CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes son aquellos que se basan en:

a) Su consistencia

b) Su utilización

c) Su composición

d) Su origen

 

SEGÚN SU ESTADO FÍSICO (CONSISTENCIA).

1) Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración.

2) Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa a temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar:Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39ºC y nose funde por debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez fundido alrededor de los 45ºC. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgánicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacáridos, Araki, en 1937, los dividió en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de ácido pirúvico, y- agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporción de agarosa a agaropectina en el agar varía según el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos.

3) Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios

 

sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias

 

SEGÚN SU UTILIZACIÓN.

1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc.

2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores  indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cisteína para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).

3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias.

4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adición de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una población determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos.

5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. También lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc.

6) Medios de identificación: Son los destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento

de los microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya añadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificación. Actualmente están apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios específicos de identificación para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultáneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificación. Son ejemplos de esto último los medios CPS ID3 o Uriline ID(Biomerieux), utilizados para identificar los gérmenes urinarios más importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilización de sustratos cromogénicos específicos.

7) Medios de multiplicación: Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un microorganismo ya aislado. Seemplean en la obtención de vacunas, en la investigación y en la industria. Los medios más adecuados para la multiplicación suelen ser líquidos. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de estos medios.

8) Medios de conservación: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en elLaboratorio de Microbiología. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:

  a) haciendo pases periódicos de placa a placa,

  b) mediante liofilización de una suspensión bacteriana, y

  c) congelando las cepas en leche descremada estéril al 0,1%.

9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Suutilización debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior delmedio (generalmente en un tubo). Son ejemplos típicos de este grupo los medios de Stuart-Amies,Cary-Blair, etc.

ATENDIENDO A SU COMPOSICIÓN.

Según las sustancias que entren a formar parte en su composición, los medios de cultivo pueden ser clasificados en:

1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se preparan a partir de tejidos animales, y más raramente de vegetales. Su composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podrá ser exacta. En la práctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados.

2) Medios sintéticos: Son aquellos que contienen en su composición exclusivamente sustancias químicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composición perfectamente

definida.

3) Medios semisintéticos: El gran número de factores de crecimiento exigidos para ciertos gérmenes hace que la fabricación de un medio sintético para estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos gérmenes no crecen en ningún medio por muy enriquecido que esté éste, haciéndolo exclusivamente en células vivas con unas características determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.

 

Según su origen:

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como serextractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida cuali ycuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una formade un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

 

 

 

DESCRIPCIÓN Y UTILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS DE CULTIVO COMUNES.

Son los más corrientemente utilizados, y aunque no vamos a enumerarlos todos, sí son los más conocidos en un laboratorio de Microbiología.

Agar nutritivo: Este medio es bastante bueno para el cultivo de gérmenes que no presentan exigencias particulares. No es diferencial.

Agar sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza además para la investigación de los diversos tipos de hemólisis(α, ß ó gamma ). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la preparación del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sódico o un preparado enriquecido con

otras sustancias como Columbia o el tripticase de soja. La adición de sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que están en el interior de los hematíes, pero sí puede añadir factores inhibidores del crecimiento bacteriano presentes en el suero. Este es un inconveniente que puede solucionarse calentando la sangre para romper los eritrocitos y para que se destruyan las sustancias inhibidoras, que son termolábiles.La sangre utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al 5%, pero en algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies (caballo, conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolíticas o contienen determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias inhibidoras del crecimiento de determinados gérmenes. Agar chocolate: El agar chocolate se obtiene calentando la sangre antes de adicionarla al medio base. Por esta razón el agar chocolate contiene hemoglobina, que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el factor X o hemina termoestable. El agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de Neisserias (gonococos ymeningococos) y Haemophilus, pero en él pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. El agar chocolate puede convertirse quizás en uno de los medios más enriquecidos si añadimos una mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas, denominadas de forma diferente según las casas comerciales (Polivitex, Isovitalex, etc.) contienen más de una docena de compuestos que confieren a este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias. Por adición de uno o varios antibióticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el crecimiento de determinados microorganismos. Un ejemplo clásico es el Thayer-Martin, utilizado para el aislamiento del gonococo y que no es otra cosa que un agar chocolate enriquecido al cual se ha añadido unamezcla de tres antibióticos específicos que impedirán el crecimiento del resto de la flora acompañante. Agar MacConkey: Es un medio utilizado para el aislamiento e identificación de enterobacterias. Es un medio inhibidor de los gérmenes Gram positivos por su contenido en cristal violeta y selectivo para enterobacterias por su contenido en sales biliares. En su composición lleva un azúcar (lactosa) y un indicador (rojo de metilo) que lo convierten en un medio diferencial. Los gérmenes que fermenten la lactosa producen una acidificación del medio que hacen aparecer de color rojo fuerte a las colonias resultantes. Las colonias lactosa negativas serán incoloras, apareciendo del mismo color que el medio subyacente (naranja).

Agar C.L.E.D.: El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrólito Deficiente) está recomendado para el recuento e identificación presuntiva de los microorganismos de las vías urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita la invasión de los cultivos por Proteus.La presencia de lactosa en su composición le confiere el carácter de medio diferencial, aunque la interpretación sea diferente al anterior medio por la incorporación de otro indicador: el azul de bromotimol. Las colonias lactosa positivas aparecerán de color amarillo y las lactosa negativas lo harán con un color verdoso, blanco o azulado.

Agar S.S.:El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir demuestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante para impedir el crecimiento de coliformes y gérmenes Gram positivos. La presencia de lactosa y rojo de metilo nos permiten diferenciar las colonias que fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las que no lo hacen

(incoloras).Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que este medio es excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito. El agar SS es doblemente diferencial, porque además de indicarnos el comportamiento de los gérmenes con relación a la lactosa, nos muestra los gérmenes que son capaces de producir ácido sulfhídrico, que se manifiesta como un precipitado de color negro en el centro de la colonia. Así, una colonia incolora y con un punto negro central es sospechosa de Salmonella, y será exclusivamente a estas colonias a quienes se hagan las pruebas bioquímicas confirmatorias de esta especie. El agar SS es un medio muy inhibidor que a veces impide incluso el crecimiento de ciertas especies de Salmonella y sobre todo de Shigella. Por esta razón debe utilizarse siempre junto con otro medio menos inhibidor como el Hektoen.

Agar Hektoen :Es un medio más diferencial y menos selectivo que el agar SS. Se utiliza para facilitar el aislamiento de las enterobacterias. La presencia de tres azúcares (lactosa, sacarosa y salicilina ) permiten ampliar el poder diferencial de este medio. Este medio es capaz de detectar los gérmenes formadores de SH2, igual que el SS. Las cualidades del agar Hektoen se deben a su riqueza en peptonas y azúcares, que neutralizan el efecto inhibidor de las sales biliares respecto a ciertos gérmenes de cultivo delicado (Shigella en particular).El crecimiento de Salmonella es excelente, igual que el de Shigella, obteniéndose colonias más numerosas y voluminosas que en los medios selectivos usuales. La inhibición tiene lugar, esencialmente, sobre E. coli y en menor medida sobre Proteus y Citrobacter. Hay que señalar que el vibrión colérico crece bien en este medio.

C.P.S. ID3. :Medio cromogénico desarrollado por Biomerieux, que permite la identificación de E. coli, P. mirabilisy E. faecalis, con la simple visualización del cambio de color de la colonia sobre el medio (rojo burdeos, azulo marrón). La identificación solo requiere la adición de un reactivo para confirmar o descartar la especie sospechada. Otros microorganismos diferentes requieren los sistemas de identificación habituales (API, p. ej) Granada, Islam o New GBS: Medios utilizados para detección de Streptococcus agalactiae, mediante la utilización de un sustrato cromogénico específico de este microorganismo.

Agar Mueller-Hinton: Es el medio universalmente aceptado para la realización de los antibiogramas o pruebas de sensibilidada los antimicrobianos. A él nos referiremos más ampliamente en el capítulo correspondiente

Agar Tripticase de soja: Es un medio utilizado para el crecimiento de gérmenes exigentes, como Brucella, Neisseria o Streptococcus. Es un medio muy enriquecido, pero no es diferencial. Caldo tioglicolato con resazurina: Es un medio recomendado para controles de esterilidad. Permite el cultivo de aerobios, anaerobiosy microaerófilos. Tiene un bajo potencial redox que, al aumentar, se manifiesta por un color rosa del medio.

Agar Chapman: Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. Su elevado contenido en cloruro sódico permite la inhibición de la mayoría de los otros gérmenes. La presencia de manitol y rojo fenol convierten a este medio en

diferencial: así se puede identificar presuntivamente el Staphylococcus aureus, ya que estegérmen crece bien en medios salados y fermenta el manitol (colonias amarillas).

Agar Baird-Parker: Permite el crecimiento de estafilococos coagulasa positivos, a la vez que los diferencia del resto.

Medio de Loeffler: Es un medio específico para el cultivo de Corynebacterium difteriae.

Agar Desoxicolato Citrato Lactosa Sucrosa (DCLS):Similar al agar SS. Es un medio diferencial e inhibidor a la vez.

Agar Kligler: Medio específico para pruebas de identificación de enterobacterias. Aunque de él hablaremos conmás detenimiento en el capítulo de pruebas de identificación bacteriana, podemos ir adelantando que se tratade un medio diferencial que permite conocer el comportamiento del microorganismo ante dos azúcares (glucosa y lactosa), investigar la formación de gas y comprobar si el microorganismo puede producir sulfatoferroso a partir del tiosulfato sódico.

Agar Levine ó EMB (Eosina azul de metileno):Se utiliza para aislamiento de enterobacterias, pues impide el crecimiento de Gram positivos y diferencia muy bien a E. coli, cuyas colonias adquieren un color negruzco con un brillo metálico característico. Caldo selenito-F: Se utiliza exclusivamente para enriquecimiento de Salmonellas.

Agar Cetrimida. Agar King: Permiten el crecimiento de Pseudomonas, inhibiendo Gram positivos y la mayoría de enterobacterias.El segundo pone además de manifiesto la pigmentación fluorescente de Pseudomonas bajo luz UV.

Agar Schaedler: Es un medio con sangre y vitamina K muy adaptado para el cultivo de anaerobios.

Agar Gardnerella:Agar con sangre humana más una mezcla de antibióticos que permiten la observación de colonias betahemolíticas características de Gardnerella vaginalis

Campylosel: Se utiliza para el aislamiento de Campylobacter intestinales creciendo a 42º C en microaerofilia.

Agar BCYE (Buffer Charcoal Yeast Extract):Se utiliza para el aislamiento de bacterias del género Legionella

Löwenstein-Jensen:Este medio se utiliza para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis. Contiene verde malaquita parainhibir parcialmente el crecimiento de otras bacterias. El huevo se utiliza como sustancia de enriquecimiento.   

MANUAL DE CONTROL DE CALIDADEN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

INTRODUCCIÓN

El laboratorio clínico de microbiología moderno, requiere para su correcto funcionamiento de un adecuado y constante control de calidad sobre todas las etapas en el recibo, manejo y reporte de especimenes clínicos.

En general este control debe identificar, monitorear, evaluar y aprobar metodologías relativas al cuidado del paciente. En este contexto el control de calidad en Microbiología Clínica envuelve el monitoreo de los medios de cultivos, reactivos, instrumentos, procedimientos y el personal, para asegurar una adecuada práctica en el aislamiento, identificación y caracterización de agentes etiológicos y su correspondiente prueba de susceptibilidad como una guía de la terapia.

Un programa de control de calidad debe incluir además un Manual de Procedimientos, validación de metodologías y equipos, el desarrollo de ciclos de educación continuada, elementos de bioseguridad y una supervisión sobre los reportes generados. En éste sentido se hace énfasis en la correcta valoración de las pruebas de laboratorio, los agentes causales de enfermedades, el conocimiento de la flora normal ,la taxonomía bacteriana y la interpretación correcta de las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos.

El Aseguramiento de la Calidad, es un concepto un tanto más difícil de cuantificar que el control de calidad, ya que su foco es el impacto de las pruebas de laboratorio en el cuidado del paciente. Este control nos indica que tan bueno es nuestro trabajo y establece mecanismos para asegurar la generación de información de utilidad clínica rápida y segura. Este concepto incluye entrenamiento y calificación del personal, evaluación de los reportes, rapidez y seguridad diagnóstica, certificación de los laboratorios, controles externos, etc. El Control de Calidad y el Aseguramiento de la Calidad son similares en sus propósitos, aunque su significado y su manera de funcionar sean diferentes; sin embargo, ambos conceptos deben desarrollarse interactivamente durante un programa de control de calidad.

El control de calidad en el laboratorio tiene como objetivo , que el producto final del trabajo tenga un grado aceptable de seguridad , de conformidad con los limites establecidos. Debido a que la mayoría de los resultados en microbiología son producto de interpretaciones y evaluación de reacciones bioquímicas de seres vivos, donde la capacidad y experiencia del evaluador tienen un gran valor, los cálculos de coeficientes de variación y desviaciones estándares que son parte de funciones analíticas, tienen poca aplicación en el laboratorio de microbiología. Es

 

por ello que algunos expertos consideran que el control de calidad en microbiología es mas un arte que una ciencia. 

Un programa de control de calidad debe contar con los siguientes elementos mínimos:

Las pruebas y los procedimientos. Verificación y validación del test. Manual de procedimientos. Mantenimiento de reportes y libros de registros. Evaluación del personal. Controles externos. El programa evalúa y documenta el desempeño de todos los aspectos de un procedimiento. Esto incluye la calidad del espécimen, la eficiencia de los reactivos, medios e instrumentos y verifica los resultados del test por errores.

El Manual de Procedimientos del laboratorio de microbiología, debe contener todos los aspectos relevantes en la operación del laboratorio y la generación de reportes que tienen que ver con la salud de los pacientes.

El factor más importante en la generación de reportes microbiológicos de calidad corresponde al personal. El personal del laboratorio de microbiología debe ser escogido en base a sus cualidades académicas y personales. Debe poseer habilidad para ejecutar pruebas complejas, la mayoría de las veces manuales, interés en mantenerse al día en las ejecutorias y taxonomía bacteriana, excelente concepto de protección de grupo y de bioseguridad en general. 

El control de calidad en resumen, es un elemento vital en el laboratorio, ya que ayuda en la confiabilidad de las pruebas, su reproducibilidad, asegura la calidad de los materiales, reactivos y equipos empleados, mejora la auto confianza del personal, detecta fallas que pueden reflejarse en el informe de resultados y en general provee un entorno de excelencia en todos los aspectos del trabajo.

Conociendo los elementos básicos que debe poseer un programa de control de calidad moderno, los albores de un nuevo milenio nos obligan a la confección de un Manual que pueda ser una guía para el personal dedicado a la microbiología clínica en el país, una disciplina de las Ciencias del Laboratorio en constante evolución que marcha a la par del progreso de la medicina moderna.

PREPARACION DE LAS MUESTRAS CLINICAS CRITERIOS PARA LA OBTENCION, TRANSPORTE Y 

RECIBO DE MUESTRAS CLINICAS:

En términos de la efectividad del laboratorio de microbiología, nada es más importante que la apropiada selección, colección y transporte de las muestras clínicas.

Por ello todo el personal que tiene que ver con estas responsabilidades, debe comprender lo determinante que es el mantenimiento de la calidad de la muestra, en la evaluación e informe de un espécimen clínico. Es responsabilidad del laboratorio proveer ésta información en forma clara y que sea fácilmente incorporada en la metodología de trabajo de todas las salas de atención y hospitalización , el cual debe estar siempre accesible al personal de enfermería y médicos como una referencia.

Independientemente del hecho de que algunos tipos de muestras requieren metodologías de colección muy especiales, podemos enumerar algunos aspectos generales que deben ser tenidos en cuenta al coleccionar las muestras clínicas:

La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso. Cuando se va a proceder a tomar un espécimen clínico, es importante evitar la contaminación con microorganismos saprofitos del área. Esta flora normal puede interferir con la interpretación del cultivo y enmascarar la presencia del verdadero agente etiológico de la enfermedad. Seleccione el tipo anatómico correcto donde se obtendrá el espécimen, y utilice la técnica apropiada y los instrumentos o elementos adecuados para su obtención. En el caso de investigar microorganismos anaeróbicos, la biopsia y el aspirado con aguja, son las muestras de elección. Los hisopos y sistemas tipo Culturette son los menos deseables para este fin. Nunca refrigere una muestra por anaerobios.

Coleccione un apropiado volumen de muestra. Insuficiente material puede ser causa de resultados falso-negativos.

Identifique cada muestra con el nombre del paciente, número de identificación personal ( Número de seguro social o Cédula de identidad personal ), procedencia, tipo de muestra, fecha de colección e iniciales del funcionario que tomó la muestra. Coloque la muestra en un receptáculo adecuado para su transporte con el fin de asegurar la sobrevivencia del posible agente infeccioso, evitar derrame del espécimen y mantener las medidas de bioseguridad apropiadas. Ordene siempre un frotis por gram para los especímenes que proceden de cavidades asépticas, y anote su interés en determinado microorganismo.

GUIA PARA LA COLECCIÓN DE ESPECIMENES CLINICOS

ABSCESOS , FÍSTULAS y HERIDAS : Limpie la superficie del absceso o herida con solución salina estéril o alcohol etílico al 70%. Si el absceso es cerrado, preferiblemente aspire con aguja la muestra de la base o de la pared de la lesión Cultive por anaerobios también. En caso de absceso abierto , fístula o herida, introduzca un hisopo profundamente dentro de la lesión, sin tocar el área superficial ya que puede introducir en la muestra bacterias que están colonizando la superficie y no están envueltas en el proceso infeccioso. No cultive lesiones secas, a menos que esté presente el exudado. De ser necesario, puede refrigerar la muestra hasta por 1 hora antes de enviar al laboratorio. No envíe solo pus, ya que ésta no es representativa de la lesión. La base y bordes activos de la lesión son mas apropiados. 

HEMOCULTIVOS: Desinfecte el tapón de caucho del frasco de hemocultivos con alcohol etílico al 70%. No utilice solución de yodo para limpiar el caucho. Asépticamente desinfecte el sitio de la venopunción con alcohol etílico al 70% y luego con una preparación de yodo en círculos concéntricos hacia fuera del sitio elegido. Espere que el yodo seque y realice la punción sin palpar de nuevo. Coleccione la muestra de sangre a razón de 0.5 – 2 ml para niños y 5-10 ml para adultos en cada frasco. El volumen de sangre a cultivar es el factor más importante en la recuperación del microorganismo. Cada frasco debe ser servido con una punción diferente en diferentes tiempos, a menos que utilice a la vez frascos para organismos aeróbicos y anaeróbicos. Nunca llenar todos los frascos con sangre provenientes de una sola punción. No tomar sangre del catéter, a menos que se esté realizando un estudio epidemiológico. 

QUEMADURAS : Limpiar y desbridar la superficie de la quemadura antes de proceder a coleccionar la muestra. Una pequeña cantidad de tejido puede ser apropiada para el cultivo. Si hay supuración utilice un Culturette. Solicite cultivo aerobio solamente. 

CATETER : Limpie la piel alrededor del catéter con alcohol etílico al 70%. Asépticamente remueva el catéter y corte 5 cm de la punta distal y colóquela en un tubo o envase estéril sin medio de cultivo. Transporte inmediatamente al laboratorio para prevenir la desecación. Catéteres i.v aceptables para cultivos semicuantitativos son: 

Central, CVP, Hickman, Broviac, periférico, arterial, umbilical, hiperalimentación, Swan-Ganz.

LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO : Asépticamente desinfecte con tintura de yodo al 2%. Inserte una aguja con estilete en el inter espacio L3-L4, L4-L5 ( niños ) ó L5-S1.

Mida la presión del líquido. Coleccione de 1 – 3 ml de LCR en 4 tubos estériles previamente rotulados. Ordene en los tubos: Química, celularidad, frotis, cultivo, aglutinaciones. Si no logra obtener suficiente líquido, envíe lo colectado al laboratorio de microbiología primero. Envíe inmediatamente al laboratorio. Nunca refrigere el líquido cefalorraquídeo. En la requisición con los datos del paciente indique la edad y si ha habido antibioterapia previa.

6. ULCERA DE DECUBITO :

Limpie la superficie con agua jabonosa y solución salina estéril. Tome una muestra de biopsia de tejido o un aspirado con jeringuilla de la lesión. Un hisopo no es la mejor escogencia para colectar la muestra, sin embargo, cuando no es posible de otra forma, presione vigorosamente el palillo en la base de la lesión para tomar la muestra. 

OIDO : La timpanocentesis está reservada para casos complicados, recurrentes, que no responden a la antibioterapia y otitis media crónica. El espécimen de escogencia es un aspirado del tímpano, ya que éste fluido representa el proceso infeccioso, no así la flora del canal externo del oído. El hisopo no es recomendado para la colección de muestra para diagnosticar otitis media, ya que puede contaminarse con la flora externa. Solo en caso de ruptura del tímpano, se puede usar el hisopo para recoger el líquido. En éste caso se debe limpiar previamente con un antiséptico el canal del oído externo.

Indique en la orden médica si se trata de secreción de oído interno, o externo o líquido de timpanocentesis. No refrigere la muestra. No solicite cultivo por anaerobios. Transporte la muestra rápidamente al laboratorio. 

OJOS : Tome muestra de cada ojo con diferentes hisopos previamente humedecidos con solución salina estéril, rotando el algodón por la superficie de la conjuntiva. Esto es independiente de que solo un ojo esté infectado, ya que la muestra del ojo sano puede servir de control de la flora normal del paciente, y compararlo con el reporte del ojo infectado.

Indique en la muestra , en los medios enviados y en la orden médica, si es ojo derecho o izquierdo en cada caso. Inocule directamente en medios de agar chocolate, agar sangre, sabouraud-dextrosa agar y tioglicolato. Utilice otro hisopo para colectar muestra para frotis , el cual debe ser inmediatamente colocado en la placa. En el caso de raspado corneal, el método es el mismo, solo que se utiliza una lanceta o aguja estéril para realizar el raspado de la lesión y se adiciona una placa para frotis por KOH. No utilice el término " ojo " o " ocular " para identificar la muestra. Sea más específico al describirla: Secreción conjuntival, secreción corneal, secreción acuosa o vítrea, etc. 

HECES : Coloque la muestra dentro de un envase limpio, con cierre hermético y no necesariamente estéril. No solicite frotis por gram. No cultive si la muestra es dura o bien formada. No se recomienda el uso de Culturette, salvo para infantes y pacientes con diarrea activa. Si lo utiliza, recolecte mas de 2 g de muestra. Para estudios por Rotavirus y Clostridium difficile, envíe solo muestra diarreica, y no utilice hisopo. 

LIQUIDOS CORPORALES : LIQUIDO PERITONEAL, ASCITICO, BILIS, SINOVIAL, PERITONEAL, PERICARDICO, PLEURAL Y TORACICO : Desinfecte el área con tintura de yodo al 2%. Obtenga la muestra vía aspiración con aguja percutanea o cirugía. Transporte inmediatamente al laboratorio. Puede enviar la muestra para cultivo inoculándola en una botella para hemocultivos. Anótelo en el rótulo. Siempre envíe una apropiada cantidad de líquido, dependiendo de las pruebas que requiera. Nunca envíe la muestra en hisopo. 

LIQUIDO AMNIÓTICO: Coleccione por aspirado vía amniocentesis, cesárea o catéter intrauterino. 

La aspiración de la secreción vaginal no es aceptable debido a contaminación por la flora vaginal normal. Puede enviar en un tubo estéril o en un sistema de transporte para anaerobios. 

SECRECION DE GLANDULA DE BARTHOLINO : Limpie los genitales externos con agua y jabón y descarte el exceso de secreción. Pus del absceso de la glándula puede ser colectado por palpación digital del ducto. Solicite frotis y cultivo por Gonococos. Aspire el líquido del ducto preferiblemente con aguja y jeringuilla. Puede utilizar un sistema de transporte para anaerobios. 

CERVICAL O ENDOCERVICAL : Visualice el cérvix utilizando un especulo sin lubricante. Limpie el excedente de secreción. Remueva la mucosa y secreción del canal con un hisopo y descártelo. Con un nuevo hisopo estéril de alginato de calcio, dacrón o algodón no tóxico, obtenga muestra del canal endocervical. Preferiblemente inocule la muestra en un plato de Thayer-Martin y el resto envíelo al laboratorio. Con otro hisopo coleccione muestra para colocarla en una placa para frotis. Un cultivo anal puede ser colectado para acompañar la muestra cervical cuando se sospecha N.gonorrhoeae, ya que el recto podría ser el único sitio positivo post-tratamiento.

No refrigere la muestra. Envíe pronto al laboratorio de microbiología. 

VAGINAL : El cultivo rutinario de secreción vaginal no es apropiado debido a la presencia de alto número de microorganismos saprofitos en el área que hacen difícil la interpretación del cultivo. Descarte el exceso de secreciones externas Obtenga la secreción de la mucosa vaginal con un palillo estéril no tóxico o con una pipeta. Con otro palillo obtenga una muestra y colóquela en una placa para frotis directo. Esta placa puede servir también para confirmar vaginosis bacteriana, candidiasis vaginal o Tricomoniasis. No solicite cultivo por anaerobios. 

SECRECION URETRAL DAMAS : 

Colecte la muestra al menos 1 hora después que el paciente a orinado. Remueva el exudado del orificio uretral. Colecte la descarga de material en un hisopo no tóxico por masaje de la uretra. Si no hay descarga, lave la uretra externa con jabón Betadine y enjuague con agua. Inserte un hisopo 2 a 4 cm dentro de la uretra y rote el palillo. Envíe la muestra rápidamente al laboratorio. 

SECRECION PROSTATICA: Colecte la muestra al menos 1 hora después que el paciente a orinado. Limpie el meato urinario con jabón antiséptico y agua. Proceda a masajear la próstata a través del recto. Coleccione el fluido en un hisopo estéril y no tóxico o en un tubo estéril. También es muy útil para recuperar gonococos el cultivo de orina después del masaje prostático. 

SECRECION URETRAL VARONES : Colecte la muestra al menos 1 hora después que el paciente ha orinado. Inserte un hisopo urogenital 2-4 cm dentro del lumen de la uretra. Rote el hisopo..

Preferiblemente inocule directamente en un medio de Thayer-Martin. Utilice otro hisopo para tomar muestra para el frotis directo. La placa debe ser hecha en el sitio.

No refrigere la muestra. Envíe rápidamente al laboratorio. Solicite antígenos por Chlamydia y cultivo por Mycoplasma. No solicite cultivo por anaerobios. 

NASAL : Inserte un hisopo humedecido con solución salina estéril +/- 2 cm dentro de la fosa nasal. Rote el hisopo contra la mucosa nasal. Colóquelo en un medio de transporte. Envíe al laboratorio El cultivo de la fosa nasal anterior, solo está reservado para la detección de portadores de Staphylococcus aureus y/o Estreptococos betahemolíticos o en caso de lesión. No refrigere la muestra. El cultivo nasal no predice el agente etiológico de infecciones en oído medio o el tracto respiratorio inferior. No cultive por anaerobios. 

NASOFARINGEO: 

La muestra debe ser tomada evitando la contaminación con la flora nasal u oral. Lentamente inserte un hisopo de alginato de calcio dentro de la nasofaringe posterior, vía fosas nasales. Puede usar un especulo nasal. Rote lentamente el hisopo para absorber secreción. Inocule en medios de agar sangre y agar chocolate en el sitio o envíe al laboratorio. La muestra nasofaríngea es muy útil para detectar portadores de Meningococos o en caso de sospecha de tos ferina. El cultivo rutinario de la nasofaringe no es recomendado. 

FARINGE : Utilizando un depresor lingual presione la lengua hacia abajo para observar los pilares de la faringe y el área tonsilar para localizar el área de inflamación y exudado. Utilizando un hisopo de alginato de calcio o de Dacrón, rote el mismo sobre el área de exudado, las tonsilas y faringe posterior. No toque el resto del área de la cavidad oral o los dientes.

Envíe al laboratorio. Si el transporte demora, refrigere el Culturette hasta por 1 hora. No solicite frotis directo de faringe. Indique si requiere cultivo o prueba directa de detección de antígenos. Indique si hay sospecha de otro patógeno diferente a Estreptococos betahemolíticos ( Ejemplo N. Gonorrhoeae ). El cultivo de faringe está contraindicado en pacientes con epiglotis inflamada. 

ESPUTO POR EXPECTORACION : El esputo podría no ser la muestra apropiada para determinar el agente etiológico de neumonía bacteriana. La sangre, el lavado bronquial o el aspirado transtraqueal son mas seguros. Es recomendable que la muestra sea tomada en la mañana al levantarse. Haga que el paciente se enjuague la boca con agua antes de expectorar, para remover la flora superficial oral. Si el paciente tiene dentadura postiza, se la debe quitar. Instruya al paciente para que tosa con fuerza y profundo, tal que obtenga un esputo que provenga del tracto respiratorio inferior. Explíquele que es el esputo. Depositarlo directamente en un envase estéril. No colecte saliva ni fluido post-nasal. Ordene un frotis por gram para confirmar la validez del esputo. Para pacientes pediátricos que no pueden producir la muestra apropiada, un terapista respiratorio puede colectar la muestra por succión. Si la muestra no puede ser llevada al laboratorio, puede refrigerarse. Indique en la orden médica los microorganismos de interés, ya sea por bacterias, hongos o micobacterias, cada una con un formulario diferente. Para el diagnóstico de la tuberculosis colecte 2 muestras en días

consecutivos. ESPUTO INDUCIDO : Haga que el paciente se enjuague la boca con agua. Con ayuda de un nebulizador, haga que el paciente inhale aerosoles de una solución salina estéril al 3-10%. Colecte el esputo inducido en un envase estéril. 

ASPIRADO TRAQUEAL : Colecte el espécimen a través de una traqueotomía o tubo endotraqueal. Con cuidado pase el catéter de polyetileno a través del sitio dentro de la tráquea. Aspire el material de la tráquea utilizando una jeringuilla o un succionador intermitente. Remueva el catéter y descarte la jeringuilla. Envíe al laboratorio. No refrigere la muestra. 

ASPIRADO TRANSTRAQUEAL : 

Utilice este método cuando su resultado puede influir grandemente en la terapia, cuando los procedimientos no invasivos no han sido productivos, cuando la infección no está siendo controlada, cuando se sospeche infección por anaerobios o cuando el paciente está comatoso. Anestesie la piel del sitio de la colección y prepare asépticamente el área. Inserte una aguja calibre 14 a través de la membrana cricotiroidea. Pase un catéter de polyetileno calibre 16 a través de la aguja hacia la tráquea inferior. Remueva la aguja. Aspire la secreción con una jeringuilla de 20 ml o un succionador. Si la secreción es escasa, inyecte lentamente de 2 a 4 ml de solución salina estéril para inducir la tos, lo que usualmente produce un adecuado espécimen. Envíe el envase colector con el tubo incrustado al laboratorio prontamente. Evite la entrada de aire al envase colector. No refrigere la muestra. 

MUESTRA POR BRONCOSCOPIA : Colecte el espécimen vía broncoscopio. El cepillado bronquial es preferido al lavado, ya que el lavado es más diluido. Anestesie el área con Lidocaina tópica al 2% preferiblemente. Haga que el paciente inhale por la boca y exhale por la nariz. Lubrique ambas fosas nasales con Xylocaina en jalea. El paciente pudiera necesitar Demerol intravenoso para tolerar el broncoscopio. 

Lubrique el broncoscopio con Xylocaina al 2% en jalea, evitando tocar la punta distal. Introduzca el broncoscopio intranasalmente.

PARA LAVADO BRONQUIAL Sujete una trampa de Lukens al broncoscopio. Introduzca 10 ml de solución salina no bacteriostática a través del canal abierto. Succione el material desde afuera. Selle el tubo de la trampa y envíe al laboratorio. PARA CEPILLADO BRONQUIAL Utilice un broncoscopio de doble lumen. Inserte la brocha citológica dentro del canal abierto del broncoscopio y avance. Empuje la brocha fuera de su protector y realice el cepillado. Jale la brocha hacia dentro de su protector y remueva la unidad de brocha completa. Coloque la brocha dentro del tubo de transporte conteniendo solución salina o Ringer’s lactato. 

Recuerde que la brocha se seca al aire rápidamente, lo cual es negativo para el cultivo Envíe al laboratorio inmediatamente. Si desea estudio por micobacterias, puede colocar la brocha dentro de un tubo conteniendo 10 ml de caldo de Middlebrook 7H9. PARA LAVADO BRONQUIO-ALVEOLAR ( BAL ) : Sujete una trampa de espécimen de 70 ml al broncoscopio. Introduzca 100 ml de salina no bacteriostática a través del canal en pociones de 20 ml. Después de la tercera o cuarta inyección de salina, reemplace la trampa de 70 ml por una de 40 ml.. Envíe las trampas al laboratorio ó 10 ml de líquido de cada una en tubos estériles.  

COMENTARIO: El mayor problema con el lavado bronquial, es la inhibición de las bacterias por la solución anestésica.

El cepillado bronquial solamente obtiene 0.001 ml de muestra, por lo que la brocha debe ser rápidamente colocada en el líquido de transporte para evitar la desecación.

La muestra colectada vía broncoscopio puede ser fácilmente contaminada con la flora oral. Esto puede reducirse utilizando un broncoscopio de triple lumen.

El lavado bronquioalveolar es preferido especialmente cuando el cultivo

de esputo no ha sido satisfactorio. 

El análisis cuantitativo de la muestra por lavado broncoalveolar, es clínicamente más relevante que el análisis de la muestra de esputo.

ORINA POR VACIADO DIRECTO : Se recomienda recoger la primera orina de la mañana al despertar. Lave los genitales con jabón y abundante agua. Secar con un paño limpio. Dejar escapar la primera porción de orina y a continuación recoger la muestra directamente en un envase estéril. Enviar inmediatamente al laboratorio. Si no se puede, refrigerar la orina hasta por 2 horas. No utilizar orina de receptáculos. NO utilizar orina de pool de 24 horas . No solicitar cultivo por anaerobios. El frotis directo por Gram de orina de mujeres recolectadas por vaciado directo, no es del todo confiable, ya puede estar contaminado por microorganismos de la flora normal vaginal. 

ORINA POR CATETERIZACION : Limpie la porción del cateter donde se va a tomar la muestra de orina con alcohol etílico al 70 %. Inserte la aguja dentro del cateter y colecte la orina dentro de la jeringuilla. Transfiera la orina a un envase estéril. Enviar inmediatamente al laboratorio. En caso contrario refrigerar la orina. La colección de la orina por cateterización uretral tiene algún riesgo de forzar hacia la vejiga, parte de la flora normal uretral durante la inserción del catéter. Nunca recoja orina de la bolsa del catéter. No desconecte el catéter de su bolsa durante la colección de la muestra. Paciente con catéter por 48h – 72h pueden ser colonizados con múltiples cepas bacterianas. Indique en la orden médica si la orina ha sido colectada por catéter. 

ORINA POR ASPIRACION SUPRAPUBICA : Mediante técnicas asépticas descontamine y anestesie el área de la punción. Introduzca la aguja calibre 22 dentro de la vejiga entre el pubis y el ombligo. Aspire alrededor de 20 ml de la vejiga y transfiera la orina asépticamente a un envase estéril o tape la aguja y envíe la jeringuilla. 

Enviar inmediatamente al laboratorio, o refrigerar. Esta técnica evita la contaminación de la orina por microorganismos de la uretra o perianales. Es útil cuando se sospecha infección por anaerobios, en pacientes pediátricos si hay problema en la colección de la orina, pacientes con trauma en la médula espinal y en general en aquellos en que el método del vaciado directo o cateterización no ha sido posible. Indique en la orden médica cuando la orina ha sido colectada por punción suprapúbica. 

TRANSPORTE DE LA MUESTRA

La mayoría de las especies bacterianas son vulnerables a demoras en su procesamiento, cambios de temperatura, humedad, etc. Durante el transporte las bacterias de rápido crecimiento, pueden crecer sobre los patógenos más fastidiosos y de crecimiento lento o con requerimientos especiales, por lo que es vital en el éxito del cultivo que la muestra sea transportada y procesada con la celeridad necesaria. 

Todas las muestras deben ser enviadas inmediatamente al laboratorio después de colectadas. Se debe instruir al personal médico, de enfermería y mensajeros en la importancia de un transporte expedito de las muestras clínicas. En los casos en que el transporte o el procesamiento pudieran demorar, se establecen a continuación las condiciones de temperatura para algunos tipos de muestras: 

MANTENIMIENTO A 4 °C : Tejido de autopsia, lavado bronquial, catéter i.v , Biopsia de pulmón , 

líquido pericardico, esputo, orina., quemaduras, oído externo.

MANTENIMIENTO A TEMPERATURA AMBIENTE : Muestras de LCR, Líquido sinovial,, abdominal y amniótico, bilis, Cul-de-Sac, aspirado de pulmón, lesión, placenta, nasal, aspirado transtraqueal,

orina suprapúbica, raspado corneal, sangre, humor vítreo, médula ósea,

cérvix, conjuntiva, genitales, heces, nasofaríngeo, tracto respiratorio superior., heridas, cultivos por anaerobios, ocular, genital, oído interno. 

En general no guarde una muestra por mas de 24h bajo ninguna condición. Sin embargo, los virus permanecen estables por 2 a 3 días en medios de 

transporte apropiados.

El transporte óptimo de la muestra depende en gran parte del volumen obtenido. Mientras menor sea su volumen, con mayor rapidez debe transportarse. Microorganismos sensitivos a las condiciones ambientales, como N. meningitidis, N. gonorrhoeae y H. influenzae se recomienda sembrar 

directamente en platos en el sitio de colección de la muestra.

Si se anticipa que habrá demora en el envío de la muestra o si el cultivo ha de ser enviado a otro laboratorio, se recomienda utilizar medios de transporte adecuados como Stuart, Amies o Cary-Blair. No enviar hisopos. Tenga en cuenta que los medios de transporte están formulados para mantener la viabilidad de los microorganismos, sin embargo, algunos podrían no sobrevivir en un medio pobre en elementos nutricionales específicos.

Siempre que sea posible, las muestras deben ser enviadas directamente y en forma inmediata al laboratorio de microbiología, sin utilizar las áreas de recibo central u otros departamentos del laboratorio. 

CRITERIOS DE RECHAZO DE MUESTRAS CLINICAS : 

El personal del laboratorio debe tener siempre presente que los especímenes clínicos que son enviados para su evaluación, representan elementos de suma importancia en la detección, evaluación y control de enfermedades potencialmente peligrosas que aquejan al paciente y que la rapidez y eficiencia con que se logre obtener información de utilidad clínica de las mismas, tendrá repercusiones directas en la salud del paciente, el manejo racional y adecuado de los recursos del laboratorio, la seguridad del resto de los pacientes y el personal que allí labora, el control de los antibióticos, el tiempo de hospitalización, disminución de costos de operaciones y en general la credibilidad del laboratorio y el hospital en general. 

Por todo lo anterior las muestras que son recibidas por el laboratorio, deben ser apropiadamente colectadas, transportadas y procesadas. Estas muestras deben representar la causa probable de infección, de lo contrario el procesamiento y reporte de muestras no adecuadas puede proveer información equivocada, lo cual puede llevar a un mal diagnóstico y por consiguiente fallas en el tratamiento que pueden poner en peligro la vida del paciente.

Consecuentemente, el laboratorio debe poner en ejecución una política estricta de aceptabilidad y rechazo de muestras clínicas. 

Causales de rechazo de muestras clínicas :

Muestras no rotuladas o sin identificación. Discrepancia en la identificación del paciente y la muestra. Envase inapropiado o medio de transporte inadecuado. Demora prolongada en enviar la muestra al laboratorio. Duplicación de muestra del mismo paciente dentro de 24h, excepto sangre.

No indicar tipo de muestra o procedencia. No indicar tipo de examen en la orden. Muestra con preservativos. Muestra derramada o rotura del envase. Hisopos secos. Un solo Culturette con múltiples ordenes. Muestra para anaerobios en envase inapropiado. Cultivo por anaerobios de muestras con flora anaeróbica normal. Frotis de Gram por N. gonorrhoeae de muestras de cérvix, vagina y cripta anal, ya que pueden haber Neisserias saprófitas en el área. Cultivo por anaerobios de orina colectada por vaciado directo. Orina colectada de la bolsa del catéter. Saliva. Frotis directo por Gram de hisopos. Volumen inadecuado. Contaminación obvia de la muestra. Nota: El rechazo de una muestra debe estar acompañado de la solicitud de un nuevo especímen. Es conveniente notificarlo directamente al médico solicitante.

MUESTRAS DESAPROBADAS DEBIDO A SU CUSTIONABLE INFORMACION CLINICA : Hisopo superficial oral. Hisopo de úlcera de decúbito. Hisopo de úlceras varicosas. Hisopo de lesión superficial gangrenosa. Contenido de vejiga. Vómito. Punta de catéter Foley. Descarga de colostomía. Loquios. Aspirado gástrico de recién nacido. Frotis faríngeo, nasal, orina o heces. 

Muestras no adecuadas para cultivo por anaerobios :

Lavado bronquioalveolar desprotegido. Hisopo cervical. Aspirado endotraqueal. Loquios. Hisopo nasofaríngeo / Secreción faríngea. Líquido seminal o prostático. Esputo por expectoración o inducido. Heces o muestra rectal. Secreción uretral / hisopo vaginal o vulvar. Orina por vaciado directo o catéter. 

4. PRIORIDAD DE LAS MUESTRAS :

Todas las muestras deben ser procesadas lo más rápidamente posible al llegar al laboratorio. Sin embargo, su manejo puede ser clasificado de la siguiente manera, independientemente de su orden . 

MUESTRAS URGENTES

Sangre. LCR. ( Su estudio tiene Prioridad sobre cualquier otra muestra o trabajo ). Aspirado Transtraqueal Líquido pericardico. Líquido amniótico. Tracto respiratorio inferior. Muestras quirúrgicas de la sala de CIC. Líquido articular ( Artritis séptica ). Biopsia de Pulmón. 

