clonación y secuenciación del dna1 clonación y secuenciación del dna

Clonación y secuenciación del DNA 1

Clonación y secuenciación del DNA

Clonación y secuenciación del DNA


Clonación y secuenciación del DNAClonación y secuenciación del DNADeberán quedar bien claros los siguientes puntos:

•¿Cómo se manipula el DNA?•Las endonucleasas (enzimas) de restricción•Mapas de restricción•Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción• Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación, organismo huésped, selección de vectores•Métodos de detección a partir de una sonda de DNA: transferencia en Southern, sondeo de un gen clonado•Vectores eucarióticos•Organismos transgénicos•La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)•La secuenciación del DNA

Deberán quedar bien claros los siguientes puntos:

•¿Cómo se manipula el DNA?•Las endonucleasas (enzimas) de restricción•Mapas de restricción•Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción• Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación, organismo huésped, selección de vectores•Métodos de detección a partir de una sonda de DNA: transferencia en Southern, sondeo de un gen clonado•Vectores eucarióticos•Organismos transgénicos•La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)•La secuenciación del DNA


Manipulación del DNA

Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse en un conjunto heterogéneo de secuencias.

Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de DNA específico

La nueva tecnología se denomina:Tecnología del DNA recombinante, clonación

génica o ingeniería genética

Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica

Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:

El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado


Herramienta básica

Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato.

•Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar)

•Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes

5´-GGATCC- 3´

3´-CCTAGG- 5´


EcoRI: E. ColiBamHI: Bacillus amyloliquefaciens

Dos tipos de cortes:

•Corte plano: extremos romos

•Corte escalonado:extremos pegajosos o cohesivos


Herramienta básica

Las enzimas de restricción tipo II:

Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos


Población de fragmentos


Separación fragmentos

Reptación de los

fragmentos a través del gel de agarosa


Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos

Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda

•Transferencia en Southern (Southern blotting)•Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con RNA


Transferencia en Southern

(esquema resumen)


Uso de la enzimas de restricción para la construcción de mapas de restricción


Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)


Usos de los Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)

•Análisis de ligamiento que permite cartografiar y “cazar” genes asociados a enfermedades o rasgos fenotípicos (proyecto SNPs)

•Medicina forense: análisis de las huellas dactilares genéticas (DNA fingerprinting)


Clonación del DNA

•DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)

•Vector de clonación (vehículo)

•Organismo huésped (E. Coli)

•Selección de vectores

Vector híbrido


Vectores híbridos (quimera)Fragmentos de distintas procedencias que se unen in vitro tras cortarse con la misma enzima de restricción

Vectores de

clonación•Plásmido (1 sitio de corte) 2-15 kb•Fago (Lambda)•Cósmido

Clonación del DNA


Vectores de clonación

Fago (2 sitios de corte) < 24 kb

Clonación del DNA


Vectores de clonaciónCósmido: extremos cos + DNA plásmido (origen

replicación) + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb

Clonación del DNA


Huésped: E. coli

Inserción del vector híbrido en el huésped:

•Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma

•Fago (transducción, inserción en DNA huésped)

•Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido)

Clonación del DNA


Selección de vectores híbridos

•Plásmido: resistencia a antibióticos

•Fago : Inserción en E. coli (sólo se puede empaquetar el DNA de si contiene el inserto foráneo)

Clonación del DNA


Obtención de la secuencia que se clona

•Un gen •Aislamiento a partir del mRNA: uso de la transcriptasa inversa que hace cDNA

•Síntesis automatizada de DNA in vitro: a partir de la secuencia aminoacídica se puede hacer DNA con la ayuda del código (no región promotora ni controladora de la expresión) ~100bp

•Fragmentos del genoma por digestión con enzimas de restricción (perdigonada, Shotgun)

•Se obtiene genoteca, juego completo fragmentos clonados del genoma del organismo

Clonación del DNA


Transfección: Introducción de DNA foráneo en eucariotasOrganismo transgénico: un eucariota con DNA

foráneo

•Células eucariotas toman DNA foráneo del ambiente con fosfato cálcico (poco eficiente)

•Inyección en el oocito: DNA incorporado en el cromosoma (ratones transgénicos 15% eficiencia)

Métodos transfección


•Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA foráneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infección viral)



•Electroporación: se usa corriente eléctrica para introducir DNA

•Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesículas de membrana artificial)

•Biolística (mitocondrias y cloroplastos): disparo de proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA

•Plásmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens) y elementos móviles



•Sistemas marcadores (reporter systems): indican la expresión del gen insertado; p.e., enzima luciferasa de luciérnagas en plantas (el vector es el plásmido Ti de A. tumefaciens). Uso como marcador de la expresión de genes específicos

Sistemas de detección del inserto

Luciferina (substrato) + ATP -> luz->

luciferasa


Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas

•Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs):

Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de levadura + (telómero levadura)Puede incorporar más de 500 kb de DNA

Vectores eucarióticos

Origen de replicación del DNA de levadura

(ARS)

Región centromérica (CEN)

Resistencia a antibiótico (p.e., ampr)

Origen de replicación bacteriano (ori)

CEN ARSampr ori TelómeroTelómero

Linealización (con endonucleasas) y

adición de extremos teloméricos


•Vectores animales: SV40, virus vacuolado del simio, de DNA, aunque partes cambiadas. Puede tranformar en cancerosas células conejo o hámster.

•Vectores de plantas: plásmido Ti de bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens, inductor de tumores cuando se integra en DNA huésped (agallas en dicotiledóneas)

Vectores eucarióticos


La reacción

en cadena de la

polimerasa (PCR)


Secuenciación de DNA

La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA permite un conocimiento más completo dela estructura y función de un gen.

Métodos:Secuenciación manual

Químico (Maxam y Gilbert 1977)

Didesoxi (Sanger 1977)

Secuenciación automatizada Didesoxi

Disoxi

•La base molecular de mutaciones específicas en un gen pueden investigarse•Las secuencias del DNA han revelado regiones reguladoras comunes a todos los genes•La comparación de secuencias de diferentes especies provee estimas de las tasas de evolución molecular


Secuenciación del DNA


Secuenciación automatizada del DNA

clonación y secuenciación del dna1 clonación y secuenciación del dna

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