliza dos tipos de colorantes. La hematoxilina que es un colorante básico, colorea los componentes ácidos de la célula (núcleo) de color morado; y la eosina que es un colorante ácido se une a estructuras básicas de la célula (citoplasma) otorgándole una tonalidad rosada

Tinción de Giemsa Colorante neutro

Tinción Azul de ToluidinaColorante metacromático

Impregnación con sales de plataColoración indiferente

Coloraciones Utilizadas en Microscopía Óptica

• Coloración con PAS (ácido periódico-Shiff): se usa para determinar la presencia de macromoléculas ricas en glúcidos como glucógeno, glucoproteínas y glucosaminoglucanos. Se observa color fucsia al microscopio óptico.

• Coloración con Azán: (tricrómica): se obtiene tres colores diferentes: Azul oscuro en los núcleos de la célula; rojo en el músculo, queratina y citoplasma celular, y azul claro en el mucinógeno y colágeno, o sea en el tejido conjuntivo

• Coloración con metales: actúan impregnando a ciertos componentes celulares. Se usan para demostrar aparato de golgi, y las neurofibrillas.

Coloraciones Utilizadas en Microscopía Óptica• Coloración con hematoxilina férrica: útil para estudiar detalles

celulares finos. Ej. Las fibras elásticas y las mitocondrias presentes en el citoplasma de ciertas células • Tricrómico de Cajal y Gallego: implica el uso de tres colorantes. Para demostración

diferencial y selectiva de las fibras colágenas y del músculo.

• La orceína y la fucsina resorcina: son colorantes para fibras elásticas. Se observan entre bordeau y castaño oscuro.

• Carmín de Best: para tinción nuclear y detección de glucógeno

Elementos celulares que presentan basofilia, es decir afinidad por los colorantes ácidos y se ven de color morado al microscopio óptico- Heterocromatina y nucléolos del núcleo- Algunos componentes citoplasmáticos- Material extracelular

Elementos celulares que presentan acidofilia, es decir afinidad por los colorantes básicos y se ven de color rosado al microscopio óptico-La mayoría de los filamentos citoplasmáticos-La mayoría de los componentes membranosos intracelulares-La mayoría de las fibras extracelulares

RESUMEN- Que es la Histología. Que es la Anatomía: Anatomía Macroscópica y Anatomía Microscópica. Que es la Citología. Célula, Tejido, Órgano, Sistema. Obtención de la muestra de material humano: necropsia, biopsia, piezas operadas.-Preparación Histológica de los tejidos: Obtención de la muestra, fijación, deshidratación, aclaramiento, impregnación, confección de bloques, Cortes, Montaje, aclaramiento, rehidratación, coloración.-Biopsias por congelación-Fundamentos de la Histoquímica y Citoquímica-Composición química de las muestras histológicas-Coloraciones Utilizadas en Microscopía Óptica: colorantes básicos, ácidos, neutros, metacromáticos e indiferentes.- Coloración hematoxilina-eosina, Giemsa, azul te toluidina, sales de plata, PAS, Azan, hematoxilina férrica, cajal gallego, orceína, fucsina resorcina…Sustancias que presentan basofilia, es decir afinidad por los colorantes ácidos y se ven de color morado al microscopio ópticoSustancias que presentan acidofilia, es decir afinidad por los colorantes básicos y se ven de color rosado al microscopio óptico

MICROSCOPÍA

¿Qué es un Microscopio?

• Es un Instrumento que aumenta el tamaño de una imagen y permite ver mayores detalles.

• EL Microscopio más sencillo: lupa, lentes de corrección

“El conocimiento detallado moderno de la arquitectura celular se basa sobre varios tipos de observación por diferentes tipos de microscopios”

M. Óptico

compuesto

Campo claroCampo oscuroContraste de faseFluorescenciaLuz U.V.

M. Electrónico

Transmisión (MET)

Barrido (MEB)

La Luz como ondaEn una onda electromagnética, por ejemplo, el campo eléctrico cambia en intensidad de manera cíclica así:

• Cada ciclo de la onda se repite en intervalos separados por una longitud de onda• La frecuencia mide el número de estos ciclos que ocurren cada segundo.

• En la luz, la longitud de onda determina el color de la luz (por ejemplo la longitud de onda correspondiente al color verde es de 550 nanómetros)

EL ESPECTRO ÓPTICOLa luz blanca está compuesta de ondas de diversas frecuencias. Cuando un rayo de luz blanca pasa por un prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la longitud de onda así:

d= 0.61λ/An

MICROSCOPÍAAUMENTO

Es la relación entre el tamaño de la imagen y el del objeto en medidas lineales

El Aumento de un microscopio es:

Am= Alente objetivo x ALente ocular

Ej: Ocular: 10X

Objetivo: 40X

¿Cuanto es el aumento del microscopio?

PODER DE RESOLUCIÓN Es la capacidad de producir imágenes separadas de objetos que están muy cerca uno de otro. Numéricamente equivale a d o distancia mínima entre dos objetos distinguibles.

