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Células «inteligentes»…, saben adonde ir…, y con quien juntarse.

Un investigador nos cuenta su trabajo....

por Roberto A. Rovasio

Mi historia como investigador

Aunque la idea que surge del título no siemprefue expresada de esta manera, sin duda resume laesencia de importantes líneas de investigaciónbiológica en el mundo desde hace varias décadas.El tema que vamos a tratar está centrado en lacomunicación a distancia entre las células y,aunque los avances recientes han sido muyimportantes, reconoce antecedentes muy antiguos(ver a continuación de este artículo la revisiónhistórica de la comunicación celular).

La comunicación entre células posee lascaracterísticas generales de otros tipos decomunicación, integrándose con elementos quepermiten la transferencia de información. Dichoselementos pueden ser considerados comoequivalentes en una comunicación sonora (figura1A), o en una comunicación celular (figura 1B).

Estos conceptos generales servirán para ubicarel enfoque de mi formación científica inicial,orientado al interés en las relaciones de la célulacon su micro-ambiente. Por razones de formación,de época y de tecnologías disponibles, en losprimeros trabajos estudié la ultraestructura y

características citoquímicas de los materiales de lasuperficie celular (glicocáliz), bajo la dirección delDr. Benito Monis, en el Instituto de Biología Celularde la Facultad de Ciencias Médicas de la UniversidadNacional de Córdoba. Los resultados integraron unaTesis de Doctorado que fue realizada en los años1970, época en que aún se discutía si los materialesde la «corteza celular» eran «artificios de técnica».Afortunadamente, numerosos estudiosposteriores y la maduración del tiempo dieron larazón a los que «creíamos» que los componentessuperficiales de la célula cumplen una actividadesencial para su funcionamiento. Se podría decirque, intuitivamente, estábamos ubicados en elpoco conocido dominio de la superficie celular, enuna época en que hablar de «señalesextracelulares» y de «receptores» era aún unaaudaz novedad. Para agregar un contexto histórico,

Nota del editor: Dada la copiosa bibliografía citada en este artículo, se señalarán las citas utilizando supraíndices cuyas correspondenciaslos lectores podrán buscar en la bibliografía al final del artículo.

El Dr. Roberto Rovasio trabajando ensu laboratorio del Centro de BiologíaMolecular y Celular (FCEFN,Universidad Nacional de Córdoba).

Roberto Rovasio es Profesor Titular Plenario de BiologíaCelular, Director del Centro de Biología Celular yMolecular (CEBICEM, FCEFN, Universidad Nacional deCórdoba) e Investigador Principal (CONICET). Correoelectrónico: rrovasio@efn.uncor.edu

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cabría acotar que el período de elaboración ydefensa de esta Tesis tuvo una triste historiaparalela, al ser mi Director humillante ytemporalmente expulsado de la Universidad porlos sicarios «académicos» del «procesouniformado».

Al consolidar mi interés por el estudio en losniveles embrionarios, mi etapa post-doctoral fuedesarrollada en 1980-1982 en el Institutd’Embryologie Cellulaire et Moleculaire (CNRS etCollège de France) donde trabajé dirigido por JeanPaul Thiery y Nicole M. Le Douarin, en un modelodefinido de migración de células de la crestaneural, que ya no abandonaría. Vale recordar quela década de 1980 fue testigo de un enormeimpulso en los estudios de dos componentes clavesen el comportamiento dinámico de la célula: elcitoesqueleto y la matriz extracelular. Una felizcombinación entre los nuevos métodosbioquímico-moleculares, asociados con lainnovación de tecnologías en registro y análisis deimágenes, con el valioso apoyo de nuevascomputadoras de uso creciente en el laboratorio,permitieron realizar muchos avances durante esaetapa. En nuestro caso, realizamos una de lasprimeras contribuciones acerca del rol esencial deuna glicoproteína extracelular (fibronectina) en lamigración activa de la mencionada población decélulas embrionarias18, trabajo que luego fuedistinguido con uno de los «Premio Houssay»,instituído por el CONICET en 1987. Esos estudiosme permitieron completar una segunda Tesis deDoctorado en Biología del Desarrollo, presentadaen la Université de Paris-Nord (XIII).

En ese período mi experiencia humana crecióen varios sentidos, no sólo por la riqueza culturalde Europa y por el nivel científico del laboratorio,sino también porque la etapa final de mi sejourfrancés estuvo enmarcada por la Guerra deMalvinas. Experiencias «extrañas», si las hay, desdeque lo asimilado con mi familia a través de la radioy la televisión no se condecía en nada con lasnoticias venidas desde el país. Al final de miestadía, fui sorprendido con la invitación aquedarme en el laboratorio francés, a lo que tuveque responder: «Pardon Madame…, le agradezcoel ofrecimiento, pero nunca se me había pasadopor la cabeza tal posibilidad…». Lo cual eraestrictamente cierto. En general, los becarios demi generación salíamos del país para aprender, yqueríamos regresar para trabajar y enseñar. Luego,y por diversas circunstancias no siemprejustificadas, esa actitud cambió (para beneficio del«primer mundo»), ubicándose en la antípoda(«…emigrar para nunca más volver»).

