猪瘟病毒流行毒株遗传演化分析与免疫对策...diagram (c):a (a). piglets of group a...

吴家强博士

山东省农业科学院畜牧兽医研究所

山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室

2016年10月18日南京

猪瘟病毒流行毒株遗传演化分析

与免疫对策

http://www.sdxms.com/index.asp

汇报提纲

♦ 猪瘟与猪瘟病毒概况

♦ 近年猪瘟检测与分析

♦ 猪瘟病毒遗传进化分析

♦ 猪瘟病毒2.1d亚型免疫攻毒试验

♦ 猪瘟免疫对策

一、猪瘟与猪瘟病毒概况

1、猪瘟（CFS）

OIE规定的A类烈性传染病

不同品种、日龄的家猪或野猪均易感

可分为最急性、急性、慢性、温和型四种

C株疫苗广泛应用，典型猪瘟较为少见，症状与

病变亦不甚典型，易误诊。


猪瘟临床图片

未免疫猪瘟疫苗的发病猪，外观看皮肤苍白、贫血，皮肤上有大量紫色点状出血斑。

慢性猪瘟：耳朵皮肤坏死


猪瘟临床图片

急性猪瘟：肠道粘膜大量出血点慢性猪瘟：大肠粘膜纽扣装溃疡


猪瘟临床图片

典型猪瘟：喉头粘膜和扁桃体出血典型猪瘟：脾脏边缘出血性梗死


猪瘟临床图片

猪瘟：淋巴结出血，呈大理石状猪瘟：怀孕母猪流产、死胎


2、猪瘟病毒（CFSV）

属于黄病毒科、瘟病毒属，单股正链RNA

与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）有共同的抗原

基因组长约12.3kb，含有1个ORF,产生4个结构蛋白

和7个非结构蛋白，其中E2是重要的免疫蛋白。

可分为3个基因型（1型，2型和3型），11个基因亚

型（1.1～1.4；2.1～2.3；3.1～3.4）

二、近年山东地区猪瘟检测与分析

1000头母猪以上

500头母猪左右

猪瘟检测样品采集分布图

年份 2013年 2014年 2015年 2016上半年合计

样品数 516 624 690 804 2634

阳性数 73 161 87 100 421

阳性率 14.15% 25.80% 12.61% 12.44% 15.98%

1、2013-2016年猪瘟抗原检测结果


近四年检测临床病料样品2634份，其中猪瘟抗原阳性样品421份，

平均抗原阳性率为15.98%

2014年猪瘟抗原阳性率达25.80%，显著高于近四年的平均水平，

提示山东地区2014年猪瘟病毒发生了一定程度的变异和流行

年份 2013年 2014年 2015年 2016上半年合计

样品数 1924 1710 2899 3469 10002

阳性数 1082 1067 2074 2738 6961

阳性率 56.24% 62.40% 71.54% 78.93% 69.60%

2、2013-2016年猪瘟抗体检测结果


近四年检测血清样品10002份，其中猪瘟抗体阳性样品6961份，

平均抗体阳性率为69.60%

近四年猪瘟的抗体水平呈逐渐上升趋势，其中2015年和2016年的

猪瘟抗体阳性率均达到群体免疫合格水平（70%）以上

三、猪瘟病毒遗传进化分析

1、病毒分离测序：2014-2016年共分离、鉴定28株猪瘟病

毒，并对病毒的E2基因进行测序分析：

2014年：10株，其中8株为2.1b，2株为2.1d亚型（20%）；

2015年：10株，其中1株为2.1b，9株为2.1d亚型（90%）；

2016年： 8株，全部为2.1d亚型（100%）。

PCR扩增E2基因结果 M道为DL2000 plus Maker，1道为阳性对照，

2-19道为阳性结果，20道为阴性对照。

2、猪瘟病毒遗传进化分析

2、猪瘟病毒遗传进化分析（参考）

Isolation and Characterization of a Moderately Virulent Classical Swine Fever Virus Emerging in China ——Y. Luo 1,† , S. Ji 1,2† , Y. Liu 1,† , J.-L. Lei 1 , S.-L. Xia 1 , Y. Wang 1 , M.-L. Du 1 , L. Shao 1 , X.-Y. Meng 1 , M. Zhou 1 , Y. Sun 1 and H.-J. Qiu Transboundary and Emerging Diseases May 27, 2016

