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COLEGIO DE BIOQUIMICOS DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES PREPARACION DE PLASMA RICO EN PLAQUETAS PARA MEDICINA REGENERATIVA: optimización y cuantificación de citoquinas y factores de crecimiento. Paola Romina Amable, Rosana Bizon Vieira Carias, Marcus Vinicius Telles Teixeira, Ítalo da Cruz Pacheco, Ronaldo José Farias Correa do Amaral, José Mauro Granjeiro, and Radovan Borojevic. Stem Cell Res Ther. 2013; 4(3): 67. INTRODUCCION Las principales funciones de las plaquetas son impedir la pérdida de sangre aguda, la reparación de las paredes vasculares y de los tejidos adyacentes después de una lesión. Durante la cicatrización de la herida, las plaquetas se activan por el contacto con el colágeno, expuesto a la corriente sanguínea después de la lesión endotelial. Las plaquetas secretan mediadores y citoquinas intracelulares almacenados en el citoplasma y liberan su contenido de los gránulos-α después de la agregación. Esta secreción es intensa en la primera hora y las plaquetas continúan sintetizando más citoquinas y factores de crecimiento de sus reservas de ARNm por un mínimo de 7 días [1]. Más de 800 proteínas diferentes se secretan en los medios circundantes [1,2], que tiene un efecto paracrino en diferentes tipos de células: los miocitos [3], las células del tendón [3-7], las células madre mesenquimales de diferentes orígenes [8-11], condrocitos [12-14], osteoblastos [ 3,15,16], los fibroblastos [17-19] y las células endoteliales [20]. Se estimula la proliferación celular, la angiogénesis y la migración de las células, lo que resulta en la regeneración de tejidos. También hay informes que confirman que las plaquetas secretan péptidos antimicrobianos, lo que sugiere un efecto antibiótico [21]. Se demostraron otras propiedades de las plaquetas relacionadas con sus efectos antiinflamatorios y analgésicos [22-24]. Un ensayo clínico mostró que los concentrados de plaquetas tenían un efecto analgésico [25] y Asfaha con sus colaboradores mostraron efectos analgésicos mediados por receptores activados por proteasas 4 (PAR4) in vitro [26]. El Dr. Sharkawy y colegas estudiaron las secreciones de plaquetas y su efecto

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COLEGIO DE BIOQUIMICOS DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES

PREPARACION DE PLASMA RICO EN PLAQUETAS PARA MEDICINA REGENERATIVA:

optimización y cuantificación de citoquinas y factores de crecimiento.

Paola Romina Amable, Rosana Bizon Vieira Carias, Marcus Vinicius Telles Teixeira, Ítalo da Cruz Pacheco,

Ronaldo José Farias Correa do Amaral, José Mauro Granjeiro, and Radovan Borojevic.

Stem Cell Res Ther. 2013; 4(3): 67.

INTRODUCCION

Las principales funciones de las plaquetas son impedir la pérdida de sangre aguda, la reparación de las

paredes vasculares y de los tejidos adyacentes después de una lesión. Durante la cicatrización de la herida, las

plaquetas se activan por el contacto con el colágeno, expuesto a la corriente sanguínea después de la lesión

endotelial. Las plaquetas secretan mediadores y citoquinas intracelulares almacenados en el citoplasma y

liberan su contenido de los gránulos-α después de la agregación. Esta secreción es intensa en la primera hora

y las plaquetas continúan sintetizando más citoquinas y factores de crecimiento de sus reservas de ARNm por

un mínimo de 7 días [1]. Más de 800 proteínas diferentes se secretan en los medios circundantes [1,2], que

tiene un efecto paracrino en diferentes tipos de células: los miocitos [3], las células del tendón [3-7], las

células madre mesenquimales de diferentes orígenes [8-11], condrocitos [12-14], osteoblastos [ 3,15,16], los

fibroblastos [17-19] y las células endoteliales [20]. Se estimula la proliferación celular, la angiogénesis y la

migración de las células, lo que resulta en la regeneración de tejidos. También hay informes que confirman

que las plaquetas secretan péptidos antimicrobianos, lo que sugiere un efecto antibiótico [21].