A mi retorno al país, viví una de las experienciasmás contradictorias. A la amargura por la «perdidaguerra-ganada» y la consiguiente depresión de lasociedad, se contraponía el júbilo por la debacle yretirada del «régimen procesista». Una nueva etapase iniciaba con esperanzas descomunales y nuevos«exitismos»…, como generalmente lo concebimoslos argentinos, muchos de los cuales pasaron (sinescalas) de vitorear en la Plaza de Mayo al«recuperador» de las Islas a descubrir las «virtudesdemocráticas». La cultura, la ciencia y la tecnologíadel país, arrasada durante decenios, no tendría

Figura 1: Elementos de la transferencia de información. A: Comunicación sonora: La voz es receptada por el teléfono, laseñal sonora se transduce en señal eléctrica/electrónica y se transmite hasta el otro receptor, donde se transducenuevamente en señal sonora. B: Comunicación celular: Moléculas liberadas por una célula (señales), son reconocidaspor receptores específicos de la membrana de otra célula, que activan reacciones intracelulares (transducción)22, queterminan activando estructuras de moléculas efectoras (citoesqueleto) determinando una acción (movimiento celular).

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posibilidades de una pronta recuperación y, engeneral, tampoco existía mucha voluntad políticapara hacerlo, ni recursos genuinos para llevarlo acabo. La «excitación dispersante» de esa etapa,junto con la falta de una infraestructura adecuaday los esfuerzos escasamente recompensados(¿reconocidos?) hicieron que, en mi ásperareinserción al país, los ideales de muchosexperimentos por hacer, chocara con lasdificultades de poder implementarlos…, había queempezar todo desde cero!!!

Y resolví empezar desde el «cero absoluto»,aceptando el desafío que significaba hacerme cargode la posición de Profesor Titular ganada porconcurso en la Escuela de Biología de la Facultadde Ciencias Exactas, Físicas y Naturales de la UNCba.Un duro desafío y también una dura experiencia,no siempre por causas académicas. Sin embargo,el sentimiento de respaldo moral por parte dealgunos profesores y académicos, la inversión demucho esfuerzo y el apoyo incondicional de mifamilia, posibilitaron superar (casi) todos losconflictos. Luego del tiempo transcurrido, losresultados globales podrían ser consideradosaceptables. La propuesta, fundamento, defensa ycreación de nuevas asignaturas del plan de estudios(Biología Celular y Biología del Desarrollo Animal),la dirección de las primeras Tesinas y Tesis deDoctorado en esas áreas de las Ciencias Biológicas,el montaje de laboratorios con apoyo institucionalexterno, la creación del Centro de Biología Celulary Molecular albergando a tres grupos deinvestigación independientes e integrados en lamisma Cátedra, el traslado del Centro a un nuevoEdificio de Investigaciones Biológicas yTecnológicas, y una activa formación de recursoshumanos en niveles de grado y post-grado encolaboración con instituciones extranjeras.

Nuestro trabajo en el presente

Actualmente, en el grupo de investigación bajomi dirección tratamos de conocer los factorescelulares y moleculares que participan en laregulación de la movilización celular orientadahacia sitios específicos del embrión, bajo diferentescondiciones normales, experimentales ypatológicas in vivo e in vitro.

Nuestros trabajos se enfocan en el mecanismode migración orientada por quimiotaxis de lascélulas de la cresta neural (CCN) (figura 2). Tambiénestudiamos sus posibles alteraciones en el marcode las anomalías inducidas por exposición aletanol en condiciones equivalentes al SindromeFetal Alcohólico.

Trabajamos en un modelo biológico/experimental de embrión de pollo(*), estudiandola población de CCN del nivel mesencefálico que,durante el desarrollo temprano, migran hacia el

Figura 2: Elementos de la comunicación celular involucrados en la respuesta migratoria de las células de la cresta neural(CCN) orientada por quimiotaxis (comparar con figura 1). Las señales moleculares (bajo la forma de un gradiente deconcentración) son reconocidas por receptores de la membrana celular, que desencadenan una cascada de señalescitoplasmáticas, cuyo efector final o citoesqueleto modifica la forma y la migración de la célula orientándola enrelación al gradiente (flecha negra).

Hipótesis de trabajo

En el organismo animal, un mecanismo dedistribución celular específica se basa en lacapacidad de la célula para reconocer un

gradiente de concentración extracelular demoléculas difusibles liberadas por una región«blanco», lo que desencadena una respuesta

migratoria activa de (re-)orientación enrelación topológica con el gradiente. Es decir,

un desplazamiento celular direccionalmediante el mecanismo de quimiotaxis.

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extremo cefálico y, en particular, hacia lalocalización retro-ocular del futuro ganglio ciliar,al cual dan origen tanto en sus poblacionesneuronales como gliales. Nuestra hipótesis detrabajo establece que las CCN migran orientadaspor un gradiente de moléculas difusibles liberadaspor la región ocular (figura 3).