2、猪瘟病毒遗传进化分析

猪瘟病毒SDZP01-2015株(2.1d亚型) 与其他基因亚型毒株的同源性比较

毒株

基因亚型

HCLV Shimen SXCDK HEBZ HNSD JSZL LAL290 Borken TWN

1.1 1.1 2.1a 2.1b 2.1c 2.1d 2.2 2.3 3.4

基因组核苷酸 84.4 84.9 92.8 95.6 91.8 97.5 87.3 88.8 83.4

E2蛋白核苷酸 82.3 84.2 91.8 96.2 90.6 98.2 86.5 86.6 82.9

E2蛋白氨基酸 89.8 91.2 94.9 97.3 95.7 99.5 92 92.5 90.3

E2蛋白主要氨基酸位点突变

aa 31 34 40 45 47 49 56 72 88 1.1 K S N K S V T K/G N

2.1b E/G N D R I T I R S 2.1d R S D R I T I R S

3、猪瘟病毒遗传进化小结与推测

猪瘟病毒2.1d亚型已经替代2.1b亚型，成为当前猪群新

的猪瘟流行毒株；

与1.1亚型的猪瘟兔化弱毒疫苗毒株相比，2.1d亚型序列

发生了很大程度的变异，其中E2蛋白的核苷酸同源性为82%,

氨基酸序列同源性不足90%；

2.1d亚型正朝着远离猪瘟兔化弱毒疫苗的方向进化，那

么当前疫苗是否还能够有效保护2.1d亚型的攻击？

四、猪瘟病毒2.1d亚型免疫攻毒试验

1、病毒-血清中和试验：采用抗疫苗毒株的血清，分别中和HCLV疫苗株和SDZP01-2015株，在PK-15细胞上测定，中和抗体效价分别为1:256和1:16，差异极显著。

HCLV疫苗株（1.1亚型）

SDZP01-2015 （2.1d亚型）


1、病毒-血清中和试验(参考）

——Y. Sun 1 and H.-J. Qiu et al. Transboundary and Emerging Diseases, 2016


2、猪瘟疫苗对2.1d亚型的交叉保护试验设计

组别 A组 B组 C组

第一天疫苗稀释150倍注射1ml，相当于2 RID

注射1ml DMEM, 0 RID

疫苗稀释150倍注射1ml，相当于2 RID

免疫后0、7、14、21、28天采血检测抗体消长规律

第十五天肌注105TCID50的SDZP01-2015病毒2ml

攻毒后0、3、6、9、12、15天采血检测病毒血症持续时间

第三十天剖检

注：1）猪瘟脾淋苗购自国内某疫苗厂家，含量为300 RID/头份；

2）政府采购猪瘟活疫苗（脾淋源）质量标准中的效力试验规定：每头份猪

瘟脾淋疫苗作1:150稀释，免疫无猪瘟中和抗体的健康仔猪，用强毒株攻毒，免

疫仔猪全部健活（或稍有体温反应，但无猪瘟临床症状）为合格。


A B C

D E F

Extended scoring systems for clinical symptoms and pathology were used allowing the detailed characterization of the diseases and lesions (Everett et al., 2010).

3、SDZP01-2015分离株致病性


3、猪瘟病毒2.1d亚型的致病性（参考）

——Y. Sun 1 and H.-J. Qiu et al. Transboundary and Emerging Diseases, 2016


4、猪瘟病毒抗体水平检测

Detetion of serum antibodies (B) in the immunized pigs using blocking ELISA. Animal challenge assay were carried on as shown in the schematic diagram. Piglets of group A and C vaccinated 2 RID50 HCLV vaccine, group B vaccinated equivalent DMEM, two weeks later, piglets in group A and B were inoculated intramuscularly (i.m.) with 105 TCID50 CSFV SDZP01-2015 strain, group C were inoculated DMEM as control. Serum samples were collected once a week for 5 weeks after HCLV vaccination and tested for the presence of the CSFV-specific Nabs (B), antibody levels >40% were taken as antibody positive.


5、猪瘟病毒血症检测

Detetion of viral RNA in the immunized pigs using RT-PCR separately. Animal challenge assay were carried on as shown in the schematic diagram (C):A (A). Piglets of group A and C vaccinated 2 RID50 HCLV vaccine, group B vaccinated equivalent DMEM, two weeks later, piglets in group A and B were inoculated intramuscularly (i.m.) with 105 TCID50 CSFV SDZP01-2015 strain, group C were inoculated DMEM as control. Serum samples were collected once a week for 5 weeks after HCLV vaccination and tested for the presence of the CSFV-specific Nabs (B). Serum samples were collected at 0-15 dpi after challenge with SDZP01-2015 and tested for viral RNA by qRT-PCR (C), the value in the table is 10X in the X value, “-” said did not detect the virus content.