Se demostraron otras propiedades de las plaquetas relacionadas con sus efectos antiinflamatorios y

analgésicos [22-24]. Un ensayo clínico mostró que los concentrados de plaquetas tenían un efecto analgésico

[25] y Asfaha con sus colaboradores mostraron efectos analgésicos mediados por receptores activados por

proteasas 4 (PAR4) in vitro [26]. El Dr. Sharkawy y colegas estudiaron las secreciones de plaquetas y su efecto

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en cultivos de macrófagos, concluyendo que los concentrados de plaquetas funcionaban como un agente

antinflamatorio, debido a las altas concentraciones de RANTES (Regulated on Activation, Normal T Cell

Expressed and Secreted) y Lipoxina A 4 (LXA4) [27].

Los productos derivados de plaquetas incluyen el plasma rico en plaquetas (PRP), que se puede utilizar con o

sin activación de las plaquetas. Estas preparaciones se han utilizado desde la década de 1970 y han sido cada

vez más populares desde la década de 1990 [28]. Desde entonces, han surgido diferentes maneras de

preparación de PRP: el convencional de centrifugación de la sangre con tubos de sistemas comerciales;

activado mediante la adición de colágeno, calcio y / o trombina, por el contacto de vidrio o mediante ciclos de

congelación; se aplica como suspensión de plaquetas o como un gel, y la metodología se sigue ampliando [29-

31].

La aplicación de PRP en diferentes tejidos ha dado resultados prometedores en diferentes patologías tales

como lesiones agudas y crónicas de hueso y cartílago. El Dr. Kon y colegas informaron de la observación de

91 pacientes (115 rodillas) tratados con PRP, que el tratamiento PRP es seguro, reduce el dolor y mejora la

función de la rodilla a los 12 meses , especialmente en pacientes más jóvenes [32]. Este método fue superior a

la viscosuplementación con ácido hialurónico [32]. El análisis posterior a los 24 meses, sin embargo, mostró

una pérdida progresiva de la mejora y planteaba la cuestión de las posibles terapias repetidas [33]. En este

ejemplo se observa la necesidad de estudios adicionales, incluso en serie, con un gran número de pacientes y

con controles. La opinión general en los últimos comentarios es que la mayoría de los ensayos clínicos

presentados no tienen el poder estadístico suficiente para arrojar resultados concluyentes. En vista de

múltiples aplicaciones potenciales PRP en ortopedia, medicina deportiva y cirugía reparadora, serían útiles los

análisis comparativos de diferentes escenarios clínicos. Estas comparaciones no son viables, principalmente

porque PRP es un producto biológico, preparado utilizando diferentes protocolos, a veces incluso sin controlar

si las plaquetas se concentraron y se purificaron efectivamente o si se ha producido una activación temprana,

descartando todos los factores de crecimiento secretados dentro del plasma pobre en plaquetas (PPP). Otra

cuestión que ni siquiera se menciona en los informes clínicos es si existe una correlación entre la

concentración de plaquetas o el volumen de PRP aplicado por área lesionada. Los estudios ya han demostrado

que la baja concentración de plaquetas es ineficiente y que las concentraciones altas tienen un efecto

inhibidor sobre el crecimiento celular, pero los resultados son todavía contradictorios [34-36]. Aunque todavía

no profundamente caracterizado, el contenido de leucocitos también ha demostrado ser un factor

importante, en el aumento de la inflamación y la reducción de la regeneración de tejidos en tendinopatías

[37]. Los procedimientos de preparación también son pertinentes, tal como se muestra en estudios del

potencial condro-inductivo y osteo-inductivo de PRP, que se informó que se pierde por la activación de la

trombina [38] y es retenido después de la activación por procesos de congelación-descongelación [39]. Siguen

sin definirse nomenclaturas consensuadas, protocolos estandarizados para producir PRP, así como una

caracterización completa del producto final que podría mejorar la comparabilidad de los estudios [40,41].

Las combinaciones de PRP y células madre mesenquimales han sido ampliamente estudiadas in vitro [8-11].

Todos los autores concluyeron que el PRP aumentó la proliferación celular, pero se encontraron divergencias

con respecto a la capacidad de diferenciación de células madre, algunos se indicaron al PRP como

favorecedor de la diferenciación osteogénica [9] y otros que demostraron un compromiso condrogénico

[10,12]. Estas variaciones pueden deberse a diferentes preparaciones de PRP, incluyendo o no la fracción de

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leucocitos, que puede modificar su contenido de factor de crecimiento. En ambos casos, el PRP parecía ser un

aditivo prometedor para el trasplante de células madre con aplicaciones ortopédicas, al aumentar el

número de células madre trasplantadas y guiar su diferenciación a un tipo celular definido.