En los experimentos in vitro, los cultivos de CCNson colocados en una cámara de quimiotaxis29,ubicada en un microscopio con control detemperatura, donde se exponen a un gradiente deconcentración de moléculas difusibles y seregistran las trayectorias celulares mediantevideo-microscopía durante varias horas, para serposteriormente analizadas con un programacomputarizado (figura 4).

Además de parámetros morfométricos(tamaño, forma celular) y dinámicos (distancia,velocidad), evaluamos los siguientes parámetrosquimiotácticos: 1) Porcentaje de células queremontan el gradiente. 2) Porcentaje de célulasque remontan el gradiente en un ángulo acotado.3) Promedio de la distancia neta hacia el gradiente.4) Índice quimiotáctico: cociente entre la distancianeta remontando el gradiente y la distancia totalrecorrida. 5) Promedio del ángulo de giro («turning

angle»): en base a la transformación arco-tangentede la pendiente entre puntos inicial y final delrecorrido. 6) Porcentaje de células con trayectoriasde giro positivas, negativas o no orientadas.

En síntesis, en un sistema in vitro, obtenemosdatos cuantitativos que nos informan sobre ladireccionalidad de la migración celular cuando lasCCN son expuestas a moléculas quimiotácticas, enexperimentos que tratan de imitar la situaciónnatural que suponemos ocurre en el embriónentero.

Utilizando este sistema, hemos demostrado lacapacidad quimiotáctica de la quimioquinaStromal cell-Derived Factor-1 (SDF-1) (figura 5) yde los factores tróficos Stem Cell Factor (SCF) yNeurotrophin-3 (NT-3) (figura 6). Esto significa unafuerte presunción de que estas moléculas, quecumplen importantes funciones en el sistemanervioso y el sistema inmune, también podríanparticipar en la orientación de la poblaciónembrionaria de CCN. En el caso del factor NT-3,

Figura 3: Esquema de la región cefálica de embrión depollo en etapa temprana del desarrollo, mostrando lascélulas de la cresta neural (CCN) del nivel mesencefálico(MB = cerebro medio) y rombencefálico anterior (r1, r2 =cerebro posterior), en etapa de migración hacia la regiónocular (VO), para formar el ganglio ciliar. A la derecha seseñala el hipotético gradiente de concentración demoléculas difusibles que induciría la migraciónquimiotáctica de las CCN hacia la región ocular. FB = cerebroanterior. OV = esbozo del oído.

Figura 4: Cámara de quimiotaxis (A: sección transversal yB: vista superior) en un sistema de video-microscopía.Un gradiente de concentración se forma entre elcubreobjetos y el tabique (T) que separa los doscompartimientos (c1, c2). Abajo, proyección de un campoóptico a nivel del tabique en un sistema de coordenadasXY, con el lado derecho hacia el origen delquimioatractante (o medio de cultivo = control). Se indicauna trayectoria celular con el punto de partida en elorigen (0,0) del sistema XY y el punto final en un área delocalización de células que responden al atractante. Elcociente X/Y>1 representa los parámetrosquimiotácticos4 y 13.

(*) El uso de modelos animales en la experimentación biológica esnecesario, usual y válido, toda vez que la mayor parte de lascaracterísticas celulares, moleculares y de regulación son similaresy en muchos casos equivalentes en las diferentes especies, incluidoel ser humano.

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también demostramos que la molécula ejerce suacción mediante los receptores celulares TrkC y p75(figura 6)6, 7, 8, 17, 19, 26, 27 y 28.

En el mismo sistema, luego de exponer a las célulasa una concentración de etanol suficiente para producirel Sindrome Fetal Alcohólico en mamíferos,observamos alteraciones irreversibles en lamorfología, la estructura y comportamiento migratoriode las CCN in vivo e in vitro14, 15, 16 y 8. Asimismo,demostramos que en estas condiciones, se produceun bloqueo específico de la quimiotaxis de CCNinducida con SDF-1 (figura 7)21. Estos resultados,permitirán profundizar en el estudio del mecanismode producción de una anomalía del desarrolloembrionario de mucha significación para la especiehumana y, eventualmente, diseñar estrategias para sudiagnóstico temprano, o herramientas terapéuticaspara su tratamiento o prevención.

Los estudios de localización de estasmoléculas en el embrión in vivo, nospermitieron observar la expresión de SDF-1 yNT-3 en las regiones «blanco» de las CCNcefálicas (figura 8)23 y 24. La presencia de lasmoléculas con actividad quimiotáctica en elorganismo entero es un fuerte respaldo anuestra hipótesis de trabajo, y conforma lasbases para el diseño de los próximosexperimentos (ver más adelante).

Los resultados obtenidos hasta ahora,tomados en conjunto, nos indican que variasmoléculas que son conocidas como señalesmoleculares difusibles poseen actividadquimiotáctica para la orientación de las CCN invitro. Además, mostramos algunos aspectos desu mecanismo de acción, tales como losreceptores específicos mediante los cuales lascélulas reconocen a esas moléculas, y algunoscomponentes de la cadena de señalesresponsables de su acción. Tambiénmostramos, en experimentos in vivo, que esasmoléculas-señales son sintetizadas y liberadasal ambiente extracelular en las regionescolonizadas (invadidas) por las CCN en etapastempranas del desarrollo, donde formaránparte de sus importantes derivados (por ej., elganglio ciliar).

