26-09-20141Tcnicas de Separacin yPurificacin de protenas26-09-20142Importancia Tcnicas de Separacin La obtencin de protenas puras es fundamental para determinar las propiedades y la actividad que estas poseen. Las tcnicas de purificacin se basan en las propiedades de las protenas como tamao, carga y propiedades de unins26-09-2014MecnicoLquido3Extraccin de Protenas Se realiza a partir de tejidos, clulas, bacterias entre otros. Se pueden obtener por mtodos mecnicos o nomecnicos Lisado CrudoMecnico NoMedio LisisMedio slidoQu considerar al Purificar protenas? Resolucin: Seleccionar la tcnica que me entregue de manera m simple la protena pura Capacidad: A partir de cuanta protena puedo partir Velocidad: mtodo rpido y eficiente Recuperacin: Obtener la mayor cantidad de protena pura a partir de la cantidad inicial26-09-20144Medios de extraccin Medios de extraccin mantienen condiciones estables deprotenas de inters. Mantener integridad de la protena es MUY importante Buffer, pH del medio, T, endonucleasas Medios contienen: Buffers y sales Detergentes y agentes caotrpicos (desestabilizan membranas) Agentes reductores Quelantes y metales inicos Inhibidores de Protenas BacteriostticosExtraccin de protenas Extraccin Mecnica Medios lquidos Ultrasonido, Agitacin, Presin Medios slidos Molienda, PresinExtraccin No Mecnica Lisis Fsicos, Qumicos, Enzimticos26-09-20145Solubilidad de las protenas Depende de la concentracin de sales, el tipo de solvente, el pH y la temperatura del medio en que se encuentren EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SAL: se expresa a travs de la Fuerza inica de una solucin. Relaciona la concentracin de las especies inicas y su carga inica Salting in: Mayor solubilidad debido a menor fuerza inica (menor atraccin electrosttica entre partculas en presencia de sales). Salting out: Menor solubilidad al aumentar la fuerza inica. Concentracin de sales >1M, partculas se unen entre si y dejan de solvatarse, volvindose insolubles.Mtodos de purificacin Se basan en las caractersticas de las protenas26-09-20146Solubilidad de las protenas EFECTO DE SOLVENTES ORGNICOS: Reducen el poder de solvatacin de las soluciones acuosas ya que tiene valores bajos de constantes dielctricas. (Protenas precipitan por menor interaccin con el agua) EFECTO DEL pH: en soluciones de baja concentracin de sal, las protenas se encontrarn solubles a pH distintos a su punto isoelctricoSolubilidad de distintas protenas en solucin de sulfato de amonio No afecta estructura protena Precipitacin no selectiva Barato Efectivo Muy Soluble26-09-20147Mtodos de purificacin DILISIS proceso por el cual se separan las molculas segn tamao por medio de una membrana semipermeable Se eliminan molculas ms pequeas como solventes, salesy metabolitos pequeos Celofn y celulosa con distintos tamao de separacin (0,1-500 KDa)Solubilidad de las protenas26-09-20148Mtodos de purificacin FILTRACIN Solucin de macromolculas que se pasa por un filtro de celulosa semi permeable bajo presin o por centrifugacin Molculas de inters pueden o no fijarse a la membranaMtodos de purificacin26-09-2014 CENTRIFUGACIN es una tcnica de sedimentacin acelerada9Mtodos de separacinMtodos de separacin CENTRIFUGACIN es una tcnica de sedimentacin acelerad mediada por la fuerza centrfuga. Permite analizar o separar mezclas de partculas, clulas, orgnulos o molculas. La sedimentacin depende de las propiedades fsicas de las partculas y/o componentes. Separa las partculas o componentes de acuerdo con su masa ysu forma. La fuerza centrfuga (G) depende de la velocidad () y del radio de giro (x). El radio de giro es la distancia desde el centro de rotacin hasta el extremo del recipiente donde est contenida la muestra.26-09-201410Mtodos de separacin CROMATOGRAFA Desarrollada en 1900 para la separacin de pigmentos vegetales usando un medio slido. Actualmente se usa en diversas reasMtodos de separacin CENTRIFUGACIN EN GRADIENTE: Se utiliza una solucin inerte como Sacarosa o Cloruro de Cesio, donde la concentracin (densidad) del