6、猪瘟病毒组织病理学检测

Sple

en

In

guin

al

lym

ph n

ode

Kid

ney

DMEM+ SDZP01-2015

HCLV＋ DMEM

HCLV+ SDZP01-2015 (Diseased)

HCLV+ SDZP01-2015 (Healthy)

A1-1

A1-2

A1-3

A2-1

A2-2

A2-3

B-1

B-2

B-3

C-1

C-2

C-3

Pathological section of Inguinal lymph node, spleen and kidney of CSFV-challenge pigs, H&E stain, ×200. Piglets of group A and C vaccinated 2 RID50 HCLV vaccine, group B vaccinated equivalent DMEM, two weeks later, piglets in group A and B were inoculated intramuscularly (i.m.) with 105 TCID50 CSFV SDZP01-2015 strain, group C were inoculated DMEM as control. C: Health control B: Animal challenge control; the histological structure of the spleen was disordered and characterized by necrosis, hemorrhage, and depletion of lymphocytes (B-2, A1-2); The lymph nodes showed hemorrhagic necrotizing lymphadenitis with necrotic lymphocytes and hyperplastic reticular cells (B-1, A1-1); The glomerulus and mesenchyme were hemorrhagic (B-3); The histological examination showed that the pigs in Group A2 showed slight lesions (A2-1, A2-2, A2-3); There were no lesions in control Group (C1-1, C1-2, A1-3).


7、猪瘟病毒2.1d亚型免疫攻毒计分统计

Table 4 Average scores for the pathological changes observed in challenged pigs

Groups Heart Liver Spleen Lung Kidney Stomach Bladder LN Tonsils Total

A1-1 1.0 1.2 1.5 1.3 1.3 0.8 1.0 1.3 1.5 10.9

A1-2 0.5 0.2 0.3 0.4 0.3 0.1 0.5 0.4 0.3 3.0

B 2.0 2.1 2.4 2.0 2.1 1.3 1.8 2.0 2.6 18.3

C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Extended scoring systems for clinical symptoms and pathology were used allowing the detailed characterisation of the diseases and lesions(Everett et al.,2010). Heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach, bladder, tonsils and lymph nodes (LN) were collected from pigs that died from the infection or were euthanised at the end of the trial. Examinations followed standard operational procedures and any observed lesions were recorded. A gross pathological scoring system was used incorporating 10 parameters. Each parameter was scored from 0 (no lesion) to 3 (severe lesion).


8、猪瘟病毒2.1d亚型免疫攻毒小结

1. 疫苗免疫血清中和2.1d亚型的能力降低

2. SDZP01攻毒可引起部分免疫猪中和抗体延迟、持续高病

毒血症，并引起猪发病，出现较为典型的病变和组织病理学

变化，但其致病性比1.1亚型的Shimen株弱。

五、猪瘟免疫对策

1、猪瘟疫苗免疫遇到的问题

仔猪首免与二免时间是否20/60日龄？

疫苗免疫剂量是1头份还是加倍？

为什么保育猪群的猪瘟抗体水平低下？

母猪免疫疫苗是跟胎免疫还是普防？

疫苗有BVDV污染是否影响抗体水平？

2、猪瘟疫苗使用临床案例解析

第一个案例：

母猪存栏2400多头，年出栏商品猪近50000头。防疫猪瘟、伪狂犬病、口蹄疫（以上三病均普防，1次/3个月）、猪蓝耳病（母猪使用进口弱毒疫苗，普免4次；仔猪使用国产弱毒疫苗，免2次），饲料中定期添加氟苯尼考、替米考星、支原净等药物等进行保健。自2014年2月开始爆发疫情。仔猪陆续发烧，体温41℃，皮肤出血点或出血斑，呼吸困难。部分仔猪有腹泻和水肿症状，部分仔猪有神经症状，死亡率50-100%。