Para continuar este trabajo, una etapanecesaria es la comprobación de los resultadosde quimiotaxis obtenidos en sistemas in vitro,en un sistema in vivo de embrión entero. Paraello, estamos ajustando los métodos para

Figura 5: Quimiotaxis de las células de la crestaneural (CCN) estimuladas por un gradiente deconcentración de quimioquina (SDF-1). En todos loscasos el atractante (SDF-1) se representa a laderecha del gráfico.

A: En este gráfico las barras celestes expresan lamagnitud del índice quimiotáctico con diferentesconcentraciones de SDF-1. La zona derecha delgráfico representa atracción mientras que laizquierda representa repulsión. Las concentracionesde 300 y 400 ng/ml resultaron ser quimiotácticascomparadas con el tratamiento control (sin SDF-1).Las barras señaladas con el símbolo (*) resultaronestadísticamente diferentes al control (P<0.001).

B: En este gráfico los segmentos rectos expresan ladistancia lineal recorrida y la orientación de lastrayectorias celulares de un experimento donde lascélulas de la cresta neural (CCN) fueron estimuladascon un gradiente de concentración formado a partirde 300 ng/ml de SDF-1. En el gráfico, el gradiente deconcentración de SDF-1 está representado por eltriángulo verde, disminuyendo la concentración dederecha a izquierda. Puede verse como lastrayectorias indican que la mayoría de las célulasmigraron selectivamente hacia la fuente de SDF-1.

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producir el bloqueo funcional de las moléculasinvolucradas en la respuesta quimiotáctica(ligandos y receptores). Esto se hará medianteexperimentos en tres etapas consecutivas, que sepueden resumir de la siguiente manera:

(1) Microinyecciones en la región de expresiónde las moléculas quimiotácticas (o de susreceptores) en embriones enteros mantenidos encultivo (figura 8). El propósito de este paso esadministrar moléculas que produzcan el bloqueoo neutralización de la actividad quimiotáctica(anticuerpos específicos, o siRNA para «silenciar»el mRNA, o morfolinos para bloquear el DNA).

(2) Electroporación. En este paso se hacen pasarmicro-pulsos de corriente eléctrica en la vecindadde la zona donde se hizo la microinyección, con locual se logra que las moléculas bloqueantes oneutralizantes administradas, penetren en lascélulas de la región «blanco» que sintetizan yliberan las moléculas quimiotácticas. El propósitoes bloquear la síntesis y/o liberación de esasmoléculas.

(3) Determinación de la distribución de las CCN.Se realiza mediante «marcadores» específicos, esdecir, moléculas o «sondas» que marcanexclusivamente las CCN. Con esto se evalúa si elbloqueo funcional de las moléculas quimiotácticasen el embrión entero, afecta la capacidad demigración orientada de las CCN in vivo y la invasiónde las regiones «blanco».

(4) Controles: Como en todos los experimentosbiológicos, es necesario realizar muchos«controles». Por ejemplo, microinyección demoléculas no-quimiotácticas, maniobras deelectroporación pero sin paso de corrienteeléctrica, etc. Considerando nuestro sistemaexperimental, en donde las CCN migran por igualhacia ambos lados de la línea media (tubo neural),uno de los controles importantes resulta deefectuar la microinyección y electroporaciónsolamente en uno de los dos lados, manteniendoel otro sin tratamiento (control).

Además del bloqueo funcional, se haránexperimentos a fin de inducir ganancia de funciónpor (sobre-)expresión de DNA en embriones

Figura 7: En la segunda columna se muestra larespuesta quimiotáctica de las células de lacresta neural (CCN) a la quimioquina SDF-1 yen la columna debajo de esta se ve como estarespuesta es bloqueada luego de la exposicióna etanol en concentraciones teratógenas (vercolumna señalada con flecha verde claro). Entodos los casos el atractante (SDF-1) serepresenta a la derecha del gráfico y las barrasexpresan la magnitud del índice quimiotácticocon diferentes concentraciones de SDF-1, con ysin exposición a etanol.

Figura 6: Quimiotaxis de CCN estimuladas porun gradiente de concentración de NT3. En todoslos casos la fuente del atractante (NT3) serepresenta a la derecha del gráfico y laconcentración disminuye de derecha aizquierda. Las barras horizontales verdesexpresan la magnitud del índice quimiotácticocon diferentes concentraciones de NT3. Laconcentración de 40 ng/ml resultóquimiotáctica (*) y es estadísticamentediferente del control (sin NT3). En algunostratamientos se bloquearon los receptores deNT3. Para ello se agregó K252 que bloquea elreceptor TrKs y REX que bloquea el receptor p75.Se puede observar en las dos columnassuperiores que cuando se bloquearon losreceptores celulares las células no migraron.