Nota: Cuando éstas muestras se encuentran rotuladas con la advertencia "Stat" o

" Urgente", los resultados deben ser informados telefónicamente al médico solicitante.

MUESTRAS DE RUTINA

Boca. Líquido pleural. Quemaduras. 

Ocular. Orina. Genitales Muestras quirúrgicas. Líquido peritoneal. 

MUESTRAS ELECTIVAS

Líquido ascítico. Bilis. Líquido articular ( No artritis ). Líquidos intravenosos. Genitales Nasal. Oído. Nasofaríngeo. Rectal. Ulceras, vesículas. Piel. Post Mortem. 

CONTROL DE CALIDAD CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: 

Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos y la absorción de agua del exterior, así como la formación de agua dentro de la botella como consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente, favorecen el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de nutrientes, variaciones de Ph y cambios en el color del medio. Además la exposición a la luz puede llevar a importantes alteraciones en los constituyentes del medio de cultivo. Tomando en cuenta los factores antes señalados, los medios de cultivo deshidratados deben almacenarse siempre en lugares frescos, a temperatura ambiente y protegidos contra la humedad y la luz. La mayoría de los suplementos se guardan en refrigeración. Utilizando condiciones de almacenamiento adecuadas, los medios elaborados en polvo tienen una vida útil de al menos 3 años. El material que ha sufrido cambios substanciales, tales como hidratación, endurecimiento y cambio de color,

deben descartarse. Se debe mantener un registro de cada frasco de medio de cultivo deshidratado, con el nombre del producto, nombre y número telefónico de la casa proveedora, número de control del frasco, fecha de recibo, fecha de expiración, número de lote y fecha en que se abrió el frasco.

El grado de disolución de un medio deshidratado, así como la eficacia del mismo ya preparado, depende en gran medida del procedimiento empleado en la rehidratación. Se recomienda utilizar agua recién destilada o completamente desmineralizada y un erlenmeyer con capacidad del doble del medio que se quiere preparar. Si el medio va a distribuirse en tubos, debe agitarse constantemente para asegurar una adecuada homogenización al momento de servirlos. Cuando se va a esterilizar, debe asegurarse en seguir las instrucciones de tiempo, presión y temperatura para la obtención de medios de cultivo óptimos. Una temperatura de 121 °C , presión de 15 libras y un tiempo de esterilización de 15 minutos, son suficientes para la mayoría de los medios. Si no se dispone de autoclave, es posible esterilizar en marmita de 

vapor a 100 °C por 30 minutos. En tal caso la esterilización debe

repetirse durante 3 días consecutivos.

5) El medio esterilizado debe ser enfriado a 45°-60°C en un baño maría, para 

evitar la formación de agua de condensación. Al ser vertidos en las placas Petri, 

evitar la formación de burbujas y coágulos. Durante el proceso de servida, debe 

tomarse una muestra del medio para realizar el control de calidad por esterilidad 

y eficiencia.

El medio de cultivo reconstituido tiene una vida útil limitada. Si no se emplea de inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para garantizar su 

utilidad durante un periodo de tiempo. 

El almacenamiento a 4°C es el mejor para la mayoría de los medios. 

Sin embargo, aquellos que contienen Tioglicolato, deben guardarse a 

temperatura ambiente.

Los medios deben mantenerse preferiblemente en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar algunos de sus componentes. Para evitar la desecación se aconseja que se guarden en bolsas plásticas bien cerradas. Los platos Petri almacenados así, deben mantenerse con el fondo hacia arriba. Dado que los medios almacenados en refrigeración, cuando pasan a temperatura ambiente tienden a formar agua de condensación en la superficie, se recomienda poner los platos Petri en la incubadora a 35°C por 2 horas, colocándolos con el fondo hacia arriba para obtener una superficie seca. Esto es particularmente importante para que el agua no afecte la individualidad de las colonias en el aislamiento o en los casos de pruebas de sensibilidad a los antibióticos en los 

que el exceso de agua puede afectar la dilución de las colonias y por ende la 

lectura del halo de inhibición.

Cada lote preparado de medio de cultivo se prueba antes de su uso rutinario, por eficiencia o calidad, mediante la inoculación de microorganismos cuyo 

comportamiento conocemos, tanto para reacciones positivas como negativas. 

Puede utilizarse para ello cepas bacterianas domésticas o cepas control 

comerciales ( ATCC ).

Se debe guardar un libro de registro de los resultados obtenidos.

Evite el congelamiento de los medios preparados o la sangre de carnero. Al colocar en la refrigeradora los medios preparados, debe colocar los de más reciente preparación al fondo y los mas viejos adelante. Rotular todos los medios preparados, tanto en platos Petri como en tubos, indicando además, la fecha de preparación y expiración. 

PRUEBAS BASICAS DE CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS PREPARADOS:

Ph Esterilidad Capacidad de crecimiento y reacción Estabilidad 

CRITERIOS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS:

Rajadura del plato o envase. Rajadura en la superficie del medio. Variaciones en el volumen del medio. Hemólisis. Cristales en el medio. Presencia de burbujas. Presencia de coágulos. Cambio de color normal. Contaminación. Falla en la inhibición de microorganismos saprófitos. 

FALLAS Y CAUSAS EN LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO :

Valor de Ph incorrecto: Medir el Ph por encima de los 25°C. Sobrecalentamiento en la esterilización, vuelta a fundir o calentamiento prolongado a 50°C. Solución incompleta del medio. Mala calidad del agua. Recipiente mal lavado o con residuos químicos. Mala conservación del medio deshidratado o vencido. Turbidéz o precipitación : Mala calidad del agua. Sobrecalentamiento. Ph incorrecto. Solución incompleta. Oscurecimiento : Sobrecalentamiento. Solución incompleta. Alteración del Ph. Gel blando : Bajo porcentaje de agar en el medio. Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos. Sobrecalentamiento. Mala homogenización del medio. Exceso de agua. Crecimiento bacteriano pobre : Exceso de calentamiento. Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente. Alteración en el Ph. 

EVALUACION DE LA EFICIENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS :

MEDIO DE CULTIVO ORGANISMO CONTROL REACCION ESPERADA

TSI E. coli ácido/ácido

TSI Shigella flexnerii alcalino/ácido

TSI Pseudomona aeruginosa alcalino/alcalino

SIM Proteus mirabilis movilidad positiva

SIM K. pneumoniae movilidad negativa

Citrato de Simmons K.pneumoniae color azul. Crece

Citrato de Simmons E. coli color verde. No crece.

Caldo de urea Proteus mirabilis Rojo-Morado. Positivo.

Caldo de urea E. coli color Naranja. Negativo.

Agar sangre Estr.Betahem.Grupo B Crece. Betahemólisis.

Agar sangre S. pneumoniae Crece. Alfahemólisis. 

Agar sangre K.pneumoniae Crece. No hemolítico.

McConkey E. coli Crece. Colonias moradas.

McConkey Proteus sp Crece. Colonias claras.

McConkey Estafilococos No crece.

McConkey Sorbitol E.coli 0157:H7 Colonias claras. Sorbitol negativo

McConkey Sorbitol Proteus sp Colonias claras. Sorbitol negativo

McConkey Sorbitol Klebsiella sp Colonias rosadas. Sorbitol positivo

EMB E. coli Brillo metálico

EMB Proteus sp colonias Claras

Manitol Sal Estafilococos Colonias amarillas

Manitol Sal E. coli No crece.

SS agar Salmonella sp Crece. Colonias claras con H2S

SS agar E. coli No crece.

Agar alcohol-fenil etílico Estafilococos Crece.

Agar alcohol-fenil etílico E. coli No crece.

Thayer-Martin N. gonorrhoeae Crece.

Thayer-Martin E. coli No crece.

OF – medio E. coli Amarillo ambos tubos. Fermentador

OF – medio Pseudomona sp Un tubo amarillo. Oxidativo

OF – medio Moraxella sp Ningún tubo amarillo. Inerte

MEDIO DE CULTIVO ORGANISMO CONTROL REACCION ESPERADA

Lysina decarboxylasa Citrobacter freundii alcalino/ácido H2S +

Lysina decarboxylasa Proteus vulgaris Rojo/ácido H2S -

Lysina decarboxylasa Salmonella arizonae Alcalino/alcalino H2S +

Bili-Esculina Streptococcus mitis Incoloro

Bili-Esculina Enterococcus faecalis Negro

Caldo Malonato Klebsiella pneumoniae Azul

Caldo Malonato E. coli No cambia el color

NaCl 6.5% Streptococcus mitis No crece

NaCl 6.5% Enterococcus faecalis Crece

Sabouraud-Dextrosa agar Levaduras Crece

Sabouraud-Dextrosa agar Dermatofitos Crece

Sabouraud-Dextrosa agar Estafilococos Crece

Mycosel agar Levaduras Crece

Tioglicolato Flora mixta Crece

Selenita Flora mixta Crece en menos de 24h

Caldo Cerebro-Corazón Flora mixta Crece

CONTROL DE CALIDAD DE LOS SUPLEMENTOS :

Es importante tener en cuenta que los suplementos de los medios de cultivo, pudieran confrontar problemas de eficiencia o inhibición, ya que como todo 

producto pudiera no haber sido almacenado y/o transportado adecuadamente. 

Solo el uso rutinario de los medios de cultivo preparados con éstos 

suplementos, pudieran darnos la alarma de problemas en los mismos.

Muchos suplementos son lábiles al calor, por ello se añaden al medio después de la esterilización para evitar su deterioro.

Los medios preparados con la mezcla inhibidora VCN , deben ser utilizados dentro de los 8 días siguientes a su preparación ya que la eficacia de la mezcla 

decrece muy rápidamente. La misma advertencia es aplicable a los frascos de 

VCN rehidratados, por lo que conviene guardarlos congelados si no se va a 

usar de inmediato. No sobrepasar los 15 días.

En el caso de la sangre de carnero para la preparación del agar sangre, es importante cada vez que se reciba un nuevo lote, anotar su apariencia, observar por presencia de coágulos, hemólisis, número de lote, fecha de recibo y expiración, hacerle una determinación de hemoglobina, la cual debe medir entre los 13.0 - 15.0 g/dl, y por supuesto se debe tomar con una jeringuilla una pequeña muestra del vial para sembrarla en agar sangre y tioglicolato para determinar su esterilidad. También se debe examinar el agar sangre preparado con sangre de carnero, por adecuada formación de hemólisis, especialmente utilizando Estreptococos hemolíticos.

CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS : Un elemento fundamental en el trabajo diario del laboratorio, lo constituyen los reactivos, tanto comerciales como de preparación doméstica, que son utilizados en la caracterización de microorganismos. Estos reactivos merecen una especial atención, toda vez que fallas en su funcionamiento pueden generar en identificaciones equivocadas.

Por ello, se recomienda correr controles diarios con las bacterias tipo y seguir estrictamente las indicaciones en cuanto almacenamiento de los reactivos, metodología de la prueba y tiempo de lectura.

Es recomendable que los reactivos comerciales sean examinados inmediatamente cuando se abre un nuevo lote o vial y llevar un registro de su funcionamiento. 

REACTIVO MICROORGANISMO REACCION ESPERADA

Coagulasa Staphylococcus aureus Coágulo. Coagulasa positiva

Coagulasa Cepa ATCC 25923 Coágulo. Coagulasa positiva

Coagulasa Stafilococcus epidermidis Inerte. Coagulasa negativa

Oxidasa Pseudomona aeruginosa Negro. Oxidasa positiva

Oxidasa E. coli Inerte. Oxidasa negativa

Catalasa Staphylococcus sp Burbujas. Catalasa positiva

Catalasa Streptococcus sp Inerte . Catalasa negativa 

Betalactamasa S. aureus ATCC 29213 Rojo. Positiva

Betalactamasa H. influenzae ATCC 10211 Inerte. Negativa 

Optoquina S. pneumoniae Halo de >/= 12 mm

ONPG E. coli Amarillo. Positivo

ONPG Proteus sp Incoloro. Negativo

Ehrlich E. coli Anillo rojo. Indol positivo

Ehrlich K .pneumoniae Incoloro. Indol negativo

Cloruro férrico Proteus sp Verde. Fenilalanina positivo 

Cloruro férrico E. coli Incoloro. Fenilalanina negativo

REACTIVO MICROORGANISMO REACCION ESPERADA

Sobres de Anaerobiosis Bacteroides sp Crecimiento en Anaerobiosis

Suero para tubos germinales Candida albicans Tubos germinales positivo

CONTROL DE CALIDAD DE LOS TINTES : La clasificación correcta de las bacterias de acuerdo a las reacciones bioquímicas, dependen de la pureza, reactividad y estabilidad de los reactivos. La concentración de las soluciones por efecto de la evaporación de los solventes o las variaciones introducidas en los métodos recomendados, puede afectar los resultados de modo adverso. Este es el caso de las tinciones para diferenciar bacterias por su reacción al Gram y la morfología bacteriana, tintes para cápsulas, esporas, etc.

El control de calidad de éstos tintes debe realizarse primero con cada nuevo lote preparado; luego basta con un control cada semana para mantener un grado de seguridad apropiado en su uso.

En el caso de la tinción de Gram, sin lugar a dudas una de las herramientas más importantes del microbiólogo, se recomienda tener especial cuidado con la mezcla de alcohol-acetona para decolorar la placa. Es posiblemente éste reactivo el que produce mayores problemas ya sea por decoloración excesiva o por débil decoloración de los microorganismos. Es también la etapa de la tinción de Gram en la que el tiempo de exposición es más determinante.

Para facilitar el control de los tintes, se recomienda preparar placas con microorganismos aislados en el trabajo rutinario, utilizando cepas frescas, tomando en cuenta aquellos que pudieran ser más útiles según la tinción a evaluar.

Algunos ejemplos son :

TINCION MICROORGANISMO REACCION ESPERADA

Gram Estafilococo sp Morado. Gram-Positivo.

Gram E. coli Rosado. Gram-Negativo.

Gram Mezcla de ambos Mezcla de ambas colores.

Zielh-Neelsen Mycobacterium sp Rosadas. BAAR positivo

Zielh-Neelsen E. coli Azul. BAAR negativas.

Kellung S. pneumoniae Detección de cápsula positiva

Kellung E. coli Detección de cápsula negativa

Verde malaquita Clostridium sp Espora de color verde.

Resto de la célula rosada.

Verde malaquita E. coli Célula completa rosada.

ALGUNAS CAUSAS DE ERROR DURANTE LA TINCION :

El Violeta Cristal tiende a hacer precipitación, lo cual puede ser causa de observación de estructuras ficticias en el frotis. Si se observa precipitación, proceda a filtrar el tinte. La evaporación puede ser causa de mal funcionamiento de los tintes. Las placas que no han sido previamente limpiadas o con restos de grasa, pueden ser causa de mala fijación y tinción de la muestra . Sobrecalentamiento de la placa durante la fijación. El exceso de calor provoca un daño físico en la pared celular de las bacterias que puede afectar la retención de los colorantes. Lavado muy fuerte de la placa durante la tinción. Proporción no adecuada de los componentes de la tinción. Algunos tintes como Safranina y Fucsina básica pueden contaminarse. Si se sospecha esto , cultive 1 ml en Tioglicolato, o descarte el tinte. La tinción de Zielh-Neelsen tiene sus limitaciones en cuanto a no ser específica para micobacterias y su baja sensibilidad, ya que el nivel de detección es de 5,000 a 10,000 bacilos por mililitro de esputo. Esto debe ser tenido en cuenta al evaluar una placa. Una Cepa Control positiva, debe ser teñida cada vez que un nuevo lote de tintes para Zielh-Neelsen es preparado y cuando se reciba un nuevo pedido de tintes y reactivos. Se puede utilizar la cepa de Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177 como control positivo. 

CONTROL DE CALIDAD DE ANTISUEROS : 

El mundo de la microbiología ha sido inundado cada vez más por productos comerciales hechos con el objetivo de detectar agentes etiológicos de enfermedades en el menor tiempo posible, con el mayor grado de especificidad , sensibilidad y algunos de ellos con la intención de eliminar el cultivo bacteriano como única forma diagnóstica. Estos sistemas actúan algunos con solo la muestra del paciente y otros requieren de la cepa aislada o detectan sus metabolitos. Estos sistemas se han convertido en un arma imprescindible para el microbiólogo y en muchos casos dan confianza en la seguridad del diagnóstico y en otras se utilizan en la detección de microorganismos difíciles de cultivar.

Estos productos para la detección directa del espécimen o la cepa bacteriana, son considerados exámenes bacterianos y no test serológicos. En forma general éstos kit deben ser probados cada vez que se recibe un nuevo lote y cada vez que se utilicen, se le deben correr sus controles positivo y negativo que vienen con cada kit.

CONSIDERACIONES GENERALES EN EL USO DE ANTISUEROS :

Los sistemas son para uso exclusivo de diagnóstico in vitro. Conservar todos los reactivos en refrigeración. Anotar la fecha en que se abre el kit. No congelar los reactivos. No utilizar los reactivos si se sospecha deterioro de los mismos, tales como si se observa cambio de color, autoaglutinación en el envase, no producen la reacción esperada con los controles respectivos, reactivos contaminados o con signos de evaporación. El personal de laboratorio calificado, debe utilizar las técnicas asépticas y las precauciones habituales para protegerse de los agentes infecciosos. Nunca pipetear con la boca las muestras y/o los reactivos. No utilizar reactivos de lotes diferentes. No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. Después de sacar los reactivos de la refrigeradora, dejarlos a temperatura ambiente antes de utilizar. Todos los productos inoculados deben ser considerados como potencialmente infecciosos. No volver a utilizar las tarjetas desechables , después de haber sido utilizadas. Algunas pruebas deben estar precedidas por su apropiado cultivo, aislamiento y pruebas bioquímicas preliminares, antes de realizar métodos serológicos y una identificación final. 

Al terminar la prueba, todo el material sucio y productos inoculados deben ser sometidos a esterilización por autoclave, incinerados o sumergidos en un desinfectante germicida adecuado, antes de su eliminación. La interpretación de los resultados debe ser hecha por personal calificado, que tomará en cuenta el contexto clínico, el origen de la muestra, los aspectos macro y microscópico y su experiencia. Aglutinación por Antígenos de Estreptococos : Un test positivo está indicado por la aparición de una aglutinación nítida de látex en 2 minutos en un círculo, lo cual permite la identificación de grupo. No tomar en cuenta las aglutinaciones débiles que pudieran aparecer en otros círculos. Una aglutinación intensa en varias suspensiones de látex, representa una mezcla de grupos o una cepa autoaglutinable. Volver a hacer el aislamiento de la colonia y el test de látex. Una vez a la semana verificar la reactividad de las suspensiones bacterianas. Para ello seguir las indicaciones del fabricante y reemplazar la cepa a analizar , por el control positivo. Debe aparecer una aglutinación en cada suspensión látex. También la especificidad del test se puede analizar utilizando cepas control como el Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ó seguir la técnica sin emulsionar colonias en la enzima de extracción, o mezclar los reactivos de látex con una gota de NaCl 0.15 mol/l. No debe aparecer aglutinación en las suspensiones de látex. Pueden aparecer resultados falsamente negativos si se estudia una cantidad insuficiente de colonias Cuando se utiliza el método de detección directa de antígenos en muestras del tracto respiratorio superior, hay que tener en cuenta la baja sensibilidad del test, por lo que todo resultado negativo debe ser seguido por su correspondiente cultivo para verificar. 

17) Detección de antígenos asociados a meningitis bacteriana : 

El antígeno de N.meningitidis grupo B es más difícil de detectar, ya que está relacionado estructural e inmunologicamente con el antígeno de E.coli K1. Por ello una reacción positiva con éste antisuero en LCR de recién nacido o prematuro, indica en la mayoría de los casos la presencia de E.coli K1. En un sujeto de más edad, si puede indicar la presencia de N. meningitidis grupo B. La sensibilidad de éste látex de aglutinación tiene un rango entre 65% para S. pneumoniae y 95% para H. influenzae.

Como otras pruebas de látex, un valor positivo depende del nivel de antígenos detectable. Este es un test de descarte, que no reemplaza al cultivo. Cada laboratorio debe evaluar la sensibilidad, especificidad y valor predecible para su población de pacientes. 

18) Aglutinación por Salmonella sp :Sea estricto en el tiempo de la reacción. Miembros del grupo Salmonella están antigénicamente relacionados a Citrobacter y Arizona. Antígenos de éstos microorganismos tienen estructuras compartidas, por lo que puede haber reacciones cruzadas. 

Por esto es importante que la prueba de aglutinación por Salmonella solo se realice a aquellas cepas que muestran patrón bioquímico del género Salmonella.

5. CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD

A LOS ANTIBIÓTICOS MEDIANTE DISCO:

Hemos querido resaltar los aspectos de control de calidad de la prueba de sensibilidad a los antibióticos por difusión simple en agar, utilizando discos de sensibilidad, ya que es la prueba de mayor utilidad en nuestro medio.

Es importante tener presente que ésta prueba a sido designada exclusivamente para examinar microorganismos de rápido crecimiento, utilizando la normativa

NCCLS M2-A6 , volumen 13, número 24. 

Este método no es útil para organismos fastidiosos, de crecimiento lento o para anaerobios.

El método de difusión simple en agar es sin lugar a dudas el sistema de mayor uso para la realización de la sensibilidad bacteriana. Hay que tener en cuenta el gran valor de ésta prueba en la detección temprana de multiresistencia, escogencia y valoración de un antibiótico frente a un microorganismos patógeno, protección de infección, estudios epidemiológicos, etc .

La prueba de sensibilidad a los antibióticos consta de varios elementos que deben ser tenidos en cuenta: El medio de cultivo, inoculo, incubación, lectura e interpretación y el reporte. 

Control de calidad del medio de cultivo: Utilizar agar de Mueller-Hinton. La calidad del agua es determinante, ya que la misma debe estar libre de iones metálicos. Las variaciones de cationes divalentes, principalmente calcio y magnesio, afectará los resultados con aminoglicósidos, tetraciclina y colistina, cuando se prueban ante cepas de Ps. Aeruginosa. Un contenido excesivo en catión, reducirá la zona de inhibición, mientras que un escaso contenido en catión, puede dar un inaceptable aumento en el tamaño de la

zona. Servir en platos Petri grandes de 150 x 15 mm preferiblemente o 100 x 15 mm, con una profundidad de 4 a 5 mm

Aproximadamente se utilizan 25 cc para platos de 100 mm y 60 cc para platos de 150 mm.

5. Volúmenes mayores de medio provocan disminución en el tamaño del 

halo de inhibición, y volúmenes menores halos más pequeños.

6. Se deben seguir las normas generales establecidas para almacenamiento 

del medio de cultivo.

7. Los platos Petri deben ser colocados en la incubadora para secarlos de 

restos de agua producto de la condensación, antes de ser utilizados para 

no diluir el inoculo bacteriano.

Control de calidad de los discos de sensibilidad: Las metas de un programa de control de calidad van destinadas a monitorear: 

La precisión y exactitud del procedimiento de la prueba de susceptibilidad, el comportamiento de los reactivos utilizados en la prueba y la actuación de las personas que llevan a cabo las pruebas y sus resultados. 

Los discos deben ser almacenados a un temperatura entre –20 y +8°C. Algunos discos, especialmente los de antibióticos ß-lactámicos deben guardarse congelados a -20°C. Solo los viales en uso deben mantenerse a temperatura de refrigeración.

Al sacarlos de la refrigeradora para su uso, espere a que los viales alcancen la temperatura ambiente por 1 a 2 horas.

Siempre utilice primero los viales con fecha de caducidad más próxima. Siempre que un cartucho a sido extraido del paquete, éste debe guardarse en un desecador que cierre perfectamente. Cuando se utilice el aparato dispensador que contiene los discos deberá mantenerse siempre refrigerado. Los discos son colocados en el medio a una distancia de más de 24 mm del centro de uno al centro del otro. En todo caso no colocar más de 12 discos en una placa de 150 mm, ni más de 5 discos sobre la placa de 100 mm. 

Procurar no colocar discos de antibióticos bactericidas ( Ej. Penicilina, Cefalosporinas, Aminoglicósidos, Vancomicina ) al lado de antibióticos bacteriostáticos ( Ej. Cloranfenicol, Tetraciclina, Sulfonamidas ) para evitar el antagonismo antibiótico.

Colocar las placas en la incubadora dentro de los 15 primeros minutos después de su aplicación.

Para verificar el estado de los discos de sensibilidad, utilice cepas control ATCC, las cuales son seleccionadas por su estabilidad genética y por su utilidad en el método utilizado. Estas cepas se corren como una muestra más y se correlaciona el tamaño de los halos de inhibición con las medidas expresadas en los Manuales NCCLS M2-A6. 

Entre las cepas ATCC ( American Type Culture Collection ) recomendadas están:

Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Haemophilus influenzae ATCC 49247 y 49766

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226

Escherichia coli ATCC 25922 y 35218 

( La E coli 35218 como organismo de control para combinaciones con inhibidor de betalactamasa, como aquellos que contienen ácido clavulánico, sulbactam o tazobactam ).

Staphylococcus aureus ATCC 25923 y 29213

Pseudomona aeruginosa ATCC 27853

Enterococcus faecalis ATCC 29212 

( Para ser utilizado con discos de alto contenido de Aminoglicósidos ).

EL ESTANDAR McFARLAND :

La densidad de la turbidez del Estándar McFarland deberá ser verificada utilizando un espectrofotómetro con dirección de luz de 1 cm y cubetas adecuadas para determinar absorbancia. Para realizar el control de un estándar McFarland de 0.5 , la absorbancia deberá leer entre 0.08 a 0.10 a una longitud de onda de 625 nm.

La suspensión de Sulfato de Bario deberá transferirse en alícuotas de 4 a 6 ml dentro de tubos con rosca. Estos tubos deberán guardarse a temperatura ambiente en un lugar fresco y oscuro. Antes de ser usados, los patrones deberán agitarse para una adecuada homogenización. Mensualmente los patrones son descartados y vueltos a preparar, o en su defecto se debe comprobar su densidad. 

Habituales causas de error en la prueba con disco:

Error administrativo en la transcripción de los datos del control de calidad. Lectura errónea al medir el diámetro de la zona. Contaminación u otros cambios en la cepa control. Suspensión del inóculo demasiado fuerte o demasiado débil. Mala agitación del estándar McFarland o estándar dañado. Incorrecta temperatura, tiempo o atmósfera de incubación. Perdida de la potencia del disco durante su transporte, su manejo o su almacenaje en el laboratorio. 

3) Control de calidad de la lectura e interpretación:

Cuando se va a determinar la sensibilidad del S. Pneumoniae a la Penicilina, utilizar un disco de Oxacilina de 1 µg.

Las cepas de S. Pneumoniae con zonas de Oxacilina de >/- a 20 mm

son susceptibles a penicilina ( CIM </- 0.06 µg/ml ). 

Se recomienda utilizar un disco de Oxacilina de 1 µg para probar Resistencia a Oxacilina y Meticilina de los Estafilococos. Esto se debe a que la Oxacilina es más resistente a la degradación durante el almacenaje y porque es más probable que detecte a las cepas heteroresistentes de Estafilococo.

Las pruebas para detectar Estafilococos Meticilina Resistentes ( MRSA), deben incubarse a 35° C por 24 horas exactas.

Los Estafilococos meticilina resistentes deberán informarse como resistentes a todos los Cefems y otros betalactámicos, así como Ampicilina/ácido clavulánico, Ampicilina/Sulbactam, Ticarcilina/ácido

clavulánico, Piperacicilina/Tazobactam e Imipenem, independiente de los resultados in vitro con dichos agentes.

Los Enterococos pueden ser resistentes a Penicilina y a Ampicilina debido al desarrollo de poca afinidad de las proteínas fijadoras de penicilina ( PBP’s) o a la producción de betalactamasa. Las pruebas de difusión en disco pueden detectar con exactitud los aislamientos que poseen alteradas las PBP’s , pero no detectarán con fiabilidad las cepas productoras de betalactamasa. Estas últimas han de detectarse con pruebas directas de betalactamasa ( Ej. Cefinasa ). Las placas han de leerse con luz transmitida para visualizar cualquiera 

pequeña colonia dentro del halo, que haría la cepa resistente.

Todo caso de Estafilococo resistente a la Vancomicina, debe ser confirmado, enviado a un laboratorio de referencia e informar a las 

Autoridades de Salud Pública.

Cuando se trata de Sulfonamidas, los microorganismos deben desarrollarse por varias generaciones antes de que ocurra inhibición, por lo que se hace caso omiso del crecimiento leve, al igual que de un vestigio de proliferación dentro del halo de inhibición. Si se observan colonias dentro de un halo de inhibición, deberá confirmarse la pureza de la cepa y repetir la prueba. La difusión ( " swarming ") de los Proteus sp no es inhibida por todos los antibióticos, por lo que no se toma en cuenta. Ocasionalmente se pueden observar varis colonias esparcidas por una zona de inhibición. Este fenómeno es constante para la Serratia sp y la Polimixina. Las colonias se considerarán significativas y la cepa resistente Solo es necesario probar una Tetraciclina y sus resultados son equivalentes a la Tetraciclina, Minociclina, Doxiciclina. Los resultados obtenidos con al Polimixina, pueden aplicarse a la Colimicina. Su halo es pequeño debido a su pobre difusión en agar. Se ha informado que algunas cepas de Providencia sp dan resultados de sensibilidad falsos con discos de Cefprozil , las cepas de éste género 

no deben analizarse ni informarse con éste disco.

Los Estafilococos resistentes a la Meticilina, Oxacilina o Nafcilina, también puede ser informados como resistentes a la Penicilina, Cefalosporinas , carbapenem y combinaciones de inhibidores de betalactamasa, a pesar de su aparente sensibilidad in vitro, lo cual no se refleja in vivo. La Cefalotina puede utilizarse para representar Cefalotina, Cefradina Cefaclor y Cefadroxil Los datos de sensibilidad al ácido nalidíxico, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Sulfonamidas y Trimethoprim, se aplican solamente a cepas aisladas de infecciones urinarias. 

El disco de Sulfisoxazol puede ser usado para representar cualquiera de las Sulfonamidas disponibles. 

En cepas de Salmonella y Shigella, solo Ampicilina, una Quinolona y Trimethoprim/sulfametoxazol deben ser probados e informados de rutina en heces. Además el Cloranfenicol y una cefalosporina de tercera generación deben ser probados e informados en cepas de Salmonella sp extraintestinal. En cepas de Salmonella sp y Shigella sp, los aminoglicósidos y las cefalosporinas de primera y segunda generación, pueden aparecer como activos in vitro pero no son efectivos clínicamente y no deben ser informados como susceptibles. La prueba de la betalactamasa predice la resistencia a la Penicilina, Ampicilina y Amoxicilina. Las cefalosporinas pueden aparecer activas in vitro contra Listeria sp, pero no son efectivas clínicamente y no deben ser informadas como susceptibles. Los Enterococos sp las cefalosporinas, los aminoglicósido ( Excepto por resistencia de nivel alto ), Trimethoprim/sulfametoxazole y la Clindamycina, pueden aparecer activos in vitro pero no son efectivos clínicamente y éstas cepas no deben informarse como susceptibles. La susceptibilidad y resistencia a Azitromicina, Claritromicina y Diritromicina puede ser interferida por la prueba de Eritromicina. Solo los resultados de las pruebas de Ampicilina, una cefalosporina de tercera generación, el Cloranfenicol y Meropenem deben ser informados de rutina en todas las cepas aisladas de H. influenzae aisladas de sangre y LCR de pacientes con infecciones severas. Los resultados de las pruebas de susceptibilidad con Penicilina, Cefotaxime o Ceftriaxone, Meropenem y Vancomicina, deben ser informados de rutina en cepas de S. pneumoniae aisladas de sangre y LCR de pacientes con infecciones severas como meningitis y bacteremia. 

Verificación de antibiogramas atípicos :

Examine primero por errores de trascripción. Reexamine el plato de sensibilidad. Evalué reportes previos del paciente para observar su patrón de sensibilidad anterior. Repita los test de identificación y sensibilidad a los antibióticos. 

Condiciones sugeridas que requieren verificación del resultado de 

Sensibilidad a los antibióticos :

S. aureus resistente a Oxacilina. S. pneumoniae resistente a Penicilina. Cefalosporinas de amplio espectro ( Cefotaxime, Ceftriaxone ) resistente a S. pneumoniae. Streptococcus viridans penicilina resistente o intermedio, aislados de áreas estériles del cuerpo. Estafilococos o Enterococos resitentes a la Penicilina o intermedio. Enterococos con altos niveles de resistencia a la Gentamicina aislados de áreas estériles del cuerpo. Klebsiella sp o E. coli con potencial espectro de betalactamasa. ( Ej. Resistente a Ceftazidime ).

Bacilos Gramnegativos no fastidiosos resistentes a Gentamicina- Tobramicina-Amikacina.

S. maltophilia resistente a Trimethoprim-Sulfametoxazole. H. influenzae Ampicilina resistente y betalactamasa negativa. 

Un aislamiento para el cual el antibiograma es atípico para la especie. Ampicilina y/o Cefalotina susceptible para Enterobacter sp, Citrobacter freundii, Serratia marcescen y Ps. Aeruginosa.

Klebsiella sp sensible a Ampicilina. Bacilos Gramnegativos Imipenem resistentes o intermedio, excepto S. maltophilia.

Bacilos Gramnegativos Ciprofloxacina resistente, excepto S. maltophilia o B. cepacia.

Control de calidad de la sensibilidad a los antibióticos en los sistemas computarizados :

Los Laboratorios de Microbiología modernos tienen a su alcance una creciente gama de sistemas computarizados para la identificación de los microorganismos y su susceptibilidad a los antibióticos. Algunos de estos sistemas traen consigo programas de computadora para ayudar a evaluar el control de calidad de los mismos. En algunos casos, la computadora hace un control periódico de su funcionamiento mediante comandos u ordenes preestablecidas.

Debido a que en nuestro medio existe solamente el Sistema Vitek de identificación microbiana, solo haremos algunas observaciones relativas a éste sistema. 

El Sistema Vitek utiliza una determinación turbidimétrica de la rapidez de crecimiento del microorganismo, en presencia de agentes antimicrobianos para obtener un análisis de regresión lineal y posteriormente determinar un algoritmo derivado de la concentración inhibitoria mínima ( CIM ).

Actualmente el laboratorio cuenta con un grupo limitado de tarjetas Vitek para la sensibilidad a los antibióticos, tal como sigue:

Sensibilidad de los Gramnegativos: 1. GNS : Para uso en Policlínicas y área hospitalaria.

GNS-PA : Para uso hospitalario – Cuidados intensivos. GNS-GD : Uso hospitalario – Líquidos corporales GNS-OP : Uso exclusivo para urocultivos. Sensibilidad de los Grampositivos: 1. GPS-SA : Para Estafilococos y bacilos Grampositivos.

2. GPS-TA : Para Estreptococos, inclusive Enterococos. 

Al hacer el control de calidad de las tarjetas de sensibilidad a los antibióticos, se recomienda utilizar cepas ATCC con CIM conocidas. Estas pruebas se pueden realizar una vez al mes durante 10 días seguidos, en los cuales se aceptan no más de 2 valores de CIM para cada combinación de Antibiótico/Organismo fuera del rango establecido.

Si se diera el caso de deben correr controles de calidad con cepas ATCC durante 30 días consecutivos, en los cuales no se aceptan más de 3 valores fuera de rango. Si los hay, llamar al Departamento de Servicio de Vitek para el chequeo correspondiente.

Para realizar los controles se recomiendan las siguientes cepas ATCC para las tarjetas respectivas:

TARJETA CEPAS ATCC

GNS E. coli ATCC 25922 / Ps. aeruginosa ATCC 27853 

E. faecalis ATCC 29212

GNS-PA E. coli ATCC 25922 / Ps. aeruginosa ATCC 27853

TARJETA CEPAS ATCC

GNS-GD E. coli ATCC 25922 / Ps. aeruginosa ATCC 27853

E. coli ATCC 35218 / E. faecalis ATCC 29212

GNS-OP E. coli ATCC 25922 / Ps. aeruginosa ATCC 27853

E. coli ATCC 35218 / E. faecalis ATCC 29212 

GPS-SA E. faecalis ATCC 29212 / S. aureus ATCC 29213

E. coli ATCC 35218

GPS-TA E. faecalis ATCC 29212 / S. aureus ATCC 29213

Las tarjetas de sensibilidad a los antibióticos del Sistema Vitek, han sido comparado con los estándares de la NCCLS, mediante las técnicas de microdilución para obtener la CIM; sin embargo, bioMérieux Vitek recomienda la utilización de métodos alternos para confirmar la susceptibilidad a ciertos microorganismos contra drogas específicas.

TARJETA ANTIBIOTICO MICROORGANISMO

GNS Ampicilina A. lwoffii, Aeromona sp, Citrobacter sp

GNS Carbenicilina Acinetobacter lwoffii

GNS Cefoxitin A. lwoffii, Aeromona sp.

GNS Cefalotina Aeromona sp

GNS Trimeth/Sulfa A. lwoffii, Aeromona sp 

GNS-PA Ceftazidime A. jejunii, A. lwoffii

GNS-PA Imipenem Aeromona sp

GNS-PA Mezlocilina Aeromona sp 

GNS-PA Piperacilina A. jejunii, A. lwoffii

Aeromona sp , Ps. aeruginosa

GNS-PA Ticarcilina A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp

GNS-GD Ampicilina A. jejunii, A. lwoffii, 

Aeromona sp, Citrobacter sp

GNS-GD Cefazolina Aeromona sp

GNS-GD Cefoxitina A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp

GNS-GD Imipenem Aeromona sp

GNS-GD Piperacilina A. jejunii , A. lwoffii,

Aeromona sp, Ps. aeruginosa

TARJETA ANTIBIOTICO MICROORGANISMO

GNS-GD Ticarcilina/Acido clavulánico Aeromona sp, Ps. aeruginosa

GNS-GD Trimetho/Sulfametoxazole A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp

GNS-OP Acido nalidíxico Pseudomona sp ( diferente a Ps. aeruginosa)

GNS-OP Ampicilina A. jejunii, A. lwoffii,

Aeromona sp, Citrobacter sp

GNS-OP Carbenicilina A. jejunii , A. lwoffii

GNS-OP Cefalotina Aeromona sp

GNS-OP Ceftriaxone Klebsiella sp

GNS-OP Norfloxacina Acinetobacter sp

GNS-OP Trimetho/Sulfametoxazole A. jejunii, A.lwoffii, Aeromona sp

GPS-SA Eritromicina Enterococcus sp, Estreptococos grupo D

GPS-SA Tetraciclina Estafilococos coagulasa negativa,

Enterococcus sp, Estreptococos grupo B,

Estreptococos grupo D.

GPS-SA Vancomicina Enterococcus sp.

GPS-TA Cloranfenicol Staphylococcus sp

GPS-TA Eritromicina Estafilococos coagulasa negativa,

Enterococcus sp, Estreptococos grupo B,

Estreptococos grupo D

GPS-TA Vancomicina Enterococcus sp

Existe un grupo de microorganismos en que se desconoce la capacidad de las tarjetas de sensibilidad para detectar resistencia a antibióticos específicos, debido a que las cepas resistentes no estaban disponibles en el momento de realizar los test comparativos. Entre ellos tenemos :

TARJETA ANTIBIOTICO MICROORGANISMO

GNS Amikacina Aeromona sp

GNS Cefalotina A. lwoffii

GNS Gentamicina Aeromona sp

GNS Tetraciclina A. lwoffii

GNS Tobramicina Aeromona sp

GNS-PA Amikacina Aeromona sp

GNS-PA Aztreonam A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp

GNS-PA Ceftazidima Aeromona sp

TARJETA ANTIBIOTICO MICROORGANISMO

GNS-PA Ciprofloxacina Aeromona sp

GNS-PA Gentamicina Aeromona sp

GNS-PA Tobramicina Aeromona sp

GNS-GD Cefazolina A. jejunii, A. lwoffii

GNS-GD Cefotaxime A. jejunii, A. lwoffii, 

Aeromona sp, Citrobacter sp

GNS-GD Ciprofloxacina Aeromona sp

GNS-GD Gentamicina Aeromona sp

GNS-GD Tobramicina Aeromona sp

GNS-OP Acido nalidíxico A. jejunii, A. lwoffii

GNS-OP Amoxicilina/Acido clavulánico A. jejunii, A. lwoffii

GNS-OP Cefalotina A. jejunii, A. lwoffii

GNS-OP Ceftriaxone Aeromona sp

GNS-OP Ciprofloxacina Aeromona sp

GNS-OP Nitrofurantoina A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp

GNS-OP Norfloxacina Aeromona sp

GNS-OP Tetraciclina A. jejunii, A. lwoffii

GPS-SA Penicilina y Ampicilina Enterococcus sp : Utilizar Betalactamasa

GPS-TA Penicilina y Ampicilina Enterococcus sp : Utilizar Betalactamasa

CONSIDERACIONES GENERALES:

Se debe tener especial cuidado en la preparación del inóculo. Fallas en su preparación, tienen efecto sobre el funcionamiento de todo el instrumento. Siempre tener presente que el sistema no puede examinar todos los grupos relevantes de bacterias. El uso de colonias absolutamente aisladas es clave en el aprovechamiento de los sistemas computarizados. Algunos de los organismos sugeridos por el fabricante para control de calidad, podrían no detectar deterioro en el instrumento o la calidad de los reactivos. Es relevante utilizar métodos alternos de sensibilidad a los antibióticos en aquellos casos en que la literatura que acompaña las tarjetas indique que el sistema falla en detectar resistencia. Se han reportado casos de falsa sensibilidad o resistencia, particularmente debido al lector del instrumento o a un corto periodo de incubación durante la prueba de sensibilidad. Un periodo de 3.5 a 6 horas podría no ser adecuado para expresar todos los mecanismos de resistencia de las bacterias. Tal es el caso de algunos bacilos Gramnegativos que inducen resistencia mediada por ß-lactamasa a algunos antimicrobianos enzimáticamente lábiles a la ß-lactamasa, como ocurre con el Citrobacter freundii, Enterobacter sp, Serratia sp, Morganella morganii, Providencia sp y Ps.

aeruginosa.

