Clonación de secuencias de DNA

Biot 3250

Clonación de productos de PCR

�  A menudo se utiliza PCR en vez de rastreo de biblioteca para clonar un gen porque es efectivo y rápido.

�  La desventaja es que se necesita saber algo de las secuencias de DNA que flanquean el gen de interés para diseñar los primers.

�  Esxiten varias formas de clonar un gen utilizando PCR.

�  Uno de los primeros enfoques implicó el diseño de cebadores para un gen de interés que incluía secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción construida en los cebadores.

Se amplifica

el gen Se trabaja

con los sitios de

restricción en los

primers Digestión

de los productos

de PCR con enzima de restricción

Productos se ligan al

vector Puede ser

utilizado para la secuenciación de

DNA

�  Un enfoque más moderno de la clonación aprovecha una peculiaridad de las enzimas termoestables.

�  A medida que se copia el DNA, taq y otras enzimas añaden un solo nucleótido de adenina(A) al extremo 3’ de todos los productos de PCR.

Amplificación de un gen

Producos de PCR clonados pueden

ser ligados en plásmidos (vectoresT) Plásmido

recombinante que contienen el

producto de PCR clonado puede ser introducido en las

bacterias por transformación

Pruebas de genética humana

Diagnóstico de enfermedades

Amplificacion de DNA poco

común

Análisis forense de DNA

Pruebas de Paternidad

Identificación de Restos humanos

Estudios de expresión

génica

Pruebas disgnósticas

para patógenos

Aplicaciones de la PCR

Apliaciones de la tecnología del DNA recombinante

�  Estudiar estructuras de los genes su secuencia y su expresión en órganos

�  Crear animales transgénicos

�  Producción a escala, aislamiento y purificación de proteínas terapéuticas

�  Utilización en terapia génica humana

�  Diagnosticar transtorno en la genética humana

�  Creación de microorganismos, animales y plantas mediante ingeniería genética

�  Forzar la mutación de genes y estudiar el funcionamiento de la proteína alterada.

�  Utilización de proteínas purificadas para fabricación de anticuerpos y vacunas.

Electroforesis en gel y mapeo de la estructura genética con

enzmas de restriccción

Mapa de Restricción �  Es muy útil conocer el mapa de restricción de un

gen para fabricar clones a partir de trozos pequeños del mismo (subclonación) y para manipular muchos fragmentos pequeños de DNA, para estudiar el DNA y preparar sondas de DNA para estudiar la expresión génetica.

Mapa de Restricción �  Para la creación de mapa de restricción , el DNA

clonado se somete a una serie de digetiones simples y dobles.

�  Los patrones de fragmentos creados por las digestiones se analiza para construir el mapa.

�  Un gel de agarosa se utiliza para separa y visualizar los fragmentos.

�  Un gel con un alto % de agarosa tiene mejor cualidad para separar fragmenos de DNA

Mapa de restricción