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enteros. Estos experimentos constituyen«controles» en si mismos, y tienen el propósito derestaurar la expresión de moléculas previamentebloqueadas, así como también inducir (provocar)la expresión de moléculas quimiotácticas en sitiosectópicos (o sea, regiones normalmente nocolonizadas por las CCN).

Tanto los experimentos de bloqueofuncional como de (sobre-)expresión in vivopodrán inducir un nivel puntual de disecciónmolecular que permita orientar los resultadoshacia transferencias potencialmente aplicables anuevas tecnologías de diagnóstico, prevención oterapéutica de numerosas patologías por «maladistribución celular», como las Neurocristopatías9

o el Sindrome Fetal Alcohólico12, etc.

Reflexión final

El avance de las tecnologías disponibles en laactualidad posee límites difíciles de imaginar, loque nos puede llevar al error de creer que larespuesta a casi todos los interrogantes está a lavuelta de la esquina. Hoy existe una enormebatería metodológica, cuyo acceso pareciera estarlimitado sólo por el aspecto financiero. Sinembargo, los jóvenes docentes e investigadoresen formación deben advertir el peligro deconfundir el camino con la meta. Porque, siguesiendo cierto que la disponibilidad de un arsenalde técnicas no reemplaza una pregunta bienformulada, y un novedoso instrumental nosustituye una idea clara o una interpretación bienencaminada.

Figura 8: Región cefálica deembrión de pollo con 46 horasde incubación (comparar conla Fig. 3).

A: Inmunolocalización de lascélulas de la cresta neural(CCN) (zonas blancas) quemigran hacia la región oculary se acumulan en la vesículaóptica (VO) (comparar con B).

B: Las zonas de color azuloscuro dentro de los óvalosson las regiones de expresiónde mRNA de NT-3. Estosiginifica que la«maquinaria» celular de esaregión sintetizaría la proteínaSDF-1.

P=Prosencéfalo.M=Mesencéfalo. VO=Vesículaóptica.

ADENDA: A continuación de este artículo, el Dr.Roberto Rovasio hace una revisión histórica de las

investigaciones y descubrimientos relacionados conla comunicación entre células.

El Dr. Roberto Rovasio junto aa los integrantes del «Grupode motilidad de célulasembrionarias» que él dirige.

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Revisión Histórica de la Investigación en Comunicación CelularRevisión Histórica de la Investigación en Comunicación CelularRevisión Histórica de la Investigación en Comunicación CelularRevisión Histórica de la Investigación en Comunicación CelularRevisión Histórica de la Investigación en Comunicación Celular

n concepto importante que el biólogodebe saber transmitir es el de laconstrucción del conocimiento. Esbastante común que los docentes

jóvenes (y no tanto…) tengan la idea de que lo queenseñan a sus alumnos se conoce desde unos pocosaños atrás, sin percatarse de que la mayor parte delos conocimientos que transmitimos o recibimosen aulas y laboratorios de cualquier parte delmundo, no se descubrieron ayer, ni surgieron porgeneración espontánea.

Para esta revisión, hemos seleccionado unospocos ejemplos que, como veremos al final,poseen un denominador común que comparte latemática de la línea de investigación quedesarrollamos en nuestro laboratorio.Globalmente, los antecedentes antiguos serán«encadenados» con referencias a trabajosrecientes de los que fueron antecedentes.

Desde las llamadas «etapas iniciales» delconocimiento biológico, época comprendidadesde la remota antigüedad hasta la Edad Media-no menos de 2.000 años-, las creencias, mitos,leyendas y fantasías se fueron acumulando juntocon algunos registros y las primeras descripcionessobre el posible origen y desarrollo de losorganismos vivos. Para una muestra tardía, bastarecordar los trabajos biológicos de Leonardo DaVinci (figura 9).

En el período siguiente, que podríamosconsiderar como «etapas preparatorias»,extendido hasta mediado del siglo XIX -unos 400años-, se esbozaron los conceptos del denominadoMétodo Científico, también fueron inventados losprimeros instrumentos que ayudarían a indagar

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sobre la forma, función y desarrollo biológico, seesbozó la primera descripción de la célula ytuvieron lugar poderosas disputas como la de«ovistas» y «animaculistas» («teoría delhomúnculo») (figura 10), o entre «generaciónespontánea» y «microbios». Como si eso fuerapoco, en la misma época se descubrió lapartenogénesis en algunas especies, lo quecontribuyó a enturbiar las disputas sobre el origende los nuevos individuos. Y…, hablando deorígenes, fue también en esa etapa cuando CharlesDarwin dio a conocer sus históricos conceptos sobrela evolución, Gregor Mendel inició el camino de lagenética y Friedrich Miescher descubrió el ADN.Dicho sea de paso, los personajes mencionadosnunca se conocieron, como tampoco sabían de susrespectivos trabajos, y aunque lo hubieran hecho,probablemente no los hubieran relacionado consus propias concepciones biológicas.