Se ha observado una falsa resistencia a Aztreonam, especialmente por Proteus y Morganella sp por problemas de detección fotométrica del crecimiento. Se han reportado falsa resistencia a Imipenem para varias especies en periodos largos y cortos de incubación. Esto no es común y se debe a la degradación del antibiótico o la concentración de Zinc en el medio. Una baja o moderado nivel de resistencia a la Vancomicina frente a Enterococcus sp se ha detectado, especialmente del tipo VanB, ya que podría no ser detectado en periodos cortos de incubación. Se han observado o problemas en la detección de resistencia a altos niveles de Gentamicina o Estreptomicina frente a Enterococcus sp en incubaciones largas y cortas. Tener presente colocar las marcas externas en la tarjeta, antes de meterla a la incubadora/lector. No deje pasar más de 15 minutos después de prepara el inóculo, para llenar las tarjetas y colocarla en la incubadora. Chequear la solución salina por esterilidad. Para ello inocule en caldo de cultivo e incube a 35°C por 24 horas. Con cada lote de preparación de inóculo, estandarizar primero el calorímetro. Haga que el Departamento de Servicio técnico de Vitek revise periódicamente el lector del aparato para calibrarlo. Lleve un récord de cualquier discrepancia en la identificación de cepas estándar de control. Igualmente el tipo de tarjeta, lote, fecha de expiración, etc. 

PATRON DE RESISTENCIA ESPERADA PARA ALGUNOS

MICROORGANISMOS:

MICROORGANISMO RESISTENCIA ESPERADA

Citrobacter, Enterobacter, Ampicilina

Klebsiella, Morganella,

Providencia, Proteus vulgaris,

Proteus penneri, Serratia,

Yersinia. 

Citrobacter freundii, Enterobacter, Cefazolin, Cefalotina 

Morganella, P. Vulgaris, P. penneri,

Providencia, Serratia, Yersinia.

Klebsiella Ticarcilina

C. freundii, Enterobacter, Serratia. Cefoxitin, Cefotetan

C. freundii, Enterobacter, Cefuroxime

P. vulgaris, Serratia.

MICROORGANISMO RESISTENCIA ESPERADA

Citrobacter, Enterobacter, Serratia. Amoxicilina/ácido clavulánico

Ampicilina/Sulbactam

Acinetobacter baumannii, Ampicilina, Cefazolin, 

Burkholderia cepacia, Cefalotina, Cefoxitin, Cefotetan, 

Ps. aeruginosa, Aeromonas, Cefmetazole.

Stenotrophomonas maltophilia.

Acinetobacter baumannii Ticarcilina, Mezlocilina, Piperacilina.

B. cepacia, S. maltophilia, Gentamicina 

S. maltophilia Imipenem, Meropenem.

Ps. aeruginosa Trimethoprim-Sulfametoxazole.

6. CONTROL DE CALIDAD DE EQUIPOS Y MATERIALES DE 

TRABAJO:

Objetivo: Todos los instrumentos utilizados en el laboratorio clínico,

deben estar amparados por un programa de control de calidad y de mantenimiento preventivo, basados en las instrucciones del fabricante y los procedimientos establecidos.

Programa de mantenimiento: Un programa de mantenimiento preventivo es esencial para asegurar la exactitud y longevidad del instrumento. El chequeo periódico recomendado es importante para minimizar el daño o la necesidad de servicio y reparación. El Director del laboratorio es responsable por el programa general, recayendo en el jefe de la sección la responsabilidad primaria en su área de trabajo.

Puede en algunos casos relegar la responsabilidad en el Departamento de Biomédica de la institución quienes coordinarán con la casa suplidora el programa de mantenimiento. 

Manual Estándar de Procedimientos Operacionales: El Manual Estándar de Procedimientos Operacionales debe ser organizado por grupo de equipos. 

Un listado de los equipos debe incluir: nombre, marca, modelo, número de serie, fecha de recibo y número de inventario de la institución.

Los nuevos equipos requieren una inspección previa de Biomédica para garantizar su funcionabilidad y seguridad eléctrica.

El Manual debe incluir el récord de mantenimiento preventivo, periodicidad de la inspección y fallas del instrumento.

El Manual debe estar accesible en todo momento.

Validación de Equipos : Los nuevos equipos de mayor impacto en el cuidado del paciente ( Vitek, Bactec, BacT/alert) requieren estudios de validación para determinar que su funcionamiento es al menos comparables a los equipos existentes o a métodos de referencia. Estos equipos son aceptados solo si logran cumplir las metas mínimas de funcionabilidad y eficiencia al compararse con los existentes.

Este récord de validación debe mantenerse por toda la vida útil del equipo.

Manual de Instrucciones del Uso del Instrumento: Estos Manuales deben estar incluidos en el Manual de Operaciones del instrumento, redactados en forma clara, en el idioma de los usuarios, inclusive la documentación del entrenamiento del personal.

Cada protocolo debe incluir precauciones de seguridad y los procedimientos de limpieza y cuidado del instrumento. Los Manuales deben incluir instrucciones básicas para resolver problemas menores y un

récord de incidencias, que incluye el tipo de problema, los pasos tomados para resolverlo y la acción correctiva para evitarlo en el futuro.

Calibración del Instrumento : Los equipos que requieren un exacto nivel de precisión para obtener un resultado seguro, requieren de una calibración periódica. La fecha de la calibración, frecuencia y resultado, deben ser mantenidos en un libro récord dentro del laboratorio.

Control de Calidad: Todo equipo debe ser evaluado por un programa de Control de Calidad en base a las instrucciones del proveedor y las regulaciones internas del laboratorio. Debe mantenerse un libro récord de todo lo realizado al respecto, con el nombre del instrumento, fecha, resultado y comentarios. En otro capítulo se afianzarán los conceptos sobre éste tema.

Referencias y Lectura Suplementaria: El Laboratorio guardará en un fólder toda literatura extra que se obtenga sobre un equipo, sus accesorios, materiales, estudios foráneos sobre su funcionamiento, etc.

a) INCUBADORAS:

Controle diariamente la temperatura de las incubadoras , antes de sacar los platos y anote en una hoja control el resultado. Observe el termoregulador por cualquiera alteración en su posición preestablecida. Coloque las muestras, platos y tubos, en una posición segura. Un papel de filtro humedecido con agua en el fondo de la incubadora, es adecuado para mantener la humedad requerida. Las incubadoras de CO2 requieren medir el nivel de gas diariamente. El jefe de sección debe ser notificado cuando una incubadora falla en mantener el rango de temperatura aceptable. Observe macroscópicamente los platos Petri para observar desecación. En incubadoras de CO2 , se puede colocar un cultivo de N. Gonorrhoeae ATCC 43069 , subcultivandola cada día, para observar su óptimo crecimiento, ya que es un microorganismo que necesariamente requiere CO2 para crecer. Todas las incubadoras deben ser limpiadas mensualmente y llevar un récord de mantenimiento preventivo. 

b) AUTOCLAVES :

Procedimiento Por corrida Diario Semanal Mensual

1. Examine récord de Temperatura y Presión X

2. Utilice Indicadores de Esterilización X

3. Récord de uso, fecha, temperaturas, presión X

4. Chequeo del nivel de agua X

5. Uso de Indicadores biológicos de Esterilidad X

6. Chequeo de la válvula de seguridad X

7. Limpieza del Interior y Exterior. X

8. Limpieza de la Pantalla de Temperatura X

9. Limpieza del drenaje y sellos X

c) CAMARAS DE SEGURIDAD :

Apague la lámpara Ultravioleta antes de comenzar a trabajar. Prenda el blower 15 minutos antes de utilizar. Observe que no se obstruye el flujo de aire. Si hay derrame dentro de la cabina, limpie con un desinfectante apropiado, manteniendo apagada la cabina. Evite el uso de mecheros de flama dentro de la cabina. Lleve un control de la medida del flujo de aire. Lleve un control de la calibración del flujo de aire. Lleve un control del remplazo de los filtros. Compruebe los sistemas de alarma de funcionamiento. La superficie interior de la mesa de trabajo de la cabina, puede ser cultivada semanalmente para detectar contaminación. Desinfecte la cabina antes y después de utilizar. No utilice las cabinas biológicas para hacer mezclas de sustancias químicas y viceversa. Cuando trabaje en la cabina, evite la entrada brusca de aire y el uso innecesario de las puertas del área. 

d) INCINERADOR :

En condiciones normales el incinerador logra la temperatura óptima de esterilización ( 815°C ) 10 minutos después de haber sido encendido. Bastan 5 segundos para lograr la destrucción de bacterias, hongos y micobacterias. No es necesario observar incandescencia en el asa para lograr la

esterilización. Inspeccione la cerámica del incinerador por rajaduras. Aleje el incinerador de elementos que puedan incendiarse por el calor generado. 

e) GENERADORES DE AMBIENTE - SISTEMA GasPak

Mantenga los generadores de gas a temperatura ambiente y el sobre sellado. Mantenga los catalizadores en lugar seco, a temperatura ambiente y las bolsas sellados. Mantenga los indicadores de anaerobiosis a temperatura de refrigeración ( 2-8°C ).

El tiempo de generación de la atmósfera dentro de la jarra es de 30 minutos. El indicador de anaerobiosis cambia de color azul a blanco dentro de la jarra en 4 a 5 horas. Una evidencia sugestiva de ambiente anaerobio, es el cambio de color a rojo vino del agar sangre. Algunos microbiólogos utilizan un agar inoculado con Clostridium novyi B ( ATCC 19402 ) como indicador de ambiente anaerobio, ya que el mismo es anaerobio estricto.

Los catalizadores de Paladio, pueden ser regenerados colocándolos en horno a 160 °C por 2 horas. Control biológico de crecimiento: 

CEPA ATCC RESULTADO

Cl. perfringes 13124 Crece

Micrococcus luteus 9341 No crece

Campylobacter jejuni 33291 Crece 

Refrigeradoras : 

Control diario de la temperatura. Coloque los platos Petri en posición invertida con la tapa hacia abajo. Mantenga la temperatura entre 4 – 8 ° C. 

Utilice refrigeradoras que no hacen escarcha. No coloque medios de cultivo aún ligeramente calientes dentro de la refrigeradora. Evite abrir con frecuencia la puerta de la refrigeradora. Lleve un registro de problemas de funcionamiento, causa y solución. No guarde alimentos en refrigeradoras para especímenes clínicos. 

Microscopios : 

Cuidados y mantenimiento Diario Mensual Semestral

1. Limpieza del aceite de objetivos, condensador, etc X

2. Apagar la fuente de luz X

3. Colocar cobertor contra el polvo X

4. Limpieza de Ocular, condensador, diafragma

con líquido de limpieza de lentes X

5. Limpieza y ajuste del sistema óptico X

6. Limpieza y ajuste del sistema lumínico X

7. Limpieza y lubricación del sistema mecánico X 

Centrífugas : 

Elemento / acción Por corrida Diario Semanal Mensual Anual

1. Verificar tubos por rajaduras X

2. Verificar por restos de vidrio o líquido

dentro del portatubo o las copas X

3. Verificar por balance de cada lote X

4. Verificar por la temperatura de 

funcionamiento ( Refrigeradas ) X

5. Limpieza de cualquier derrame X

6. Limpieza de la olla del rotor X

7. Limpieza externa X

8. Desinfección de la olla del rotor X

9. Verificación de brochas X

10. Chequeo del circuito eléctrico X

11. Certificación del velocímetro X

12. Medición de la temperatura interna

con termómetro calibrado ( Centrífugas refrigeradas ) X

Problemas y Limitaciones:

Vibración Chequear por balance apropiado. Chequear tamaño de los tubos. Mirar si la centrífuga está sobre una superficie plana. Rotura Chequear tamaño de los tubos. Balance correcto. Verificar el interior de los portatubos Desprendimiento de tapas: Utilice tapas de rosca. Si no es posible, use Parafilm sobre los tapones de caucho. Siempre que sea posible utilice tubos de plástico. 4) No centrifuge grandes volúmenes de líquidos inflamables, los cuales pueden 

producir vapores que pueden incendiarse durante la operación del equipo.

La concentración de materiales infecciosos para cultivo puede realizarse en el área rutinaria de cultivo, siempre y cuando los tubos estén bien cerrados. No colocar las tazas o los portatubos en el horno o autoclave para descontaminar. Evitar utilizar para la limpieza soluciones que contengan cloro o sal, ya que son altamente corrosivas. 

CONTROL DE CALIDAD DE EQUIPOS COMPUTARIZADOS 

El laboratorio de microbiología moderno se auxilia de equipos computarizados para ayudar en la rapidez y precisión del diagnóstico etiológico. En la sección de Microbiología del Laboratorio Clínico del C.H.M,Dr. A.A. Madrid contamos hasta la fecha de 4 sistemas computarizados: BacT/Alert y Bactec para los hemocultivos, Vitek System para la identificación y antibiogramas y mas recientemente el Bactec MGIT 960 para la detección de micobacterias.

Cada uno de éstos equipos, consta de sus propios sistemas para el control de calidad. A continuación presentamos algunas observaciones relativas al control de calidad de los referidos equipos:

a) BacT/Alert:

El sistema BacT/Alert es utilizado para la detección temprana de microorganismos en hemocultivos u otros fluidos corporales. El sistema utiliza un sensor colorimétrico y una luz reflejada para monitorear la presencia y producción de CO2 disuelto en el medio de cultivo. Si existen microorganismos en la muestra, se genera CO2 cuando los microorganismos metabolizan los substratos del medio de cultivo. Si el crecimiento de los microorganismos genera CO2, el color del sensor 

gas-permeable instalado en el fondo de cada frasco de cultivo cambia de verde a amarillo.

Cada equipo trae consigo un kit de reflectancia estándar para los procedimientos de control de calidad y de calibración. Además, de un software para ayudar en pantalla a realizar el mismo. A parte de esto, cada lote de frascos de cultivo es suministrado con un Certificado de Análisis de control de calidad de fábrica.

El BacT/Alert utiliza 3 determinantes de control de calidad: Control de calidad de las celdas, Calibración de las celdas y Calibración de la temperatura del equipo.

La opción Control de Calidad de las Celdas es utilizada para asegurar que las celdas del instrumento están en su óptima capacidad de detección.. Este control debe ser parte del mantenimiento normal del sistema. Un kit estándar de reflectancia es proporcionado con cada instrumento para los procesos de control de calidad y calibración. Son dos estándares de reflectancia en cada kit, sin embargo, el proceso de control de calidad solo utiliza el estándar de reflectancia B. El anillo al final de los estándares identifica su número estándar de reflectancia. Cuando el control de calidad de una celda falla y no es recalibrada, ésta automáticamente es inactivada.

Generalmente el periodo de control de calidad para cada celda está configurado en 30 días en base al menú Editar Configuración del Sistema del capítulo Mantenimiento de Funciones del Sistema. Este control solo se puede realizar en celdas vacías. Al final de que todas las celdas han sido evaluadas, puede obtenerse por impresión un Reporte del Estado de las Celdas, luego de lo cual el instrumento retorna automáticamente al menú Funciones de Mantenimiento del Instrumento. 

La opción Calibración de Celdas, es utilizada para recalibrar cualquier celda que haya fallado el control de calidad. El kit viene con dos estándares de reflectancia. El procedimiento utiliza ambos. El instrumento automáticamente recalibra la celda una vez se ha introducido el estándar cuando lo indique el instrumento. Si la calibración de la celda falla, el instrumento automáticamente inactiva la celda. Al final se puede obtener un reporte del estado del instrumento y la pantalla retorna automáticamente al menú de Funciones de Mantenimiento del Instrumento.

La opción Calibración de la Temperatura, es utilizada para calibrar la temperatura dentro del instrumento. Primero se mide la temperatura interna del instrumento utilizando el proceso descrito en Verificación de la Temperatura del capítulo Mantenimiento Preventivo. Solo utilice ésta opción si hay discrepancia entre la temperatura marcada por el equipo y la temperatura óptima preestablecida.

En el Menú principal ir a Otras Funciones BacT/Alert. Mantenimiento del Instrumento. a1) Control de calidad.

b1) Control de calidad de celdas.

c1) Lista de Celdas

d1) Seleccionar la tecla F9

f1) Introducir los estándares de calibración de celdas siguiendo las 

instrucciones de la pantalla.

a2) Calibrar celdas.

b2) Quiere calibrar la celda "x " 

c2) Si 

d2) Introducir el estándar I en la celda "x"

a3) Calibrar temperatura

b3) Seleccionar y ajustar la temperatura del equipo.

Observaciones y Limitaciones del Sistema:

En cada frasco se debe anotar su número de laboratorio y la casilla asignada. Colocar los frascos hasta el fondo de la celda. No aerear los frascos anaerobios. Todo frasco con frotis negativo, debe ser colocado nuevamente en el aparato. Ciertas variantes de H. influenzae, N. Meningitidis, N. Gonorrhoeae y P. anaerobius, pueden ser sensibles al anticoagulante ( SPS ) lo que resulta en una falta de crecimiento o baja producción de CO2.

En el caso de cultivo de otros fluidos corporales, se requiere agregar sangre u otro suplemento al frasco si se intenta recuperar organismos tales como H. influenzae y N. gonorrhoeae.

En contadas ocasiones pueden presentarse BacT/Alert positivos, con frotis y subcultivos negativos, debido a una excesiva cantidad de glóbulos blancos en la muestra de sangre. Se recomienda quitar del aparato, aquellos frascos considerados positivos por el BacT/Alert, para evitar cultivos no viables debido a autolisis, especialmente en microorganismos fastidiosos como el S. pneumoniae. 

BACTEC 9240 : 

El sistema Bactec 9240 es utilizado para la detección temprana de microorganismos en hemocultivos por el método de la fluorescencia.

Cada frasco contiene un sensor que puede detectar aumentos del CO2 producido por el crecimiento de los microorganismos. Cada 10 minutos el instrumento verifica el aumento de la fluorescencia del sensor, la que se relaciona con la cantidad de CO2 presente. 

Observaciones y limitaciones del Sistema:

1.. No utilice frascos con signos evidentes de deterioro.

No utilice frascos de cultivo después de la fecha de caducidad. Los frascos inoculados deben ponerse en el instrumento tan pronto como sea posible. Si se ha tardado en colocar un frasco inoculado en el instrumento, y se puede ver crecimiento, el frasco no debe analizarse en el instrumento, sino subcultivarse y hacer placa por Gram, considerándolo como un frasco presuntamente positivo. Se recomienda analizar el rendimiento de cada lote de frascos recibidos, utilizando un control positivo y uno negativo. El frasco positivo debe inocularse con 1.0 ml de una suspensión de E. coli o S. aureus con un estándar McFarland de 0.5. El control negativo está constituido por un frasco sin inocular.

Dado que la sangre puede neutralizar la acción tóxica del anticoagulante SPS sobre algunas Neiserias y cocos Grampositivos anaerobios, se recomienda utilizar volúmenes de sangre no menores a 1.0 ml para facilitar el crecimiento.

Ciertos organismos exigentes como el H. influenzae requieren para su crecimiento de elementos que se encuentran en la sangre como el factor V. Si la muestra de sangre es reducida, es posible que se requiera agregar éstos suplementos al frasco si se sospecha de éstos microorganismos. Puede darse casos de falso positivo en pacientes con un conteo de leucocitos muy elevado. 

Sistema ViteK: 

El control de calidad , es un subsistema del Vitek, que examina la seguridad de sus tarjetas. El control de calidad opera similarmente a la evaluación de exámenes clínicos. El test clínico identifica el organismo, el examen de control de calidad valida el test. 

1. El programa de control de calidad evalúa el kit del Vitek y los organismos de control de calidad listados en el paquete.

Las tarjetas de control de calidad utilizan 7 dígitos, compuestos de 2 partes: Los primeros 6 dígitos identifican el tipo de tarjeta y un organismo ATCC.

El séptimo dígito identifica el número de lote.

Cada número predefinido de referencia en el control de calidad significa un tipo de test y un organismo. Un número de referencia de control de calidad es más 

que un número de identificación de tarjeta. Cada uno de éstos números significa 

la paridad de un tipo de tarjeta con un organismo. Así por ejemplo el número de 

referencia 900101 corresponde al Proteus mirabilis ( ATCC 7002 ) y el 900102 

a la Ps. aeruginosa ( ATCC 27853 ).

Un campo para control de calidad demográfico está accesible para la información del lote de la tarjeta. El control de calidad provee su propio set especial de reporte. El flujo de operación del control de calidad es idéntico al flujo de una muestra clínica. Los resultados de control de calidad se transfieren de la incubadora/lector a la base de datos, si la opción de transferir la tarjeta finalizada está activa. Todos los resultados se mueven a través del manejador de desviaciones del control de calidad, el cual compara los resultados actuales con los conocidos. El programa de control de calidad Vitek permite ver los resultados del control en pantalla., los cuales aparecen en 3 diferentes formatos: Resultado de la identificación, resultado de la sensibilidad a los antibióticos y Resultado de la Identificación de Urocultivos. La pantalla nos indica : La identificación del organismo esperado ( ATCC ). Resultado de la identificación actual. Lote de la tarjeta. Fecha del test. 

Fecha de expiración de la tarjeta. Reacciones bioquímicas esperadas y de la prueba actual. Cada uno de los test bioquímicos son señalados tanto en lo esperado como en el resultado actual, y se genera una lista de los test que se han desviado del resultado esperado. Igual patrón al anterior muestra la tarjeta de sensibilidad a los antibióticos. Todos los resultados de control de calidad pueden ser imprimidos para guardar en un libro récord. 

La base de datos de los equipos de identificación computarizados, deben ser frecuentemente revisados para actualizarlo en lo referente a los cambios 

taxonómicos que ocurran. Igualmente se debe prestar atención a la información 

proveniente de la casa manufacturera acerca del producto y las investigaciones 

que con el equipo aparezcan en la literatura especializada.

El sistema Vitek también cuenta con un programa que ayuda a evaluar los resultados, minimizando los errores de interpretación. Se trata del bioMérieux Vitek Expert System, un programa que usa la lógica proposicional, es decir llega a ofrecer ciertas conclusiones basado en la información formulada. El programa puede detectar:

Identificaciones que son inconsistente con los resultados de sensibilidad. Errores técnicos. Fenotipos raros o improbables. Expresiones de resistencia incompleta. Resistencia cruzada. El sistema también permite la adición de reglas ( CAR ) en la que se establecen parámetros que debe cumplir el reporte antes de su impresión. 

Sistema Bactec MGIT 960 : 

El sistema Bactec MGIT 960 es utilizado para la detección temprana de micobacterias en especímenes clínicos. El control de calidad del instrumento es automático y está activo continuamente para asegurar la operación confiable del sistema.

El reporte de control de calidad suministra una lista del estado de todos los

detectores del instrumento con la fecha y hora de la última verificación, e incluso la lista de las celdas bloqueadas, temperatura de cada incubadora, estado de los sensores, etc.

Control Diario del Equipo:

Verificar la operación de las gavetas/incubadoras y las lámparas indicadoras de estación. Realizar test de las luces LED indicadoras ( Verde y Roja ). Chequear el termómetro apretando el botón de test. Cada vez que se recibe un lote nuevo de tubos MGIT , se sugiere control de calidad de cepas ATCC en caldo Middlebrook 7H9.

Especie ATCC Dilución 0.5 McFarland Días para ser detectado 

( Suspención en salina ) Positivo 

M. tuberculosis 27294 1:500 6 – 10

M. kansasii 12478 1:50000 7 – 11

M. fortuitum 6841 1:5000 1 - 3 

Control de Calidad Negativo:

Utilice un frasco MGIT con solución descontaminante MycoPrep kit y PANTA ( Mezcla antimicrobiana ). colóquelo en la incubadora/detector. Colocar un frasco de MGIT sin muestra y sin descontaminante y colóquelo en la incubadora/detector. Inocule una suspensión de E. coli dentro de un tubo MGIT y colóquelo dentro de la incubadora/detector. 

Control de Calidad Positivo:

Inocule un frasco de MGIT con una cepa control doméstica de Mycobacterium tuberculosis o una cepa control de M. Tuberculosis ATCC 25177 o M. Intracellulare ATCC 13950 y colóquelo en la incubadora.

Es importante comprobar que el agua, reactivos de tinción, suplementos, etc, están libres de contaminación por micobacterias ambientales especialmente M. Gordonae y M. Terrae.

CONTROL DE CALIDAD DE FORMULAS LACTEAS y MAMADERAS PARA EL SERVICIO DE NEONATOLOGIA :

El control de calidad de las fórmulas lácteas y sus mamones se realiza como un servicio al Departamento de Neonatología del hospital. Básicamente éste control consiste en un recuento bacteriano de bacterias mesófilas y recuento de bacilos coliformes.

Consideraciones referentes al control de calidad de formulas y mamaderas:

Mantener control sobre la esterilidad de los platos Petri y las pipetas. Si al calentar los tubos para diluir el agar base o el Red Bile presentaran turbidéz, descartar ya que es signo de contaminación del medio. Es preferible no mezclar por inversión la leche para homogenizar, ya que se puede salpicar la parte interna de los mamones y si hubiera contaminación de la leche, ésta se puede extender al mamón afectando la calidad de los mismos. Evitar servir muy calientes el agar base o el Red Bile al plato Petri conteniendo la muestra a evaluar, ya que se pueden matar los posibles gérmenes. Una temperatura de aproximadamente 30-40 °C es apropiada, sin dejar coagular el agar. Mezclar homogéneamente el agar y la muestra rotando el plato y sin permitir la formación de coágulos. Las fórmulas lácteas solo pueden guardarse en refrigeración por un máximo de 48 horas antes de ser procesadas. En condiciones normales la leche y los mamones deben ser estériles, especialmente no deben contener bacterias coliformes. Si repetitivamente se observa contaminación de la leche, solicitar a las nutricionistas encargadas de la supervisión de la preparación de las fórmulas, una muestra de leche en polvo para un cultivo directo y una muestra de agua, si fuera necesario. 

NOTA: Solo como referencia se describen los grados de leche pasteurizada establecidos en Panamá, mediante el decreto # 522 de 1957

Grado A : El recuento bacteriano no debe exceder de 30,000 col/ ml.

Recuento de coliformes no mayor de 10 col/ml.

Grado B: El recuento bacteriano no debe exceder de 50,000 col/ml.

Recuento de coliformes no mayor de 10 col/ml.

CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DESTILADA : 

El agua destilada utilizada en la preparación de medios de cultivos y para reconstituir reactivos, debe tener un control de calidad básico que incluye los parámetros químicos y bacterianos.

Control de Calidad Químico :

Este control puede ser realizado teniendo en cuenta una gran variedad de parámetros a evaluar, tales como :

Ph Conductividad Olor Color aparente Turbidéz Alcalinidad Dióxido de carbono Dureza Iones Cationes Metales pesados Sin embargo, dadas las limitaciones para realizar un estudio profundo, recomendamos el siguiente método sencillo y apropiado para determinar la calidad del agua, aparte de la determinación de su Ph ( 5.0 – 5.5 ).

Reactivos:

a) Solución Acuosa de Nitrato de plata ( NO3Ag )

NO3Ag ......... 5.1 g

Agua destilada ............ 300 ml

b) Acido Nítrico

Método:

Colocar en un vaso químico limpio :

10 ml de agua destilada a examinar

2 gotas de ácido nítrico

1 ml de Solución de NO3Ag

Evaluación:

El agua deberá continuar completamente clara. Si aparece una ligera turbidéz 

blanquecina, indicará que la calidad es deficiente.

Ref: manual de Técnicas Básicas OPS/OMS N° 439, pag. 58

Control de Calidad Microbiológico del Agua destilada:

Agregar 1 ml de agua destilada a examinar, a un tubo de Tioglicolato. Agregar 1 ml de agua destilada a examinar a un plato de agar sangre. Incubar a 35.5 °C por 4 días. Llevar un libro récord del control de calidad del agua. 

EL CEPARIO : 

Los sistemas de Validación son los procesos que se requieren para asegurar que los parámetros de funcionamiento de los test, tanto comerciales como los de uso domésticos, son los esperados y las pruebas pueden ser utilizadas como métodos de diagnóstico en el laboratorio. La mayoría de los procedimientos en Microbiología Clínica, dependen de que los microorganismos viables en el cultivo sean capaces de mantener sus características morfológicas , fisiológicas y que sean típicas y

reproducibles. Para ayudar en este control, las Cepas Estándar de Control de Calidad, son un componente esencial de un proceso de validación.

Existen varias colecciones de cepas utilizables para el control de calidad. Algunos ejemplos son:

ATCC : American Type Culture Collection- Rockville, USA

NCIC : National Collection of Industrial Bacteria- Survey, Inglaterra

JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism- Japón

CCTM : Colección Nacional – Lille, Francia

RIA: USSR Reseach Institute for Antibiotics- Moscú, Rusia.

NCIB : Colección Nacional industrial – Aberdeen, Escocia

DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen – Gottinger, Alemania.

Así, la E. coli ATCC 25922 es igual a la DSM 1103 y a la NCIB 12210.

Los organismos que han de ser utilizados en el control de equipos o sistemas de identificación, generalmente son estipulados por los fabricantes o bien escogidos por el usuario. Generalmente se utilizan cepas de referencia como las ATCC y si son cepas domésticas, es necesario tener un historial del organismo que incluye nombre, área de aislamiento, reacciones bioquímicas y patrón de sensibilidad a los antibióticos, forma de almacenaje, fecha de último transplante, etc

En todo caso, las cepas de referencia deben tener requisitos específicos: 

Características típicas. Características estables. Reproducibilidad 

1. Métodos de Conservación de Cepas Bacterianas:

Los métodos de conservación de las cepas estándar de control de calidad, deben asegurar que las mismas mantengan sus características típicas y que puedan ser reproducidas después. El medio utilizado para su conservación debe mantener un mínimo de mutaciones. Estas mutaciones pueden evitarse permitiendo también el mínimo crecimiento del microorganismo y aportando óptimas condiciones ambientales para su sobrevivencia, con el

menor número de subcultivos

Para una mejor clasificación de los métodos de conservación de cepas, los dividiremos en tres categorías: Cultivos Stock, Semistock y Cultivos de Trabajo diario.

a) Cultivos Stock:

Estos representan el verdadero " Banco de Cultivos" . Estos son mantenidos en un sistema cerrado de conservación, minimizando su actividad genética y fisiológica,

para evitar su potencial mutación.

Los dos más importantes métodos para conservación en Stock, son la Liofilización y el Ultracongelamiento. 

LIOFILIZACION: Se hace una suspensión fuerte de un cultivo puro y joven en leche estéril o similar, y se coloca en tubos con rosca y se siguen las instrucciones del aparato liofilizador, que puede ser tan sencillo como un simple bomba de vacío, hasta un sofisticado sistema. Durante este proceso evitar que el cultivo se derrame dentro el aparato liofilizador y la formación de aerosoles

Este sistema tiene la ventaja de ser el que permite la sobrevivencia por un mayor periodo de tiempo y mayores facilidades para el transporte de las cepas.

ULTRACONGELAMIETO: Hacer una suspensión fuerte de la colonia pura en caldo Brucella conteniendo 15% de glicerol o sustituto. Dispensar en pociones de 0.5 ml en pequeños tubos con rosca y coloque en lo profundo del congelador a -45°C..

También se puede utilizar la modificación de Ultracongelamiento en Nitrógeno líquido, que consiste en colocar en una ampolla especial dentro de un aparato específicamente designado para el mantenimiento de cepas en nitrógeno líquido.

Ambos sistemas preservan las bacterias por largos periodos de tiempo.

b) Cultivos Semistock:

Este término se refiere al mantenimiento de cultivos por un periodo intermedio entre el relativamente permanente cultivo en Stock y el cultivo de cepas control para el trabajo diario. De las 5 técnicas listadas a continuación, solo la de congelamiento es utilizable para el mantenimiento de cepas de anaerobios.

Congelamiento en congelador convencional : Los congeladores convencionales pueden mantener una temperatura entre

-10 a –25°C. Los cultivos se preparan de la misma manera como en el caso de la ultracongelación y son colocados en el congelador. El método permite la sobrevivencia de bacterias y levaduras en algunos casos por años y en la mayoría de las veces por al menos de 6 a 12 meses.

Cultivo en CTA: Se preparan tubos con rosca conteniendo Cisteína- Tripticasa y Soya agar.

Inocular el cultivo puro y joven e incube por 18 a 24 horas para obtener un crecimiento moderado, afloje la tapa y mantenga a temperatura ambiente o preferiblemente en refrigeración, si es posible en la oscuridad. Microorganismos menos delicados sobreviven bien por un año y los fastidiosos por 6 meses.

Secado en discos con gelatina: Este método es conocido también como método Stamp en honor de su creador. Corte pequeños círculos de papel encerado y colóquelo en un plato Petri de vidrio. Esterilice en autoclave por 15 minutos a 15 libras de presión.

Prepare una suspensión de caldo nutriente con 10% de gelatina en polvo 

( Peso por Volumen ) y 0.25% de ácido ascórbico ( P x V ) y dispense en 

tubos con rosca y esterilice en autoclave. 

Haga una suspensión fuerte de un cultivo puro y joven y coloque una gota del 

mismo con una pipeta estéril sobre uno de los discos de papel acerado 

estéril en un plato Petri. Con una pinza estéril, transfiera el disco a un 

desecador de vacío conteniendo Pentaóxido de fósforo. Evacue el desecador 

con la bomba de vacío. Cuando el disco está seco, asépticamente introducir 

en un tubo estéril con tapa de rosca y colocar en el refrigerador.

Para hacer un subcultivo del disco, asépticamente retire un círculo de papel 

con las colonias y colocarlo en un tubo conteniendo un caldo de cultivo e 

incubar por 24 horas a 35C y luego hacer transplante a agar sangre e incubar 

nuevamente.

Conservación en medio de cultivo inclinado con aceite mineral: Es un método especialmente utilizado para hongos, pero es útil también para algunas bacterias.

En el caso de los hongos, se utiliza un cultivo joven y bien esporulado en un medio de cultivo inclinado, tal como agar de Sabouraud-dextrosa. Cubrir completamente con aceite mineral estéril. El aceite debe ser esterilizado a 15 libras de presión por 45 minutos, para asegurar su esterilidad absoluta.

Para reactivar la cepa, colocar la boca del tubo cerca de la llama de un mechero o incinerador y remueva una porción visible de crecimiento con una asa estéril larga o una aguja.

Este método permite la sobrevivencia por muchos años.

Si el método se va a utilizar para conservar bacterias, se utiliza Agar de Cerebro-Corazón o agar Mueller-Hinton suplementados con hemoglobina al 2% e Isovitalex al 1%. Los medios se sirven en tubos con rosca. Se esterilizan y luego se les hace coagular en forma inclinada. 

Las bacterias son inoculadas en el medio e incubadas a 35°C por 24 horas, tomando en cuenta sus requerimientos de oxígeno. Luego las cepas son cubiertas con aceite mineral estéril, hasta 1 cm por encima del final del inclinado. Los cultivos son viables por 2 años a temperatura ambiente.

Mantenimiento en tierra estéril: Es utilizado primeramente para hongos y bacterias esporuladas.

Esterilice en autoclave tierra suelta en tubos con rosca a 15 libras de presión por 1 hora. Haga una suspención fuerte del microorganismo joven y esporulado y colóquelo en el tubo con tierra estéril. Deje secar y colocarlo en un refrigerador.

Cultivos de trabajo diario: 

Los cultivos control para el trabajo diario, son una forma conveniente para realizar el control de calidad de pruebas de uso frecuente y que requieren una lectura comparativa al momento de su lectura. Tal es el caso de las pruebas de coagulasa y oxidasa, entre otras. Para éste propósito se utilizan cultivos de 24 horas y son transplantados diariamente.

Bacterias resistentes: Tal es el caso de Estafilococos y Enterobacteriaceas. Se transfiere una colonia joven de un cultivo en Stock o semistock y se transfiere a un tubo con agar nutritivo inclinado e incubar por un mínimo de tiempo tal que haya crecimiento. Guardar en refrigerador. Los cultivos para trabajo diario, son transferidos a otros tubos de agar inclinado cada mes por un intervalo de 6 meses. Después de éste tiempo, se debe volver a hacer otro pase del cultivo stock.

Bacterias delicadas : Los cultivos de trabajo diario de organismos delicados como 

N. Meningitidis, N. Gonorrhoeae, S. pneumoniae y algunos menos delicados como el S. pyogenes, son preparados a partir del stock e incubados por 24 horas en medios apropiados como agar chocolate en ambiente de CO2 , para luego ser colocados en refrigeración. Después de una serie de 6 transplantes consecutivos, se debe preparar otro cultivo para uso diario a partir de la cepa en stock.

Bacterias anaeróbicas: Los cultivos para trabajo diario de la mayoría de las bacterias anaeróbicas, pueden ser mantenidos en medio de carne cocida o en Tioglicolato con 

0.5% de carbonato de sodio adicionado después de esterilizar por autoclave.

Los cultivos se incuban por 24 a 48 horas y guardados a temperatura ambiente.

Hongos: Los cultivos de uso diario de hongos, son mantenidos en tubos con agar Sabouraud o sustituto.. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente hasta que haya crecimiento, y ocurra la esporulación, para luego ser colocados en refrigeración. Los cultivos de trabajo deben ser transferidos cada 2 meses . Pasado éste tiempo se debe preparar otro cultivo de trabajo a partir de la cepa en stock.

Cultivos de trabajo comerciales: Son preparados por casa comerciales utilizando cepas conocidas como la

ATCC.. Estas son estables en refrigeración por un año. Tal es el caso de Bact-Chek de Roche Diagnostics, Bactrol Disk de Difco, entre otras.

Para reactivar las cepas se colocan en un caldo nutritivo como el caldo de Tripticasa y Soya e incubados por 24 horas a 35°C. Luego se hace un transplante a un medio de enriquecimiento o a agar sangre.

Mantenimiento del Cepario: Se debe tener especial cuidado en el mantenimiento del cepario, ya que el mismo constituye una ayuda importante en la validación de equipos, materiales, reactivos y habilidad del personal. Debe existir un programa metódico de transplantes de cepas , archivo de cada uno de los cultivos con sus características bioquímicas, sensibilidad a los antibióticos, origen de la cepa, método de identificación, fecha de siembra y próximo transplante, etc

Cepas ATCC: En nuestro medio por situaciones muy especiales y altamente beneficiosas, 

podemos tener acceso a las cepas control del American Type Culture 

Collection ( ATCC ) , la colección más grande e importante del mundo. Estas 

cepas bacterianas pueden ser utilizadas como control en una gran variedad de 

utilidades, lo cual nos permite conocer el grado de confiabilidad de los productos 

comerciales o elaborados en el laboratorio.

A continuación algunas referencias de las cepas ATCC:

Microorganismo ATCC Medio Característica

E. coli 25922 McConkey Colonia rosada

S. typhimurium 14020 McConkey Colonia incolora

P. mirabilis 12453 McConkey Colonia incolora

E. faecalis 29212 McConkey No crece

St. pyogenes 19615 Agar sangre ß-hemólisis

St. pneumoniae 6305 Agar sangre alfa-hemólisis

S. epidermidis 12228 Agar sangre no hemolítico

Candida albicans 60193 Agar sangre no hemolítica

Candida albicans 60193 Tubos germinales Positivo

Candida tropicalis 66029 Tubos germinales Negativo

Microorganismo ATCC Medio Característica

S. aureus 25922 Manitol sal Colonia amarilla

S. epidermidis 12228 Manitol sal Colonia incolora

P. mirabilis 12453 Manitol sal No crece 

M. tuberculosis (TBC) 2577 Low-Jensen Crece. Incoloro

M. kansassi ( I ) 12478 Low-Jensen Crece. Amarillo + luz

M. scrofulaceum (II ) 19981 Low-Jensen Crece. Amarillo – luz

M. intracellulare ( III ) 13950 Low-Jensen Crece. Incoloro

M. fortuitum ( IV ) 6841 Low- Jensen Crece. < 7 días.

E. coli 25922 Low-Jensen No crece 

LISTADO DE CEPAS ATCC SUGERIDAS PARA CONTROL DE CALIDAD

MICROORGANISMO ATCC

Campylobacter jejuni .............................................. 33290

Enterococcus faecalis ............................................... 29212

Escherichia coli......................................................... 25922 

Escherichia coli ........................................................ 35218

Proteus vulgaris ....................................................... 8482

Pseudomona aeruginosa .......................................... 27853

Salmonella typhimurium ........................................ 14028

Shigella sonnei ........................................................ 9290

Shigella sonnei ........................................................ 25911

Shigella flexnerii ..................................................... 12022

Enterobacter aerogenes ........................................... 13048

Staphylococcus aureus ............................................ 25923

Staphylococcus aureus ............................................ 29213

Staphylococcus epidermidis .................................... 12228

Steptococcus pyogenes ............................................ 19615

Streptococcus pneumoniae ....................................... 6305

Streptococcus pneumoniae ....................................... 49619

Streptococcus faecalis ............................................... 19433

Haemophilus influenzae ............................................ 49247

Haemophilus influenzae ............................................ 49766

Neisseria gonorrhoeae ............................................... 49226

Escherichia coli 0157:H7 .......................................... 43894

Bacteroides fragilis .................................................... 23745

Clostridium perfringes ............................................... 3624

Clostridium sporogenes ........................................... 19404

Clostridium tertium ................................................... 19405

Clostridium novyi A ................................................. 19402

Fusobacterium necrophorum .......................................25286

Fusobacterium nucleatum ............................................25586

Transporte de cepas bacterianas: 

La mayoría de las naciones han implementado regulaciones internacionales para el empaque y transporte de materiales biológicos potencialmente nocivos para el hombre o los animales. Estas reglas intentan proteger al público de accidentes al tener contacto directo o indirecto con dichos productos. El personal que prepara éste envío debe ser apropiadamente entrenado en las formas de empaque y en las regulaciones internacionales que lo rigen.