剖检可见肾脏、心脏、肺脏、喉头、膀胱等器官点状出血；淋巴结切面大理石样出血；肠道浆膜和粘膜出血，肠系膜水肿，腹腔有胶冻样渗出液。

病猪皮肤出血点（斑）

心肌出血

肺脏出血

肾脏布满出血点

肠系膜水肿、肠壁出血

喉头粘膜出血

猪瘟病毒

猪蓝耳病病毒

样品编号猪瘟病毒猪蓝耳病毒

1#（孟3） + 弱+

2#（孟无） + +

3#（孟保育） + +

4#（合作社1-1） — 弱+

5#（合作社2-1） — +

6#（合作社3-1） — —

7#（B14） + +

8#（B18）弱+ +

9#（B23） + 弱+

10#（C23）弱+ +

实验室检测病原

1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 8# 9# 10# + — M

1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 8# 9# 10# + — M

经PCR检测和测序，确定猪瘟病毒均为野毒2.1d亚型，PRRSV均为疫苗毒株。

附注：送检的1#—10#仔猪28日龄，未注射猪瘟疫苗，但已注射猪蓝耳病疫苗（15

日龄注射）

猪瘟发病原因分析

猪瘟疫苗含量不准确：由450RID下降为150RID

猪场免疫程序不合理

感染PRRS、PCV2等疾病，免疫功能下降

缺乏有效的免疫监测手段

鉴于猪群目前的猪瘟和蓝耳病感染情况，发病场的免疫程序

调整如下：

（1）猪瘟疫苗：经产母猪分别于产后23天、配种后23天各注

射一次猪瘟疫苗；仔猪超前免疫1头份猪瘟疫苗，25日龄和65日

龄再各免疫一次猪瘟单苗。严格把关猪瘟疫苗的质量，采购前

先让厂家送检猪瘟疫苗样品，经实验室测定抗原含量，合格后

再采购同一批次的疫苗入库保存。

（2）猪蓝耳病疫苗：经产母猪产后15日龄，分别给母猪和15

日龄仔猪各注射1头份猪蓝耳病疫苗。经产母猪不再实施普免（

原来程序是4-8-12月各一次），仔猪第二针蓝耳病疫苗（35日

龄）统一停掉。

猪场免疫程序调整与优化

2、猪瘟疫苗使用临床案例解析

第二个案例：

基础母猪存栏1000多头，年出栏商品猪18000头。母

猪跟胎防疫猪瘟脾淋疫苗（产后25天免疫2头份，间隔1

个月加强免疫2头份）。仔猪21日龄首免1头份，60日龄

加强免疫1头份。保育猪饲料中添加强力霉素、支原净等

药物等进行保健。

问题：仔猪和保育猪猪瘟抗体阳性率低下，而且参齐

不齐，三分之一的仔猪首免猪瘟疫苗后发生过敏反应。

部分仔猪发生疑似猪瘟感染，剖检可见肾脏、肺脏、膀

胱等器官出血；淋巴结切面大理石样出血。经实验室诊

断为猪瘟感染。

山东LW4场抗体检测报告2014.05.10收样

样品编号猪瘟抗体猪蓝耳病抗体伪狂犬病毒-gE（野毒）抗体

OD450 阻断率 OD630 S/P OD630 S/N 备注

仔猪首次免疫前的猪瘟母源抗体

仔猪首次免疫后的猪瘟免疫抗体

10 15 20 25 30 35 40天 10 15 20 25 30 35 40天

临界保护水平临界保护水平

21天首免 35天首免

阻断率

60%

40%

阻断率

60%

40%

80% 80%

山东LW4场抗体检测报告2015.05.31收样

五、猪瘟免疫对策

仔猪的首免日龄不应千篇一律，应该根据各个猪场母源

抗体的消长规律制定。

母猪跟胎免疫的猪瘟抗体水平优于普防

降低猪群蓝耳病的带毒量或减少蓝耳病疫苗的用量和频次，

有助于提高猪群的猪瘟抗体水平

对使用的疫苗进行定量监测，并定期对不同猪群进行猪瘟

抗原和抗体监测，为调整优化猪瘟免疫程序提供参考依据。

山东省农业科学院畜牧兽医研究所猪病研究室是山东省从

事猪病诊断和防治研究的专业机构。研究室依托山东省畜

禽疫病防治与繁育重点实验室研究平台，拥有先进的兽医

分子生物学和免疫学研究设备，包括荧光显微镜、PCR仪、

酶标仪、生物安全柜、凝胶扫描成像仪、高级细胞培养室、

超低温冰箱等。研究室技术力量雄厚，现有职工7人，博

士和硕士研究生14人。目前承担8项国家和省部级项目，

课题经费1000多万元。

猪病研究室简介

http://www.lifesci.sdu.edu.cn/new/passage/upload/20090319/20090319102354514.jpg

祝大家猪事顺利！

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