compuesto va aumentando de arriba hacia abajo del tubo. Permite separar molculas por tamao y tiene mejor resolucin26-09-201411Mtodos de separacin CROMATOGRAFA EN PAPEL permite la separacin eficiente de molculas de tamao pequeo (aminocidos y nucletidos) Fase estacionaria: papel o celulosa Fase mvil: mezclas de solventes (agua/butanol/acido actico; etanol 77%; amil-alcohol/pirimidina) Molculas se separan segn polaridad (molculas apolares se mueven ms rpido que las polares)Mtodos de separacin CROMATOGRAFA Interaccin entre fase mvil (mezcla de molculas o solutos a separar disueltas en un lquido o gas) con una matriz porosa slida conocida como fase estacionaria. Los tipos de interacciones de los solutos con la fase estacionaria regulan su avance a travs de la matriz, migrando a diferentes velocidades permitiendo la separacin de la mezcla de molculas26-09-201412Mtodos de separacinMtodos de separacinVelocidad de migracin (Rf) es especifica del solvente y del tipo de papel utilizado.26-09-201413Mtodos de separacinIntercambio Catinico Intercambio AninicoMtodos de separacin CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO permite la separacin de iones y molculas polares basado en las propiedades de carga de las molculas Intercambio catinico retiene cationes cargados positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargado negativamente Intercambio aninico retiene aniones usando grupos funcionales cargados positivamenteLa elucin de las partculas cargadas se logra cambiando el pH del solvente hasta igualarlo al pI o hasta invertir la carga neta (baja sal alta sal).26-09-201414Mtodos de separacin Resina de celulosa utilizada para intercambio inicoMtodos de separacinhttp://higheredbcs.wiley.com/legacy/college/voet/0470570954/animated_figs/4e_ch6/6-6_4e.html26-09-201415Mtodos de separacin CROMATOGRAFA DE FILTRACIN MOLECULAR O DE EXCLUSIN MOLECULAR permite la separacin de las molculas por tamao, saliendo primero las molculas ms grandes, luego las medianas y al final las ms pequeas La resina que se utiliza en este mtodo tiene distintos rangos de separacin Lmite exclusin: Tamao molcula mayor al rango de separacin de la resina que no penetra la resina Volumen de elucin: Volumen de solvente necesario para que la molcula de inters eluya o salga de la columnaMtodos de separacin Tipo de resinas de intercambio inico26-09-201416Mtodos de separacin Volumen total (Vt): volumen que ocupa elcilindro de gel hidratado. (r2h) Volumen de vaco (Vo): volumen entre las esferas del gel. Es el volumen de solvente utilizado para eluir un soluto de alto peso molecular, como azul de dextrano (PM2.000.000 Da) Volumen ocupado por las esferas del gel (Vt-Vo): se expresa como la diferencia entre los dos volmenes anterioresMtodos de separacin26-09-201417Mtodos de separacinQu datos puedo obtener de estos resultados?http://higheredbcs.wiley.com/legacy/college/voet/0470570954/animated_figs/4e_ch6/6-9_4e.htmlMtodos de separacin60 20 30 5 KDa26-09-2014 CROMATOGRAFA DE AFINIDAD matriz tiene un ligando que une18K= (Ve-V0)/Vt-V0Mtodos de separacin CROMATOGRAFA DE AFINIDAD matriz tiene un ligando que especficamente la protena de inters de forma no covalente. Otras protenas no son retenidas. Para liberar la protena se modifican condiciones de la interacci modificando buffer Cromatografa de inmunoafinidad Cromatografa de adsorcinnMtodos de separacin A partir de los volmenes de elucin de protenas de masas conocidas puedo obtener el peso molecular de una protena de inters1. Debo determinar volumen total de la columna2.En la columna debo pasar una molcula con rango lmite de exclusin mayor al de la columna (azul dextrano)3. Pasar protenas de peso molecular conocido y determinar su volumen de elucin (curva calibracin)26-09-201419Mtodos de separacinResina es inerte, solo el ligando es funcional para unir protenas Condiciones del buffer son ptimas para interaccin protena-ligando La elucin ocurre modificando buffer para disminuir interaccin protena-ligandola ser,26-09-201420Mtodos de