Solo como una guía enumeraremos algunas regulaciones foráneas:

U.S Public Health Service, 42 CFR part 72, Interstate shipments of Etiologic Agents.

International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations.

Unites Nations Recommendations of the Committee of Experts on the Transportation of Dangerous

Goods.

U.S Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration, 29 CFR Part 1910.1030, Bloodborne Pathogens.

Generalmente el transporte de agentes etiológicos requiere un doble o triple empaque, dependiendo de las regulaciones del país de destino. Si la cepa está contenida en un tubo de vidrio, se recomienda que sea pequeño y de vidrio grueso. Este a su vez debe estar inmerso en un envase de metal con material aislante como el aserrín o foam desmenuzado. A éste envase se le puede adicionar otro que contenga igualmente aserrín o foam , dependiendo de las regulaciones y por último la caja externa no porosa, con recubrimiento de cera en su interior y a prueba de derrame. En ésta caja irán las etiquetas , guía aérea, etiquetas de advertencia, números telefónicos para contactar en caso de emergencia, tanto en el país de origen como en el de destino. Igualmente se etiquetará con un símbolo de material peligroso de color rojo.

SUPERVISON DEL PERSONAL: 

El personal es el factor más importante en la calidad del trabajo en el laboratorio de microbiología. Este personal debe tener una dedicación y actitud positiva hacia el trabajo, capacidad académica, actualización constante y contar con los elementos indispensables para su labor.

1. Evaluación del personal:

La competencia del personal de microbiología, debe ser certificada por la revisión de su hoja de trabajo, la interpretación de muestras desconocidas , su habilidad técnica y exámenes escritos anuales. Se debe llevar un registro profesional acerca de su evaluación académica, reporte sobre su capacidad de trabajo, asistencia a programas de educación continuada, responsabilidad, asistencia, trabajos de investigación, charlas, conferencias y su evaluación profesional anual.

Todo nuevo empleado que se adicione a la plantilla de la sección, debe ser documentado, evaluado y certificado, incluyendo las fases pre-analíticas, analíticas y post-analíticas de funcionamiento del laboratorio.

2. Programa de docencia:

Un elemento fundamental en el mantenimiento apropiado de la competencia del personal es el programa de educación continuada. Este programa mantiene al personal informado en los avances en la detección e identificación de agentes etiológicos, nuevos test, equipos, cambios en la taxonomía bacteriana y la evaluación correcta de las pruebas de sensibilidad a los antibióticos.

Este programa puede incluir charlas, mesas redondas, lecturas de artículos de interés, discusión de casos clínicos, evaluación de nuevos test o equipos, revisión de la literatura sobre temas específicos, trabajos de investigación, etc. Se debe llevar un control sobre la participación individual del personal en el programa, su asistencia y actividad, lo cual

formará parte de su evaluación anual.

3. Evaluación del informe final:

El resultado final de la evaluación de un espécimen clínico luego de cumplir con todas las etapas de investigación, es el informe final que implica una identificación etiológica, si la hubiera, y su correspondiente sensibilidad a los antibióticos. Para llegar a éste resultado, el laboratorio de microbiología debe haber agotado todos los elementos diagnósticos de que dispone y hacer un juicio respecto a la posibilidad de que dicho informe represente el potencial agente infeccioso, tomando en cuenta los factores que están involucrados tales como el tipo de muestra, microorganismo aislado, edad del paciente, procedencia, informes previos, frotis directo y el patrón de comportamiento frente a los antibióticos, entre otros.

En todo informe final debe prevalecer el concepto de rapidez y seguridad diagnóstica. Es recomendable y así está establecido en Manuales foráneos, que los resultados sean evaluados antes de su envío por un el jefe del laboratorio de microbiología o en su defecto por un Supervisor con experiencia y capacidad demostrada, con el fin de minimizar potenciales errores, omisiones o interpretaciones del informe final, tomando en cuenta el valor que éste reporte tendrá en la evaluación, tratamiento y la salud del paciente.

Es importante en ésta etapa establecer los " Valores de Alerta " en microbiología, los cuales son aquellos resultados de mayor preponderancia, ya sea por el tipo de microorganismo involucrado o por su significado en el control de enfermedades de notificación obligatoria.

VALORES DE " ALERTA " EN MICROBIOLOGIA

* Organismos vistos en LCR * Tinta china positiva

* Detección de antígenos de Cryptococcus * Detección de antígenos de LCR

* Frotis BAAR positivos * Hemocultivos positivos

* Cultivo de LCR positivo * Aislamiento de M. Tuberculosis

VALORES DE " ALERTA " EN MICROBIOLOGIA

* Aislamiento de Shigella sp * Aislamiento de Salmonella typhi

* Aislamiento de E. coli 0157:H7 * Aislamiento de Neiserias patógenas.

* Aislamiento de Estafilococos resistentes a la Vancomicina.

* Aislamiento de agentes etiológicos de notificación obligatoria.

Cuando se observen " Valores de Alerta " , se debe notificar al jefe de la sección.

4. Control de calidad externo:

Es recomendable que los laboratorios de microbiología puedan participar en programas de evaluación externa. Estos programas miden la capacidad del laboratorio para evaluar un desconocido y llegar a un resultado seguro. Los mismos consisten en la identificación de muestras o microorganismos desconocidos en los cuales se debe informar del resultado de la identificación, pruebas utilizadas para el diagnóstico etiológico y sensibilidad a los antibióticos.

El Director del laboratorio debe escoger el programa que sea consistente con el nivel de calidad de su laboratorio. Generalmente estos desconocidos vienen con un abstracto clínico y son recibidos al menos 2 veces al año. Los laboratorios que ofrecen éstos programas invalidan aquellos laboratorios que fallan en responder el cuestionario, por lo que es necesario mantener un contacto muy especial para no perder éste beneficio. Los resultados de la evaluación de los desconocidos deben ser discutidos por todo el personal antes de su informe al laboratorio generador del programa.

Algunos laboratorios que ofrecen programas externos de evaluación de la calidad son :

Accutest: POBox 999

Westford, MA 01886-0031

American Association of Bioanalysts Proficiency Testing Service 205 West Levee Street

Brownsville, TX 78520-5596

American Proficiency Institute Business Park Drive Traverse City, MI 49686

The College of America Pathologists- Survey College of American Pathologists

Waukegan Road Northfield, Il 60093-2750

Idaho Bureau of Laboratories Proficiency Testing Program Old Penitenciary Rd. Boise, ID 83712

Medical Laboratory Evaluation (MLE ). 2011 Pensnsylvania Av, NW, Suite 800

Washington, DC 20008-1808

New Jersey Department of Health Proficiency Testing Program, CN 360 Trenton, NJ 08625-0360

USA

Pacific Biometrics 110 Eastlake Avenue East

Seatle, WA 98109

Puerto Rico Department of Health Laboratory Service Program

Department of Health of Puerto Rico, Bulding A

Call Box 70184

San Juan, Puerto Rico 00936

( Tel. (800)-769-7774 )

Universitair Ziekenhuis St. Rafael B-300 Bacteriologie

Leuven – Belgium

Att: Prof. Dr. J. Vandepitte

Prof. J. Verhaegen

Tel. 0032-16-332150

Fax. 0032-16-336321

5. Certificación del laboratorio de microbiología:

Un nuevo concepto en la organización de los laboratorios es la acreditación a Asociaciones especializadas que promueven la excelencia en la calidad de los servicios de sus miembros. Esta calidad está enfocada no solo en los aspectos técnicos, sino también en los administrativos, racionalización de recursos, planificación gerencial, costos de operaciones, calidad de servicio al cliente, es decir, un enfoque de Calidad Total. En los Estados Unidos éstas acreditaciones están validadas por asociaciones como la American Society for Microbiology, College of American Pathologists,

American Association of Bioanalysts, etc. En Latinoamérica algunas asociaciones de laboratorios han creado comités de acreditación para laboratorios públicos y privados.

El enfoque moderno en un mundo en que las distancias se han acortado y los conceptos de globalización son una realidad, la acreditación proporciona a los miembros la posibilidad de comunicarse mejor con otros laboratorios del mundo, lo cual permite un intercambio de experiencias en metodologías, compra de equipos, entrenamiento de personal, etc

Los problemas legales y altos costos de operaciones, han obligado a los grandes laboratorios a encontrar un modelo aún más complejo de aseguramiento de la calidad, con el fin entre otros, de bajar costos. La Organización Internacional de Estándares ha desarrollado una guía llamada ISO 9000 que establece un flujograma de trabajo en los programas de aseguramiento de la calidad y unifica los diferentes actividades del control de calidad. La categoría apropiada para los laboratorios clínicos en general es el ISO 9002 el cual comprende 18 elementos de control. Para que un laboratorio pueda ser certificado bajo la norma ISO, debe cumplir con todos los elementos del estándar.

En éstos casos un equipo de Aseguramiento de la Calidad implementa las medidas en cada una de las área con el fin de que cuando se esté listo,

pueda pasar las pruebas a que es sometido todo el sistema por parte de auditores certificados. La obtención de ésta certificación ISO 9002 es el máximo galardón a la excelencia en control de calidad en los laboratorios clínicos.

PROFORMAS DE REPORTE DEL CONTROL DE CALIDAD: 

Se adjuntan a continuación las hojas proformas utilizadas para llevar el registro del control de calidad en microbiología:

Libro de reporte de control de calidad de medios en platos. 2) Libro de reportes de control de calidad de medios en tubos.

Libro de reporte de control de calidad de antisueros y reactivos. 4) Libro de reporte de control de calidad de fórmulas lácteas y mamaderas.

5) Libro de reporte de control de calidad de la sangre de carnero.

6) Libro de reporte de control de calidad de los discos de sensibilidad a los antibióticos.

7) Libro de control del cepario.      

Tipo de infección Muestra Comentarios

Bacteriemia Hemocultivos  Infecciones cardiovasculares y asociadas a dispositivos intravasculares (IV)

Endocarditis Hemocultivos/Válvula/Verrugas

Infección del catéter Catéter IV, piel pericatéter, conexión del catéter

Pericarditis Líquido pericárdico

Sistema nervioso central

Meningitis LCR

Abscesos cerebrales Aspirados de abscesos

Tracto respiratorio

Faringoamigdalitis Exudado faríngeo

Sinusitis Aspirado sinusal No válidos los exudados nasales

Otitis media Timpanocentesis

Otitis externa Exudado oído externo

Neumonia Esputo, muestras obtenidas por fibrobroncoscopia, punción transtorácica aspirativa, punción transtraqueal, broncoaspirado

Empiema y abscesos pulmonares

Líquido pleural, aspirados de abscesos

Nasofaríngeo Diagnóstico tosferina/Infecc. víricas

Nasal Detección de S. aureus

Infecciones oculares

Conjuntivitis Exudado conjuntival/raspado

Queratitis Raspado corneal

Endoftalmitis Líquido intraocular

Infecciones gastrointestinales

Diarrea Heces/Biopsia intestinal/ Aspirado duodenal

Infecciones intraabdominales

Peritonitis Líquido peritoneal

Abscesos intraperitoneales y abscesos viscerales

Aspirados de abscesos

Colecistitis Líquido biliar

Tracto urinario

Infección urinaria Orina (micción media, sonda)

Orina obtenida mediante punción suprapúbica

Diagnóstico de bacteriuria por anaerobios y de ITU en niños

Tracto genital

Úlceras genitales Raspado de la úlcera

Nódulos genitales Aspirado del nódulo

Uretritis Exudado uretral

Vulvovaginitis Exudado vaginal Detección de S.agalactiae (también exudado rectal )

Cervicitis Exudado endocervical

Prostatitis Secreción prostática Acompañada de orina pre y post masaje prostático

Piel y tejidos blandos

Impétigo, foliculitis, erisipela, celulitis, úlceras, infecciones gangrenosas, abscesos cutáneos, heridas y quemaduras

Preferiblemente aspirados tomados con jeringa y biopsias de tejido. Son menos recomendables las muestras tomadas con torundas

Hueso y articulaciones

Artritis Líquido sinovial

Osteomielitis Biopsia ósea o exudado

RECOGIDA Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS

Toda la información diagnóstica que puede generar el laboratorio de microbiología depende en gran medida de la muestra enviada. Esta no sólo tiene que ser la adecuada, sino que además debe cumplir unos requisitos que aseguren su idoneidad y en consecuencia la calidad de nuestro trabajo. La idoneidad de las muestras enviadas depende del cumplimiento de una serie de medidas o reglas referentes a: procedimiento de obtención, cantidad enviada y transporte rápido y adecuado al laboratorio. Todas las normas y recomendaciones sobre estos aspectos se encuentran detalladas en el documento técnico. Las consecuencias de una muestra mal tomada y/o mal enviada pueden suponer un fracaso en el aislamiento del agente etiológico o el aislamiento de posibles microorganismos contaminantes que pueden generar tratamientos innecesarios o inadecuados. Para asegurar la idoneidad de las muestras que recibe, el laboratorio de microbiología debe elaborar un manual claro y conciso de las normas de recogida y transporte de las mismas. Dicho manual debe distribuirse en controles de enfermería, consultas y demás dependencias hospitalarias y ambulatorias en las que se asista a los pacientes.

 

Normas generales

1. Obtención de muestras:

Deben realizarse en condiciones de máxima asepsia, evitando contaminaciones ambientales, del personal médico y del propio enfermo.

No debe estar en contacto con sustancias desinfectantes.

2. Cumplimentación del volante. Precisa:

Identificación del paciente. Identificación del médico. Datos de la muestra (hora de recogida, tipo de muestra,

localización anatómica, procedimiento de obtención de la muestra).

Determinaciones solicitadas.

3. Identificación de la muestra:

Cada muestra debe estar acompañada siempre de un volante. El RECIPIENTE debe identificarse con nombre y apellidos, tipo de muestra, fecha, y hora de extracción (IMPRESCINDIBLE en isolator). EL volante y el sobre deberán  tener etiqueta de color según su conservación:

Rojo: en estufa. Azul: en nevera. Amarillo: a Temperatura ambiente.

  Medios de transporte

1. Envase estéril de boca ancha:

Para: biopsias, tejidos, orinas, escamas, líquidos, esputos, secreciones bronquiales.

Estudia: micobacterias, aerobios, hongos, antígeno de Legionella y Neumococo.

2. Port-A-Cul vial (medio de Cary Blair):

Para: líquidos y exudados obtenidos por aspiración.

Estudia: aerobios, anaerobios, hongos y micobacterias.

3. Port-A-Cul tubo (medio de Cary Blair):

Para: raspados de heridas, escaras, abscesos, úlceras, pequeñas biopsias y tejidos.

Estudia: aerobios, anaerobios y hongos.

4. Hisopo con medio de transporte Stuart:

Para: abscesos y heridas recogidas con escobillón.

Estudia: aerobios y hongos. No válido para: anaerobios y micobacterias.

5. Tubo estéril de tapón verde:

Para: líquidos estériles. Estudia: micobacterias, aerobios y hongos. No válido para: anaerobios, ni para líquidos

con alto contenido hemático.

6. Medio de transporte para virus:

Para: aspirados nasofaríngeos, exudados y biopsias.

Estudia: virus.

7. Tubo de plástico estéril:

Para: catéteres (no más de 4 cm), tejidos y líquidos.

Estudia: aerobios, hongos, micobacterias. Precisa 3-4 ml por frasco.

8. Hemocultivos adultos:

Envase estérilde boca ancha

 

   

  Port-A-Cul vial

 

   

  Port-A-Cul tubo

 

   

  Hisopo con mediode Stuart

 

   

  Tubos estérilesde tapón verde

 

   

  Medio transportepara virus

 

   

  Tubo plástico

 

   

 Frascos

hemocultivosadultos Bactec

 

   

 Frasco

hemocultivopediátrico Bactec

 

   

  Isolator adulto-10I. pediátrico-1,5

 

   

  Contenedorespecial Para-Pak

 

Para: sangre y líquidos estériles. Estudia: aerobios, anaerobios y hongos levaduriformes. Precisa 10 ml por frasco.

9. Hemocultivos pediátricos:

Para: sangre y líquidos estériles. Estudia: aerobios y hongos levaduriformes.

10. Isolator:

Para: sangre. Estudia: infecciones de catéter, micobacterias, brucelosis,

legionella, bartonella y hongos filamentosos.

11. Contenedor especial Para-Pak:

Para: heces. Estudia: aerobios y hongos. Nota: Para el estudio de Clostridium difficile, Rotavirus

y Cryptosporidium, RECIPIENTE ESTÉRIL DE BOCA ANCHA.

12. Medio de transporte para Chlamydias:

Para: muestras vaginales y balano-prepuciales. Estudia: Chlamydias.

  Conservación de las muestras

Muestras para virus: en NEVERA, salvo sangre, médula ósea, y Ag CMV.

Muestras para hongos: en NEVERA, salvo LCR, piel, pelo, uñas, vaginal y balano-prepucial.

Muestras para anaerobios: a Temperatura ambiente. Muestras para micobacterias: en NEVERA, salvo contenido

gástrico. Muestras para Bacteriología:

A temperatura ambiente: médula ósea, líquidos estériles (pleural, peritoneal, articular,...), muestras oculares, muestras de cavidad oral, heridas, abscesos, fístulas, adenopatías, del tracto genital, y biopsias.

En NEVERA: orinas, heces, catéteres. En ESTUFA: hemocultivos, LCR, placas y tubos

inoculados. Según el microorganismo a investigar:

ANAEROBIOS: Máxima asepsia. ASPIRAR. Conservación a Tª ambiente. Enviar en PORT-A-CUL.

MICOBACTERIAS: No recoger con escobillón. Conservar en nevera. Enviar en envases estériles de boca ancha. Rapidez en envío.

HONGOS: ASPIRAR Y RASPAR. Conservar en nevera (excepto tracto genital, uñas, pelo,...). Rapidez en envío.

VIRUS: Tomar muestras en estadio precoz. Transporte específico. Conservación en nevera.

  Criterios de rechazo de una muestra

Mala cumplimentación del volante y/o de la muestra. Muestras derramadas, o rotas,... Muestra no adecuada para la prueba solicitada. Muestras sin medio de transporte adecuado.

 

Instrucciones   específicas

1. Sangre:

  1.a.  Hemocultivo:

Muestra: sangre. Volumen: 10 ml en adultos cada uno de los 2

frascos. Recipiente: frascos hemocultivo BACTEC. Consideraciones: desinfección adecuada,

evitando la entrada de aire en los frascos de anaerobiosis.

  1.b.  Sangre para hongos levaduriformes:

Muestra: sangre. Volumen: 10 ml  por cada frasco. Recipiente: frascos hemocultivo BACTEC.

  1.c.  Sangre para Mycobacterias, hongos filamentosos,

microorganismos de crecimiento intracelular. Para infecciones por catéter:

Muestra: sangre. Volumen: 10 ml (en pediátrico de 2 a 5 ml). Recipiente: tubos de Isolator. Consideraciones: para hongos filamentosos, Mycobacterium y

microorganismos de crecimiento intracelular. Para infecciones por catéter. Especificar “mantener larga incubación”, pues pueden tardar 4 semanas en crecer.

2. Vías respiratorias:

  2.a.  Nariz:

Frascoshemocultivos

adultos Bactec

 

   Frasco

hemocultivopediátrico Bactec

 

Isolator adulto-10I. pediátrico-1,5

 

   

Hisopo con mediode Stuart

 

   

Muestra: frotis de fosas nasales. Volumen: 1 torunda. Recipiente: medio de transporte Stuart.

  2.b.  Garganta:

Muestra: frotis de faringe posterior, de úlceras, o lesiones purulentas.

Volumen: 1 torunda. Recipiente: medio de transporte Stuart.

  2.c.  Esputo:

Muestra: esputo (no saliva). Volumen: 2 ml. Recipiente: envase estéril de boca ancha.

  2.d.  Aspirado bronquial:

Muestra: aspirado bronquial, transtraqueal o muestra de broncoscopia.

Volumen: 1 ml. Recipiente: envase estéril.

3. Heces:

  3.a.  Coprocultivo habitual:

Muestra: muestra de heces. Volumen: 1 g de heces. Recipiente: contenedor especial Para-pak. Consideraciones: estudio de Salmonella,

Shigella, y Campylobacter.

  3.b.  Para Yersinia, E. coli:

Muestra: muestra de heces. Volumen: 1 g de heces. Recipiente: contenedor especial Para-pak.

  3.c.  Para Aeromonas y Plesiomonas:

Muestra: muestra de heces. Volumen: 1 g de heces. Recipiente: contenedor especial Para-pak.

4. Aparato génito-urinario:

  4.a.  Orina:

Envase estérilde boca ancha

 

   

Contenedorespecial Para-Pak

 

   

Contenedorespecial Para-Pak

 

   

Envase estérilde boca ancha

 

   

Muestra: micción media. Volumen: 0,5 ml. Recipiente: envase estéril de boca ancha. Consideraciones: primera micción de la mañana.

  4.b.  Secreciones urogenitales:

Muestra: secreciones vaginales o uretrales, torundas de cérvix, líquido prostático,...

Volumen: 1 torunda ó 0,5 ml. Recipiente: medio de transporte Stuart (en muestras líquidas usa

el tubo estéril de tapón verde). Consideraciones: para estudio de Chlamydias utilizar medio de

transporte específico.

Hisopo con mediode Stuart

Tubo estéril de tapón verde

Transporte paraChlamydias

5. Líquidos corporales, aspirados y tejidos:

  5.a.  LCR:

Muestra: líquido cefaloraquídeo. Volumen: 1 ml habitualmente, ≥ 5 ml para

micobacterias. Recipiente: tubo estéril de tapón verde. Consideraciones: enviar el segundo tubo de

extracción.

  5.b.  Líquidos corporales:

Muestra: líquidos aspirados de forma aséptica. Volumen: 1 ml. Recipiente: tubo estéril de tapón verde.

  5.c.  Heridas:

Muestra: material purulento o contenido de abscesos. Volumen: 2 torundas ó 0,5 ml de pus aspirado. Recipientes:

para estudio de aerobios: medio de transporte Stuart. para  estudio de aerobios/anaerobios:

o muestras líquidas: Port-a-cull vial.o muestras sólidas: Port-a-cull tubo.

Hisopo con mediode Stuart

Port-A-Cul vial Port-A-Cul tubo

Tubos estérilesde tapón verde

 

   

Tubos estérilesde tapón verde

 

   

  5.d.  Biopsia y materiales aspirados:

Muestra: tejido extirpado mediante cirugía, hueso,... Volumen: 1 ml de líquido ó 1 gr de tejido. Recipientes:

para estudio de aerobios: medio de transporte Stuart. para  estudio de aerobios/anaerobios:

o muestras líquidas: Port-a-cull vial.o muestras sólidas: Port-a-cull tubo.

Hisopo con mediode Stuart

Port-A-Cul vial Port-A-Cul tubo

6. Recomendaciones especiales:

  6.a.  Hongos:

Muestra: pueden utilizarse las muestras antes mencionadas. El esputo y la orina deben obtenerse de la primera muestra de la mañana.

Volumen: 1 ml o lo especificado en cada muestra. En orina se requiere más volumen.

Recipientes: envase estéril de boca ancha.

  6.b.  Mycobacterium:

Muestra: esputo, tejido, orina, líquidos corporales. Volumen: 10 ml ó 1 gr de tejido. No usar torundas. Recipientes: envase estéril de boca ancha o tubo estéril de tapón

verde.

Envase estérilde boca ancha

Tubos estérilesde tapón verde

  6.c.  Legionella / S. pneumoniae:

Muestra: muestra de orina. Volumen: 1 ml.

Recipientes: envase estéril de boca ancha.

Envase estérilde boca ancha

 

   

Envase estérilde boca ancha

 

   

Consideraciones: detección de Ag de Legionella y Neumococo en orina mediante técnica de cromatografía.

  6.d.  Anaerobios:

Muestra: aspirados o líquidos corporales. Volumen: 1 ml de líquido o 2 torundas. Recipientes:

muestras líquidas: Port-a-cull vial. muestras sólidas: Port-a-cull tubo.

Port-A-Cul vial Port-A-Cul tubo

  6.e.  Virus:

Muestra: secreciones respiratorias, lavado de vías respiratorias, torundas nasales, torundas, vaginales y rectales, lesiones cutáneas sospechosas, heces, sangre,...

Volumen: 1 ml de líquido, 1 torunda, ó 1 gr de heces. Recipientes: medio de transporte específico para virus. Consideraciones: para el estudio de virus en heces se usa el

envase estéril de boca ancha.

Medio de transportepara virus

Envase estéril de boca ancha

 

RECEPCIÓN Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍAUna vez que la muestra se recibe en el laboratorio de microbiología, el manejo de la misma incluye:

 1. Recepción de la muestra: consiste básicamente en determinar si la muestra cumple o no los requisitos de calidad necesarios para ser procesada. Estos requisitos incluyen: la correcta identificación de la muestra, la valoración sobre si existe una cantidad adecuada para el estudio solicitado y la comprobación de las condiciones adecuadas de transporte y conservación. Cada laboratorio debe elaborar y distribuir los criterios de aceptación y rechazo de las muestras.

 2. Procesamiento: consiste en la preparación de las muestras, la realización de tinciones, y la inoculación en los medios de cultivo para su

posterior incubación. En este proceso es preciso considerar: a) el tipo de muestra enviada, b) el diagnóstico clínico del paciente y c) la petición solicitada. El tipo de muestra enviada determina si requiere o no pretratamiento (centrifugación, homogeneización) previo a la inoculación de los medios de cultivo. La información clínica del paciente es fundamental para la selección de los medios de cultivo a inocular y su posterior incubación. De modo general, en función del tipo de muestra, el laboratorio utiliza unos medios de cultivo primarios que permiten el aislamiento de la mayoría de los agentes etiológicos más frecuentes de los distintos procesos infecciosos. Sin embargo, en ocasiones el síndrome clínico puede estar causado por microorganismos poco frecuentes cuyo aislamiento requiere el uso de medios de cultivo específicos y/o selectivos no habituales. La sospecha de la participación de alguno de estos microorganismos poco habituales, debe comunicarse al laboratorio. Igualmente, el laboratorio debe dar a conocer a los clínicos de su institución qué microorganismos investiga rutinariamente y cuáles debe especificar en la petición (cartera de servicios o catálogo de pruebas).

Aunque el aislamiento por cultivo y continúa siendo una las técnicas más frecuentemente empleadas en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, existen en la actualidad otras técnicas cuya principal ventaja sobre el cultivo es la rapidez diagnóstica. Estas técnicas de diagnóstico rápido se basan en la detección de antígenos y de ácidos nucleicos o en la detección de la respuesta inmunológica. Si bien la detección de ácidos nucleicos no está al alcance de todos los laboratorios, las técnicas de detección de antígenos no requieren tecnología ni equipos especiales y son fáciles de realizar. Las técnicas más utilizadas son la inmunofluorescencia directa, la aglutinación con partículas de látex, el enzimoinmunoensayo y la inmunocromatografía. Otras técnicas de diagnóstico rápido basadas en la detección de la respuesta inmunológica (anticuerpos principalmente) han demostrado ser muy útiles en el diagnóstico de determinadas enfermedades infecciosas. Las técnicas más utilizadas son el Rosa de Bengala (para el diagnóstico de la brucelosis), y la detección por anticuerpos heterófilos (para el diagnóstico de la mononucleosis infecciosa), el RPR (para el diagnóstico de la sífilis), y la detección rápida presuntiva de infección por el VIH. En la actualidad existen múltiples equipos comercializados para la detección de numerosos microorganismos en determinadas muestras clínicas que han demostrado utilidad.

  Microorganismos con técnica rápida disponible

 para su detección en muestras clínicas

Microorganismos Muestras Técnicas disponibles

Bacterias

Haemophilus influenzae tipo b

LCRa Aglutinación

Streptococcus pneumoniae LCR, orina, muestras Aglutinación (LCR), ICb(orina)

respiratorias

Neisseria meningitidis LCR Aglutinación

Legionella pneumophila Muestras respiratorias, orina

IFDc (respiratorias), IC, EIAd(orina)

Streptococcus pyogenes Exudado faríngeo, lesiones cutáneas, líquidos estériles

IC

Brucella spp. Sangre Aglutinación

Clostridium difficile Heces Aglutinación, EIA

Hongos

Aspergillus spp. Suero Inmunodifusión, EIA

Cryptococcus neoformans Suero Inmunodifusión, EIA

Pneumocystis jiroveci Muestras respiratorias IFD

Virus

Rotavirus Heces IC, Aglutinación

Adenovirus Heces, muestras respiratorias

IC (heces, respiratorias), Aglutinación (heces), IFD (respiratorias)

Virus respiratorio sincitial Muestras respiratorias IC, IFD

Virus influenza Muestras respiratorias IC, IFD

Virus parainfluenza Muestras respiratorias IFD

Virus de la inmunodeficiencia humana

Sangre IC, EIA

Virus herpes simplex Lesiones cutáneas IFD

Virus varicella zoster Lesiones cutáneas/muestras respiratorias

IFD

Citomegalovirus Sangre/muestras respiratorias/orina

IFD

Virus Epstein Barr Sangre Aglutinación

Parásitos

Cryptosporidium Heces Tinción de ácido-alcohol resistencia

Plasmodium Sangre Giemsa, Gota gruesa, IC

Giardia+Cryptosporidium Heces IFD

Entamoeba histolityca Heces EIA

Abreviaturas: aLCR: Líquido cefalorraquídeo; bIC: Inmunocromatografía; cIFD: Inmunofluorescencia directa; dEIA: Enzimo inmunoensayo

Transporte y conservación de muestras en el

laboratorio de Microbiología

 

Determinación Envases TRANSPORTE Tiempo y temperatura

Abscesos/heridas quemaduras/mordeduras

Bacterias Envase para anaerobios (pref.) o

jeringa sin aguja (pref.). Una para Gram, otra para cultivo (Amies/Stuart)

<2 h, TA

Hongos Estéril (pref.)/Torunda. Una torunda para tinción, otra para cultivo (Amies/Stuart)

<2 h, TA

Virus Torunda seca¹ Transferir a TV, <24 h, 2-8°C

Bacterias/Hongos Estéril <15 min, TA

Virus Estéril Transferir a TV, <24 h, 2-8°C

Catéter/material protésico Bacterias/Hongos Estéril <15 min, TA

No es aceptable    

No se recomienda Enviar líquido drenaje/ abscesos/aspirados

 

Genital (Secreción Bacterias/Hongos Estéril <2 h, TA

(cervical/uretral/rectal)Chlamydia trachomatis

Medio transporte clamidia (cultivo). Torunda seca (fluorescencia)

Inoculación inmediata

(cervical/rectal/uretral)Bacterias (gonococo)

Inoculación directa sobre medios de cultivo Torunda con medio transporte

<2 h, TA

Genital (líq. amniótico) Bacterias/Hongos Transporte de anaerobios <15 min, TA

Genital (úlcera) (cualquier Virus Torunda seca¹ Transferir a TV, <24 h, 2-8°C

No se recomienda    

Genital (úlcera) (cualquier Treponema pallidum

Campo oscuro Inmediata visualización

Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum

Torunda de dacrón Inocular en medio transporte de micoplasmas

Bacterias/Hongos Torunda con medio transporte (cultivo) Torunda seca para Gram

<2 h, TA

Bacterias Estéril con Cary Blair <2 h, TA

Clostridium difficile Estéril <1 h, TA

1-24 h, 2-8°C

>24 h, -20°C

Parásitos Transporte con SAF, FOR + PVA, MIF + PVA

Indefinido, TA

Rotavirus Estéril 2-8°C

Virus Torunda seca¹ Transferir a TV, <24 h, 2-8°C

Bacterias/Hongos Estéril <2 h, 2-8°C

Micobacterias Estéril <15 min, TA o neutralizar en la 1ª hora de la recogida

Lesiones fúngicas (piel, Hongos Inoculación directa sobre medios de cultivo

<24 h, TA

Líquidos estériles Bacterias Estéril/botellas de hemocultivos /transporte para anaerobios

<15 min, TA

Hongos Estéril <15 min, TA

Virus Estéril <15 min, 2-8°C

Serología Estéril <15 min, TA

Parásitos Estéril <15 min, TA

Bacterias/Hongos Estéril/botellas de hemocultivos <24 h, TA

Parásitos (Leishmania)

Estéril <2 h, TA

Virus Estéril Transferir a TV, <24 h, 2-8°C

Ocular (Conjuntival) Bacterias/Hongos Torunda con medio de transporte <2 h, TA

Ocular (Raspado corneal) Bacterias/Hongos Inoculación directa en medios de cultivo

<15 min, TA

Virus Torunda seca¹ Transferir a TV, <24 h, 2-8°C

Bacterias/Hongos Torunda con medio de transporte <2 h, TA

Bacterias/Hongos Torunda con medio de transporte Transporte para anaerobios Tubo estéril

<2 h, TA

Bacterias/Hongos Estéril Tubos con conservante (ác. bórico-formiato sódico)

<2 h, TA (sin conservante) <24 h, 2-8°C (con conservante)

Virus Estéril <24 h, 2-8°C

M. hominis/ U. urealyticum

Estéril Inocular en medio transporte de micoplasma

Leptospira Estéril <1 h, TA

Parásitos Estéril <2 h, TA

AntígenoLegionella Estéril <2 h, TA

Antígeno de neumococo

Estéril <2 h, TA

Orina suprapúbica Bacterias Transporte para anaerobios <2 h, TA

Bacterias Torunda con medio de transporte <2 h, TA

Hemocultivo Botellas de hemocultivos <2 h, TA

Serología Suero  <24 h, 2-8°C

Plasma (no válido si hay que inactivar)

Virus Plasma (con EDTA para técnicas moleculares)

<2 h, TA

Carga vírica VIH Plasma (nunca heparina) <2 h, TA

CultivoLeishmania Sangre no coagulada (con heparina pref.)

<15 min, TA

Parásitos Sangre no coagulada (con EDTA) <15 min, TA

Tracto respiratorio superior (sinusal)

Bacterias  Transporte para anaerobios/Estéril  <15 min, TA

Hongos Estéril

Tracto respiratorio superior (faríngeo)

Bacterias/Hongos Torunda con medio de transporte <2 h, TA

Tracto respiratorio superior (faríngeo)

Antígeno S. pyogenes

Torunda seca (Dacrón/algodón) <2 h, TA

Virus Torunda seca¹ Transferir a TV, <24 h, 2-8°C

Tracto respiratorio Bacterias/Hongos Torunda con medio de transporte <2 h, TA

Bacterias/Hongos Torunda con medio de transporte <2 h, TA

Virus Torunda seca¹ Transferir a TV, <24 h, 2-8°C

Tracto respiratorio superior (nasofaríngeo)

Bordetella pertussis Torunda seca de alginato Inmediato/2-8°C

Tracto respiratorio Bacterias/Hongos Estéril <2 h, TA

Virus Estéril Transferir a TV, <24 h, 2-8°C

Transporte para la investigación de aerobios

  

Sistema de transporte Comentarios

Torundas con medio de transporte

Torundas en tubos de plástico con medio de transporte que mantiene un pH favorable y previene la desecación de la muestra.

Torundas de alginato cálcico

Útiles para la investigación de Chlamydia spp. y Bordetellaspp. Pueden ser tóxicas para N. gonorrhoeae, U. urealyticum y virus. Útiles para la toma de muestra de conexiones de catéteres intravasculares.

Torundas de dacrón Útiles para la investigación de virus

Torundas de algodón Pueden inhibir a Chlamydia spp. Cuando la torunda es de madera, puede inactivar a virus del grupo Herpes e interferir con las pruebas de identificación de Ureaplasma.

Torundas para exudados nasofaríngeos

Torundas flexibles que emplean alambre en lugar de madera

Tubos estériles de boca ancha

Útiles para el transporte de orinas, esputos, broncoaspirados, lavados broncoalveolares, heces, biopsias.

Tubos estériles Líquidos estériles, catéter telescopado, aspirados de abscesos y heridas

Tubos estériles con medio de transporte o conservante

Tubo estéril con medio de transporte (Cary Blair) para enteropatógenos en heces. Tubo con fijador (alcohol polivinílico) para parásitos en heces. Tubo con conservante (ácido bórico–formiato de sodio) para orinas. Mantiene la población bacteriana durante 48 h a temperatura ambiente sin necesidad de refrigeración.

Placas de Petri estériles

Útiles para pelos, escamas cutáneas y uñas

Sistemas de transporte para la investigación de microorganismos anaerobios

Sistema de transporte Comentarios

Torundas con sistemas de transporte específicos para anaerobios

 

Viales y tubos con atmósfera anaerobia

Contienen un medio de transporte semisólido con un agente reductor y un indicador. Cualquier coloración azul de dicho medio indica exposición al aire.

Bolsas de anaerobiosis La muestra se introduce en el interior de una bolsa impermeable en cuyo interior se introduce un catalizador y un generador de hidrógeno y CO2.

Jeringa para la obtención de aspirados

Cuando no se dispone de ninguno de los sistemas anteriores o bien la cantidad de muestra es mínima, puede utilizarse la misma jeringa con la que se ha obtenido. Para ello hay que eliminar el aire y taponar la aguja con un tapón de goma.

Pretratamiento de la muestra 

  Centrifugación - Centrifugar todos los líquidos en volumen superior a 1ml a 2.500 rpm durante 15 minutos- Centrifugar sangre a 3.500 rpm durante 3-5 minutos para detección de antígenos y/o anticuerpos- Otras técnicas de concentración específicas: precipitación en etanol, ultracentrifugación selectiva, etc.  Homogeneización  Mediante hoja de bisturí

- Traspasar la muestra a una placa de Petri estéril. Con ayuda de una hoja de bisturí desmenuzar el tejido hasta obtener una consistencia homogénea.- Traspasar la muestra homogenizada a un contenedor estéril con ayuda de una pipeta Pasteur. 

 Mediante mortero- Traspasar la muestra al interior de un mortero estéril y añadir 1-2 ml de caldo de cultivo.- Con ayuda de la mano del mortero triturar la muestra mediante movimientos rotatorios.- Traspasar la muestra utilizando una pipeta Pasteur estéril a un contendor estéril. 

 Mediante Stomacher- Colocar la muestra en el interior de una bolsa de Stomacher y añadir 1-2 ml de caldo de cultivo - Colocar la bolsa en el interior del Stomacher, dejando unos centímetros de la bolsa sobresalir sobre la tapa del Stomacher. - Cerrar la tapa y conectar el Stomacher durante 1 a 5 minutos. - Desconectar el Stomacher, extraer la bolsa y traspasar su contenido a un contenedor estéril. Las muestras que se procesen para hongos no se homogenizan sino que se deben cortar en pequeños trozos con la ayuda del bisturí y se inoculan directamente sobre los medios de hongos con objeto de evitar que determinados hongos no septados sean inviables.

 Preparación de extensiones 

Mediante impronta: Piezas de tejido- Colocar el tejido en una placa de Petri y cortar una porción con la ayuda de una hoja de bisturí- Con unas pinzas, tomar la pieza cortada y realizar impresiones por la superficie del corte sobre un portaobjetos 

  Extensiones finas: material muy purulento - Tomar una porción de la muestra y colocarla sobre un portaobjetos- Colocar otro portaobjetos sobre la muestra y presionar los dos portaobjetos- Desplazar el portaobjetos superior sobre el que contiene la muestra hasta separarlos- Repetir este último paso hasta conseguir una extensión fina 

Líquidos- Depositar una gota de líquido sobre un portaobjetos y dejar secar- Citocentrifugar unas gotas de líquido 5-10 min. a velocidad media 

Muestras en torunda- Colocar la torunda sobre un portaobjetos- Añadir sobre la torunda una pequeña cantidad de caldo de cultivo- Realizar movimientos rotatorios, exprimiendo la torunda sobre el portaobjetos

 

Medios de cultivo y

tinción de Gram para muestras

microbiológicas

seleccionad

 

as

   Muestras/

MicroorganismoGram

AS ACH

MCK

Tio/BHI

Otros

Biopsias X X X X X Medios anaerobios¹

Biopsias (intestinal, colon, rectal)

          C.difficile Enteropatógenos

Biopsias gástricas X         Helicobacter pylori

Catéter vascular   X        

Conexiones/Piel pericatéter

  X        

Genitales            

  Rectal   X       S. agalactiae

  Uretral X   X     Thayer Martin

  Cervical   X X     Thayer Martin

  Secreción prostática   X X X X  

  Vaginal   X       S. agalactiae

Heces           Caldo Selenito SS o similar Campylobacerselectivo Sangre ampicilina

Heridas profundas, mordeduras, quemaduras, úlceras, abscesos

X X X X X Medios anaerobios¹

Heridas superficiales X X X X X  

Jugo gástrico   X X X X Medios anaerobios¹

Líquidos estériles            

  L. ascítico, peritoneal, pericárdico, sinovial

X X X X X Medios anaerobios¹

  L. pleural X X X X X BCYE Medios anaerobios¹

  Líquido cefalorraquídeo

X X X   X  

Ocular            

  Exudado conjuntival   X X      

  L. intraocular X X X X X Medios anaerobios¹

Oído externo   X X X    

 

Timpanocentesis X X X X X  

Orina (micción, sondaje)   X   X   Agar Cled

Orina suprapúbica X X X X   Medios anaerobios¹

Tracto respiratorio inferior

           

  Broncoaspirado X X X X   BCYE

  Cepillado bronquial con telescopado

X X X X   BCYE

Medios anaerobios1

  Lavado broncoalveolar X X X X   BCYE

  Esputo X X X X    

Tracto respiratorio superior

           

  Aspirado sinusal X X X X X Medios anaerobios¹

  Faríngeo   X       Alternativa CNA

  Nasal   X       Agar Manitol sal

Clostridium difficile           CCFA

E.coli O157H7           Sorbitol-MCK

Bordetella pertussis           Bordet Gengou IFD si no cultivo

Helicobacter pylori   X       AgarHelicobacter Thayer Martin Agar Brucella

Legionella           BYCE

Neisseria gonorrhoeae     X     Thayer Martin

Streptococcus agalactiae

  X       Todd-Hewitt

Agar Granada

Vibrio           TCBS

Yersinia           CIN

 

medios anaerobios: agar sangre para anaerobios (Brucella agar), agar feniletanol para anaerobios, agar sangre lacada-vancomicina-kanamicina (ASKVL), agar Bacteroides bilis esculina (BBE) Abreviaturas: AS: Agar sangre; ACH: Agar chocolate; MCK: Agar MacConkey; Tio/BHI: Caldo tioglicolato ó infusión cerebro-corazón de buey; BCYE: agar enriquecido para cultivo de Legionella; CNA: agar sangre colistina-ácido nalidíxico; CCFA: agar cicloserina-cefoxitina-fructosa-yema de huevo; TCBS: agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa; CIN: agar cefsulodina-irgasán-novobiocina

 Incubación

Temperatura- La mayoría de los cultivos bacterianos se incuban a 35-37ºC- El aislamiento de Campylobacter spp. de heces requiere una temperatura de incubación de 42ºC- La mayoría de los cultivos para hongos se incuban a 30°C 

Atmósferas de incubación- Aerobiosis- Atmósfera enriquecida con 5-7% de CO2

- Atmósfera microaerofílica para el aislamiento de Campylobacter: 5% de O2, 10% CO2 y 85% de N2.- Atmósfera de anaerobiosis

Cada laboratorio debe realizar una vigilancia de la calidad de los medios de cultivo que utiliza, tanto de los preparados en el propio laboratorio (apariencia, crecimiento/inhibición, esterilidad) como de los que se adquieran comercialmente.