Ojo humano: d= 0.2 mm

Depende de:

•Apertura numérica (An) del sistema óptico (objetivo y condensador)

•Longitud de onda de la luz incidente (λ)

Microscopio óptico de Campo Claro

Usa Luz Visible. D = 0.2 um.(micrométro)La luz atraviesa el objeto examinado y el objetivo capta la luz directa provenientede la fuente luminosaUtilidad: Académico, Diagnóstico clínico (Lab. Bioanálisis, Patológico), Investigación.Componentes Principales:- Fuente Luminosa- Lente Condensadora: para enfocar el haz de luz a la altura de la muestra- Platina: sobre la que se coloca la muestra.- Lente Objetivo: para recoger la luz que ha atravesado la muestra- Lente ocular: a través de la cual se puede examinar directamente la imagen formada por la lente objetivo

MICROSCOPÍAPARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO

Mecánicas

•Cabezal

•Brazo

•Revolver

•Platina

•Carro

•Tornillos macrométrico y micrométrico

•Base

Ópticas

•Lámpara

•Condensador/Diafragma

•Objetivos

•Oculares

Examen de un Preparado Histológico con el Microscopio Óptico

- Los órganos son tridimensionales, mientras que los cortes histológicos tienen sólo dos dimensiones-Al examinar un corte hay que reconstruir mentalmente la organizaciónde la estructura y sus partes constitutivas- Los artefactos son elementos que representan un error en el proceso de preparación (partículas de polvo,fragmentos de vidrio, agregadosde colorante, filamentos de gasa etc.)

OTROS SISTEMAS ÓPTICOS

• Microscopio de Contraste de Fase: Aprovecha las pequeñas diferencias en el índice de refracción que hay en diferentes partes de una muestra de células o tejidos. - Las partes oscuras corresponden a las regiones densas y las partes claras corresponde a las regiones menos densasUtilidad: permite observar las células en acción y estudiar los movimientos implicados en procesos como la mitosis o la migración celular. Estudiar cortessemifinos no teñidos

Microscopio de Campo Oscuro

-La lente objetivo no capta la luz directa proveniente de la fuente luminosa-El principio se consigue con un condensador específico que permite transmitir la luz de forma circular, dejando el centro oscuro. - Con esto se logra que el fondo de la muestra aparezca negro y los especimenes brillantes.-Utilidad: En la práctica clínica para la detección de cristales en la orinay la identificación de espiroquetas

Microscopio de Fluorescencia-Aprovecha la capacidad de algunas moléculas de fluorescer bajo la luz UV-Utilidad: Detección de moléculas con autofluorescencia como la vitamina A y algunos neurotransmisores (fluorescencia natural)- En técnicas de inmunocitoquímica (fluorescencia secundaria), - En la investigación del trayecto de fibras nerviosas

Microscopio de Luz ultravioleta (UV)-Utiliza lentes de cuarzo con una fuente de luz ultravioleta.- La imagen depende de la absorción de la luz UV por las moléculas de la muestra.-La muestra no puede inspeccionarse directamente a través del ocular porque la luz UV no es visible y lesiona el ojo.

Utilidad: Detectar ácidos nucleicos, en especial las purinas y pirimidinas. Detectar proteínas que tienen ciertos aminoácidosen la práctica clínica para evaluar el gradode ploidia en cortes de tumores

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Representa un gran adelanto respecto a la microscopía óptica ya que:

• La longitud de onda del haz de electrones es 2000 veces menor que la del haz de luz, por lo que aumenta la resolución por un factor de 10³

• Los electrones no pueden atravesar el vidrio, por lo que deben remplazarse por bobinas o lentes electromagnéticasExisten dos tipos: MET y el MEB

Microscopio Electrónico de Transmisión

-Utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz-La fuente es un filamento de tungsteno calentado que emite electrones-El haz de electrones atraviesa unaserie de lentes electromagnéticas que cumplenla misma función que las lentes cristal de un microscopio óptico-La imagen final se observa en una pantalla fosforescente

Microscopio electrónico de barrido

- El haz de electrones no atraviesa la muestra sino que explora (barre) su superficie.- Forma una imagen de tipo tridimensional en un tubo de rayos catódicos de alta resolución.

RESUMEN-Qué es un microscopio. -Microscopio compuesto: campo claro, campo oscuro, contraste de fase, fluorescencia, ultravioleta.-Longitud de onda, frecuencia, espectro óptico-Aumento de un microscopio, poder de resolución-Microscopio óptico de campo claro: utilidad, componentes principales, partes mecánicas y partes ópticas-Examen de un preparado histológico en un microscopio óptico-Microscopio de contrates de fase: fundamento, utilidad-Microscopio de campo oscuro: fundamento, utilidad-Microscopio de fluorescencia: fundamento, utilidad-Microscopio de luz ultravioleta: fundamento, utilidad-Microscopio Electrónico: de transmisión y de barrido