separacinMtodos de separacin CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO O HPLC permite separar, identificar y cuantificar molculas disueltas en un lquido Permite separacin de compuestos por polaridad, carga elctrica y tamao de la molcula La columna es metlica en el exterior y en el interior posee resina que permite la separacin. Las muestras son detectadas mediante un lector (UV/Vis, LFluorescencia) Se utiliza en diversas areas (farmacutica, alimentos, muestrasforenses, industria qumica)26-09-201421Mtodos de separacinMtodos de separacinCROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO O HPLC Los factores determinantes en el poder de resolucin del mtodo largo columna, tamao partcula, empaquetamiento de la columna26-09-201422Mtodos de separacin EquiposMtodos de separacin26-09-201423Mtodos de separacin ELECTROFORESIS permite separar molculas segncarga elctrica neta aplicando un campo elctrico La separacin de las molculas puede ser por tamao opor carga y tamao La matriz de la electroforesis puede ser de agarosa o poliacrilamida Molculas se mueven a travs de poros, la eleccin de la matriz depende del tamao de la molculaMtodos de separacin26-09-201424Mtodos de separacin Matriz de Poliacrilamida Ms utilizada para protenas Acrilamida + BisacrilamidaMtodos de separacin ELECTROFORESIS EN CONDICIONES DENATURANTE Migracin de las protenas ocurre respecto a la carga y al tamao de la molcula pero no a su forma. Agente desnaturalizante SodioDodecilSulfato o SDS(detergente). ELECTROFORESIS NATIVA Protenas no se desnaturalizan, por lo tanto, la migracin es en funcin de su carga, de su tamao y de su forma. Se mantienen interacciones entre subunidades y entre protenas Para ambos tipos de electroforesis se pueden utilizar los buffer Tris-glicina (pH 8.3 a 9.5), Tris-borato (pH 7.0 a 8.5) y Tris- acetato (pH 7.2 a 8.5).26-09-201425Mtodos de separacin 1,4 gr de SDS se unen a 1 gr de protena, o aproximadamente 1 molcula de SDS por cada 2 aa de una protenaMtodos de separacinAcrilamida (%) Bisacrilamida (%) Rango (KDa)15 0,4 12-4312 0,32 15-5010 0,26 16-687,5 0,20 36-945,0 0,13 57-21226-09-201426Mtodos de separacin(pH 6,8) (pH 8,8)26-09-201427Mtodos de separacinMtodos de separacin26-09-201428Mtodo de Separacin Visualizacin de las protenas Radioactividad Tincin con plata Sensibilidad 10 ng Azul de Coomasie Sensibilidad 50 ng Anticuerpos26-09-201429Visualizacin de las protenasAzul de CoomasieVisualizacin de las protenasAutoradiografa Tincin con Plata26-09-201430Determinacin Tamao ProtenaDeterminacin Tamao Protena SDS-PAGE permite determinar tamao protena desconocida. Se compara movilidad relativa (Rf) de la protena de peso molecular desconocida con el de las protenas de referencia Se determina el frente del gel por la posicin de un compuesto de referencia de movilidad mxima, como azul de bromofenol.26-09-201431Mtodos de SeparacinMetodos de Separacin ISOELECTROENFOQUE (IEF) Se basa en el pI de las protenas (protenas no se mueven en un campo elctrico) La protena se encuentra en una gradiente estable de pH, (pH aumenta levemente desde el nodo al ctodo), permitiendo la migracin de las protenas a la posicin en que el pH es igual a su pI. La muestra es agregada antes de la polimerizacin del gel.or nmero detiempotas condiciones de o de tratamiento26-09-201432Mtodos de SeparacinMtodos de Separacin ELECTROFORESIS EN DOS DIMENSIONES (2D) Isoelectroenfoque + SDS-PAGE Permite analizar un may protenas en un mismo Permite comparar distin desarrollo, metablicas26-09-201433Mtodos de SeparacinMtodos de Separacin ELECTROFORESIS DE DOS DIMENSIONES (2D)26-09-201434Tabla ResumenMtodos de Purificacin ProtenasTabla ResumenMtodos de Purificacin Protenas26-09-201435Tabla ResumenMtodos de Purificacin protenasPropiedad MtodoSolubilidad Precipitacin con sulfato de amonio(Salting out)Tamao/Forma Cromatografa de Exclusin MolecularElectroforesis de ProtenasPunto Isoelctrico Cromatografa de Intercambio Inico(carga) IsoelectroenfoqueUnin a molculas Cromatografa de Afinidadpequeas