El laboratorio debe solicitar al proveedor de medios de cultivo los certificados de los controles de calidad donde deben estar incluidas las características físicas y químicas que definen al medio de cultivo. Esos certificados deben conservarse en el laboratorio. Asimismo, se deberán realizar controles de calidad a los medios adquiridos comercialmente. El propio laboratorio debe elegir tanto la periodicidad como la selección de los medios a los que realizar el control de calidad en función del tipo de medios que utilice, la variedad y los datos históricos de la conformidad de los controles realizados por el laboratorio con las características que el proveedor facilite: un medio estable y que no haya ocasionado problemas de crecimiento según registros previos se debe controlar menos que uno que sea menos estable y haya ocasionado problemas en su uso. El laboratorio debe generar registros de este control de medios adquiridos de proveedores y conservar estos registros para poder evaluar los medios y reconsiderar permanentemente el control de calidad de los mismos. Como ejemplo de formato para el registro de control de medios adquiridos comercialmente se propone el formato del  Control de medios preparados. Con este control no sólo se evalúa la conformidad del laboratorio con los medios que adquiere ya preparados sino que también se evalúan las condiciones de procesamiento, estufas y atmósferas utilizadas.

Para el control de los medios se deben utilizar preferentemente cepas de colección (ATCC, CECT u otras colecciones) pero en el caso de no tener acceso a estas cepas se podrán utilizar cepas aisladas en el propio laboratorio con características perfectamente definidas. Incubación

Temperatura- La mayoría de los cultivos bacterianos se incuban a 35-37ºC- El aislamiento de Campylobacter spp. de heces requiere una temperatura de incubación de 42ºC- La mayoría de los cultivos para hongos se incuban a 30°C 

Atmósferas de incubación- Aerobiosis- Atmósfera enriquecida con 5-7% de CO2

- Atmósfera microaerofílica para el aislamiento de Campylobacter: 5% de O2, 10% CO2 y 85% de N2.- Atmósfera de anaerobiosis

Cada laboratorio debe realizar una vigilancia de la calidad de los medios de cultivo que utiliza, tanto de los preparados en el propio laboratorio (apariencia, crecimiento/inhibición, esterilidad) como de los que se adquieran comercialmente.

El laboratorio debe solicitar al proveedor de medios de cultivo los certificados de los controles de calidad donde deben estar incluidas las características físicas y químicas que definen al medio de cultivo. Esos certificados deben conservarse en el laboratorio. Asimismo, se deberán

realizar controles de calidad a los medios adquiridos comercialmente. El propio laboratorio debe elegir tanto la periodicidad como la selección de los medios a los que realizar el control de calidad en función del tipo de medios que utilice, la variedad y los datos históricos de la conformidad de los controles realizados por el laboratorio con las características que el proveedor facilite: un medio estable y que no haya ocasionado problemas de crecimiento según registros previos se debe controlar menos que uno que sea menos estable y haya ocasionado problemas en su uso. El laboratorio debe generar registros de este control de medios adquiridos de proveedores y conservar estos registros para poder evaluar los medios y reconsiderar permanentemente el control de calidad de los mismos. Como ejemplo de formato para el registro de control de medios adquiridos comercialmente se propone el formato del  Control de medios preparados. Con este control no sólo se evalúa la conformidad del laboratorio con los medios que adquiere ya preparados sino que también se evalúan las condiciones de procesamiento, estufas y atmósferas utilizadas.

Para el control de los medios se deben utilizar preferentemente cepas de colección (ATCC, CECT u otras colecciones) pero en el caso de no tener acceso a estas cepas se podrán utilizar cepas aisladas en el propio laboratorio con características perfectamente definidas.

 

PARASITOLOGÍA

INTRODUCCIÓNExiste cierta relación entre el parásito y el huésped, que va desde lo más simple como es el transporte mecánico hasta lo más complejo, como es el predatismo.

Entre ellas tendríamos al mutualismo, comensalismo y parasitismo.

CLASIFICACIÓN DE PARÁSITOS

Los parásitos son eucariotas de estructura compleja y que poseen un núcleo verdadero. Los estudiamos según la siguiente clasificación:

Protista: Protozoos        Animal: Metazoos

-        Helmintos ( Platelmintos o Nematelmintos)-        Artrópodos

CLASIFICACIÓN SEGÚN DISTINTOS PUNTOS DE VISTA

Desde el punto de vista temporal el parasitismo puede ser Ocasional u Obligado. Este último a su vez puede ser permanente o intermitente.

Desde el punto de vista de la situación se da el Endoparasitismo (afectan al interior del huésped. INFECCIÓN) y elEctoparasitismo (afectan a la piel. INFESTACIÓN).

Desde el punto de vista del huésped al que parasitan y cómo lo parasitan tenemos parásitos Monoxenos (uno exclusivo y específico)

      

y Heteroxenos (puede haber más de un parásito afectando al individuo)

EPIDEMIOLOGÍA

Vías de Transmisión

Directa: se da entre personas. Caso de la Trichomona              Por vía transplacentaria. Caso de la Toxoplasmosis

Fecal – Oral: por alimentos. Caso de la amebas y la Triquina.

Telúrica: Suelos contaminados. Caso de la Ascanidiasis.

Antropozoonosis: animales infectados. Caso de la Hidatidosis.

Artrópodos: paludismo (transmitida por un piojo).

Vías de Entrada

Digestiva

Mucosas

Cutánea

RespiratoriaTransfusional (caso excepcional)

 

ACCIÓN PATÓGENAMecánica: Hidatidosis (quistecompresión de órganos anejos), Ascanidiasis                  (obstrucción del intestino por un número abundante de parásitos).

Traumática: migración  sarna.

Expoliadora: botriocéfalo  sustrae la vitamina B12

Tóxica: sustancias químicas que son secretadas o vehiculizadas por la sangre, como enzimas proteolíticas, enzimas necrotizantes y venenos.

Citopatógena: destrucción celular (Plasmodium)

Neoplásica: Schistosoma (carcinoma), Fasciola Hepática (tumores biliares)

CLÍNICA

La clínica puede ir desde un portador asintomático o sintomatología leve, hasta unas graves manifestaciones.

Las manifestaciones clínicas dependerán del número de parásitos, del

tamaño de los mismos, actividad, toxicidad y respuesta inmunitaria.

Las manifestaciones generales son: anorexia, cefaleas, dolores abdominales...

PROFILAXIS

        Control del reservorio y fuentes de infección        Saneamiento del medio ambiente        Higiene personal y de la vivienda        Control higiénico alimentario        Control de artrópodos vectores        Quimioprofilaxis (paludismo / desparasitación)

DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICOEl diagnóstico serológico consiste en la detección de   huevos   ,   larvas   o   adultos   de helmintos , así como la observación de trofozoitos (forma vegetativa) o   quistes   de protozoos.

IDENTIFICACIÓN

La identificación se lleva a cabo en función de la Morfología y a través de pruebas complementarias como el hemograma (anemia, leucocitosis, eosinofilia) y la radiología (detección de hidatidosis).

DETECCIÓN DIRECTA EN HECES

En el caso de la investigación de Trofozoitos deberá hacerse un procesamiento rápido que no deberá superar los 30 minutos después de la recogida de la muestra.

En caso de huevos y larvas no es tan importante el rápido procesamiento. Se utilizará un conservante que se añadirá en proporción 3 : 1, es decir 3 partes de conservante por 1 de muestra. Los conservantes más comúnmente utilizados son: Tormalina (formol al 5-10%); PVA (Alcohol Polivinílico) y MIF (Mertiolate Iodo y Fenol.

Generalmente se necesitan 3 muestras recogidas con intervalos de entre 2-3 días, con el fin de que en alguna de ellas aparezcan los trofozoitos, los quistes...

A la muestra se le realiza un EXAMEN MACROSCÓPICO en el cual observaremos a los parásitos enteros y la consistencia de la muestra (formes o semiformes; blandas; o líquidas).

También se le realiza un EXAMEN MICROSCÓPICO en el cual se buscan trofozoitos, quistes y huevos. El procesamiento de la muestra consiste en los siguientes pasos:

-         Realizar la suspensión de las heces

-         Depositar una gota en un porta-         Añadir un colorante, generalmente lugol, que tiñe las

estructuras de un color amarillo-marrón.-         Colocar un cubre-         Observar al microscopio con el objetivo de bajo aumento.

Se pueden llevar a cabo TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN en el caso de que el microorganismo sea escaso en la muestra. Existen dos tipos de técnicas de concentración:

Concentración por Flotación: (Huevos, larvas y quistes)

Preparar una solución de Sulfato de Zinc ( 330 g de Zinc / 670 mL de agua).

Centrifugar a 1500-2000 r.p.m. una suspensión de heces (1-2 mL) durante 1 minuto. Decantar.

Añadir 1-2 mL de Solución de Sulfato

Resuspender: completar el tubo con Sulfato, filtrar con una gasa y centrifugar durante 1 minuto.

Tomar la muestra de la superficie del tubo (los parásitos flotan)

Observar al microscopio con soluciones yodadas (lugol).

Concentración por Sedimentación:

Preparar una suspensión de heces en 10 mL de formol. Dejar reposar durante 30 minutos y filtrar por una gasa a un tubo de fondo cónico.

Completar el tubo con suero salino y centrifugar durante 2 minutos. Eliminamos el sobrenadante.

Resuspender con formol hasta la mitad del tubo y añadir de 1 a 3 mL de éter. Agitar y centrifugar durante 2-3 minutos.

Observar el sedimento utilizando soluciones yodadas (lugol) que proporciona un color amarillo-marrón a las formas buscadas.

Otras de las pruebas que se pueden llevar a cabo son las TINCIONES PERMANENTES como son la tinción Tricrómica y la tinción Hierro-Hematoxilina.

 

 

Por último se encuentran las TÉCNICAS ESPECIALES, que son las siguientes:

     Pruebas de Graham: se utiliza para el diagnóstico de Oxiuros generalmente aquellos que pertenecen al género Enterobius vermicularis.

Se utiliza una cinta de celofán, que se sujeta con un depresor y se pasa por la zona perianal a primera hora de la mañana y sin aseo previo. Colocamos la cinta sobre un porta y examinamos en busca de huevos.

     Técnica para buscar quistes de Criptosporidium: se trata de una tinción AAR modificada, que consiste en:

-         Fijar con Metanol durante 30 minutos-         Añadir Carbol Fucsina durante 5 minutos-         Lavar con Etanol a 50ºC-         Lavar con agua-         Decolorar con Ácido Sulfúrico al 1% durante 2

minutos.-         Añadir Azul de Metileno-         Los quistes se observarán de color rojo-rosa sobre fondo

azul.

     Técnica para la búsqueda de proglótides de cestodos   (segmentos del cuerpo de gusanos): Se utiliza para diferenciar entre las especies de Tenia solium y Tenia saginata.

     Prueba de cápsulas duodenales o enterotest: Esta prueba se utiliza para la investigación de Giardia y Strongyloides. Consiste en hacer pasar un hilo de nylon con un peso por el intestino y posteriormente, cuando el hilo es eliminado, se raspa para la examinación.

     Tinción Tricrómica: Esta prueba es más concentrada que las tinciones tricrómicas que habitualmente se realizan. Se utiliza para la investigación de Microsporidium.

     Cuantificación de huevos: se utiliza para la investigación de Ascaris lumbricoides y Trichuris trichura. La prueba se lleva a cabo mediante el “Recuento de Stoll”:

Consiste en la realización de una suspensión con 4 gramos de heces. Se utiliza un asa calibrada de 0,15 mL. Los resultados se expresan como:

% huevos / gramo = nº huevos x 100 x Factor de Corrección

El Factor de Corrección se pone en función de la contextura de las heces, así, para heces diarreicas se utiliza un 3, para heces blandas un 2 y para semiformes un 1,5.

     Observación de larvas de Nematodos / larvas de Strongyloides: se realiza una suspensión de heces no refrigeradas. Se pasan a un tubo de ensayo con papel de filtro y se deja reposar en el durante 10 días. Transcurrido el tiempo se retira el papel y se observa la presencia de larvas en la superficie del papel.

 

 

 

DETECCIÓN DIRECTA EN OTRAS MUESTRAS DISTINTAS A HECES

        Sangre: para el estudio del Paludismo, Filarias y Tripanosomas. Se pueden utilizar dos técnicas:

-         Capa fina: se realiza una extensión igual que para el frotis sanguíneo.

-         Gota gruesa: depositamos una gota en el centro de un porta y con el extremo de otro porta desfibrinamos la gota moviéndola como si la estuviéramos mezclando.

        Esputo: se puede realizar un examen en fresco o tinciones permanentes. Podemos encontrar:

-         Fases larvarias de Áscaris, Strongyloides-         Huevos de algunos gusanos-         Amebas (excepcionalmente)-         Criptosporidium

        Exudados vaginales: se realiza un examen en fresco y se investiga la presencia de Tricomonas vaginalis.

        Biopsias hepáticas, nódulos linfáticos y LCR

        Pruebas serológicas y detección de Ag y técnicas de PCR

PROTOZOOS

DIVISIONES EN FUNCIÓN DEL MEDIO DE LOCOMOCIÓN

SARCODINA-AMEBAS         MASTIGAFORA O FLAGELADOS         CILIATA         ESPOROZOA

SARCODINA (Rizópodos) – AMEBAS

Las amebas se pueden clasificar en dos grandes grupos, según sean:

De vida libre: se dividen en Naegleria y AcantamoebaParásitos: se dividen en Entamoeba, Endolimax  e  Iodamoeba.

Las características generales de las amebas son:

-         Se multiplican por fisión binaria

-         Se desplazan mediante seudópodos

-         Presentan formas de resistencia (quistes)

La ameba más característica de todas las anteriores

es la Entamoeba   hystolítica , que es el agente etiológico de la disentería amebiana.

Esta ameba se presenta tanto en forma vegetativa (trofozoito) como en forma quística. Cada quiste da lugar a 8 amebas diferentes en función de la forma del quiste, etc (Fotocopias).

La Transmisión es por vía fecal-oral a través de la ingestión de los quistes.

Produce lesiones necróticas en el colon y en ocasiones se producen manifestaciones sistémicas que se observan por la presencia de abscesos hepáticos.

El Diagnóstico consiste en la observación de las heces en fresco para la detección de trofozoitos y quistes.

Los quistes se producen por deshidratación del contenido intestinal pasando luego de la forma vegetativa a la forma quística. Los quistes pueden ser:

-         Inmaduros: se observan como cuerpos cromatoides (cromatina) con cúmulos de glucógeno que se tiñen con lugol de amarillo.

-         Maduros: presentan de 1 a 4 núcleos (E. hystolítica)

Hay que saber diferenciar entre los quistes de Entamoeba hystolítica de los quistes de Entamoeba hartmanni y Entamoeba coli, que tienen de 5 a 8 núcleos.

También es necesario diferenciarlos de los quistes de otras amebas, como son la Iodomoeba (quistes ovoides sin cromatina más grandes que los de la E. hystolística, con  4 núcleos) y la Endolimax  nana (quistes más pequeños que la E. hystolítica con un solo núcleo).

CILIATA (CILIADOS)

El representante de este grupo es el Balantidum coli que se produce por la ingestión de quistes que contaminan agua y alimentos.

Tienen forma oval, con numerosos cilios. Los quistes avanzan por el intestino y dan lugar a la disentería. Se detectan en heces.

MASTIGAFORA – FLAGELADOS

En función de la localización en el huésped, se clasifican en:

Intestinales: el representante de este grupo es la Giardia lamblia. Se transmite por vía  fecal – oral por ingestión de aguas contaminadas.

La morfología que presenta depende de si aparece en forma de trofozoito (lágrima) o en forma quística (redondeada u ovalada).El cuadro clínico puede ir desde infecciones asintomáticas hasta una diarrea intermitente. Cuando el cuadro va más allá de las infecciones asintomáticas se produce una irritación de la mucosa intestinal que acompañada de un gran número de parásitos da lugar a un síndrome de mala absorción.El Diagnostico se realiza mediante la observación de quistes en las heces del paciente.

Urogenitales: el representante de este grupo es Tricomonas vaginalis que produce una enfermedad de transmisión sexual. Tiene su hábitat en la vagina y uretra. No produce quistes y da lugar a trofozoitos de 3 a 5 flagelos con una membrana ondulada característica.El cuadro clínico consiste en la aparición de síntomas hacia los 4-28 días de incubación que consisten en prurito vulvar y una secreción purulenta en el caso de la mujer, mientras que en el hombre es poco significativo y puede darse uretritis inespecíficas.El Diagnóstico se realiza en fresco de un exudado vaginal o directamente a partir de una muestra de orina.Hemoflagelados: los parásitos más representativos de este grupo son Tripanosomas (brucei y cruzi) y las Leishmanias.

TRIPANOSOMA BRUCEI :  las especies más importantes de este género son T. Brucei brucei, T. Brucei gambiense y T. Brucei rhodesiense. Estas dos últimas producen la “Enfermedad del sueño” o “Tripanosomiasis africana”, que es transmitida por la mosca     tsé-tsé. Tiene un periodo de incubación variable que puede oscilar desde semanas a meses.

El cuadro clínico consiste en fiebre irregular, linfoadenopatías, esplenomegalia, anemia, letargia, sueño, apatía,...

El diagnóstico de laboratorio se realiza mediante una tinción de Giemsa o Wright tomando como muestra sangre, nódulos linfáticos, LCR,... También se pueden utilizar pruebas serológicas como técnicas de ELISA e IFI.

TRIPANOSOMA CRUZI :  es el agente etiológico de la “Enfermedad de Chagas” o “Tripanosomiasis americana”. Se transmite por chinches y el periodo de incubación es de 1 a 2 semanas.

El cuadro clínico consiste en fiebre irregular, edema parpebral, adenopatías, hepatoesplenomegalia,..Después de esta fase aguda, tras un periodo de latencia, se produce una infección crónica que finaliza en una miocarditis.

Para el Diagnóstico se realiza una observación en sangre que puede ser a través de una extensión en capa fina o mediante la técnica de gota gruesa. También se realizan hemocultivos y técnicas de ELISA e IFI.

LEISHMANIAS :  el ciclo vital lo llevan a cabo en el interior de dos huéspedes, uno vertebrado, que suele ser un mamífero, y un invertebrado (mosquitos hembras). El ciclo se lleva a cabo de la siguiente forma:

Partimos de un sujeto infectado que es picado por un mosquito (vector). Las Leishmanias pasan al intestino del mosquito donde se multiplican. Transcurridos de 15 a 20 días, las Leishmanias vuelven a la faringe (boca) del mosquito. Si en este momento el mosquito pica a otra persona, ésta quedará infectada. En el individuo, las Leishmanias se localizan en los

macrófagos, comportándose como un parásito intracelular.

Los principales grupos de Leishmanias en función de la localización de la infección son:

         Complejo L. donorani infantum  Kala azar o leishmaniasis visceral. El reservorio lo constituyen los perros y se transmite por la picadura de los mosquitos.

         Complejo L. trópica  agente etiológico de leishmaniasis cutáneas (mediterránea).

         Complejo L braziliensis  agente etiológico de la leishmaniasis mucocutánea (americana).

El diagnóstico se lleva a cabo por la observación de las leishmanias en una tinción de Giemsa. Además, si se trata de una forma cutánea, se realizan biopsias de la piel, y si se trata de una forma visceral se realizará un aspirado de médula ósea.

ESPOROZOA . ESPOROZOOS

Plasmodium: es el agente etiológico de la “Malaria” o “Paludismo”. Poseen un ciclo sexual, llevado a cabo en el interior del mosquito, y un ciclo asexual, llevado a cabo en el interior de un vertebrado. Este ciclo asexual comprende una fase eritrocitaria y una fase extraeritrocitaria.

Partimos de un mosquito infectado. Cuando  se produce la inoculación de los esporocitos del mosquito en el individuo, éstos llegan por el torrente sanguíneo hasta el hígado, donde se reproducen extraeritrocitariamente. Del hígado se liberan de nuevo al torrente sanguíneo y penetran en los hematíes. Producen la lisis de los mismos y se liberan tanto formas asexuales como formas sexuales (gameto). Si en este momento, el individuo es picado por un nuevo mosquito, éste adquiere las formas sexuales que proliferarán en el estómago donde se produce la fecundación. Por último pasan a la glándula salivar de donde podrán infectar a un nuevo individuo si el mosquito lo picara.

La clínica consiste en un período de latencia y , tras la liberación en sangre de los merozoitos, se produce una crisis febril característica que consiste en horas de malestar general, cefaleas, mialgias, escalofríos, aumento de la sensación de frío durante 15-60 minutos y un período caliente con temperaturas superiores a los 41ºC con una duración de 2 a 6 horas. Después aparece un período de lisis, aumento de la sudoración y período de somnolencia (2-4 horas).

Las especies más importantes de este grupo son:

     Plamodium vivax y P. Ovale: período de latencia cada 48 horas  “Terciana”

     P. Malarie: período de latencia de 72 horas  “Cuartanas”

     P. Falciparum: causante del 80% de los casos de paludismo. Tiene un período de latencia cada 36-48 horas  “Terciana maligna”

Para el Diagnóstico se realiza una extensión de sangre periférica y se tiñe mediante una tinción de Giemsa (capa fina o gota gruesa).

Babesia: la más significativa es B. microtti, que se transmite por las garrapatas. Hay una infectación de los eritrocitos y el cuadro clínico se manifiesta con fiebre, mialgias, artralgias, hepatoesplenomegalia, anemia hemolítica,...

Toxoplasma gondii: lleva a cabo una reproducción sexual y otra asexual en el interior del gato. Se excretan en forma de quistes en las heces del animal. La transmisión se produce por la ingesta de los quistes o la ingestión de carne cruda o poco cocinada contaminada.

La clínica consiste en una enfermedad leve y poco definida. Tiene importancia cuando la infectación se produce en personas inmunodeprimidas y mujeres embarazadas (infección del feto).

El diagnóstico serológico se lleva a cabo por técnicas de ELISA e IFI en las que se detectan IgG y IgM.

Criptosporidium: se localiza en el epitelio intestinal y su reservorio son los animales y el hombre. Se transmite por vía fecal-oral y provoca diarrea acuosa y profusa. Esta diarrea se incluye en la clasificación de diarreas del viajero. El diagnóstico se lleva a cabo mediante una tinción AAR modificada (Tinción de Kingou).

Isospora belli: se transmite por la ingestión de bebidas y comidas contaminadas. Da lugar a infecciones leves salvo en individuos con SIDA. El diagnóstico consiste en una observación en fresco mediante técnicas por concentración.

Sarcocystis: La clínica consiste en fiebre, diarrea, disminución de peso, dolor abdominal,...generalmente en pacientes con las defensas disminuidas. Se transmite por la ingesta de quistes del tejido muscular de vacas  ovejas.

Blastocystis hominis: produce infección gastrointestinal en personal inmunodeprimidas.

Microsporudium: produce diarreas en pacientes inmunodeprimidos. Se realiza una tinción permanente y biopsias intestinales.

Pneumocytis carinii: produce neumonías en pacientes inmunodeprimidos. El diagnóstico se lleva a cabo a partir de muestras respiratorias mediante tinciones permanentes.

No está definida su morfología y a veces se incluye en el grupo de los hongos.

METAZOOS

HELMINTOS:

PLATELMINTOS:

-         Trematodos (duelas)-         Cestodos o Tenias

        NEMATELMINTOS

PLATELMINTOS

Son gusanos planos, no segmentados, mayoritariamente hermafroditas, salvo los “Esquistosomas”.

TREMATODOS

Los clasificamos en función de la localización del parásito en el huésped, en:

      Intestinales     Pulmonares     Hepáticos     Sanguíneos

Ciclo de vida general: para que se pueda completar el ciclo de vida de los Trematodos son imprescindibles uno o más huéspedes.

Se excretan los huevos a través de las heces y para continuar con su maduración es necesario que lleguen al agua. Allí se deben dar una serie de condiciones (temperatura, iluminación,...) para completar la maduración de los huevos. Transcurrida esta primera etapa, que suele durar unos 5 o 7 días, se forma una larva llamada “MIRACIDIO”, que necesita un huésped intermediario para seguir completando su ciclo. El tiempo que tarda el Miracidio en parasitar un huésped ha de ser corto porque sino morirá.

Generalmente, este huésped intermedio son diferentes especies de caracoles. En el caracol tiene lugar una nueva fase que se denomina “CERCARIA”. A partir de este estadío pueden suceder distintas posibilidades dependiendo del parásito:

1.      Que se pase a otro huésped intermediario, generalmente el cangrejo. En él desarrolla otra fase, convirtiéndose en “METACERCARIA”, que llega al huésped definitivo que es el humano, depositándose en los pulmones                               (Ej. Paragonimus westermani)

2.      Que infecte directamente al humano a través de la penetración de venas periféricas, pasando seguidamente al corazón, pulmón e hígado. Del hígado se desplaza hacia su localización definitiva, que son las venas mesentéricas y venas pélvicas (Ej. Schistosoma).

3.      Que las cercarias se fijen en planteas acuáticas donde llevan a cabo la fase metacercaria llegando después al hombre, donde infecta los conductos biliares   (Ej. Fasciola hepática).

Trematodos Intestinales: “Echinostoma ilocanum” ; “Heterophyes heterophyes”

Trematodos Hepáticos: “Fasciola hepática”. Afecta a los conductos biliares. Su observación se lleva a cabo en las heces. Generalmente se transmite por consumo de plantas que han sido regadas con aguas contaminadas, generalmente berros.

Trematodos Pulmonares: “Paragonimus westermani”. El parásito se detecta en esputos y en heces. También se puede utilizar la técnica de fijación del complemento.

Trematodos Sanguíneos: “Schistosoma”. Es el agente etiológico de las Esquistosomiasis. Las distintas especies de Schistosoma no son hermafroditas.

Manifestaciones clínicas: atraviesan la piel mediante un sistema enzimático y alcanzan el torrente sanguíneo, produciendo una “dermatitis benigna”. Pasan a las venas periféricas, al corazón, al pulmón y al hígado. El cuadro agudo consiste en fiebre, hepatitis, hemorragia intestinal, hematuria, etc.

El diagnóstico se lleva a cabo mediante la detección de los huevos en heces, orina y biopsias. Los huevos presentan una morfología característica (espolón).

CESTODOS O TENIAS

Son parásitos del tracto gastrointestinal (forma adulta). En forma de larvas, parasitan los tejidos del huésped intermedio.

Morfología: podemos dividir la tenia en tres partes

1.      Escolex: cabeza. Constituye el órgano de fijación que puede presentar ventosas en número que oscila de 2 a 6. En ocasiones presentan alrededor del escolex una corona de ganchos.

2.      Cuello: Zona de crecimiento del gusano.

3.      Estróbilo: constituida por segmentos denominados “proglótides” y que contienen los órganos femeninos (ovarios) y masculinos (testículos). En función de la maduración se van alejando del escolex.

TENIA SOLIUM / Tenia del Cerdo/ SOLITARIA: puede medir de 2 a 5 metros. Los huevos se excretan en las heces y son ingeridos por el cerdo en donde pasan a la fase larvaria os “cisticerco”, depositándose en el tejido muscular. Se desarrollan en el intestino de la persona cuando ésta ingiere la carne del cerdo.

La clínica consiste en malestar general, pérdida de peso, apetito,...

El diagnóstico se lleva a cabo mediante la detección de huevos o proglótides en heces.

La “Cisticercosis” es una enfermedad producida por la forma larvaria de la tenia y que produce como consecuencia de la ingestión accidental de los huevos a través de agua, alimentos o autoinfección. Los huevos no

desarrollan la forma adulta, sino la de cisticerco, localizándose preferentemente en el cerebro y en los ojos.

TENIA SAGINATA: Es de mayor tamaño que la Tenia soluim. La parasitosis se produce por la ingesta de carne de vaca, donde el parásito se encuentra en fase larvaria (cisticerco). En el hombre, el parásito se encuentra en la fase adulta. La diferencia entre la Tenia soluim y la saginata es que ésta última no desarrolla el cisticerco en el hombre.

ECHINOCOCCUS GRANULOSUS   o Tenia del Perro:  La forma adulta se desarrolla en el interior del perro. El hombre se infecta a partir de las heces que contienen los huevos. Tras la ingestión se produce una migración de los huevos a diferentes órganos, principalmente hígado y pulmones donde se desarrolla el “Quiste Hidatídico”.

Las alteraciones producidas por el quiste pueden ser mecánicas (gran tamaño) o tóxicas (por la ruptura del quiste).

El diagnóstico es serológico y se trata mediante tratamiento quirúrgico.

ECHINOCOCCUS MULTILOCULARIS: Hidatidosis alveolar.

HYMENOLEPSIS: Hay dos tipos, H. Nana y H. Diminuta. Se detectan por observación directa de los huevos o proglótides en heces. La diferencia de los proglótides de los Hymenolepsis con los de las tenias es que los primeros son más anchos que largos (normalmente 4 veces)

DIPLIDIUM CANINUM: produce infecciones intestinales leves en el hombre. Se adquiere por contacto con perros y gatos infectados. El diagnóstico se lleva a cabo por la detección de huevos en heces.

DIPHYLLOBOTRIUM LATUM: Produce infección por ingestión de peces insuficientemente cocinados. Da lugar a múltiples lesiones intestinales, anemia,... Requiere de dos huéspedes intermediarios, los crustáceos y los peces, para acabar parasitando definitivamente al hombre.

Dependiendo de la localización del gusano a lo largo del intestino, se puede establecer una competencia por la vitamina B12. Esto sucede cuando se localiza en la porción del Yeyuno, dando lugar a anemia.

 

 

 

 

NEMATELMINTOS

Son gusanos redondos. La mayoría sólo tiene un huésped, el definitivo, pasando las larvas de un huésped a otro directamente o a través de un período de maduración en el exterior. Se transmiten por la ingestión de huevos maduros, larvas, o penetración de las larvas a través de la piel o mucosas.

En función de la localización del parásito en el huésped, se clasifican en

tres grandes grupos:

      Intestinales

      Tisulares

      Filarias

NEMATODOS INTESTINALES: Llevan a cabo la infección a través de la migración de las fases larvarias por los tejidos.

        Enterobius vermicularis – Oxiuros:

Se localizan en el intestino delgado (mucosa del ciego) y ocasionalmente en el tracto genitourinario femenino.

La sintomatología que presentan es como consecuencia de la puesta de huevos por la hembra en el ano: picor, insomnio, exfoliaciones como consecuencia del rascado...

El diagnóstico se lleva a cabo mediante la realización de la prueba de Graham.

        Trichuris trichura:

Infecta al hombre por la ingestión de agua y alimentos contaminados. Da lugar a un cuadro clínico leve. Dependiendo del número de parásitos pueden dar lugar a lesiones en la mucosa o diarreas.

El diagnóstico de laboratorio se lleva a cabo mediante la detección de los huevos en heces. Los huevos tienen una morfología característica con extremos prominentes, translúcidos al microscopio que les dan una apariencia de limón.

        Capillaria philippinensis:

Infecta al hombre por la ingesta de pescado crudo o poco cocinado. El diagnóstico se establece por observación de los huevos en las heces del sujeto (morfología similar al T. trichura con la diferencia de que en la pared aparecen estriaciones).

El cuadro es leve e inespecífico. Cuando la parasitación es muy intensa puede dar lugar a cuadros de mala absorción y deshidratación.

        Ascaris lumbricoides:

Es el agente etiológico de las Ascanidiasis. La infección se produce por la ingesta de huevos embrionados y posterior liberación de las larvas en el intestino. Los huevos permanecen viables en el exterior hasta 6 años. La migración tiene lugar por vía sanguínea, pasando por el hígado, corazón y pulmón. Cuando su tamaño les impide progresar, pasan a la faringe y se produce la deglución, pasando al intestino delgado.

El cuadro clínico, cuando la parasitación es intensa, puede consistir

en una bronconeumonía (fase pulmonar) o una obstrucción intestinal (fase intestinal).

El diagnóstico se realiza mediante técnicas de sedimentación. En la fase pulmonar aparecen larvas en los esputos.

        Anquilostomas (uncinarias): Ancylostoma duodenale / Necator americanus

Los huevos son eliminados por las heces. La maduración tiene lugar en el exterior (periodo aproximado de 10 días) y la larva penetra la piel del hombre, llegando al pulmón, faringe e intestino, donde desarrolla su ciclo de vida adulto. La fijación es oral, poseen una boca con una especie de dientes que le permiten fijarse y succionar sangre, que es de lo que se alimentan. Producen úlceras sanguinolentas.

La clínica está en función del grado de parasitación. Dermatitis, neumonía, diarrea, dolor abdominal, anemia,...

El diagnóstico de laboratorio se lleva a cabo mediante técnicas de concentración para la observación de huevos en heces.

NEMATODOS TISULARES

        Trichinella spiralis:

Es el agente etiológico de la Triquinosis. Se transmite por el consumo de carne de cerdo o jabalí que contienen las larvas enquistadas.

El proceso de parasitación tiene lugar en varias fases:

1.      Gastrointestinal: se da la liberación de las larvas contenidas en el interior de los quistes. Éstas dan lugar a gusanos adultos que infectan la mucosa intestinal, donde se produce la fertilización y puesta de larvas.

2.      Migratoria: la migración se produce por vía linfática y venosa, distribuyéndose así por el organismo. Se localizan en la musculatura estriada, generalmente en aquella que tiene mayor actividad.

3.      Enquistamiento: se produce la maduración de las larvas y alrededor de ellas se forma una cápsula que las protege. En ocasiones esta cápsula calcifica.

La clínica será en función del grado de parasitación y fase en la que se encuentre el parásito. Fiebre, mialgia, adema parpebral.

El diagnóstico de laboratorio consiste en la realización de un diagnóstico serológico (IFI, ELISA) y biopsias musculares. Se observa un aumento de las encimas musculares y eosinofilia.

        Larva migratoria visceral:

Constituida por las larvas del Toxocara (canis y catis). La

parasitación se adquiere por ingestión de los huevos del parásito.

 

        Dracunculus medinensis:

También se le denomina “Gusano de Guinea”. La parasitación se produce por ingestión de agua contaminada por pequeños crustáceos. Tras la ingestión se produce el desarrollo larvario en el tejido conectivo (peritoneo). Al año de la fase larvaria el gusano migra al tejido subcutáneo, preferiblemente a las extremidades inferiores. La piel se ulcera y el gusano realiza la puesta de huevos siempre y cuando la úlcera se ponga en contacto con el agua.

        Anisakis:

Producen cuadros de Anisakiasis. Generalmente, la parasitación se produce por la ingesta de pescado crudo. La clínica consiste en un cuadro diarreico con dolor abdominal que desaparece en pocos días.

FILARIAS

Son un tipo de gusanos de aspecto filamentoso, largos y delgados, que suelen aparecer en el tejido linfático enrollados unos a otros.

La hembra puede tener distintas localizaciones en el organismo y es la que produce las microfilarias que alcanzan el torrente circulatorio. Cuando el individuo es picado por un mosquito, le transfiere las microfilarias y en su interior desarrolla el ciclo infeccioso de las larvas. Cuando este mosquito vuelve a pica a otra persona, le transmite las larvas.

La detección se lleva a cabo en sangre periférica y será necesario realizar varias tomas ya que la presencia en sangre es variable.

Las dos especies más importantes desde el punto de vista clínico son: Wuchereria bancrofti (infecta los vasos linfáticos y región inguinal) y  Brugia malayi.

         

HEMOCULTIVO

 

   

A. Material necesario  • Frascos de hemocultivo.  • Compresores de goma.  • Jeringas y agujas de punción IV.  • Gasas estériles.  • Guantes de goma estériles.  • Alcohol etílico o isopropílico al 70%.

 

  • Solución Yodada.

B. Obtención de la muestra   • Retirar los tapones externos de los frascos.  • Desinfectar los tapones de goma con alcohol etílico al 70%, dejándolo secar al menos un minuto (no utilizar antiséptico yodado).  • Eliminar cualquier gota de desinfectante residual con una gasa estéril antes de la inoculación de la sangre.  • Localizar por palpación la vena que se va a puncionar. Debe utilizarse una vena distinta para cada extracción. Cuando no haya venas accesibles puede realizarse la extracción de sangre arterial.  • Desinfectar con alcohol etílico o isopropílico al 70% una zona de piel de unos 10 cm de diámetro. Se comenzará por el centro y se irán haciendo círculos concéntricos hacia el exterior. Dejar que se seque durante un mínimo de 30 segundos.  • Repetir el paso anterior aplicando una solución yodada, dejándolo secar durante 30 segundos si se trata de tintura de yodo al 1-2% y durante 60 segundos si se utiliza povidona yodada al 10%.  • En pacientes alérgicos al yodo, repetir la operación utilizando alcohol al 70% y dejándolo secar durante 60 segundos.  • Extraer la sangre sin tocar en ningún momento el campo desinfectado. Si fuera necesario palpar nuevamente la vena se utilizarán guantes de goma estériles o se desinfectarán los dedos de la misma manera que la piel del paciente. Si se requiere una segunda venopunción deberá cambiarse la aguja.  •Introducir la sangre en los frascos, primero en el frasco de anaerobios evitando que entre aire en dicho frasco. Mover los frascos para que la sangre y el medio de cultivo se mezclen. Introducir los frascos a 37ºC.

C. Volumen de la muestra  • Como norma general lo más adecuado es que la sangre mantenga una proporción 1:10 con el medio de cultivo.  • La cantidad de sangre a introducir en cada frasco viene determinada por el modelo utilizado en el hospital:- Adultos y niños mayores: obtener de 10-20ml por toma para inocular ambos frasco (frasco para cultivo de aerobios + frasco para cultivo de anaerobios).- En prematuros y niños pequeños: obtener de 0.2 a 5ml

de sangre a repartir entre ambos frascos especiales para Pediatría.

C. Numero de muestras y momento de la extracción  • En general se recomienda extraer tres hemocultivos por paciente, previos al tratamiento antimicrobiano.  • En caso de sepsis y endocarditis subaguda las extracciones se reparten en24 horas y en caso de que los hemocultivos sean negativos, obtener tres muestras más al día siguiente.  • El comienzo de obtención de hemocultivos debe demorarse el menor tiempo posible desde el inicio de la fiebre o de los escalofríos.  • El intervalo entre las extracciones en general debe ser de unos 30 minutos, si bien recientemente la American Society for Microbiology ha recomendado la conveniencia de extracciones simultaneas en diferentespuntos anatómicos.

D. Transporte• Deben enviarse al laboratorio lo más rápidamente posible. Hasta su envío mantener a 35-37ºC; cuando esto no sea posible, mantener a temperatura ambiente. Nunca refrigerarse ni congelar.

E. Observaciones• No son adecuadas las muestras obtenidas a través de catéter. Estas muestras sólo deberían utilizarse en el caso de sospecha de sepsis asociada a catéter, siempre que en el laboratorio se pudieran hacer cultivoscuantitativos de sangre (ésta técnica aún no está disponible en el Hospital).• Consultar siempre con el Laboratorio de Microbiología ante la sospecha de una bacteriemia por microorganismos “inhabituales” o “de difícil crecimiento”.•En caso de sospecha de determinados microorganismos (Brucella spp, Neisseria gonorrhoeae,...) o de endocarditis, indicarlo claramente en la petición.

      

INFECCI  

ONES DEL

TRACTO URINARI

O   

Se definen como la presencia anómala y elevada de bacterias en orina recogidas por micción normal. La orina es un líquido estéril y se encuentra en la vejiga, por tanto mediante punción en la zona suprapúbica debería de estar libre de gérmenes. La morbilidad y la mortalidad que pueden asociarse a distintos cuadros clínicos asociados a los ITU constituyen un reto para poner tratamiento adecuado que depende del germen involucrado en la etiología y del cuadro clínico del paciente.

Pueden presentar una morbilidad como cuadros clínicos severos ya que pueden causar por ejemplo una pielonefritis aguda. Por lo tanto se ha de poner tratamiento. También puede ser mortal ya que alguna bacteria puede pasar a sangre provocando septicemia, por ejemplo en el caso de Pseudomonas aeroginosas, que presenta unos cuadros de septicemia fulminante.