Figura 9: Estudios sobre el feto y sus anexos. LeonardoDa Vinci (1452-1519).

Teoría Celular

«Todos los seres vivos están formadospor células».

«La célula es la unidad estructural yfuncional de los seres vivos».

«Toda célula deriva de otra célula».

Figura 10: Elhomúnculo.Nicolaus Hartsoeker(1656-1725).

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Un aporte fundamental de este período fue laTeoría Celular, propuesta por Theodor Schwann,Matthias Schleiden y Rudolf Virchow a mediadosdel siglo XIX, ya que proporcionó las bases paraformular muchas preguntas que continúanvigentes hasta la actualidad.

¿De qué manera se distribuyen las células enun organismo?¿Por qué las células de un mismo órgano sontan parecidas?¿Se reconocen las células entre sí?¿Cómo «saben» repartirse en un organismo?¿Cómo se orientan hacia una regióndeterminada?¿Existen señales direccionales para la célula?¿Cómo distinguen las células sus potenciales«guías»?¿De qué forma reconocen su sitio «blanco» osu destino final?¿En qué consiste el sistema de«posicionamiento» celular?Y…, finalmente, como motivación de estosinterrogantes:¿Qué relación existe entre la perturbación delos mecanismos responsables de estosfenómenos biológicos y la producción deanomalías embrionarias y patologíastumorales?

Muchas respuestas comenzaron a ser esbozadasen lo que podríamos denominar «etapasexperimentales», que es cuando se producendescubrimientos a un ritmo vertiginoso desde lossiglos XIX y XX hasta la actualidad.

Esta rápida evolución en la creación delconocimiento fue la consecuencia natural de uncamino que se inició con enfoques descriptivos,comparados y taxonómicos, aportando conceptosbásicos muy importantes. Sin embargo, con eltiempo, estas orientaciones se revelaroninsuficientes para explicar la participación defactores causales en los procesos biológicos. Conesta inquietud de base y el desarrollo de adecuadasmetodologías se pudo acceder a los enfoquesexperimentales que permitieron agregar a ladescripción estructural, el reconocimiento demodificaciones funcionales y dinámicas de laspoblaciones celulares y, en muchos casos, comenzóa visualizarse y a comprenderse el mecanismo dela regulación de esos procesos a nivel molecular.Veamos algunos ejemplos claves en la evolucióndel conocimiento biológico.

A comienzos del siglo XX, cuando recién seconsolidaba la Teoría Celular, había tres modelospara explicar el origen del axón. El modelo de lacadena celular propuesto por Schwann, el modelodel plasmodesmo propuesto por Viktor Hensen, yel modelo del crecimiento neurítico propuesto por

Friedrich Bidder y Karl Wilhelm von Kupffer,fuertemente apoyado por Wilhelm His y porSantiago Ramón y Cajal. En 1907, en un estudiopionero de la biología experimental, Ross G.Harrison tomó un pequeño trozo de tejido neuralembrionario, lo colocó en una gota de linfacoagulada, y observó que el protoplasma de lascélulas neurales extendía una prolongación (figura11).

Figura 11: Experimento de R. G. Harrison (imagen del trabajooriginal, J.Exp.Zool. 9:787-848, 1910). Las flechas señalan elavance del cono de crecimiento axónico en tres dibujossucesivos del mismo cultivo celular.

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Figura 12: Experimento de Hans Spemann (imagen del trabajo original, Wilhelm Roux´Arch. Entwicklungsmech.Organ. 100:599-638, 1924). Las flechas señalan el tubo neural supernumerario inducido por el transplante de notocorda (N) en unsitio ectópico.

Este experimento demostró la validez delmodelo de crecimiento neurítico y confirmó a laneurona como unidad estructural, funcional y deldesarrollo del sistema nervioso, a la vez que definióla aplicación y utilidad del método de cultivo celularin vitro en diversos campos de la biología. Laimportante contribución de Harrison, derivó en losrecientes avances en el conocimiento de laregulación molecular del crecimiento y desarrollode las prolongaciones neurales, así como de losfactores que participan en la diferenciación dedendritas y axones2 y en la orientación direccionalde estos últimos hacia sus órganos «blanco»10.

Otra idea asociada al título de este artículo, fueintroducida por C. M. Child en 1914, con el conceptode gradientes embrionarios, que apuntó a explicarlos patrones generales de la morfogénesisembrionaria. Pero recién en la década de 1990, doscorrientes experimentales con fuertes basesmoleculares comenzaron a aplicar este conceptoen importantes fenómenos biológicos: (1) Elgradiente endógeno de ácido retinoico que modulala expresión de los genes Hox y con ello eldesarrollo del eje antero-posterior y de losmiembros11, y (2) La precisa orientación de la

migración de células y de prolongaciones celulares(axón) hacia sus regiones «blanco» siguiendo ungradiente endógeno de moléculas difusiblesmediante el mecanismo quimiotáctico (verdetalles más adelante)10.

Asimismo, el concepto de gradientesendógenos de factores difusibles, se asoció conlos trabajos de H. Spemann de 1924 sobre el centroorganizador y el concepto de inducción que, conmodificaciones y profundización posteriores, aúnse sostienen para explicar las bases de los procesosde determinación y diferenciación celular5. Lainducción embrionaria de la notocorda sobre electodermo, con la consiguiente formación de laplaca neural, fue demostrada por Spemannmediante un ingenioso experimento (figura 12).

La respuesta a las preguntas formuladas másarriba sobre la capacidad de reconocimiento celulartiene su origen en el estudio de «afinidades» y«tropismos» desarrollados hacia 1939 por J.Holtfreter. Sus trabajos permitieron empezar acomprender la organización armónica de las célulasdurante el desarrollo de los organismos (figura 13).Además, fueron fundamentales para el posterior

Figura 13: Experimento de Johannes Holtfreter (imagen del trabajo original, Archiv.fur experim.Zellforch. 23: 169-209, 1939).La reorganización in vitro de células aisladas de ectodermo (Ec) y endodermo (En) reproduce una estructura con el Ec haciael exterior. Si se agregan células mesodérmicas (Ms) a la suspensión celular, la resultante es una estructura con el Msdispuesto en una capa intermedia. En todos los casos la afinidad celular se reproduce in vitro, con el Ms laxo y el Encavitado, de manera semejante a la estructura y topografía embrionaria normal.

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conocimiento de las bases moleculares delreconocimiento, unión específica y organización delas células embrionarias3.

La acción de factores difusibles, además de sercentral en el crecimiento de neuritas, la induccióny el reconocimiento celular -como hemos visto-,también constituyen señales para desencadenarla apoptosis (o muerte celular programada), ladiferenciación y, como veremos más adelante, lamigración direccional de poblaciones celularesembrionarias y maduras. Dentro de estos factoresdifusibles, un capítulo de especial importancia loconstituye el descubrimiento y la identificación delos factores tróficos o factores de crecimiento, quese iniciaron con los trabajos de Rita Levi-Montalciniy Viktor Hamburger en la década de 1950, cuandoobservaron un gran incremento del tamaño y delnúmero de neuronas en tejidos embrionariosexpuestos a una fuente de moléculas difusiblesque posteriormente denominaron factor decrecimiento neural (Neural Growth Factor, NGF)(figura 14). Este, fue sólo el inicio deldescubrimiento de muchos factores tróficos quemostraron ser importantes reguladores de muchasfunciones celulares1.

Entre los conceptos más complejos queenfrentaron los Biólogos en su intento de analizarel desarrollo de los organismos, la teoría decampos embrionarios fue -como muchas ideasiniciales-, más descriptiva que analítica. Noobstante, se produjo un gran avance desde ladécada de 1970, cuando Lewis Wolpert bosquejóuna teoría para explicar cómo una célula «conoce»su posición en un patrón espacial25. Estos conceptosfueron precursores de un importante capítulo dela Biología teórica con sólida base experimental ydel uso de modelizaciones computarizadas quetratan de explicar, por ejemplo, cómo «sabe» lapunta de la nariz que tiene que crecer o dejar dehacerlo siguiendo un patrón espacio-temporaldefinido.

En síntesis, estos pocos ejemplos representantrabajos realizados para investigar los mecanismosque permiten a las células reconocerse entre sí,orientarse hacia zonas determinadas y distribuirsepara formar los diferentes órganos de un embrión,identificar «señales» o «guías» direccionales quelas orientan con precisión hacia regionesespecíficas (o regiones «blanco») como son unmúsculo, una glándula o un grupo de neuronas. Situviéramos que imaginar un denominador comúnpara estos temas -o para responder a las preguntasformuladas más arriba-, podríamos decir que entodos los casos hay una participación sustancial dela comunicación entre las células.

Para cerrar un vínculo con el primer párrafo deesta sección, podemos concluir que elconocimiento está formado por el conjunto deeslabones de una cadena que se fue alargando alo largo del tiempo, gracias a la voluntad, ladedicación, el empeño, la responsabilidad y la sanaobsesión de hombres y mujeres casi comunes...

Figura 14: A: Experimento deRita Levi-Montalcini, H. Meyery V. Hamburger (imagen deltrabajo original, Cancer Res. 14:49-57, 1954). Se observanprologaciones neurales (n)creciendo desde un explantode tejido neural (N) hacia untejido tumoral (flecha) quesintetiza y libera NGF. B:Imagen del trabajo deRutishauser y Edelman (1980)donde se observan neuritas (n)que crecen desde explantos detejido neural (N) hacia elextremo de una micropipetaque contiene NGF puro(flecha)20.

Comunicación Celular a Distancia

Fenómeno biológico basado en elreconocimiento de una señal externa a lacélula (ligando), por una molécula de su

superficie (receptor), desde donde se activancascadas de señales intracelulares que, al

llegar a un destino específico (efector),induce un comportamiento biológico en la

célula.

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Animaculistas: Los que apoyaban la idea de quesólo el espermatozoide era importante para laformación de un nuevo individuo.

Bloqueo funcional: Tratamiento molecular con lafinalidad de suprimir una función de la célula uorganismo.