Los tratamientos se ponen en función del germen causante de la etiología, y también de la sintomatología del cuadro:

-.Aspectos epidemiológicos: son junto con las afecciones respiratorias las que mayor número de casos producen en hospitales (nosocomiales). El mayor número de casos es en las mujeres en edad fértil, ya que juega papel importante la proximidad del meato urinario con el ano, y anatómicamente la vejiga de la mujer es menor que la del hombre. También es bastante frecuente en la edad senil, en hombres donde hay disminución del chorro urinario. En los neonatos masculinos las infecciones urinarias son mayores que en los neonatos femeninos, debido a que el prepucio retiene la orina.

-. Aspectos etiológicos: en más de un 80% en el medio ambulatorio y en torno a un 40% en los medios nosocomiales está producido por E. Coli. Hay otras enterobacterias como las del género Proteus que tradicionalmente (sobre todo P. Nurabilis) está relacionado en infecciones de embarazadas y hombres, que producen litiasis (formándose cristales de estrubita como consecuencia de la presencia de ureasa en las bacterias). También del género Klebsiella cuyos azúcares de su cápsula también pueden producir litiasis. También Enterococcus faecalis y la Pseudomona (no tan asidua). También son muy importantes los Staphylococcus Aureus,

 

epidermidis y saprophyticus.

También se puede dar el Mycobacterium tuberculosis que producen una bajada muy importante del pH de la orina. Sin embargo para que se dé en la orina, previamente se ha de dar en el pulmón

Hoy día en los individuos inmunodeprimidos es frecuente que se dé en hongos como la Cándida. Igualmente vemos virus, frecuentemente los adenovirus dando cistitis hemorrágicas; los citomegalovirus que se producen en cantidades muy elevadas, pero no hay cuadro clínico con un síndrome asociado; los Hantavirus que son virus de RNA con envoltura que producen fiebre de Corea produciendo cistitis hemorrágicas. En los inmunodeprimidos hay unos virus que son los Poliomavirus (papovavirus) que producen cuadros clínicos muy importantes que producen cistitis severas y cuadros clínicos muy importantes que afectan al SN central (leucoencefalopatia multifuncional progresiva que puede llegar a parar totalmente al individuo).

 

-.Clínica.-

-.Infecciones ascendentes: se trata de la infección del parénquima. Se coloniza la parte inferior del tracto urinario. E. Coli (flora del colon---meato femenino---cistitis, pielonefritis).

-.Infecciones descendentes: son las infecciones de las vías, como son los uréteres, uretra y vejiga. Infecciones del tracto genitourinario procedentes de la sangre, como son bacteremias o septicemias. Mycobacterium tuberculosis---riñón---hígado.

Las infecciones urinarias pueden ser complicadas que son las producidas por una causa orgánica como puede ser por defecto anatómico en niños que favorece la infección o por problemas fisiológicos; también vemos las no complicadas que son producidas por vía externa.

Tenemos infecciones urinarias sintomáticas al menos tres en principio tres típicas con sus signos y síntomas: Tenesmo (urgencia por ir al baño); polaquiuria (aumento de volumen y muchas veces de orinar), disuria (escozor o dolor en la micción). Pueden ir acompañadas de ago de sangre al final de la micción. También las encontramos asintomáticas, que se suelen dar en embarazadas y en niños menores de 5 años. En ancianos no se trata.

Predisposición: durante el embarazo, hipertrofia prostática, cálculos renales, tumor, estenosis de conductos urinarios. Cada causa que facilite la llegada al tracto urinario es factor de producir

la infección, como pueden ser las sondas, el coito,... También pueden ser por defectos neurológicos (espina bífida, esclerosis múltiple,..) Que disminuyen la potencia del chorro urinario, y que por tanto predispone la infección urinaria ya que queda un volumen residual de orina. Otras causas pueden ser el cateterismo, en las sondas para facilitar la micción es un elemento implicado en las infecciones de las vías superiores.

El sondaje se debe de evitar siempre en medida de lo posible. Si se ha de hacer, mejor es la forma alternada que la contínua, y administrando un antibiótico para impedir la infección. Debe evitarse el sondado abierto pues es más susceptible a la infección, el mejor es el sondado cerrado y estéril que drene por gravedad.

-.Infecciones urinarias no complicadas asintomáticas.-

 

Presencia abundante de microorganismos en orina. Presenta diferentes cuadros dependiendo de la zona en la que se encuentren:

1.- Si se ve el parénquima afectado se pueden producir pielonefritis (abscesos en la corteza renal), prostatitis y epididimitis

2.- Si se ven afectadas las vías, se produce cistitis y uretritis.

La mayoría se descubren de forma casual, mediante análisis rutinarios de orina. En adultos y ancianos se aguanta bien y no requiere tratamiento aunque hay pacientes que si lo requieren, menos los que tengan cardiopatías vasculares, portadores de prótesis o en tratamiento con inmunodepresores. En niños y en embarazadas también se generan por la morbilidad que se genera. El Proteus mirabillis se debe de tratar, ya que forma cristales, que producen cálculos renales. Da ureasa + y aumenta el pH.

En los niños la infección es asintomática (cuanto más pequeño es el niño, más clínico que asintomático). Se genera nerviosismo, inquietud y anorexia. Si el tratamiento es grave va por vía parenteral, aunque la mayoría de los casos es por vía oral, y por supuesto hay que tener en cuenta la dosis. Mejor con el estómago vacío ya que se absorbe más. Hay que tener en cuenta con el antibiótico usado aunque la mayoría de estas infecciones no lo requieren.

-NO AMINOGLUCÓSIDOS: por ejemplo en la pielonefritis, son tóxicos en el 8º par de nervios craneales, produciendo sorderas, vértigos irreversibles.

-NO METROPIN + SULFAMIDA: se excreta de forma activa.

Produce discrasia (alteración en la fórmula sanguínea) y neuropatía periférica.

-NO QUINOLONAS NO FLUOROQUINOLONAS: por su efecto neurotóxico (cefalea, irritabilidad) y afecta al colágeno.

-NO TETRACICLINAS: en la epididimitis, ya que son quelantes del Ca y afectarían al hueso.

-SÍ LOS -LACTÁMICOS: Usamos las penicilinas (ampicilina, amoxicilina, con estómagos vacíos durante 7-10 días y no más porque el tratamiento no hace nada), cefalosporinas y monolactámicos (Aztreonam).

-FOSFEMICINA: no es un -lactámico, actúa en la síntesis de la pared celular, en el citoplasma inhibiendo la síntesis de precursores de la pared.

Durante el embarazo, en el primer trimestre es asintomática y en el segundo y tercer trimestre pasa a ser sintomática. En el primer trimestre produce hipotensión, anorexia, prematuriedad (aumenta muertes en el parto). En el segundo y tercer trimestres aparecen los síntomas: Así vemos que aparece la pielonefritis (puede evolucionar con disfunción renal y acabar con hipertensión), y aparición de cistitis. Aumenta el número de infecciones urinarias con la edad y con el número de embarazos. El tratamiento es igual que el de niños.

-.Infecciones complicadas sintomáticas.-

Presenta cuadros en las vías de cistitis y uretritis y en el parénquima de pielonefritis, epididimitis, y prostatitis. Los agentes etiológicos son papovavirus y cepas uropatógenas de E.Coli.

-.Cistitis: es la más abundante en el tacto urinario de la mujer. Presenta intensos síntomas miccionales, con dolor y escozor, dolor hipogástrico, y ocasionalmente con fiebre en el paciente. En el final del chorro urinario ocasionalmente produce hematuria.

El tratamiento no es específico, como Ampicilina + clavulámico; nitrofurantoina; Ácido Nalidíxico (sustituido por nafloxacina) y sulfamidas + trimetoprim. El tratamiento es específico dependiendo de la sensibilidad de las cepas que producen la infección. El principal tratamiento era 7 días vía oral, pero en 3 días ocurre lo mismo, por lo que ahora es de 3 días vía oral en dosis únicas. Fosfamicina 4 g en dosis única.

El tratamiento tiene una eficacia alta y no se sobrepasa el umbral tóxico. Si la infección proviene de las vías, el tratamiento es un

éxito; si proviene del parénquima vuelve a producirse la infección.

 

 

-.INFECCIONES DE VIAS SEMINALES.-

 

Puede tratarse de una primo infección, y puede haber una infección asociada junto las vías urinarias, es decir, que ocurra primero en la uretra y después en la próstata, vesículas seminales, hasta poder llegar a los testículos.

-.Epidimimitis: es la infección del epidídimo que se manifiesta con fiebre y dolor relacionado y reflejado en la ingle (muy molesto al caminar). Se presenta en el varón joven y casada por dos microorganismos dependiendo de la edad: en menores de 40 años encontramos la Clamydia trachomatis; y mayor de 40 años es causado por E. Coli.

El espécimen ideal depende del tipo de la bacteria, recurriendo normalmente al sedimento urinario, orina para hacer cultivo y el semen para aislar el germen (todos ellos sí es para E. Coli; pero para Clamydias no). Como las Clamydias son parásitos internos obligados, no aparecen en el sedimento, ni en orina, hay que recurrir a los cultivos celulares. Sin embargo si en los especimenes hay leucocitos, podemos decir que si hay 5 leucocitos por campo (con el sedimento) y hasta 10 leucocitos por mililitro de orina.

Una técnica a la que hay que recurrir (es muy doloroso) se pasa a una punción en el epidídimo.

El tratamiento es de 6-8 semanas y son antibióticos del tipo del CIPROFLOXACINO y OFLOXACINO, por su capacidad para alcanzar el epidídimo (de las familias de las quinolonas). Pasado el tratamiento se recurre nuevamente a una toma del espécimen.

 

-.Prostatitis:   se incluyen varios tipos de sintomatologías, es decir, hay prostatitis aguda bacteriana, prostatitis crónica bacteriana, prostatitis no bacteriana y prostatodinia. El paciente tiene fiebre y tiene dolor sacro-lumbar, y también hay un síndrome miccional. Desde el punto de vista clínico para diferenciar la aguda del resto, es mediante el tacto rectal.

Para el diagnóstico recurrimos al fraccionamiento de la orina. Se

toma la primera porción de la micción, otra porción del chorro de la mitad de la micción. Se hace posteriormente un masaje prostático y se recoge la secreción prostática, y por último se toma una porción de la orina final. Con estas 4 muestras se hace siembras en medios de cultivo. Si hay bacterias en la secreción prostática y última porción de la orina, que no existe en la 1ª y 2ª porción de la orina, podemos pensar que la prostatitis es bacteriana y que seguramente es aguda.

Si en las cuatro placas hay, pero en la 3ª y 4ª placa hay más (orden de magnitud superior) e indica prostatitis por bacterias de tipo agudo.

La prostatitis crónica se da cuando las bacterias al colonizar los conductos superiores, forman un biofilm, formado por carbohidratos que facilita la viabilidad y mantenimiento de los microorganismos, y con el tiempo la bacteria excreta sus propios exopolisacáridos que tienden a fijar más a la bacteria. La bacteria se replica muy poco a poco, y va dando impulsos antigénicos que es lo que provoca la cronicidad de la prostatitis.

En la prostatitis aguda se puede recurrir a tratamientos con aminoglicósidos, teniendo siempre en cuenta que son tóxicos; cefalosporinas de 3ª generación y monolactámicos. Posteriormente se pasa a antibióticos que difundan bien por la membrana lipoproteica prostática, y además que se disocien bien en los medios ácidos, como por ejemplo las quinolonas aunque también podemos recurrir a la pareja sulfamida y trimetoprim.

Cuando la prostatitis es crónica, pasamos a la familia de las tetraciclinas (DOXICICLINA Y MINOCICLINA) y norfloxacino. El tratamiento dura de 6-8 semanas. Cuando termina el tratamiento se hace de nuevo un cultivo fraccionado de la orina. También si la infección es muy elevada se recurre a la punción prostática de los antibióticos.

Muchos casos de prostatitis crónicas podrían estar relacionados por Clamydias y Micoplasmas (ureaplasma urealyticum---en un 1%)

-.Pielonefritis aguda: puede ocurrir por vía ascendente o por vía descendente (a través de la sangre) como M. Tuberculosis. El peligro de la pielonefritis es cuando se establecen en el riñón ya que son capaces de formar abscesos, que provocan generalmente un tejido cicatrizado en la zona que por lo tanto genera un tejido no funcional, produciendo a la vez disfunción renal. Las bacterias tienen facilidad para alcanzar la sangre y por lo tanto producir septicemia, produciendo fiebre, escalofríos, dolor lumbar y cuando la fiebre pasa de 38 ºC sería conveniente realizar hemocultivo.

Vemos la E. Coli, Klebsiella, Proteus, y Enterococcus. El tratamiento de elección es el de aminoglicósidos por su biodisponibilidad, su baja capacidad para unirse a proteínas plasmáticas y su eliminación es total por orina. Se suele dar gentamicina inyectada cada 12 horas. El tratamiento de elección son cefalosporinas de 1ª y 2ª generación cuando no es complicada y las de 3ª generación cuando es más complicada. Cuando termina el tratamiento se hace urocultivo pasadas 3 semanas.

-.PATOGENIA DE TODAS ESTAS ENFERMEDADES.-

Vemos las características de los microorganismos y las características del hombre para ser infectado. Entre los factores del hombre sería el embarazo, tumores (factores que en general obstruyan las vías como pueden ser litiasis, estenosis), diabetes Mellitus, disfunción neurógena que regulan el proceso de la micción (creándose un volumen residual, debido a que no se tiene la capacidad de eliminar todo el volumen se orina), hipertrofia prostática.

Los atributos bacterianos que facilitan la colonización, es la adherencia (favorecido por las adhesinas por ejemplo pilis tipo I; los pilis P; AFA I y AFA III; los pilis S; y las adhesinas Dr), toxinas (endo y exotoxinas), hemolisinas y ureasa.

 

Son realmente factores de virulencia. Tomamos como ejemplo la E. Coli, que tiene una serie de armas para poder colonizar el medio, como por ejemplo los pili ya nombrados. La estructura del uroepitelio, en función que esté distendido o contraído, se pueden ver 2 o 3 capas de células, por lo tanto a microscopía podemos ver que hay estructuras distintas dependiendo de su fisiología.

Los pilis tipo 1 fueron considerados de poco interés para la colonización del uroepitelio ya que tanto las cepas patógenas como las que no, poseen pilis tipo 1. Sin embargo estos pilis reconocen las placas de uroplacina (cadenas de proteínas que están en la superficie de células globulares, agrupadas en forma hexagonal y conectados a residuos de manosa), reconociendo los restos de manosa, provocando que la célula del uroepitelio, produzcan un fenómeno de alteración del citoesqueleto, englobando a la bacteria, formando una vesícula endocítica. Este fenómeno está relacionado con la descamación del uroepitelio, por ello cuando vemos el sedimento a microscopía 40x vemos células de descamación.

Muchas veces no se descaman, sino que permanecen en un estado de latencia y se replica muy poco a poco, y por determinados motivos ale de la célula del uroepitelio y reinfecta. Esta es una de las causas

por las que se producen las infecciones en el meato urinario femenino. Por lo tanto para el tratamiento sería con antibióticos que alcanzasen una concentración bactericida alta en el interior del citoplasma, y que ataque como sitio diana la pared de la bacteria.

Las bacterias que tienen los pilis P, son capaces de llegar a un dímero de galactosa asociado a un lípido de las células del riñón, produciendo un daño histológico. Este dímero es denominado globobiosa. Los que tienen pilis P son las pielonefríticas.

Los que no tienen pilis P tienen AFA I y III, que son estructuras no fímbricas. Los pilis I están constituido por un mango formado por una sola proteína repetida a lo largo de todo el mango; y en la punta está formado por tres proteínas fim H (reconocen a los restos de manosa-manosa; y por lo tanto se buscan Antibióticos que impidan la unión de fim H con el pili P, por lo que realmente son Ac).

Respecto a las S, podemos decir que en el caso de la meningitis producido por E. Coli es provocado por los pili S. In vitro los pilis S si producen colonización del uroepitelio, pero in vivo no.

Tenemos otros factores de virulencia como son las endotoxinas, que provocan una activación manifiesta del sistema inmune, por hiperactivación de la capacidad fagocítica de las células del sistema inmune (PMN Y MACRÓFAGOS). Por ello cuando hay infección, en el sedimento podemos ver leucocitos en el campo. Las bacterias que tienen endotoxinas y pilis P son capaces de estimular o provocar una respuesta inflamatoria muy importante sin colonizar la submucosa.

Las hemolisinas forman un poro en las células que es capaz de producir la muerte de la célula. Requiere de ión Ca que se une en un punto de la hemolisina donde hay una serie de Aa repetidos. Esta región se denomina RTX. Cuando tienen pilis P y hemolisinas son las que aumentan la virulencia en los casos de la pielonefritis.

Las capacidades que tienen las células de captar Fe (sideróforos) es también un punto de estudio importante ya que compiten con la lactoferrina. Como moléculas sideróforas vemos la enterobactina, aerobactina y la yersinobactina.

 

-.Características del cateterismo.-

En principio el cateterismo se ha de evitar. En caso de que sea irreversible el cateterismo ha de ser discontinuo, antes que continuo. Ha de ser cerrado y no tener contacto con el medio; y debe de drenarse por gravedad. De la orina que se recoge en la bolsa no se hace análisis ninguno, sin embargo hay un punto del catéter que nos

permite tomar muestras de la orina.

 

-.Infecciones urinarias provocadas por los virus.-

Causado por poliomavirus (papovavirus); tienen una producción muy elevada de virus y una cantidad muy elevada de leucocitos. Las cepas BK y JC de los poliomavirus producen, a veces cuadros clínicos de gran gravedad.

La infección con cepas de poliomavirus son transmitidas al hombre por el tracto respiratorio donde se pueden replicar y producen una viremia primaria, pasando a sangre. El sitio diana es el riñón, y se establece de forma latente. En un individuo inmunocompetente puede hablarse de viuria (EXPULSIÓN DE VIRUS POR ORINA) pero ninguna sintomatología más.

En el individuo inmunodeficiente se pueden reactivar, la BK puede dar lugar a cistitis hemorrágicas; y la JC pasa a sangre (viremia) y pasa al SNC alcanzando los astrocitos atacando a las oligodendroglias, produciendo una desmielinización, produciendo leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP).

-.Criterios para considerar una infección urinaria.-

Cualquier individuo con más de 100.000 UV/ ml (UFC/ ml) y en los cultivos entre 50000-90000 UFC/ ml se considera infección. Si una persona joven tiene más de 100 UFC/ ml pero tiene unos síntomas miccionales claros y agudos se considera infección urinaria. Si la orina es suprapúbica desde que ha microorganismos se considera infección. Cuando la persona tiene un cateterismo y tiene más de 100 UFC/ ml también se considera infección

 

 Urocultivo                                                                                                                                                     Indice Microbiologia

 

INFECCIONES RESPIRATORIAS

El sistema respiratorio es el encargado de tomar O2 transportándolo hasta los pulmones, y en el alveolo ocurre el intercambio entre el oxígeno y el CO2. Desde un punto de vista microbiológico dividimos en dos partes el sistema respiratorio:

SISTEMA RESPIRATORIO SUPERIOR: hay zonas colonizadas por distintos tipos de microorganismos. Hay flora comensal que se ubica en la zona y con papel importante para

 

evitar la contaminación por patógenos primarios.

SISTEMA RESPIRATORIO INFERIOR: es la zona comprendida de la traquea para abajo. Deben de ser zonas estériles.

El aire que respiramos está lleno de millones de partículas, entre ellos microorganismos inocuos, pero por ejemplo cuando hay microorganismos patógenos primarios nos llega la infección. Cuando cualquier microorganismo llega nos encontramos con una serie de defensas como son las barreras físicas (MEDIADA POR EPITELIO CILIAR, CON ALTA IMPORTANCIA, SOBRE TODO EN LA NASOFARÍNGEA; EN OROFARÍNGE ENCONTRAMOS EL LAVADO POR LA SALIVA; TAMBIÉN ENCONTRAMOS LA LISOZIMA; Ig A COMO DÍMERO, LACTOFERRINA, MICROFLORA Y FAGOCITOS).

En el sistema respiratorio superior encontramos la flora residente común como son los estreptococos, Neiserias (ssp), Branhamella, Veionella, bacterias fusiformes, Streptococccus mutans. Ésta flora está aproximadamente en el 50 % de los individuos. Otra flora existente es la ocasional, como son Estretococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes y Neisseria meningitidis. Ésta flora está en menos de un 10 % de la población, en convivencia con la otra flora, por lo tanto el individuo sería un portador sano.

La otra flora es la flora residente infrecuente donde encontramos Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas, E.Coli, Corynebacterium diphteriae. También podemos hablar de residentes en estado latente, y abarca una gran cantidad de virus como los citomegalovirus (Epstein- Barr), Pneumocystis carinii y distintos tipos de virus herpéricos. El P.carinii es una de las primeras infecciones de que sufre un paciente de SIDA. También podemos considerar al Mycobacterium tubrerculosis.

Jueves 07-04-05

Cuando un microorganismo coloniza la rinofaringe y tracto respiratorio en general se denomina patógeno profesional o patógeno primario. Reconoce la zona y desarrolla un mecanismo que le permite estar en dicha zona, como es la adherencia y la interferencia con los cilios (Bordetella pertusis). Los patógenos secundarios necesitan de un fenómeno previo que facilite la

llegada del patógeno, como por ejemplo el Streptococcus pneumoniae, y el Staphylococcus aureus.

Hay ocasiones en las que las defensas del medio están bajas, por ejemplo e moco puede ser más espeso con el tiempo, provocando una fibrosis quística. El fumador puede ser más perjudicado por Estretococcus pneumoniae y haemophilus. El paciente con SIDA está muy deprimido y puede ser atacado por multitud de microorganismos. En muchas ocasiones hay apetencia del patógeno primario por una zona concreta (tropismo).

 

-.RINOVIRUS.-

 

Puede ser causado por hasta 100 serotipos de Rinovirus, que pertenecen a los picornavirus. Pueden estar implicados virus como Coxsackie, Adenovirus, Coronavirus y E.C.H.O.

El rinovirus tiene una simetría icosaédrica, formado por 12 capsómeros (cada uno de estos formado por 5 pentámeros) el virus es un RNA monocatenario y se replica en sentido positivo (como un RNAm). Reconoce el epitelio de la zona por adherirse a un receptor de las células epiteliales del tracto respiratorio (KAM-1) que pertenecen a la superfamilia de las Ig (puentes bisulfuro estabilizadores de los dominios). Se unen al receptor por uno de los protómeros del capsómero.

En los pentámeros hay unas proteínas, las VP-1 (vértice del pentámero) que reconoce el dominio del ICAM-1 para adherirse. Además el VP-1 tiene dos zonas reconocidas por los Ac, con lo que tiene connotaciones importantes ya que existen gran variedad de Ag, debido a las distintas cepas.

Martes 12-04-05

Tienen un tropismo especial por determinados tejidos, debido a que reconoce a una molécula, que son las ICAM tipo I, que forman parte de la superfamilias de las Ig (estas ICAM I reconocen el fondo del cañón que

es una zona prácticamente inaccesible). Este receptor tiene 5 dominios, y la parte que reconoce del virus, es la proteína VP-1.

Una vez que se unen (receptor y virus) penetran en el interior de la célula eucariota, mediante endocitosis, formándose la vesícula endocítica y disminuyendo el pH. Comienza a desorganizarse la cápsida, siendo la primera que se desprende la proteína VP-4, y el ARN se libera al medio. Ahora el virus tiene la posibilidad de iniciar el ciclo. Este RNA es +, por lo que se comporta como RNAm, pero como no tiene una proteína en su extremo, la cual es reconocida por el ribosoma, sin embargo tiene una secuencia que, denominada asa interna, que es la que es reconocida por el ribosoma, y comienza la síntesis de la proteína policistrónica. El orden de la secuencia en la que se van generando las proteínas es: VP-4, VP-2, VP-3 VP-1, la g´, la PVg, las proteasas y las polimerasas. Las proteasas se encargan tanto de separar las proteínas estructurales como las no estructurales.

Todos estos componentes se liberan en el citoplasma y produce un efecto citotóxico, produciendo un acumulo de paracristales víricos. Posteriormente la polimerasa se encarga de replicar la RNA +, en RNA -. Este RNA - es un inductor de interferones, que salen al medio y reconocen distintos tipos de células, y su función es detener la maquinaria metabólica de la célula eucariota. Este ARN - es un intermediario replicativo, que es el que va a dar al RNA +. Cuando todas las proteínas de la cápsida se unen, se produce la lisis celular.

Todo este proceso provoca el efecto patológico del virus de la gripe. Estas células que se destruyen cuando los virus salen, liberan a medio histamina y bradicina, que son vasodilatadores, y el primer efecto que producen es el exudado nasal. Posteriormente se activan las defensas del hospedador y por una parte se producen Ig (Ig A que es producida en la zona nasofaríngea con un efecto protector; y la Ig M que la encontramos en el suero). La Ig A es la que da el serotipo del virus que nos está atacando, pero estáoslo dura un año y medio. Al lugar acuden fagocitos, que no son importantes en la eliminación de la infección, y son los encargados de los detritus.

Estos detritus celulares favorecen una posterior

infección bacteriana, por lo que ahora el color del moco pasa de color blanco a color verde. Se favorece la producción de interferón que facilita la producción de receptores ICAM. Por lo tanto los IFN tienen doble efecto, una positiva, que es la detección de la maquinaria metabólica; y un efecto negativo, que es la producción de receptores ICAM por lo que se favorece la infección vírica. Igualmente se pueden producir cefaleas, tos,...

No hay ningún tratamiento contra el virus, sólo hay tratamientos paliativos, como son los descongestionantes adrenérgicos tópicos (vasoconstricción; y muchas veces cuando son descongestionantes de acción rápida, se puede producir un efecto rebote, ya que no sólo se faciliten los receptores , que producen vasoconstricción , sino también los  que son de efecto contrario). También se ha hablado de administrar por vía nasal , pero como tienen un efecto doble no se administra. Se recurre también a efedrina, fenilefrina (4-6 horas) y oximetazoliona (8-12 horas). También se ha hablado de la arildona que se une en el fondo del cañón por lo que no hay un inicio de la desorganización del virus.

Jueves 14-04-05

Su epidemiología, vemos que los más afectados son los niños, introduciendo estos las gripe en la familia. Se da más en el comienzo de la primavera. La transmisión persona-persona es la más frecuente, sin embargo vemos los aerosoles (goticulos de Well), que son los fomites, los que se encargan de la transmisión del virus. Para su cultivo necesitamos un cultivo de fibroblastos humanos diploides, mediante secreciones nasales del individuo afectado, durante el acmé de la enfermedad, donde pueden haber hasta 5000 partículas virales. El virus es sensible los pH bajos (pertenece a los picornavirus, los cuales aguantan amplios rangos de pH, pero este es la excepción), y su temperatura óptima de crecimiento es de 33-34 ºC. La causa de que no aguante el pH bajo es la envoltura.

-.ESTUDIO DE LOS ESTREPTOCOCOS.-

Son un grupo de microorganismos cocos gram + agrupados en cadenas, sin embargo también se ven de dos en dos, como S. Pneumoniae; Los podemos encontrar sueltos, como los Enterococcus (infecciones

urinarias). Esta propiedad de aparecer en cadenas depende de la edad de los cultivos y del medio del que se halla aislado.

Desde el interior hacia fuera podemos ver el citoplasma rodeado por una membrana lipoproteica, y esta a su vez por una capa de peptidoglicano, y asociada a esta capa encontramos unos restos de carbohidratos (puede llevar glucosamina, ramnosa,..., cuya proporción varia de unas cepas a otras, y que ha permitido agruparlos en grupos, que son los denominados grupos de LANCEFIELD, que se conocen como serogrupos, y donde se incluyen las principales cepas patógenas para el ser humano). Rodeando a la bacteria vemos un componente muy importante, que es la cápsula formada por ácido hialurónico, que no es un inmunógeno, por tanto permite a la bacteria mimetizarse en el medio de nuestro organismo sin ser reconocido (es un dímero de ácido glucurónico y glucosa).

En la ultraestructura vemos también los ácidos lipoteicoicos que parten desde la membrana y con un papel importante en la inmunidad, y en la patogenia, ya que contribuyen con algunas toxinas a provocar el shock séptico, e igualmente gracias a estos ácidos lipoteicoicos se pueden unir a la célula huésped. También vemos las proteínas M que está enlazada también a la membrana que se proyecta en doble hélice (cada vuelta de 7 Aa), y confiere al estreptococo gran cantidad de propiedades patógenas. Producen unos 100 serotipos distintos en el estreptococo patógenos (tomando como base el S. Pyogenes).

  GRUPO A(S. Pyogenes)

GRUPO B(S. Agalactiae)

GRUPO C(E. Faecalis)

1.-Agrupación Cadenas y pares

Pequeñas cadenas

Son sueltos como máximo

pares

2.- Comportamiento

-hemolíticos -hemolíticos -hemolíticos

3.-Resistencia a los antibióticos

Sensible a la mayoría de antibióticos usuales del mercado

Resistencia a algunos

antibióticos

Se considera la virulencia como

factor de resistencia. Resiste la

vancomicina que es

antibióticos de elección en infecciones

graves.

4.- Localización Región nasofaríngea,

Tracto gastrointestinal

Colon (produce infecciones

paladar blando

y en la mujer los podemos

encontrar en la vagina

nosocomiales)

5.- Cuadros clínicos

Faringitis aguda que puede ser

ir a fiebres reumáticas y endocarditis bacteriana.

Glomerulonefritis aguda que va precedida por infección en la piel (como el

impétigo, erisipela, celulitis, y

fascitis necrosante)

Neumonías y meningitis

producidas en los neonatos

Afecciones del tracto urinario, particularmente

en las nosocomiales y

en los cateterismos

Igualmente todos ellos son capaces de producir infecciones en las heridas, teniendo gran importancia, sobre todo el grupo A, que es capaz de producir shock séptico.

-.Principales factores de la virulencia:   tomando como base al Streptococcus pyogenes, en principio vemos la cápsula que le proporciona propiedades antifagocitarias. También vemos la adherencia gracias a la proteína M, proteína F, proteínas ligadas a la proteína M, y la proteína EPA, que es la proteína principal que se liga al colágeno. Vemos enzimas del tipo de la estreptolisina (S y O), estreptoquinasa, estreptodornasa y NAD-asa.

Otros componentes son la C5a-peptidasa y otra enzima sería la SIC que interviene en la formación de los poros formados por la cascada del complemento. Vemos endotoxinas como la superantígeno (entre las que destaca la SPE-A y SPE-B--- con actividad peptidasa que es Cys-peptidasa y permite la propagación de las bacterias).

Martes 19-04-05

La cápsula es un factor de virulencia debido al ácido hialurónico que no es reconocido, por lo que se dice que no son inmunogénicas en personas, pero se ha demostrado que en algunos animales a largo plazo se convierten en inmunogénicas. Una explicación sería que este ácido se una a componentes que la transforman en inmunogénicas.

Dentro de las adhesinas vemos de varios tipos: las proteínas M, F, proteínas ligadas a M, y las proteínas EPA. La proteína M interviene en el reconocimiento

inicial de las moléculas de Ag de la superficie del estreptococo con la superficie de tejido a infectar (FIBRONECTINA Y COLÁGENO). Ocurre en dos pasos: en un primer paso está mediado por los ácidos lipoteicoicos y segundo paso va mediado por la proteína M. La primera unión es necesario para generar el cuadro clínico. La proteína M confiere otras propiedades como impedir que se activen las moléculas del complemento sobre la superficie del coco ya que facilita la llegada del factor H y no del B, por lo que se forma el complejo C3bH que impide la formación del complejo C3bB que es la verdadera convertasa de C3.

También la proteína M, estando en la superficie permite la unión de los fragmentos cristalizables de algunas Ig, pero de forma inversa a como se une en el resto de las bacterias, y por tanto exponiendo al exterior los fragmentos variables. Por otro lado al no exponer el fragmento cristalizable no es reconocido por los receptores de las células fagocitarias (CD-16, CD-32 y CD-64), y que se inhibe la fagocitosis.

Otro aspecto de la proteína M es la presencia de epítopos en la proteína M (SOBRE TODO EN ALGUNOS SEROTIPOS), producen reacciones cruzadas con los epítopos de las proteínas musculares cardiacas (PRODUCIENDO Ac CONTRA LOS EPÍTOPOS DE LA PROTEÍNA M), especialmente de las fibras de miosina, produciendo reacciones autoinmunes. Lo hacen de manera indirecta, ya que lo hacen activando al complemento, y es este el que ataca a la miosina, produciendo la destrucción o malfuncionamiento de válvulas cardiacas (ENDOCARDITIS BACTERIANA). Realmente se conocen algunos de los epítopos que producen este tipo de reacciones autoinmunes como por ejemplo el péptido B2 del estreptococo M5.

Cuando el estreptococo pasa a sangre la proteína M tiene algunos epítopos que se pueden unir al fibrinógeno, que le da una nueva propiedad de mimetización. Y además esta unión impide la llegada del componente C3b de la sangre por lo que se impide la cascada del complemento. Hay otra alternativa para que el estreptococo altere o ataque a las fibras miocárdicas, como pueden ser la estreptolisina O u otras toxinas.

-. Enzimas: vemos la estreptolisina (O y S), estreptodornasa (DNA-asa), enzimas como la NAD-asa y una toxina como puede ser la C5a-asa. La estreptolisina O es inmunogénica y se une al colágeno del hematíe formando poros y se altera la permeabilidad, produciendo un shock osmótico sobre el hematíe. No tiene como célula diana exclusiva al hematíe sino a otras células.

La estreptolisina S es soluble y la acción más similar a otras hemolisinas. Es una fosfolipasa por lo que aumenta su permeabilidad. La estreptodornasa hidroliza el DNA del pus, que proviene de los PMN, o de leucocitos en general, por lo que asó el coco se puede expandir a una mayor zona de infección, ya que rompe el moco.La DNA-asa es inmunógeno y la detección de Ac anti-DNA-asa tiene un valor importante ya que se elevan mucho cuando la infección es nefrotógena (ATACA AL RIÑÓN). La NAD-asa hidroliza el NAD e impide que otras bacterias lo utilicen (por lo que la bacteria que la libera tiene ventaja sobre tras bacterias).

Jueves 21-04-05

La C5a-asa destruye la C5a, e impide la acción quimiotáctica de estas moléculas. Las cepas de S. Pyogenes también pueden producir hialurodinasa, rompiendo el hialurinato y por lo tanto puede expandirse.

Vemos una enfermedad que es la faringitis aguda estreptocócica, que provoca una respuesta inmune muy potente del individuo. El peligro es que esta bacteria pase a sangre y produzca fiebres reumáticas, y producir fallos y daños en las válvulas cardiacas y endocarditis. Se ha de detectar el título de antiestreptolisina O (se considera que entre 100-200 UI/ ml no es patógeno; mientras que mayores a 300 UI/ ml se considera patógeno), al igual que el título de Ac anti DNA-asa y anti hialurodinasa.

Cuando un paciente está afectado de infección estreptocócica no supurativa como impétigo, aparición de bullas,.., no lo podemos distinguir de otro tipo de afecciones. Es más frecuente que estas bacterias que producen afecciones no supurativas, produzcan una glomerulonefritis aguda en segundo término (se da más en países en evolución). En este

caso la detección de Ac va encaminado a los anti DNA-asa y anti NAD-asa.

-.Toxinas: se consideran de forma muy especial. Hay 7 tipos que se conocen como toxinas SPE que van desde A-J (sin contar D, E e I). Se conocen muy bien la SPE-A y la SPE-B. La SPE-A es la responsable del síndrome de la escarlatina. Cuando una herida se infecta con estreptococos y evoluciona hacia el síndrome de shock séptico, el cual está relacionado con la SPE-A. La SPE-B tiene actividad Cys-proteasa que rompe tejidos por ruptura de enlaces peptídicos donde existe la Cys.

La SPE-A se incluyen dentro de los superantígenos, es decir, que estimulan distintos clones de células T con lo que se producen gran cantidad de IL, monocinas,..., que a su vez sobreactivan a otro tipo de células como son los monocitos, macrófagos, células epiteliales, plaquetas,..., y continúan produciendo tras sustancias tóxicas que favorecen la inflamación, como son los leucotrienos, tromboxanos,... Esto lleva al individuo al síndrome del shock tóxico (taquicardia, colapso sanguíneo periférico,...).

Desde el punto de vista inmune, lo que se hace es que el superantígeno liga (une) una célula presentadora de Ag con las células T, además se activan clones de células T, que tienen determinados aloantígenos en la cadena . Como se une de manera casi inespecífica es lo que produce el shock tóxico.

-.Aspectos de los estreptococos.-

Nos referimos a una muestra de la faringe, recogiendo muestra con una torunda de algodón. Se toma muestra de la amígdala y paladar superior. Vamos a placas de agar-sangre (sangre de oveja, ya que contiene suficiente NAD-asa como para hidrolizar todo el NAD necesario para el crecimiento). Descargaremos la torunda en 1/6 parte de la placa, e intentaremos que en el resto de la placa seguir aislando las colonias. En 1/6 parte de la placa, lo dejamos sin sembrar, y después de haber sembrado raspamos, para que el estreptococo crezca por debajo del agar, es decir, en anaerobiosis.

Se incuban durante 18-24 horas y vemos colonias que producen hemólisis-, que puede ser S. Pyogenes, pero

también vemos S. Milleri. Lo primero que hacemos es un test de aglutinación, así tomamos 2 o 3 colonias y se resuspenden en un medio ácido que contiene pronasa, y se incuba 15 minutos a 37 ºC, que provoca lisis de las colonias de estreptococos y que se liberen los Ag de superficie. Se toma alícuota y se deposita en una placa y lo enfrentamos con distintos antisueros. Esta es una prueba muy importante.

La última prueba es la MYR que es determinar una aminopeptidasa que sólo producen los Streptococcus del grupo A (S. Pyogenes). Tenemos la pirrolidona unido a un grupo arilo que lo ponemos en un medio de cultivo y se revela con un cambio de color.

Martes 26-04-05

-.Tratamiento (S. Pyogenes).-

Si la infección es una faringitis se administra la penicilina G en dosis únicas de 600000-1200000 UI, lo que corresponde a 0,03 microg/ ml. También se administra benzatina y procaína. El tratamiento oral se hace con penicilina V o fenoxipenicilina (la primera muy lábil a pH ácidos), durante un periodo de tiempo de 10 días, lo que corresponde a 250000 UI, 4 veces al día, o de 500 mg, 3 veces al día. El uso de la amoxicilina es de 500 mg cada 8 horas y durante 10 días.

Dentro de los macrólidos de elección vemos la eritromicina, que se suministran antes de las comidas ya que son muy lábiles a pH ácidos. La administración es de 4 veces al día de 250 mg. Para el caso de la piodermia (impétigo) se suministran cefalosporinas de 1ª generación; y para las fascitis necrosantes se pueden suministrar gentamicina, metronidazol, ampicilina y clindamicina.; en el caso de fiebres reumáticas el tratamiento de por vida es con penicilinas G.

-.CORYNEBACTERIUM DIPHTERIAE.-

Son bacilos gram + que los encontramos en la región nasofaringea y en ocasiones en la piel. El hombre es el único animal de reservorio. No tiene cápsula y es inmóvil. Causa una toxiinfección como es la difteria que puede cursar con miocarditis, encefalitis, nefritis,...

La bacteria cuando se desarrolla en la garganta forma una membrana, que es un exudado que crece hasta las amígdalas, campanilla, provocando os correspondientes problemas respiratorios, cuadros hemorrágicos de alta intensidad, y provoca una alta mortalidad en pacientes con miocarditis.

Los factores de virulencia son los ácidos micólicos, que son ácidos grasos que sustituyen un dímero de glucosa. Pero sin embargo el factor de virulencia de mayor importancia es la toxina diftérica.

Jueves 28-04-05

-.Toxina diftérica.-

Es una toxina del grupo ANTIBIÓTICOS, que tienen una parte que reconoce al receptor de la célula eucariota (B) y la otra parte es la tóxica (A). Se excreta al medio como un tripéptido unido por medio de puentes disulfuro. Una vez que sale se rompen los enlaces y se queda en forma activa como:

 

S A NH3

 

S B COO-

La subunidad B se une al receptor y penetra como una vesícula endocítica, y una vez dentro de la vesícula endocítica se libera el A que tiene actividad ribosil-transferasa que actúa sobre el NAD escindiéndolo en ácido nicotínico y ADP-ribosa. Será el ADP-ribosa el que se une al factor de elongación II, cuyo sitio diana es la diftamida (Aa que proviene de la histamina por modificación postraduccional)

EF-2 + ADP- ribosa EF-2-ADP-R

 

Este nuevo factor impide la traslocación de la cadena peptídica que se está sintetizando, por lo tanto se conduce a la destrucción de la célula y como consecuencia puede dar lugar a un foco necrótico. También puede llegar a unirse al ADN y favorecer el

foco necrótico.

Para que la cepa fabrique la toxina diftérica ha de estar lisogenizada y con unos niveles de Fe bajos. Que está lisogenizado quiere decir que está infectado por un virus y que el DNA de éste, esté insertado en el DNA bacteriano y así codificar para el gen tox+. Por lo tanto hay un represor que disminuye el Fe en el medio, y hasta que es lo suficientemente bajo, no comienza la expresión del gen tox+, que es el que va a dar lugar a la toxina diftérica.

La toxina además es la responsable de los aspectos tóxicos de la enfermedad, que tiene dos aspectos: El primero es la formación de un tapete (pseudomembrana) a nivel de la zona nasofaríngea, que no es más que un exudado constituido por varios componentes. El segundo aspecto es que este tapón es muy difícil de eliminar ya que está firmemente unido a la zona. Los elementos que tiene son fibrina, hematíes, células epiteliales, difteroides, y glóbulos blancos. Cuando la cepa tiene el gen tox+, la toxina pasa a sangre dando la sintomatología más grave dando: miolisis, es decir, destruye el músculo cardiaco con un efecto irreversible, y lo que lo reemplaza es una fibrosis que no es funcional; en el riñón se puede producir nefritis produciendo hemorragia; y una neuritis que es menos grave que los dos anteriores, y que se refleja como una afección en las vainas de mielina y como consecuencia hay parálisis facial y ocular. Como consecuencia de la neuritis hay problemas en la deglución produciéndose una disfagia (dificultad para tragar).