Cadena celular: Antigua teoría que sostenía queel tejido nervioso estaba formado por células unidasunas con otras.

Cascada de señales: Reacciones de activación/inhibición entre pequeñas moléculas de la célula,que determinan y/o regulan sus diferentesfunciones.

Células de la cresta neural: Población celulartemporaria de embriones de vertebrados, quemigra por vías definidas y dan origen a múltiplesderivados (sistema nervioso periférico, célulaspigmentarias, macizo cráneo-facial, etc.).

Centro organizador: Sitio del embrión (blastoporoo nódulo de Hensen) que en una etapa tempranatiene la capacidad potencial para regular sudesarrollo.

Citoesqueleto: Moléculas del citoplasma quedeterminan y regulan los cambios de forma y losmovimientos de la célula.

Crecimiento neurítico: Teoría que sostiene laformación de las prolongaciones de la neurona(neuritas) por expansión localizada y crecimientode su citoplasma.

Explanto: Trozo pequeño de tejido extraídoquirúrgicamente de un organismo entero y utilizadopara iniciar un cultivo de células o tejidos encondiciones in vitro.

Factor trófico (o de crecimiento): Moléculas confunciones de activación de la proliferación celular yregulación de la viabilidad o sobrevida de la célula.

Ganancia de función: Tratamiento molecular porel cual se induce una función celular previamentebaja o inexistente.

Genes Hox: Familia de genes que regulan ladeterminación de los ejes del cuerpo embrionario.

Homúnculo: Antigua creencia de que en cadaespermatozoide estaba formado (en miniatura) elcuerpo completo de un nuevo individuo.

Índice quimiotáctico: expresa la distanciaeficiente recorrida por la célula hacia el atractante.Se calcula como el cociente entre la distancia netadel recorrido celular paralelo al gradiente (eje X),dividido por la distancia total recorrida (o distanciacurvilinear). Para células que responden a unestímulo direccional quimiotáctico, el valor seacerca al del recorrido en línea recta, tendiendo a«1», mientras que en células que se mueven al azar,el valor tiende a «0».

Inducción: Actividad celular mediante la cualmolécula(s) de una célula ejerce(n) influencia sobreotra(s) determinando sobre éstas el inicio oregulación de una nueva función.

Inmunolocalización: Método para demostrar lapresencia o expresión de diversas moléculasutilizando anticuerpos específicos como«marcadores».

Ligando: Molécula o ion que se une a otra con ciertaespecificidad (por ej., unión ligando-receptor).

Matriz extracelular: Moléculas intercelulares conimportantes funciones estructurales y reguladorasde la célula.

Mensajeros: Moléculas «señales» que se activansecuencialmente (cascada de señales) y determinanuna función celular o el inicio de la síntesis de una omás moléculas.

Morfogénesis: Conjunto de cambios de la etapaembrionario-fetal, que conducen a la formación deun nuevo individuo.

Morfolino: Molécula que bloquea la función deuno o más genes, suprimiendo su expresión yfunción.

Neurita: Prolongación de la neurona aún nodiferenciada como dendrita o axón.

Neurocristopatías: Grupo de patologías diversas(embriopatologías, enfermedades congénitas ytumorales) de patogenia poco conocida y queasientan en tejidos derivados de las células de lacresta neural.

Ovistas: Los que apoyaban la idea de que sólo elovocito era importante para la formación de unnuevo individuo.

Partenogénesis: Forma de reproducción sinparticipación espermática, presente en ciertosinvertebrados.

Plasmodesmo: Antigua teoría que sostenía que eltejido nervioso estaba formado por una masaprotoplásmica continua, sin individualización decélulas neurales.

Quimioquina: Familia de pequeñas moléculas conactividad quimiotáctica para diferentes poblacionescelulares embrionarias o adultas.

Quimiotaxis: Mecanismo de orientación de lamotilidad celular basado en el reconocimiento deun gradiente de concentración de moléculasextracelulares solubles.

Receptores: Moléculas de la membrana ocitoplasma celular, que «reconocen»específicamente a otras moléculas (ligandos), einician una reacción en cadena que culmina en laexpresión de una propiedad o función celular.

Silenciamiento del mRNA (siRNA): Bloqueo de laexpresión de un segmento de mRNA mediantepequeñas secuencias de RNA inhibidor (iRNA), conel propósito de suprimir la expresión de una proteínay/o su función.

Sindrome Fetal Alcohólico: Patología congénitaproducida por exposición al alcohol durante eldesarrollo embrionario-fetal, debido a la ingestamaterna.

Teratógeno: Agente físico (radiaciones), químico(alcohol, tóxicos) o biológico (bacterias, virus) concapacidad para producir anomalías embrionario-fetales durante el desarrollo prenatal.

Transducción: Conversión de una señal en otraseñal de tipo diferente (sonora en eléctrica,analógica en digital, iónica en eléctrica, iónica enmecánica, mecánica en eléctrica, etc.).

GLOSARIO

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BIBLIOGRAFÍA

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