La bacteria no es invasiva. También hay cepas de la difteria que va ligada al tejido epitelial como formación de pústulas. En todo caso provoca un cuadro mucho más leve.

Las personas vacunadas pueden producir sintomatología pero mucho menos intensa que los efectos que acabamos de estudiar, es decir, se puede formar la pseudomembrana pero no llegar a taponar, a lo mejor evolucionar hacia la nariz y producir hemorragias.

La bacteria productora de la enfermedad puede ser aislado de la membrana fibrosa. El medio de cultivo es el caldo Löffen que se suplementa con telurito potásico

que impide el crecimiento de estreptococos, y por lo tanto es un medio selectivo, es decir, dificulta el crecimiento de algunas bacterias que acompaña a Corynebacterium. Un medio que también podemos utilizar es un medio con Hb.

Lo primero que hacemos es comprobar si tiene el gen tox, que nos dice si las células están lisogenizadas. Antes esta prueba se hacia mediante el test ELEK que consiste en poner la bacteria en un medio sólido con Ig que es capaz de unirse con la toxina diftérica, y si la bacteria genera la toxina, se revela como la formación de una banda de precipitación.

Cuando la cepa está lisogenizada, el tratamiento es de un suero antitoxina diftérica que va desde 20000-10000 UI. Este tratamiento es por un suero por goteo vía intravenosa. Se administra según el tiempo transcurrido hasta que se detecte la toxina y de la gravedad del cuadro. Como antibióticos de elección tomamos la eritromicina o la penicilina G bentazina (se dan 500 mg 0 60000 UI respectivamente). El mismo tratamiento se puede administrar a un paciente que sea sólo portador, pero sólo durante 7 días en vez de 14 días.

Martes 03-05-05

 

-.TIPOS DE VACUNA PARA   LA DIFTERIA.-

1.- DTP: (diferia, tetanos y pertussi). La pauta se sigue haciendo unos pasos. Se le puede dar a los 2-4-6 meses, con lo que se consigue una respuesta inmune. Se vuelve a administrar a los 18 meses y posteriormente a los 5-7 años, con lo que el individuo queda cubierto con una dosis suficiente. Si hay un accidente con alguna herida abierta se puede volver a administrar.

2.- DtaP: se llama vacuna acelular de pertussi (en la anterior hay células muertas de pertussi). Las pautas para administrar esta vacuna es la misma. Está menos indicado en estos procesos.

3.- DT adultos: son vacunas usadas para mantener viva el recuerdo inmune. Son toxoides (toxina purificada del tétano o de cualquier toxina y tratado

con formalina, perdiendo su efecto tóxico).

4.- DT niños: es igual que la anterior pero a dosis distintas. Como está absorbido a la alúmina, su concentración suele ser menor al DTP.

5.- DTT-Hib: está incluido l Haemophilus influezae de tipo B, consiguiendo así una vacuna que nos proteja ante más bacterias, es decir, una vacuna polivalente. Esta vacuna elimina las cepas de Corynebacterium que contengan el gen tox+.

Un individuo puede sufrir la enfermedad pero sus signos y síntomas son mucho menores. En 1994 en Rusia se dio una de las peores epidemias que costó la vida de muchas personas.

-.RESPIRATORIO INFERIOR.-

Vemos las bacterias que actúan sobre el pulmón, sobre todo en el alveolo. Una de las más importantes es la Legionella Pneumophila. Provoca neumonía atípica, ya que no sólo ataca a un lóbulo del pulmón sino a 2 o 3 lóbulos del pulmón y es capaz de afectar a la pleura. El alveolo se llena de fibrina, leucocitos y líquidos que provienen de la destrucción del tejido epitelial que lo rodea, por lo que dificulta mucho la respiración, provocando diseña. Es típico encontrar a nivel radiológico muchas señales blancuzcas como consecuencia de la replicación de la Legionella.

El sitio diana es el macrófago alveolar, y para estudiar la virulencia hoy día se han tomado como modelo el ataque de las bacterias a las amebas, ya que esta enfermedad se consideran que han pasado desde un nicho ecológico rico en algas verdes-azules y amebas, que pueden ser frecuentes en aguas de circuito de refrigeración. Es decir no es mediante los aparatos en sí, sino por los aerosoles generados por dichos aparatos. La bacteria lleva a cabo el mismo proceso dentro del macrófago pulmonar como el de la ameba.

La bacteria se asocia a la superficie de la célula diana, penetra mediante un proceso de fagocitosis de enrollamiento, por el cual se produce un pseudópodo que va enrollando a la bacteria en una espiral que da lugar a un endosoma y fagosoma con la característica que se rodea de constituyentes del sistema reticular de

la célula. Esto provocaría que este fagosoma se destruyera por un sistema de apoptosis, pero en el caso de la Legionella no ocurre, y no se sabe bien porque la bacteria dentro de estos fagosomas impide la unión de los lisosomas al fagosoma, por lo que no se digiere su contenido, por lo que no baja el pH y se replica dentro del fagosoma, gana una serie de factores de virulencia como es el flagelo y posteriormente sale de la célula y destruye a la misma.

Es una enfermedad relativamente nueva que afecta a los países desarrollados. Entre otros síntomas puede producir encefalitis.

La Legionella es un bacilo gram-, aerobio estricto, móvil por un flagelo polar, y requiere de Fe y Cys, por lo que tiene un metabolismo muy exigente. Como no fermenta ningún hidrato de carbono se suministran en los medios de cultivo algunos Aa. El medio más usado es el BCYE, que es un caldo que tiene extracto de levadura, carbón activo, sales de Fe y en ocasiones 20 Aa. El medio es nutritivo y selectivos ya que lleva dos Antibióticos que impiden el crecimiento de la flora bacteriana que acompaña a la bacteria (por ejemplo la polimixina B y cefamandol). Estos medios llevan azul de bromotimol y provoca el crecimiento de bacterias con forma de vidrio tallado y color verdoso.

Los test bioquímicos no salen bien con esta bacteria. Sólo se hace un test de catalasa (+) y oxidasa (+), y una prueba de nitritos. Se acude a su identificación por fluorescencia directa, mediante Ac unidos por fluorescencia. Una forma de poner de manifiesto la infección es realizar un frotis con el espécimen supuestamente contaminado (esputo en el acmé). Los Ac presentan reacción cruzada con Leptospira, también el agente causante de la tularemia (Franciscella tularensis), y el agente causante de la peste. También se recurre al lavado bronquial y a un aspirado.

Otra técnica es aislar la Legionella de las aguas que supuestamente puede estar contaminado. También vemos el medio EDELSTEIN y tarda 3-5 días en crecer a37ºC y con presiones de CO2 bajas.

Jueves 05-05-05

 

 

 

 

-.Factores de virulencia y patogenicidad.-

Los más importantes son los MIP, también genes que codifican para factores de virulencia como icm y dot, flagelos, LAMP 1 y 2 (proteínas que están en la superficie del fagosoma), metaloproteínas de zinc, y fosfolipasas (A y C).

Una vez que ha llegado al tracto pulmonar inferior mediante los aerosoles. La adherencia en el caso de humano no va mediado por los factores del complemento (C3b) ni Ig, ya que en el alveolo hay muy bajas concentraciones de los mismos. Tampoco tiene importancia la presencia de los pilis, pero en el caso de las amebas si son muy importantes ya que la bacteria lo usa para unirse a la ameba. El factor MIP es una peptidasa (peptidilprolil isomerasa), que potencia la infertilidad de la bacteria hacia el macrófago. Destruye proteínas que pueden actuar como destructor de sulfactantes en el alveolo pulmonar (que intervienen en la tensión superficial). Alteran estructuras terciarias y cuaternarias de la estructura de las proteínas.

Una de las cepas de Legionella, causante del 80% de las neumonías (serotipo I, cepa Phyladelphia) entra por fagocitosis de enrollamiento, pero en el resto de serogrupos (4,6) no entran estas por fagocitosis.

El fagosoma tiene la particularidad de que se rodea de retículo endoplásmico granular, es decir, rodeado por ribosomas. Esto provoca que la célula desarrolla un proceso autofágico, pero sin embargo cuando en su interior hay Legionella no ocurre este proceso, y la Legionella comienza a replicarse. En un momento determinado dentro del fagosoma baja enormemente los nutrientes por lo que no hay los Aa suficientes, que provoca una respuesta potente de la célula y se activan gran cantidad de factores de virulencia (en el caso de amebas el choque térmico regula este proceso). Se activa la proteína RelA que aumenta la

producción de un metabolito que es una base de guanina con fosfato (ppGpp) que activa los genes de la virulencia, como la formación del sistema de secreción de tipo IV (relacionado con icm y dot) y como consecuencia de esto se liberarán proteínas infectivas que dañan al hospedador.

Una vez activados los genes de virulencia se activa la lisis celular.

SISTEMA DE SECRECIÓN TIPO IV:   se sabe que la bacteria sobrevive dentro del fagosoma ya que el pH no disminuye, y cuando la bacteria se está replicando se impide la unión de los lisosomas. Para que se lleve a cabo esta unión, las proteínas de membrana asociadas al lisosoma, han de alcanzar una conformación determinada que favorece la unión del lisosoma, por lo que las proteínas LAMP 1 y 2 en este caso no llegan a la maduración adecuada. Este sistema de secreción tiene la particularidad que forman puentes proteicos que toma 20 proteínas diferentes gobernado por el gen icm (se forma un tubo hueco) que une el citoplasma celular con la membrana del endosoma. Hay unas proteínas efectoras que salen del citoplasma bacteriano y alcanzan el citoplasma del macrófago que actúan en la inhibición de la unión del lisosoma al fagosoma. Estas proteínas se pueden unir a la membrana del fagosoma con lo que producen un aumento de la permeabilidad y por tanto aumenta la concentración de nutrientes dentro del fagosoma.

Cuando el crecimiento es máximo se lisa el fagosoma y queda libre en el citoplasma celular. Gracias al flagelo se pueden desplazar y lisar a más células vecinas.

A este nivel encontramos la metaloproteína que tiene actividad como hemolisina, que puede estar en la destrucción de la membrana celular salir al medio. Las fosfolipasas son el otro factor de virulencia que ataca al factor sulfactante. Previo a la lisis celular también se han visto muchos procesos apoptósicos. Como consecuencia de este ciclo se liberan gran cantidad de líquidos. No sólo atacan a los macrófagos sino a otras células epiteliales, que se puede ver impedido gracias al movimiento ciliar de dichas células epiteliales.

-.PATOGENIA.-

La colonia como coloniza este medio puede provocar anorexia, cefaleas y cansancio intenso, pero también mialgias y artralgias, pero no es frecuente. Inmediatamente la temperatura del paciente sube. Es importante la tos que es seca y con un esputo muy verdoso y que incluso puede contener sangre (hemoptosis) que puede confundir al analista, ya que se confunde cuando hay una embolia pulmonar. Dolor torácico de origen pleurítico o no. En algunos pacientes hay alteraciones neurológicas.

Martes 10-05-05

-.DIAGNOSTICO DE LABORATORIO.-

Los mejores especimenes son el esputo, aspirados transtraqueales (alta especificidad, pero es una maniobra muy dañina, ya que con un catéter se aspira a la altura de la carina, que es la bifurcación de la traquea), lavado bronquial (a partir de fibrobroncoscopia, con un cepillo de doble cubierta). Ambas muestras han de ser tratadas con ácido muy fuerte para eliminar las bacterias que sean del género Legionella, que es algo más resistente.

Se procede a hacer las tinciones: tinción de gram, giemsa, Jiménez (sales de plata, donde la Legionella se tiñe de oscuro) y tinción de fluorescencia (muy recomendada, DFA). Una vez realizada la tinción se hacen cultivos en medios selectivos y medios nutritivos, como son los medios BCYE (con cys, sales de Fe, y antibióticos como son el cefamandol y vancomicina que le dan el carácter selectivo). Las colonias crecen de manera lenta y el aspecto de sus colonias son verdosas (L. Pneumophila).

El diagnóstico requiere de pruebas bioquímicas del suero del paciente. Entre ellos vemos el nivel de P y de Na en el suero del individuo, que en presencia de Legionella provocan hipofosfatemia e hiponatremia. La hipofosfatemia es grave cuando está por debajo de 0,5 mg/ dl, ya que puede afectar al sistema nervioso del individuo, produciendo convulsiones, dificultad para emitir sonidos (disartria). El Na sus niveles normales es de 135-143 meq/ l, y hay hiponatremia

cuando está por debajo de 130 meq/ l.

También se acude a la detección de transaminasas hepáticas, sobre todo la AST (aspartato transaminasa), alaninatransaminasa (ALT) y la glutamil-gamma-transpeptidasa (valor menor que las dos anteriores). Las dos primeras las encontramos en unas unidades de 40 u.l-1, que son niveles normales.

Cuando se examinan los esputos y no se ven las bacterias pero sin embargo se ven gran cantidad de PMN, se dice que la etiología está relacionada con la Legionelosis.

 

-.TRATAMIENTO.-

El antibiótico de elección es la eritromicina por vía intravenosa, sobre todo en los medios nosocomiales. Se administran a 4g al día, con lo que requiere de un gran volumen, que puede ser perjudicial en pacientes que padezcan cardiopatías. Esta administración de 4g día dura tres días, y si el cuadro mejora se pasa a administrar 1g cada 6 horas, y su tratamiento dura hasta el día 13-14.

También podemos usar otros macrólidos como la claritromicina y azitromicina (500mg dos veces al día y 500mg al día respectivamente). Se absorben mucho mejor y penetran mejor n las células eucariotas. También vemos la doxicilina y la minociclina como tratamientos de alternativa, por vía IV o por vía oral. Se puede usar la rifampicina (600mg/ día), que actúa sobre la síntesis de RNA.

No hay vacunas hasta el momento. Ahora mismo lo que se hace es el tratamiento de las aguas con el Cl, alcanzando una concentración de 4ppm, de las aguas de estos conductos de refrigeración. El aumento de concentración de Cl puede ser carcinogénico para el hombre. Por lo tanto se puede hacer una limpieza con altas Tª, luz ultravioleta y una alternativa es buscar biocidas que afecten las amebas de esta agua.

-.MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS.-

Los encontramos dentro del grupo de los actinomicetales, que se consideran como hongos,

debido a su agrupación, ya que vemos que forman cordones ramificados que recuerdan a las hifas de los hongos. Dentro de este grupo vemos tres especies: M. Tuberculosis, M. Leprae (bacilo de Hansen) y el M. Bovis. Las Mycobacterium oportunistas están creando dificultades tanto en los medios nosocomiales como en los que no. Son ácido alcohol resistentes (ziehl-nielsen positivo).

Jueves 12-05-05

Son bacilos gram +, aunque se tiñen muy mal, son aerobios, sin cápsula y no forman esporas. Son catalasas +, reducen los nitratos a nitritos, son capaces de acumular niacina, y poseen un enzima que es la piracinamidasa como enzima que actúa sobre un antibiótico que se considera de primer orden, que es la piracinamida, por lo tanto este antibiótico no es activo, sin embargo cuando la enzima actúa se genera ácido piracinoico que es el que actúa como antibiótico (es decir es un proantibiótico).

Su pared es de alta complejidad, y está implicada en la respuesta inmune, al igual que es un factor de virulencia (el único factor). Tiene una tinción muy especial que es la de Ziehl-Nielsen (ácido-alcohol resistente), que consiste en aportar calor para que el colorante pueda pasar, ya que la pared evita el paso de los colorantes. El primer colorante es la carbalfucsina y usamos el ácido-alcohol para destruir (pero la pared de estas bacterias es capaz de resistir este lavado). El colorante de contraste es el azul de metileno.

El crecimiento de esta bacteria es muy lento (la duplicación es en aproximadamente 12 horas) por ello las placas se incuban entre 3-10 semanas; Igualmente los antibióticos tienen muy dificultada su acción ya que tanto los nutrientes como las demás sustancias entran muy lentamente. Todo esto hace que su diagnóstico sea muy lento y que su tratamiento dure meses y que la aparición de resistencia a los antibióticos, por lo que se dan dosis múltiples de antibióticos y con distintas hachones cada antibiótico.

Dado estas dificultades los medios de cultivo son muy complejos y ricos. Los medios más utilizados son el LOEWESTEIN-JENSEN (lleva huevo entero y harina de papa, desarrolla un color crema en dos semanas

aproximadamente), y medios MIDDLEBROOK 7H10, 7H11 y 7H12, que se usan en los laboratorios de referencia, en un proceso denominado BALTEC, que consiste en añadir compuestos radiactivos con 14C en un ácido graso. Así vemos que desde que comienza la duplicación, aunque sea tan lento, y podemos detectar la producción de 14CO2, que es inmediatamente atrapado por la sosa que tenemos en un recipiente dentro del medio de cultivo.

Una clasificación muy reciente de Mycobacterium, es la dada por RUNNY ON, atendiendo a la velocidad de crecimiento y a la formación de pigmentos, y si estos pigmentos son patocromógenos o escotocromógenos (producen pigmentos en ausencia de luz).

-.Pared celular.-

Tiene un peptidoglicano muy similar a las gram-, ya que los Aa que forman los enlaces cruzados que son la Lys-D-Ala - Ác. Glutámico y el diaminopinelato. Es en multicapa. El peptidoglicano está unido a una capa arabano-galactano, unidos al peptidoglicano por la ramnosa. Aquí están asociados los ácidos micólicos que son ácidos grasos que tienen un elevado número de átomos de C, que se considera un ácido graso -sustituido y -hidroxilado.

Las cadenas alifáticas son específicas de las cepas. Los ácidos micólicos son los principales factores de virulencia. Sobre esta capa vemos proteínas (inductores de la respuesta inmune), encontramos el CORD-FACTOR (complejo entre glúcidos de trealosa--- dímeros de glucosa por enlaces -1-1´) que es responsable de gran número de propiedades de virulencia; estos glúcidos pueden estar asociados a proteínas o lípidos, y más complejos como proteína-glúcido-lípidos. También podemos encontrar otra capa que es la lipo-arabino-manano, que es un complejo que partiendo de la membrana citoplasmática unido por fosfoinositol, que es equivalente al lipopolisacárido de las bacterias gram -.

Martes 17-05-05

Las moléculas de lipoarabinomanano es una molécula que parte de la membrana celular, atraviesa el inositol y todas las demás capas. Es el primer factor de

virulencia que vamos a ver. Es el equivalente lipopolisacárido de las bacterias gram-. la segunda capa que vemos es la capa de arabanogalactano y posteriormente vemos es CORD-FACTOR, que tiene como mayor componente una trealosa que se encuentran unidas a grupos sulfatos y se denominan sulfácidos (es como una sal de ácidos micólicos). Los sulfácidos constituyen la capa más externa del CORD-FACTOR.

Los sulfátidos en realidad son parte del CORD-FACTOR, y es su capa más externa. Pero además de eso, tiene otros componentes esta capa externa como son glucolípidos, péptidos de glucolípidos y además otros componentes lipídicos, micólicos libres y también encontramos proteínas y péptidos con papel importante en el diagnóstico de la enfermedad como en la respuesta inmune que provoca la bacteria (péptidos PPD o derivados proteicos purificados). El PPD es la tuberculina que es lo que se inyecta intradérmicamente para hacer la prueba de la tuberculina.

El lipoarabinomanano se caracteriza porque da una respuesta humoral que produce anticuerpos que son fútiles, es decir, que no son importantes para la defensa del organismo frente a la infección (no son anticuerpos protectores). Es un componente de la pared que inhibe la acción estimulante del IFN- del macrófago, es decir, que el macrófago no recibe las señales activadores del IFN-.

Estimula la producción del factor necrótico tumoral  (TNF-) por parte de los monocitos y posteriormente macrófagos. Dificulta la presentación de los antígenos pertenecientes al Mycobacterium y por consecuencia disminuye la activación de los linfocitos T (impide la activación correcta de los linfocitos T).

Las moléculas de arabinogalactano estimulan la producción de anticuerpos, por lo tanto interviene en la respuesta humoral, pero los anticuerpos no son fútiles, es decir, son protectores. Estimula la producción de inmunógenos, pero son anticuerpos fútiles.

El CORD-FACTOR juega el papel más importante en la infección, de tal manera que en ratones se observa

que inyectando 10 microg de este glucopéptido provoca una neumonitis hemorrágica en el ratón y además el pulmón induce la producción de granulomas en el tejido pulmonar del ratón. Si se inyectan 30 microg, produce la muerte del animal inmediatamente.

En principio es la molécula responsable de la producción del granuloma que se produce en la infección. El granuloma es una lesión hística consecuencia de la respuesta inmune celular que el individuo da a la presencia del inmunógeno. Esta respuesta inmune es la denominada CMIR (respuesta inmune mediada por células) y ocurre por el englobamiento del Mycobacterium por parte del macrófago, y la presentación por parte del macrófago de los antígenos.

Todas las bacterias que se multiplican en el interior de la célula son procesados en el interior, y desde el punto de vista inmune eso es importante porque como consecuencia del procesamiento, el macrófago expresa en su superficie junto con los antígenos de histocompatibilidad (HLA-1 y HLA-II), expresan en su superficie antígenos del Mycobacterium (determinantes antigénicos del Mycobacterium).

Cuando el macrófago presenta esos antígenos estimula a los linfocitos TH, que se dividen cada vez más rápidamente y comienzan a formar un collar alrededor de los macrófagos activados. Los antígenos se los presenta a células T que son linfocitos T que son TH-1 y TH-2.

Esto es el inicio de la formación de un granuloma, y comienzan a guardar un orden. En la parte central existe gran cantidad de macrófagos y alrededor linfocitos T. En un estado más avanzado, los macrófagos se unen entre sí dando lugar a células gigantes que son células de Langhans que se consideran un cincitio (reunión de células todas contaminadas entre sí). En la zona también se forman células epiteliales, fibroblastos y macrófagos activos.

Alrededor de este conjunto de células existen collares de linfocitos T distribidos en capas concéntricas. En el transcurso del tiempo, se va a crear un foco necrótico porque se secreta al medio el TNF-. La destrucción que se crea en el tejido se produce como consecuencia

de la activación de las células T que están en la superficie, creándose un foco isquémico con pO2 bajas y el pH también es bajo. En dicho foco isquémico también se liberan células de Mycobacterium, pero debido a las condiciones del medio no se favorecen las divisiones de la bacteria.

Además en la zona existen TFN- y un derivado de la vitamina D, que también lo producen los macrófagos de la zona, que matan al macrófago. Ese granuloma es magnífico para detener la replicación del Mycobacterium, pero a su vez ese granuloma es una destrucción de nuestro tejido, y cura espontáneamente, porque se puede producir una fibrosis o se calcifica ese tejido.

El CORD-FACTOR inhibe la migración de los leucocitos a la zona de infección. A nivel de la célula humana, destruye la membrana mitocondrial. A nivel del fagosoma inhibe la unión de los fagosomas con los lisosomas, por lo tanto no se crea el fagolisosoma. También reduce en grandes cantidades la producción de IL-6 por parte de los linfocitos T.

Los sulfátidos es la capa más externa del Mycobacterium tuberculosis, y se conoce bien el papel del sulfátido SL-1, que es el más abundante de el M. Tuberculosis, que dificulta la activación de una proteincinasa de la membrana que está implicada en la producción de radicales superoxido. El radical superoxido es un oxidante y un reductor implicado en la destrucción de bacterias y otros elementos que entran en la célula por endocitosis.

También los sulfátidos producen IL-1, que es una molécula que forma parte de la respuesta inmune y produce fiebre, por lo tanto es un pirógeno. También los sulfátidos aumentan la producción de TNF- que inhibe al Mycobacterium, también produce fiebre y también implicado en la perdida de peso que presentan los individuos con tuberculosis.

Los sulfátidos también colaboran con el CORD-FACTOR en todas sus respuestas.

La tuberculoproteína (PPD) está implicada en la respuesta inmune de hipersensibilidad de tipo retardada. Esta respuesta es doble, ya que elimina al Mycobacterium de una forma más drástica que la

respuesta CMIR, que es la destrucción masiva del tejido pulmonar de la zona, que en consecuencia da lugar a cavidades pulmonares que son zonas donde se han destruido los alveolos. Dicha cavidad se llena de Mycobacterium y permite que por expectoración salga el Mycobacterium al exterior y también esta cavidad provoca la tisis (hemorragia en pacientes en que no se ha curado bien el Mycobacterium).

Jueves 19-05-05

-.Dinámica de la infección de M. Tuberculosis.-

Vamos a partir desde que llegan los goticulos o aerosoles, pasando por los granulomas (caseificación) y la formación de cavidades (destrucción masiva del pulmón). Cuando los aerosoles llegan al pulmón (de diámetro 5 micrometros), que tienen entre 5 y 10 microorganismos, y se depositan en bronquios y bronquíolos (zona inferior del pulmón). Habrán factores de la respuesta inmune como la C5a (anafilotoxina) que ejercerá un efecto quimiotáctico de los monocitos que se convertirán en macrófagos. En la zona habrán macrófagos QUIESCENTES que son macrófagos inactivos que no detienen la infección. Estos macrófagos quiescentes son activados por la C5a y la proteína MCP-1.

Posteriormente actúa el C3bi que se une a la superficie de bacterias de manera más inespecífica, que es uno de los agentes que permite la fagocitosis por parte del macrófago, que está asistido por un receptor que en su superficie (superficie del macrófago) que es el CD-11b. Una vez que esto ocurre , engloba a la bacteria y comienza a dividirse el bacilo dentro del fagosoma, que encuentra un medio idóneo para su crecimiento, al igual que evita la unión de los lisosomas (GRACIAS AL CORD-FACTOR). El macrófago puede llegar a expresar parte de los componentes de la bacteria, en la superficie celular (determinantes antigénicos, expresados junto con el MHC-I), produciendo la respuesta CMIR (respuesta inmune mediada por células), activándose los linfocitos T mediante sus receptores - (linfocitos TH CD-4+). También se activan los linfocitos T CD-8+, que son los citotóxicos, y que son los encargados de eliminar a los macrófagos. Los receptores - están implicados específicamente en la destrucción de los

macrófagos.

Aquí juegan un papel importante las IL, como por ejemplo el INF- y la IL-2 (producidos por los linfocitos TH CD-4+). El linfocito T CD-8 se une directamente al macrófago produciéndose un proceso de apoptosis. Por parte del macrófago se forma el TNF- con acción específica ante el Mycobacterium (aunque también es perjudicial para nosotros por la producción de fiebre, pérdida de peso) y también se genera IL-1.

Como consecuencia de la CMIR hay una destrucción de la zona donde está ocurriendo, que se denomina caseificación, que es un proceso poco agresivo, es decir, se hace de manera muy lento. Aquí en este proceso se liberan Mycobacterium, y puede alcanzar los vasos linfáticos regionales, produciendo una linfaderritis, que provoca hiperplasia en el íleo y mediastino. Vía linfática se desplaza ectópica colonizando distintas partes como las médula ósea, sistema nervioso,..., y ápice pulmonar.

En el ápice pulmonar vemos zonas de mayor oxigenación, idónea para el creciemiento ya que el 5% de los individuos infectados hay una respuesta inmune muchísimo superior que en otras partes, de tal manera que la CMIR no es suficiente. En un momento dado hay procesos de hipersensibilidad de tipo retardado, que hiperactivan al macrófago que como no es capaz de , se desgranulan quedando libres los gránulos lisosomales que es el mayor causante de la destrucción pulmonar. Debido a esto se crea una cavidad que permite que el Mycobacterium quede libre en la zona y salga gracias a la expectoración.

-.Diagnóstico por el test de Manoux.-

Nos mide el nivel de sensibilidad o resistencia de M. Tuberculosis. Cuando da positivo sólo podemos ver que el individuo ha tenido contacto en algún momento de su vida con el bacilo de M. Tuberculosis. En principio se purificó la proteína de la superficie de Mycobacterium (OT---tuberculina vieja), posteriormente la PPD (que es otro tipo de tuberculina). Actualmente se purifican la RT-23 que se realiza en el antebrazo, inyectando intradérmicamente 0,1 ml con 3 UI de tuberculina que se produce una roncha ue inmediatamente desaparece a las 24 horas.

Sin embargo a las 48-72 horas se mide la pequeña lesión que aparezca en la zona, y dependiendo de su diámetro, nos da las características de su epidemiología:

1.- Diámetro de 5 mm--- si el paciente presenta éste diámetro y el paciente es VIH positivo; pero cuando hemos estado en contacto con individuos tuberculosos también es positivo.

2.- Diámetro de 10mm--- lo consideramos positivo cuando el individuo es alcohólico, en individuos con defensas bajas, individuos que viven en zonas endémicas de tuberculosis, y en la población presidiaria.

3.- Diámetro de 15 mm--- todas estas personas son positivas. Estas personas han de ser sometidas a estricta revisión médica, con la toma de distintos especimenes (orina, esputo y sangre).

Si vamos a un esputo, vamos a la expectoración propia del individuo, si el individuo no expectora se le suministran aerosoles para facilitar la expectoración. El esputo se trata con ácido acético y con L-Cys, para limpiarlo, se hace extensión y se tiñe con Ziehl-Nielsen y otra tinción con fluorocromo auramina. También se acude al recuento de los microorganismos de la extensión de la infección, haciendo cultivos por el método BACTEC en el medio 7H12 (ácido palmítico con 14C) y junto con NAP.

Martes 24-05-05

A los 15 días ya sabemos si la bacteria que está creciendo es M. Tuberculosis, ya que hacemos PCR, con una sonda específica y determinada de M. Tuberculosis. También se aude a comprobar la existencia de genes que confieren resistencia a los antibióticos. El tratamiento es de 6-9 meses con una multi-antibioticoterapia.

Cuando vamos a la orina se recoge el volumen medio de la orina (primera de la mañana) durante 3 mañanas consecutivas. Se hace tinción de Ziehl-Nielsen y poder ver si hay tuberculosis renal. Si observamos gran cantidad de PMN decimos que hay una infección aséptica, ya que vemos células inmunes,

pero no al propio bacilo.

También es importante las posibles biopsias que se hagan en tejidos que presuntamente se vean afectados por Mycobacterium. Esto se suele hacer en el bazo, y por supuesto se hacen los mismos cutivos que con el esputo. Es necesario igualmente la realización de pruebas radiológicas en busca de lesiones en el pulmón (los tuberculomas).

-.Tratamiento y prevención.-

consideramos tuberculosis pulmonares y extra-pulmonares. En la pulmonar vamos a tratamientos de elección que tengan piracinamida, isoniacida y rifampicina. Se da en los dos primeros meses en dosis de:

-ISONIACIDA--- 300 mg/ día

-RIFAMPICINA--- 600 mg/ día

-PIRACINAMIDA--- 1g/ día

Durante 4 meses se continua con isoniacida y piracinamida. Se dan ya que son tuberculostático y bactericida ya que inhiben el crecimiento de las bacterias por la n incorporación de los ácidos micólicos. La rifampicina actúa sobre la RNA polimerasa dependiente de DNA por lo que es bactericida. La piracinamida no se conoce muy bien su mecanismo de acción y tiene como aracterística que necesita un pH ácido para actuar; actúa muy bien sobre los focos caseificados que además exige la producción de la enzima piracinamidasa que actúa sobre el antibiótico. En todo caso todos ellos son antibióticos.

Este mismo tratamiento es con el extra-pulmonar, durante 9 meses, ero en los primeros meses añadimos el etambutol. Estos 4 fármacos se dan a la vez durante los dos primeros meses. El resto de los meses se da isoniacida con la rifampicina. El etambutol no se sabe su mecanismo de acción, pero se sabe que dificulta la producción de la capa de arabino-galactano de la pared. Su dosis es de 850 mg/ día. Si el etambutol se administra durante más de dos meses, se reduce su dosis a 15 mg/ día.Kg.

En el caso que la tuberculosis se desarrolle en un individuo inmunodeprimido, ya que no contiene o tiene reducido el linfocito T CD-4; requiere un tratamiento igualmente con los 4 antibióticos, durante los seis meses del tratamiento. En el caso del enfermo de SIDA se hace análisis de los especimenes para ver que su eliminación es completa, y así cuando vemos que el cultivo es negativo se actúa de otra manera.

La prevención se caracteriza por estar en países donde la tuberculosis no es endémica, se hace el test de MANDOUX y da positivo, ha de ser tratado con isoniacida como prevención, al igual que con un niño. En un país endémico se suele suministrar a los 3-4 meses de edad la vacuna de calmette Guerin, que es una cepa atenuada de M. Bovis, de manera intradérmica que produce una repuesta CMIR localizada. Esta respuesta CMIR evita la localización de M. Tuberculosis en cualquier parte del individuo, evitando la lesión primaria.

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MICOLOGÍA

GENERALIDADES

La ciencia que estudia los hongos es la Micología. Los hongos se pueden clasificar en dos grandes grupos:

Levaduras : unicelulares Mohos : pluricelulares

En general, todos los hongos son heterótrofos, precisan compuestos orgánicos que contengan carbono como fuente de energía, son aerobios o anaerobios facultativos y, la mayoría de ellos viven como saprofitos en el suelo y agua.

Para la identificación de levaduras se recurre a pruebas bioquímicas similares a las que se utilizan para las bacterias, sin embargo, los mohos se identifican en base a su aspecto físico, lo que incluye las características de las colonias y la formación de esporas. Las colonias de mohos se describen como estructuras vegetativas porque están compuestas de células implicadas en el catabolismo y en el crecimiento. Los hongos suelen reproducirse por esporas.

ESTRUCTURAS VEGETATIVAS: MOHOS

 

El TALO o COLONIA de moho consiste en largos filamentos celulares agrupados. Estos filamentos se llaman HIFAS. En la mayoría de los mohos las hifas contienen unos tabiques llamados SEPTOS que dividen a las hifas en unidades diferenciadas, mononucleares, semejantes a células. Este tipo de hifas se denominanHIFAS TABICADAS, sin embargo, en algunas clases de hongos la hifa no contiene tabiques y aparecen como largas células continuas con numerosos núcleos. Estas se conocen como HIFAS CENOCÍTICAS. Las hifas del talo crecen alargándose por sus extremos. Cada parte de una hifa es capaz de crecer y, cuando se separa un fragmento, puede alargarse para formar una nueva hifa. Cuando las condiciones ambientales son apropiadas las hifas crecen, se entrelazan y forman una masa llamada MICELIO. La parte del micelio implicada en la obtención de nutrientes de llama MICELIO VEGETATIVO y la relacionada con la reproducciónMICELIO REPRODUCTOR o AEREO, llamado así porque se proyecta sobre la superficie del medio en el que crece el hongo.

LEVADURAS

Son hongos unicelulares no filamentosos, con una morfología característica esférica u ovalada. La mayoría de las levaduras forman colonias de organismos unicelulares y la colonia crece a medida que aumenta el número de levaduras. Este aumento suele ocurrir por gemación. En la gemación, la célula forma una protuberancia o yema sobre su superficie externa. Algunas especies de levaduras forman yemas que no logran separarse y dan lugar a una corta cadena de células llamada “Pseudohifa”.

Las levaduras son capaces de crecer como anaerobias facultativas. Si disponen de oxígeno, realizan la respiración aeróbica para metabolizar azúcares hasta CO2 y H2O. Por el contrario, si carecen de oxígeno, fermentan azúcares produciendo Etanol y CO2.

HONGOS DIMÓRFICOS

Algunos hongos y especialmente, las especies patógenas, muestran dimorfismo, es decir, dos formas de crecimiento. Estos hongos pueden crecer como moho o como levadura. A menudo, este dimorfismo depende de la temperatura de incubación: a 37ºC el hongo es levaduriforme mientras que a 25ºC es filamentoso.

TOMA DE MUESTRAS

Muestras de la Piel: se deben recoger abundantes escamas de la zona lesionada, preferiblemente de los bordes o bien pasar un trozo de moqueta especial y estéril varias veces por la lesión.

Muestras de la Cabeza: recoger las escamas, los pelos (con raíz) o

pasar la moqueta.

Muestras de las Uñas: tomar fragmentos pequeños de las uñas, o un raspado subungueal. Si hay un exudado perungueal se recogerá la muestra con una torunda estéril.

Lesiones en pliegues (interdigitales, unguinales, submamarios, labiales,...): recoger escamas o pasar la moqueta. Si la lesión es exudativa y no se pueden recoger escamas, la muestra se tomará con una torunda o mediante pases de moqueta.

Lesiones en mucosas oral, balanoprepucial, etc: se recogerá un exudado mediante una torunda. Se tomarán preferiblemente dos muestras, una para examen microscópico y otra para la siembra en un medio de cultivo.

Es importante que si las lesiones tienen más de una localización, se realicen tomas separadas. Además, en los volantes deberá aparecer la fecha de la toma de muestra, la localización de la lesión y tipo de muestra que se ha tomado, junto con otros datos de interés personales.

MATERIALES Y REACTIVOS

Portas y Cubres Placas de petri estériles Torundas Bisturí y pinzas de disección Espátulas de siembra Asas de siembra Pipetas estériles y no estériles Papel celo Cinta adhesiva Guantes Laca de uñas para sellar portas

REACTIVOS

Suero salino KOH (Hidróxido potásico) ó Dimetil Sulfóxido Azul Algodón Lactofenol: colorante para el examen directo o

para teñir hongos de un medio de cultivo. Tinta china Alcohol de 70º.

MEDIOS DE CULTIVO

Para el aislamiento primario de los hongos, se utilizan diversos medios de cultivo. Estos medios hay que seleccionarlos en función del hongo

que se sospeche y del tipo de muestra.

Los medios de cultivo se pueden utilizar en tubos cerrados con tapón de rosca o en placas de petri. La gran superficie de estas últimas facilita el aislamiento y la dilución de sustancias inhibitorias en las muestras. Es importante que el medio no se deseque por lo que el espesor de las mismas debe ser por lo menos de 25 mm, aproximadamente 35-40 mL de medio. Las placas se contaminan con facilidad durante la incubación por lo que es aconsejable sellarlas con cinta adhesiva. Los medios en tubo tienen la ventaja de que no se deshidratan y se contaminan menos, pero en cambio tienen menos superficie.

Si la muestra es de una zona contaminada se deben incluir medios que contengan Cloranfenicol y Cicloheximida. El primero inhibe los contaminantes bacterianos y el segundo inhibe el crecimiento de hongos saprofitos. Hay algunas especies patógenas que pueden ser inhibidas por ambos, por esta razón es importante usar medios con y sin agentes inhibidores. Las muestras de zonas estériles pueden inocularse en medios sin sustancias inhibitorias.

La temperatura de incubación debe ser seleccionada teniendo en cuenta el tipo de hongo, en general, los medios deben incubarse a 25ºC y a 37ºC durante 4 semanas antes de considerarse como negativos. Si se emplean tubos con tapón de rosca deben estar flojos para permitir la entrada de aire.

Medios más utilizados

Agar Dextrosado de Saboureaud con Cicloheximida y Cloranfenicol: se utiliza para el aislamiento e identificación de dermatófitos y Cándidas.

Agar Dextrosado con Cloranfenicol sin Cicloheximida:  se utiliza para el aislamiento e identificación de patógenos ambientales y oportunitas.

Agar de harina de maíz (“Corn Meal Agar”): o Suplementado con Tween 80: para diferenciar distintas

especies de Cándida y para realizar subcultivos ya que estimula la esporulación de hongos miceliales.

o Suplementado con 10 gramos de Glucosa: para diferenciar Trichophyton

Agar de Urea:  se utiliza para diferenciar entre levaduras e identificar diferentes especies de Trichophyton.

TÉCNICA DE SIEMBRA Y PROCESAMIENTO

El procesamiento debe ser inmediato. Muchas muestras se pueden sembrar inmediatamente tras su recogida.

Se debe sembrar la muestra en su totalidad. En caso de aspirado de

abscesos, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, etc, el volumen deberá ser de al menos 2 mL.

En el caso de que la muestra proceda de exudados vaginales: agitar la torunda en 0,5 mL de agua y sembrar, o bien sembrar con la torunda directamente.

En el caso de líquidos corporales se deberán tomar más de 2 mL y si en los líquidos hay coágulos o material membranoso, será necesario fragmentarlos con el bisturí y luego realizar la siembra.

Cuando la muestra son pelos y raspados: depositar directamente en el medio, presionando para que queden adheridos. En caso de uñas se pueden pulverizar o cortar en fragmentos.

Por último, cuando se trata de cepillados bronquiales, hay que mezclar con agua destilada y sembrar el volumen total (más de 1 mL).

Siembra con concentración

Se realizan siempre que la muestra es líquida y se hace por centrifugación a 1500-2000 r.p.m. durante 10 minutos. El sedimento se utiliza para un examen directo o bien para cultivo.

En líquidos corporales: el volumen tiene que ser mayor de 2 mL. Se fragmenta y se centrífuga. Si las muestras son muy densas, hay que diluirlas con agua destilada y centrifugar.

En orina: volumen superior a 2 mL En LCR: centrifugar el LCR durante 10 minutos a 1500-2000

r.p.m. Retirar el sobrenadante con una pipeta estéril y resuspender el sedimento con el líquido que ha quedado. Sembrar.

Siembra con machacado u homogeneización

Se realiza en biopsias, muestras procedentes de tejidos y uñas. Se realizan con el fin de aumentar la superficie de la muestra, para lo cual cortamos en pequeños fragmentos que depositamos en una placa de petri estéril que contiene una cantidad de agua destilada estéril.

En el caso de las biopsias, homogeneizar en un triturador de tejidos. Primero cortamos la muestra, la mezclamos con agua destilada, trituramos y sembramos los medios con el homogeneizador y con pequeños fragmentos de tejido.

Incubar a 37ºC durante 3 semanas. Un error habitual es tirar los medios una vez que se ha conseguido el aislamiento de algún hongo, ya que puede haber otros de crecimiento más lento.

EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO

Se realiza a partir de muestras obtenidas de lesiones. Es el método más simple y más rápido para establecer un diagnóstico presuntivo de micosis, ya que no necesita de incubación. Si la muestra no es abundante hay que dar prioridad al cultivo, frente al examen directo.

Preparación de la muestra:

En el caso de tejidos: cortar, trocear, machacar, etc.

En el caso de líquidos: concentrar por centrifugación.

En el caso de uñas: trocear, repartir en fragmentos, etc.

Si son otras muestras como escamas, pelos, etc, no es necesaria una preparación previa, sino que se hace directamente el examen.

TÉCNICAS Y TINCIONES PARA EL EXAMEN DIRECTO

Examen Directo con Solución Salina

Colocamos una gota de la muestra líquida en un porta y añadimos una gota de solución salina. Ponemos el cubre y observamos al microscopio con poca luz y variando el aumento.

Los hongos se observan refráctiles o brillantes, ligeramente verdosos. En el caso de las levaduras pueden aparecer inclusiones. También se pueden observar burbujas de diferentes tamaños. No debemos confundir las levaduras con hematíes y con burbujas de aire. Se diferencian porque las levaduras presentan pequeñas inclusiones en la célula y las burbujas van a ser siempre de diferentes tamaños.

Hidróxido Potásico con Dimetil Sulfóxido

No es necesario calentar la preparación, de esta forma no aparecen precipitados. Las muestras de pelos, escamas y biopsias se observan con poca luz.

Es importante no confundir artefactos como fibras de tejidos, granos de polen, etc, con hongos. Otra causa de error es lo que se denomina “hongos en mosaico”, que suele aparecer cuando las muestras están muy queratinizadas. Suelen ser acúmulos lipídicos que desaparecen cuando se calienta la preparación.

Colocamos la muestra en pequeñas porciones sobre un porta y añadimos varias gotas de KOH + Dimetil y ponemos el cubre. Observamos los elementos fúngicos (hifas, levaduras, etc).

Si la muestra observada son uñas muy queratinizadas, el tiempo que actúa del KOH es de varias horas. Es conveniente dejar el porta en una cámara con ambiente húmedo (placa de petri con un algodón empapado en agua dentro).

Azul Algodón de Lactofenol

Se realizan las preparaciones a partir de cultivos. El fenol destruye la flora acompañante y organismos; el ácido láctico conserva las estructuras fúngicas y el azul algodón tiñe la quitina de las paredes fúngicas.

Añadimos una gota de la muestra o una porción del hongo en un porta. Sobre ella colocamos una gota de azul algodón y ponemos el cubre. Observamos al microscopio.

Blanco de Calcofluor

Se realiza un examen directo sea cual sea la muestra. Es útil en cortes de tejidos.

Colocamos en un porta la muestra + 1 gota de KOH dimetil sulfóxido + 1gota de calcofluor. Mezclamos y ponemos el cubre. Después de varios se ha producido la clarificación, y se observa en un microscopio de fluorescencia (verde brillante o blanco azulado). Las fibras elásticas y colágeno se observan con fluorescencia amarillo verdosa. Estas se pueden confundir con hongos y levaduras y se diferencian en la fluorescencia.

Hay algunos hongos (“hongos dematiaceos”) que producen enfermedades como micetomas que se tiñen con gran dificultad usando el blanco de calcofluor.

Colorante de Cobre ( tinta parker-KOH)

Para el diagnóstico de Malassecia furfur se tiñen intensamente de color azul. La tinta china se utiliza en muestras de LCR y exudados. La usamos siempre que busquemos Criptococcus neoformans.

La técnica consiste en añadir 1gota de tinta china junto con 3 gotas de la muestra, dejar reposar, apareciendo un color marrón (la cápsula se rodea con un halo blanco).

Tinción de Gram

Se realiza para la identificación de hongos. Suelen ser Gram+ y la única consideración a tener en cuenta es que el cristal violeta hay que mantenerlo por más tiempo.

Otras técnicas histológicas o tinciones: Plata Metalamina;

Hematoxilina; Tinción Wright.

EXAMEN DIRECTO Y CULTIVO

Las muestras a partir de las cuales se realizan son:

Exudados óticos Secreciones respiratorias Biopsias Cepillados esofágicos Escamas Pelos y uñas

NO EXAMEN DIRECTO PERO SÍ CULTIVO

Exudado balanoprepuciales Exudado bucal-lingual

IDENTIFICACIÓN DE HONGOS MICELIALES

La identificación se hace en base a su morfología, que puede ser macroscópica y microscópica y que varía en función del medio de cultivo, tiempo y temperaturade incubación.

La velocidad de crecimiento varía según el hongo:

Hongos miceliales:

No dermatófilos ! crecen rápido 3-5 días

Dermatófilos ! 1-3 semanas

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS

Textura de la colonia (mirar fotocopia 1):o Algodonosa: micelio denso y largoo Glabra: consistencia cérea. No micelio aéreoo Aterciopelada: micelio aéreo cortoo Pulverulenta: gran cantidad de esporas y conidias

Coloración

 

 

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS

  TÉCNICA CON PAPEL DE CELO CON AZUL

Cogemos un trozo de celo tocamos suavemente la parte superior del hongo del que queremos observar sus características microscópicas y lo colocamos sobre un porta al que anteriormente habíamos añadido una gota de colorante azul algodón de lactofenol. Observamos al microscopio con el objetivo de 40x o 100x.

  CULTIVO O MICROCULTIVO EN PORTA

No se alteran las estructuras fúngicas. Se utiliza un medio Saboraud que se vierte sobre una placa de petri (capa delgada). Una vez solidificado cortamos cuadrados con un bisturí estéril de 1-3 cm y los colocamos en un porta estéril o flameado. El porta estará colocado en una placa de petri estéril, sobre un soporte. En el fondo de la placa añadiremos unas gotas de agua para evitar la desecación durante la incubación.

Inoculamos o bien las esquinas, o bien los bordes del agar con el hongo a estudiar. Tomamos la muestra con un asa estéril humedecida con agua. Sellamos las placas con parafilm y llevamos a incubar.

  EXAMEN DE FRAGMENTOS DE COLONIAS AL MICROSCOPIO

Mediante esta técnica se rompen los conidios y las esporas. Consiste en cortar con el asa un fragmento de la colonia en el borde (asa en forma de cuña) y depositarlo sobre un porta con una gota de azul de lactofenol. Si se ha incluido agar, calentar suavemente para fundirlo y aplastar el cubre.

  TÉCNICA PARA CONFIRMAR EL DIMORFISMO

Consiste en incubar la misma muestra a 25ºC, temperatura a la que crecen los hongos miceliales, y a 37ºC temperatura a la que crecen las levaduras (tejidos o medios especiales).

Las especies más importantes dimórficas son: Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidiodes imitis. Penicillium marneffei, Slorothrix schenckii.

Para la confirmación es necesario convertir la fase filamentosa en levaduriforme. Para ello incubamos parte de la colonia micelial en una placa de Agar Sangre (3-4 fragmentos). Sellamos e incubamos a 37ºC. Examinamos periódicamente el crecimiento buscando levaduras. Si crece colonia micelial repetimos la siembra hasta conseguir fase levaduriforme.

MEDIOS DIFERENCIALES

Resistencia a Cicloheximida Actidiona:o Dermatofitos y hongos dimórficos ! resistentes a 30ºCo Zigomicetos, algunas levaduras, mayoría de agentes

micetomas! inhibidos Agar Maíz (patata, arroz): permite la esporulación

de hongos Desdoblamiento de urea: permite identificar

especies de Trichophyton incubando a 25ºC / 7 días.

IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS

Test de filamentación

Preparamos una suspensión de levaduras en 0.5-1 mL de suero de conejo e incubamos a 35-37ºC no más de 3 horas.

Transcurrido el tiempo observamos al microscopio la presencia o ausencia de tubos germinales, es decir, de filamentos que no constriñen su punto de origen en la levadura.

El test será POSITIVO si se observan los tubos germinales (C. albicans)

El test será NEGATIVO cuando no encontremos los tubos germinales ((otras especies de Cándida).

Medio diferenciador para levaduras

Posee cromógenos que colorean las colonias según la especie. En el caso de la Cándida albicans, las colonias son de color azul.

Asimilación de azúcares (API)

Técnicas inmunológicas y moleculares

Se utilizan para el estudio de hongos que producen micosis invasivas. Detectan Ag del Criptococo (hongo que produce una cápsula con el Ag en su interior) en LCR o suero del paciente.

ESTRUCTURAS REPRODUCTORAS

ESQUEMA (Fotocopias)

Los hongos pueden propagarse en la naturaleza de dos formas:

Sin células especializadas ! elementos propagadores de rendimiento bajo ! Clamidiosporas (*)

Con células especializadaso Elementos de propagación Asexual

Zygomycota Ascomycota Basidiomycota Deuteriomycota (HONGOS IMPERFECTOS)

o Elementos de reproducción Sexual Zygomycota Ascomycota (HONGOS PERFECTOS) Basidiomycota

ELEMENTOS DE PROPAGACIÓN ASEXUAL (Fotocopias)

Forma Interna: Esporas o Endoesporas, que pueden ser:

Móviles Inmóviles: Esporangioforo (hifa

especializada) ! Apófisis ! Esporangio !Esporangiosporas.(*)

Forma externa: Conidias, que pueden ser: Conidias Tálicas: se forman por segmentación o diferenciación

de hifas preexistentes.o Artroconidias (*)o Aleuroconidias (*)

Conidias Blásticas: se forman por gemación a partir de las hifas o de las células conidiógenas especializadas. Según el origen de la pared de la conidia se clasifican en:

Holoblásticas: toda la pared de la hifa o de la célula coridiógena participa en la formación de la conidia.

o Blastoconidias (*)o Simpodioconidias (Conidiosporas)o Aneloconidias (Conidiosporas)

Enteroblásticas: sólo participa la pared interna de la hifa o de la célula coridiógena.

Poroconidias (*) Fialoconidias (*)

Otra forma de estructurar la clasificación de la Reproducción Asexual

Gemación; Esporulación-Germinación; Fragmentación

Esporulación-Germinación:

Talosporaso Artrosporaso Blastosporaso Clamidiosporas

Formas especializadas Esporangios Conidiosporas

Terminología útil

Coridio: polvo

Aleurio: harina de trigo

Artro: articulación

Blastos: yema

Clamidio: manto

Esporangio: vaso

(*) Son los de mayor importancia para nosotros

REPRODUCCIÓN SEXUAL . CRITERIO DE AGRUPACIÓN PARA HONGOS

ZIGOSPORA: Célula grande y rodeada de una gruesa pared. Se produce por la fusión de dos células morfológicamente semejantes (mirar dibujo en fotocopia).

ASCOSPORAS: Se forman por la fusión nuclear de dos células morfológicamente similares o distintas. Estas esporas se forman dentro de una estructura en forma de saco llamada “Asca” (mirar dibujo en fotocopia).

BASIDIOSPORA: Se forman externamente sobre una base llamada “basidio”.

CLÍNICA

Agrupamos los hongos, en función de la situación preferente de las lesiones producidas por ellos, en los siguientes grupos:

  HONGOS PRODUCTORES DE MICOSIS SUPERFICIALES

DERMATOFITOS: Son hongos filamentosos, septados, con afinidad por la queratina, resistentes a la cicloheximida o actidiona.

En base a las características morfológicas en cuanto a la reproducción asexual se clasifican en tres géneros:

Microsporum Trichophyton Epidermophyton

Microsporum

Presenta abundantes macroconidias con pared gruesa y rugosa con septos transversales en número que oscila de 3 a 15. Su aspecto suele ser fusiforme. Las microconidias son escasas o incluso ausentes, tienen

forma piriforme.

Desde el punto de vista clínico, microsporum se puede encontrar infectando la piel, el cabello y excepcionalmente las uñas.

El principal representante de este grupo es el Microsporum canis, que en un medio de cultivo presenta colonias planas, con un micelio cereo corto, de color amarillento en la periferia y blanquecino en el centro. El reverso que es inicialmente amarillo, pasa posteriormente anaranjado.

Trichophyton

Presenta unas macroconidias de pared delgada y lisa que se observa de forma individual o en racimos que presenta forma de maza con un número de septos que depende de la longitud de la conidia.

Las microconidias son muy numerosas con forma esférica, oval o periforme y aparecen formando racimos a lo largo de las hifas.

Las especies del género Trichophyton pueden infectar la piel, el pelo y las uñas.

El principal representante de este grupo es el Trichophyton mentagrophytes que crece dando colonias planas, con el centro ligeramente elevado, de superficie pulverulenta o algodonosa.

Epidermophyton

No presenta nunca microconidias. Desarrolla abundantes macroconidias con pared y septos delgados, completamente lisas, en forma de mazas y dispuestas en racimos. No suelen presentar más de 4 septos. Se encuentran infectando la piel, en ocasiones las uñas y nunca el pelo.

El principal representante de este género es Epidermophyton floccosum que presenta colonias de aspecto pulverulento o aterciopelado de color amarillo-verdoso o de color marrón. El reverso es también de color amarillo-marrón.

Características morfológicas de los dermatofitos

Microscópicamente observamos un micelio con hifas tabicadas, abundantes y ramificadas. Entre ellas aparecen hifas que generan elementos de propagación asexual y que pueden ser:

Macroconidias: células pluricelulares, grandes, en forma de huso o maza. Presentan septos transversales y paredes que pueden ser finas o gruesas y lisas o rugosas.

Microconidias: unicelulares, pequeñas, redondas, ovales o piriformes.

Manifestaciones clínicas de los dermatofitos

o Tiñas:  afectan al cuero cabelludo ! Trichophyton - Microsporum

Tonsunantes Fávicas Inflamatorias

o Epidermofitias: Herpes circinado Lesiones de grandes pliegues Lesiones interdigitoplantares y palmares ! T. Mentagrophytes y

T. Rubrum (pie de atleta) Foliculitis y perifoliculitis ! T. rubrum

o Onixis inflamatorias:  infecciones de las uñas.

Epidemiología de los dermatofitos: agrupamos los dermatofitos en función de las diferentes adaptaciones parasitarias en:

Geofílicas: se adquieren por contacto con el suelo o manipulación de tierra.

Zoofílicas: contacto con animales parasitados (Conejos: T. Mentagrophytes; perros-gatos: M. canis

Antropofílicos: contacto directo entre humanos y fómites, etc.  HONGOS PRODUCTORES DE MICOSIS SUBCUTÁNEAS

o Cromomicosis o Cromoblastomicosis ! Phialophora verrucosa / fonsecae

Producidas por un grupo de hongos que se denominan “dermatiaceos” (pigmentados negros). El hongo penetra en el tejido subcutáneo, generalmente por un traumatismo y queda localizado en el lugar de la lesión en los tejidos cutáneos y subcutáneos. La respuesta del huésped se caracteriza por la aparición de nódulos verrucosos que sobresalen entre 1 -3 cm sobre la piel.

o Esporotricosis ! Sporothrix schenckii

Suele ser una lesión crónica que se caracteriza por el desarrollo de nódulos en los tejidos cutáneos y subcutáneos que llegan a ulcerarse y producir supuración, acompañándose de una afectación de los ganglios linfáticos de la zona. El hongo penetra generalmente por traumatismos subcutáneos con árboles y plantas, aunque también se puede producir la infección por mordedura de animales, picaduras de insectos, etc.

o Micetomas ! Actinomicetales / hongos

Se caracterizan por la aparición de tumoraciones múltiples y deformantes en las que se produce una fistulización por las que drena un líquido que contiene el hongo infectante.

  HONGOS PRODUCTORES DE MICOSIS SISTÉMICAS

Son infecciones fúngicas de tejidos profundos del cuerpo que pueden afectar a distintos órganos. Suelen estar causadas por hongos saprofitos que viven en el suelo y cuya transmisión se produce por inhalación. Suelen comenzar de forma característica en los pulmones desde donde se extienden a otros tejidos. Por regla general no suele producirse el contagio del animal al hombre.

  Micosis primarias: afectan a individuos inmunocompetentes Histoplasmosis ! Histoplasma capsulatum

Es un hongo dimórfico, es decir, que se puede encontrar como parásito en estado levaduriforme (30-37ºC) o como saprofito en estado filamentoso o micelial (25ºC). Se localiza primariamente en los pulmones y puede producir lesiones en diferentes órganos del cuerpo.

La sintomatología es poco clara y se desarrolla de forma subclínica. Esta micosis se contrae por inhalación de las conidias transportadas por el aire, las cuales se han formado bajo condiciones particulares de humedad y pH. Estas condiciones suelen producirse cuando se acumulan excrementos de aves que por su alto contenido en nitrógeno favorecen el desarrollo del hongo.

Blastomicosis ! Blastomyces dermatitidis

Se trata de un hongo dimórfico (igual que el anterior). La infección comienza en los pulmones y se disemina a otros órganos. Frecuentemente aparecen úlceras cutáneas con formación de abscesos y destrucción de tejidos. El m.o puede aislarse del pus y de las biopsias de tejidos.

Coccidiodormicosis ! Coccidiodes inmitis

Se trata de un hongo dimórfico. Se produce por inhalación de las conidias transportadas por el viento. Da lugar a una infección respiratoria y se manifiesta con dolor torácico y a veces fiebre, aunque la mayoría de las veces inaparentes

  Micosis secundarias: afectan a individuos inmunodeprimidos (oportunistas)

Candidiasis ! Cándida albicans, C. tropicalis, parasilopsis Criptococosis ! Criptococcus neoformans (levaduriforme)

Lo característico de Criptococcus es la presencia de una cápsula que se observa mediante una tinción con tinta china. Se desarrolla bien en los medios de cultivo habituales. Es característica la infección pulmonar, que a menudo es asintomática.

  Formas filamentosas:

Aspergilosis ! Aaspergillus fumigatus, A. Níger, A. Flavus

El mecanismo de transmisión es por inhalación de las conidias. Puede producir 3 cuadros:

o Aspergilosis pulmonar alérgica: asma, aumento de las IgE, eosinofilia

o Aspergiloma: crece en una cavidad preexistente (como tuberculosas)

o Aspergilosis invasiva: pulmón y diseminación secundaria. Zigomicosis o mucormicosis ! géneros Rhizopus y Mucor

Se caracterizan porque producen infecciones muy graves en las cuales el hongo invade paredes arteriales produciendo embolias y necrosis tisular.

CANDIDIASIS - CANDIDOSIS - CÁNDIDA

Las candidiasis son las infecciones agudas o crónicas, superficiales o profundas, causadas por levaduras del género Cándida.

Son células redondeadas u ovaladas que aparecen de forma individual o asociadas formando pseudomicelios. Son Gram+ y su metabolismo es principalmente aerobio. Forman parte de la flora saprofita mucocutánea existiendo un equilibrio entre su virulencia y los mecanismos de defensa del huésped. “Cándida albicans” se encuentra habitualmente formando parte de la flora gastrointestinal y bucal y también como parte de la flora vaginal.

Manifestaciones Clínicas

Candidiasis Cutáneas: o Intertrigo. Axilas, pliegue interglúteo, surco submamario,

etc.o Oniquia y paroniquia: uñas y lecho ungueal

Candidiasis de las mucosas: Candidiasis oral: “muget bucal” ! recién nacidos cuando hay un

descenso del pH y la flora habitual normal aún no es completa. Candidiasis genitourinarias: Vaginitis: eritema, prurito, leucorrea. Balanitis: afectación del glande y del surco balanoprepucial. Candidiasis gastrointestinal : muy infrecuente Candidiasis sistémicas:  invasión de tejidos (localización renal,

SNC, pulmonar, endocarditis, afectación cardiaca, etc.)

ACTINOMICETOS

Son bacterias Gram+ que se asemejan a los mycobacterias. En la observación al microscopio se presentan con morfología variable, que puede ser cocobacilar o filamentosa. El aspecto macroscópico de las colonias puede ser similar al de una bacteria o presentar hifas aéreas

recordando la morfología de los hongos filamentosos. Se encuentran principalmente en suelos, plantas y vegetales, aunque también se pueden aislar de la piel, orofaringe, y tracto gastrointestinal del hombre y de los animales. El hombre puede infectarse por este tipo de bacterias por inhalación o por contacto directo con una herida o traumatismo abierto.

ESPECIES DE IMPORTANCIA CLÍNICA

Géneros: Nocardia, Nocardiopsis, Streptomyces, Actinomadura, Rhodococcus.

N. asteroides, N. brasiliensis: mayor parte de las infecciones sistémicas

N. brasiliensis, Streptomyces somaliensis, Actinomadura madurae: micetoma

Rhodococcus: infecciones de heridas abiertas, abscesos, infecciones pulmonares, osteomielitis.

IDENTIFICACIÓN

Nocardia y Rhodococcus tienen tendencia a fraccionarse y aparecen al microscopio con morfología cocobacilar.

Actinomadura y Streptomyces se presentan como masas filamentosas.

No hay un medio específico para el aislamiento de estos microorganismos. Se puede emplear cualquier medio general como el Saboraud con o sin antibióticos, Agar Sangre, etc.

Las especies de Nocardia sobreviven a menudo a los procesos de descontaminación de mycobacterias, por lo que pueden crecer en dichos medios.

Las placas para el aislamiento de Actinomices se incuban a 30ºC.

Los géneros Streptomyces y Nocardia se desarrollan en un tiempo que oscila entre 2 - 10 días, y las especies de Actinomadura pueden tardar en desarrollarse hasta 3 semanas.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

o Hidrólisis de Aminoácidos:  Caseína, Tirosina y Lisina. Se utilizan medios sólidos que contengan los aminoácidos. Alrededor de la colonia parece una zona clara.

o Resistencia de la enzima Lisozima:  los microorganismos resistentes no se lisan cuando se ponen en contacto con ella. Esto les sucede a las especies que poseen la característica de AAR (Nocardia y Rhodococcus).

o Producción de Ureasa o Licuefacción de la Gelatina o Reducción de Nitratos o Degradación de Etilenglicol o Actividad     - galactosidasa

PATOLOGÍA

La infección producida por este tipo de bacterias depende en gran medida del estado inmunológico del huésped. En individuos inmunocompetentes son frecuentes los procesos alérgicos y el micetoma. En personas inmunodeprimidas es más frecuente que se produzcan infecciones pulmonares y sistémicas.

Enfermedad respiratoria alérgica: producida como una reacción de hipersensibilidad frente a Ag de los Actynomicetos.

Nocardiosis cutánea Micetoma

 

 Micobacteri

as 

  Fundamentos y técnicas de análisis

microbiológicos Micobacterias

Micobacterias

TaxonomíaLas micobacterias son microorganismos distribuidos ampliamente en la naturaleza. Se conocen más de 50 especies, de las cuales casi la mitad se han aislado en procesos infecciosos humanos. Tienen interés especial debido a su alto contenido en lípidos (hasta un 40% del peso seco de la célula)Desde el punto de vista clínico, las micobacterias pueden agruparse en tres grupos:   - Especies que nunca son patógenas.   - Especies saprófitas que pueden convertirse en patógenas (micobacterias atípicas).   - Especies que siempre son patógenas y producen tuberculosis humana y lepra.Las que vamos a ver son las de este último grupo, destacando por su importancia las siguientes:   - Mycobacterium tuberculosis o bacilo de Koch   - Mycobacterium bovis

 

   - Mycobacterium leprae (será vista aparte)

Recogida de muestrasPara el diagnóstico de tuberculosis pulmonar la muestra idónea es el esputo obtenido por la mañana, en ayunas, antes de la utilización de ningún medicamento.Para la tuberculosis renal la muestra más adecuada es la primera orina de la mañana, recogida en ayunas, previo lavado de genitales externos y despreciando la primera parte de la micción. Las muestras de orina de 24 horas son menos rentables y proporcionan una mayor tasa de contaminaciones.La tuberculosis genital se puede determinar investigando la presencia de micobacterias en la sangre menstrual, aunque la muestra más adecuada es la obtenida mediante legrado de endometrio. En el hombre se pueden recoger muestras de semen, biopsia de epidídimo o exudados de fístulas escrotales.La meningitis tuberculosa utiliza L.C.R., que puede mantenerse a temperatura ambiente de 24 a 48 h. a la espera de formación de un retículo para observación de BAAR.Para el diagnóstico de tuberculosis intestinal se pueden utilizar heces, aunque es preferible la biopsia mediante endoscopia.Otros tipos de muestras pueden ser estudiadas mediante el machacado previo en mortero con arena estéril o en aparatos mecánicos si las muestras son sólidas. Si son líquidas las muestras se centrifugan a 3000 rpm durante 30' y se trabaja con el sedimento obtenido.

Procesamiento de las muestras para estudio de micobacteriasEn el procesamiento analítico microbiológico de una muestra para cultivo, aislamiento e identificación de micobacterias, (sobre todo esputo y orina) hay un dato muy importante a tener en cuenta: las micobacterias clínicamente importantes son microorganismos de crecimiento muy lento, dando por lo general colonias visibles en medios de cultivo apropiados no antes de siete dias; lo cual permite que el crecimiento de otros microorganismos de crecimiento normal enmascare e inhiba el crecimiento de las micobacterias.Para evitar esto, todo proceso de cultivo de micobacterias lleva asociado un procedimiento previo de descontaminación en el que eliminamos microorganismos no deseados. La descontaminación puede llevarse a cabo con un ácido, un álcali o cualquier compuesto descontaminante. La sosa, a concentraciones del l al 4% es uno de los más utilizados. A pesar de que las micobacterias son muy resistentes a estos

agentes, tras un proceso de descontaminación solo quedan viables de un 10 a un 20% de la población inicial de micobacterias.De la misma forma, al ser las micobacterias microorganismos de crecimiento intracelular y quedar en muchas ocaciones englobadas en el espesor de la secrección mucosa a que dan lugar (sobre todo la bronquial), es necesario un procedimiento de fluidificación y homogeneización del producto estudiado para garantizar una óptima recuperación de dichos microorganismos en caso de que se encuentren presentes. Para esto se utilizan sustancias mucolíticas como la N-acetil cisteína o detergentes como el lauril sulfato sódico.Los líquidos normalmente estériles (LCR, líquidos articulares, pleurales, etc.) no necesitan proceso de homogeneización ni descontaminación. Unicamente sería necesario un proceso de concentración previo a la siembra.En ocasiones puede utilizarse una técnica conjunta que combine homogeneización con descontaminación en un solo paso. Una de las técnicas más utilizadas es la de Tacquet-Tison o método del lauril sulfato de sosa. Vamos a verla a continuación.

Método del Lauril sulfato de sosaEs uno de los menos nocivos para las micobacterias, porque se utiliza menor concentración de sosa que en otros. Son necesarios 2 reactivos, que denominaremos A y B.El reactivo A es una solución de lauril sulfato de sodio e hidróxido sódico que hará las funciones de descontaminante y fluidificante. Tras mezclar la muestra con el reactivo A, se homogeiniza por agitación, tras lo cual se deja reposar a temperatura ambiente durante media hora. Pasado ese tiempo se neutraliza la alcalinidad con un reactivo B (compuesto por un ácido y un indicador) hasta el cambio de color a amarillo pálido persistente.Después de una centrifugación intensa (3000 rpm durante 20 minutos) se decanta y se siembra el sedimento.

Características microscópicas y de tinciónLas micobacterias son bacilos rectos o ligeramente curvados. Son inmóviles y no esporulados. Con la tinciónde Gram no se tiñen o se comportan como Gram positivos débiles. La presencia de ácido micólico en su pared lesconfiere una resistencia a la solución de alcohol ácido que los diferencia del resto de las bacterias.Aprovechando esta propiedad se desarrolló una tinción específica para bacterias ácido alcohol resistentes.

Con la tinción de Ziehl-Neelsen las micobacterias se observan como bacilos de color rojo. Aparecen individualmenteo formando pequeños grupos.Otras tinciones utilizadas para poner de manifiesto estos microorganismos son la tinción de Kinyoun, la deTan-Thiam-Hok o la tinción fluorescente de auramina-rodamina.

BaciloscopiasTodas las muestras deben ser examinadas mediante tinción de Ziehl-Neelsen antes de proceder a su descontaminación. Aunque el hallazgo de BAAR en un frotis no es un diagnóstico definitivo de infección micobacteriana, permite un diagnóstico presuntivo muy precoz de tuberculosis, un seguimiento de los pacientes en tratamiento y una confirmación de que los aislamientos obtenidos son BAAR.Una buena baciloscopia comienza con la realización de un buen frotis. Debe realizarse a partir de la parte más purulenta del esputo, efectuándose una extensión de grosor adecuado. La fijación debe hacerse durante 30 minutos al calor seguido de alcohol metílico.La observación debe hacerse siempre con objetivo de inmersión, recomendándose hacer una valoración cuantitativa de los bacilos presentes en la muestra.Se observará todo un largo de la extensión finalizando el recuento si hay más de 10 bacilos por línea. Si hay menos de 10 bacilos por línea se efectuará el recuento en dos líneas más y se expresará el resultado como bacilos x 3LSi en la primera línea realizamos un recuento de más de 50 bacilos, no se continua el recuento y se informa como más de 50 BAAR / 1 LOtra forma de informar los recuentos cuantitativos de BAAR es la siguiente:

Ausencia de BAAR 0De 1 a 9 BAAR / 1L Nº de bacilosDe 10 a 99 BAAR /1L +De 1 a 10 BAAR / campo ++Más de 10 BAAR / campo +++

Características de cultivoLas micobacterias son muy exigentes desde el punto de vista nutritivo y se cultivan con relativa lentitud y dificultad en el laboratorio.Los bacilos de la tuberculosis son aerobios estrictos, aunque

M. bovis puede ser microaerófilo en aislamientos primarios. Crece mejor a 37ºC, y el crecimiento es nulo por debajo de 30ºC o a temperaturas superiores a 42ºC.La presencia de ácidos micólicos en la pared celular les confiere una resistencia a la acción de determinados colorantes (como verde de malaquita) o antimicrobianos (penicilina), cualidades que se utilizan para evitar contaminaciones de los medios de cultivo por microorganismos sensibles a dichos agentes.Los medios pueden ser líquidos o sólidos; los medios líquidos tienen poco interés para especímenes muy contaminados como esputos y orinas. Se podrían utilizar, siempre junto con los medios de base de huevo, en muestras poco contaminadas tales como líquido pleural, sinovial, L.C.R. o en determinados especímenes como médula ósea o biopsias. Otra utilidad de este tipo de medios es el mantenimiento de cepas o estudios de CMI de drogas.

Para el cultivo y aislamiento de micobacterias pueden utilizarse diferentes tipos de medios:- Medios enriquecidos: (Lowenstein-Jensen, Coletsos, Middlebrock, Caldo 7H9...)- Medios selectivos: 7H11- Medios diferenciales, que permiten la diferenciación entre micobacterias atípicas y Mycobacterium tuberculosis (PNB, Sauton)

Los medios más utilizados son los enriquecidos, que pueden tener base de huevo como el Lowenstein-Jensen o base de agar como el Middlebrock. La ventaja de los medios con agar es que permiten una detección precoz de las micobacterias; la de los medios con huevo es que ofrecen un mayor número de resultados positivos.Es conveniente usar siempre un medio enriquecido no selectivo, ya que algunas micobacterias pueden resultar inhibidas por los antimicrobianos presentes en el medio.Después del aislamiento primario, las micobacterias son menos exigentes en los subcultivos y crece con mucha más rapidez y en medios más simples, haciéndolo incluso en agar nutritivo.Actualmente existen sistemas automatizados que detectan el crecimiento de micobacterias de una forma mucho más precoz, utilizando sustratos marcados radiactivamente (BACTEC).El cultivo de micobacterias en medio sólido debe hacerse en tubo para evitar la desecación del medio durante el largo período de incubación. Los tubos se incuban casi en

horizontal, a 35º C, en oscuridad y en atmósfera húmeda con un 5 - 10% de CO2 durante la primera semana, para luego pasar a una atmósfera normal. Es conveniente que los tapones estén desenroscados hasta que se evapore el agua que contienen los tubos, ya que ésta puede impedir la aparición de la morfología colonial típica de las micobacterias.Mycobacterium tuberculosis crece en medio de L-J dando lugar a colonias rugosas, de aspecto cerebroide, excrecentes y de color marfil; M. bovis da lugar a colonias lisas.

Las principales características que definen a las micobacterias son las siguientes:- Velocidad de crecimiento: Rápido (menos de 7 dias)Lento ( más de una semana).- Pigmentación de las colonias: PigmentadasNo pigmentadas- Relación entre la luz y la producción de pigmento:Fotocromógenas: producen pigmento en presencia de luz.Escotocromógenas: producen pigmento en la oscuridad.

Pruebas para identificación de especies de MycobacteriumLas características más importantes de las micobacterias tuberculosas son:- Gran poder patógeno- Crecimiento lento de las colonias ( más de siete días)- No producen pigmento- No dan positiva la prueba de la catalasa a 68º C

Las pruebas bioquímicas que nos permiten diferenciar estas dos especies quedan resumidas en la tabla siguiente: 

  NiacinaRed. de

nitrato

Sensibilidad a Pirazinamida

Sensibilidad a Hidracina

M. Tuberculosis

+ + + -

M. Bovis - - - +Tabla I: Características diferenciales de las micobacterias tuberculosas

Además de las pruebas convencionales para identificación de

micobacterias, se han desarrollado nuevastécnicas que permiten la identificación de la especie en pocas horas, acortando así el tiempo de diagnóstico. Ejemplosde estas técnicas son la utilización de sondas genéticas marcadas, con o sin reacción en cadena de la polimerasa yel análisis cromatográfico de los lípidos de la pared celular.

Intradermorreacción de Mantoux o prueba de la tuberculina.La prueba de la tuberculina consiste en la comprobación de una reacción cutánea como consecuencia de una activación de la inmunidad celular cuando a un individuo infectado se le introduce subcutáneamente un extracto tuberculoso inactivado (tuberculina).Existen dos tipos de tuberculina: la clásica (OT), que no se utiliza actualmente debido al alto grado de impurezas que contiene y los derivados proteínicos purificados (PPD) que son utilizados hoy para la inoculación intradérmica.La reacción de Mantoux se hace mediante inyección subcutánea de 2-5 unidades de PPD en la cara anterior del antebrazo, produciendo una pápula sobreelevada. Tras marcar la zona de inyección con marcador graso se espera de 48 a 72 horas para valorar el diámetro del área de induración producida, considerándose positiva la prueba si ésta es mayor de 5 mm.

VacunaciónCalmette atenuó la virulencia de una cepa de M. bovis subcultivándola repetidamente durante un período de 13 años. A esta cepa se le llamó bacilo de Calmette-Guerin (BCG) y tiene especial interés en relación con la inmunización activa contra la tuberculosis, puesto que establece la infección en el huésped humano o animal, pero no da lugar a una enfermedad clínicamente aparente.

EpidemiologíaCien años después de su descubrimiento por Roberto Koch, la tuberculosis sigue siendo la enfermedad contagiosa más importante del mundo. Cada año aparecen 10 millones de nuevos casos y mueren más de 3 millones de personas debido a esta enfermedad.En los paises desarrollados, la tuberculosis es debida fundamentalmente a M. tuberculosis mientras que M. bovis ha desaparecido prácticamente como consecuencia de las medidas de control dirigidas contra las infecciones en el ganado vacuno.

La tuberculosis es una enfermedad de declaración obligatoria en España. La incidencia de tuberculosis en España no es muy fiable, debido a una endémica infradeclaración, pero las cifras que se manejan oscilan entre 26 y 50 nuevos casos por cada 100.000 habitantes.

Sensibilidad a agentes antituberculosos.La terapia antituberculosa exige un tiempo muy largo de tratamiento (de 6 a 18 meses). Desde el comienzo del tratamiento el paciente deja de ser contagioso y el aislamiento prolongado se vuelve inncesario.Sin embargo, un factor muy importante a tener en cuenta es el alto grado de mutagenicidad y resistencia que presentan los bacilos durante el tratamiento, lo que hace necesaria la politerapia para disminuir la frecuencia de recidivas.Atendiendo a esta forma de comportamiento de las micobacterias, se establece que el adecuado tratamiento debe constar de dos fases:A) una fase inicial en la que se persigue eliminar lo más rápidamente el mayor número de bacilos de multiplicación rápida (acción bactericida), para lo cual deben emplearse al menos tres fármacos para evitar la selección de mutantes.B) una fase de consolidación que permitirá eliminar los microorganismos de crecimiento lento e intermitente.Clásicamente, los fármacos utilizados para el tratamiento han sido divididos en agentes de primera y de segunda línea.Los fármacos antituberculosos de primera línea que se usan habitualmente son:

ISONIACIDA: Es el fármaco clave en el tratamiento antituberculoso. Es bactericida a nivel intra y extracelular y se utiliza también como terapia preventiva.RIFAMPICINA: Tiene efecto bactericida sobre microorganismos intra y extracelulares. Es más eficaz que Isoniacida frente a microorganismos de crecimiento lento.PIRAZINAMIDA: Efecto bactericida sobre microorganismos intracelulares. Altamente eficaz en la fase inicial del tratamiento.

ETAMBUTOL: Efecto bacteriostático intra y extracelular. Pude ser bactericida intracelularmente a concentraciones elevadas.ESTREPTOMICINA: Es un agente bactericida sobre bacilos extracelulares, aunque elevando la dosis puede ser bacteriostático a nivel intracelular.

Entre los tuberculostáticos de segunda líneaa tenemos: PAS, cicloserina, kanamicina, viomicina, amikacina,capreomicina, tiacetazona, rifabutina, ofloxacino y clofazimina.

AntibiogramaEl procedimiento para la realización del antibiograma de M. tuberculosis más utilizado en todo el mundo es el de Canetti, Rist y Grosset. Consiste en determinar la proporción de bacilos resistentes a una determinada droga que existe en la población bacteriana inicial (cepa). Para ello, se dispone de una serie de tubos con medios de Löwenstein y las diversas drogas, incorporadas a unas concentraciones previamente establecidas. Se inoculan dos series de tubos, con dos diluciones de una suspensión bacilar, así como unos tubos testigo sin drogas incorporadas.En los tubos testigo se obtiene el crecimiento correspondiente al total de la población bacteriana inoculada. Las colonias crecidas en los tubos que contienen droga indicarán el número de bacilos resistentes a dicha droga en la población analizada.La suspensión bacteriana se prepara tomando unas colonias representativas de la mayor parte de la cepa a estudiar, se depositan en un tubo conteniendo perlas de vidrio, y se añade agua destilada hasta obtener una turbidez equivalente a la proporcionada por una suspensión de BCG de 1 mg/ml. A

partir de aquí se preparan dos diluciones en agua destilada estéril al 1/1000 y al 1/100000. Se inoculan en los tubos correspondientes 0,2 ml de las diluciones así preparadas. Los tubos se depositan en posición horizontal en la estufa a 37ºC y se leen a los 21 y los 28 días. Se cuentan las colonias aparecidas en los tubos testigo y, si existen, en los tubos conteniendo las drogas.Si el crecimiento en los tubos con drogas es superior a la proporción crítica en relación con el crecimiento en los testigos, la cepa se considera resistente, y si es inferior, sensible.

PatogenicidadLos bacilos de la tuberculosis son relativamente resistentes a la desecación y los factores ambientales, probablemente como consecuencia de su alto contenido en lípidos. Los bacilos pueden permanecer viables en el esputo durante semanas o meses. Si se desecan completamente, de manera que los bacilos puedan permanecer suspendidos en el aire, pueden ser infecciosos durante más de una semana.Mycobacterium tuberculosis accede a los alvéolos pulmonares por inhalación de los microorganismos. Es posible que se desarrolle infección en una persona tras inhalar únicamente 1 o 2 bacilos viables, aunque el riesgo de desarrollar infección tras una única exposición es muy bajo (3-5%). Son necesarias exposiciones repetidas a los bacilos, junto a una inmunidad deteriorada del huésped para que aumente esa probabilidad.La patología ocasionada por el género Mycobacterium puede estar limitada a determinados órganos o sistemas: formas pulmonares, renales, osteoarticulares, meníngeas, cutáneas, ganglionares, o bien pueden originarse diseminaciones dando lugar a formas generalizadas.Por todo ello comprenderéis la razón de no trabajar en este Instituto con cepas de micobacterias.

Micobacterias atípicasLa presencia de micobacterias diferentes a las tradicionalmente productoras de tuberculosis fue considerada durante mucho tiempo como una contaminación accidental, sin darle nunca un verdadero valor patógeno.Sin embargo, en estos últimos años se han aislado con mayor

frecuencia y se ha llegado a establecer su relación causal con los procesos tuberculosos que producían.Al no ser típica la etiología de estas tuberculosis, empezó a denominárselas con el apelativo de atípica, término que aunque no es el más idóneo, ha alcanzado un uso tan general que es el que actualmente se aplica a todo este grupo de micobacterias.Las micobacterias atípicas se encuentran en el hombre en ausencia de enfermedad, aunque también se aislan mezclados con bacilos de Koch en infecciones tuberculosas.En la mayoría de las ocasiones son causantes de patología solo si hay una lesión previa de los tejidos o lainmunidad celular está muy alterada.Las micobacterias atípicas difieren de los bacilos de la tuberculosis en que no son patógenas para el cobaya,generalmente son resistentes a los agentes quimioterápicos antituberculosos habituales, crecen con más rapidez y confrecuencia están pigmentados.Runyon clasificó las micobacterias atípicas en cuatro grupos, basándose fundamentalmente en la producciónde pigmentos y en la velocidad de crecimiento, según se muestra en la siguiente tabla:

Grupo CaracteristicasEspecies de Mycobacterium

I

FotocromógenosPigmento amarillo-claroColonias rugosasCrecimiento lento (14-21 dias)

M. kansasiiM. marinumM. simiae

II

EscotocromógenasPigmento naranja-rojizoColonias lisasCrecimiento lento (10-14 dias)

M. scrofulaceumM- szulgai

IIINo pigmentadosCrecimiento lento (14-21 días)

M. aviumM. intracelulareM. xenopi

IVPigmentación variableCrecimiento rápido (5-7 días)

M. fortuitumM. cheloneiM. ulcerans

Tabla II: Clasificación de Runyon de las micobacterias atípicas.