El presente estudio propone el establecimiento de un método optimizado y reproducible para la preparación

de PRP y caracterizar el contenido en factores de crecimiento y citoquinas de las fracciones obtenidas antes y

después de la activación plaquetaria. Nuestro objetivo final es desarrollar y caracterizar una preparación de

PRP con fines terapéuticos, centrándose en la alta producción de plaquetas, la pureza y la recuperación sin la

introducción del factor de crecimiento a lo largo de la manipulación de la muestra.

MATERIALES Y METODOS

Declaración de ética

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación del

Hospital Pro-Cardíaco, Rio de Janeiro (CAAE: 04691712.3.0000.5533) y todos los donantes firmaron un

consentimiento informado.

Recolección de sangre y preparación de plasma rico en plaquetas

La sangre periférica de 22 donantes voluntarios sanos de ambos sexos (de 20 a 54 años de edad) fue recogida

en tubos que contenían 0,5 ml de solución de citrato (Vacutainer ®, Ref: 369714, BD Biosciences). El

procedimiento de preparación del PRP consistió en dos pasos de centrifugación. Todas las etapas se llevaron a

cabo en una centrífuga refrigerada (certificada Jouan Br4i, Saint-Herblain, Loire-Atlantique, Francia). Se

estudiaron las variaciones en la fuerza centrífuga relativa (FCR), la temperatura, y el tiempo para la

optimización de las condiciones para el aislamiento de plaquetas. Después de la primera centrifugación, se

recogió todo el plasma por encima de la capa leucocitaria, para la separación de las plaquetas de las células

rojas de la sangre y leucocitos (PRP1). Para la optimización de la segunda etapa de centrifugación, se

estudiaron sólo el FCR y tiempo. El PRP1 de donantes individuales se dividió en fracciones de 1 ml y después

de la segunda etapa de la centrifugación el sedimento de plaquetas se suspendió en 300 microlitros de

plasma pobre en plaquetas (PPP; nueva fracción llamado PRP2). El PRP2 se activó usando 20 mM de CaCl2

(PRP2-Ca) o 20 mM de CaCl2, más 25 UI / ml de trombina de plasma humano (PRP2-Thr, Ref.: T6884, Sigma-

Aldrich, St Louis, Missouri, EE.UU.). Todas las muestras se incubaron a 37 ° C durante 1 hora y a 4 º C durante

16 horas. Para la recuperación de la PRP2 activado, todas las muestras tratadas se centrifugaron a 3000 x g

durante 20 minutos a 18 ° C. El sobrenadante (activado PRP2) se recogió mediante aspiración. Los coágulos se

trataron con HCl 200 mM durante 10 minutos y se neutralizaron con NaOH 240 mM ( lavado del coágulo).

Todas las muestras se almacenaron a -80 º C.

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Análisis hematológico

El recuento total de células de la sangre se determinó en sangre entera, fracción PRP1, fracción PRP2 y

fracción PPP. Los recuentos de plaquetas se realizaron con un hemocitómetro utilizando un fluido REES-

ECKER modificado por Wintrobe y otros tipos de células de la sangre se analizaron usando un analizador

hematológico XE-2100 (Sysmex, Kobe, Hyogo, Japón).

Cuantificación de citoquinas

Se analizaron muestras de sangre periférica, PRP1, PRP2, PPP, PRP2 activado y del lavado del coágulo. Las

citoquinas proinflamatorias, factor estimulante de crecimiento de colonias granulocitarias-macrófagos (GM-

CSF), interleuquina (IL): IL-1β, IL-6, IL-8, factor de necrosis tumoral (TNF) α, el interferón gamma (IFN) , IL-2, IL-

2R, IL-7, IL-12p40/p70, IL-15, IL-17, citoquinas antiinflamatorias (IL-1RA, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IFN alfa),

quimiocinas (eotaxina, proteína 10 (IP-10), proteína-1 (MCP-1), monoquinas inducidas por IFN-ϒ , proteína

inflamatoria de macrófagos (MIP)-1α, MIP-1β, RANTES, quimioatrayente de monocitos y los factores de

crecimiento : factor de crecimiento endotelial (EGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de

crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de

crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento transformante (TGF)-β1, TGF-β2, , factor de TGF-

β3 crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)-AA, PDGF-AB, PDGF-BB , el factor de crecimiento similar a la

insulina 1 (IGF-1)). Fueron utilizados equipos comerciales de ELISA y Luminex: Quantikine hPDGF-AB ELISA (R

& D, Minneapolis, Minnesota, EE.UU.), citoquinas Humanos Ensayo 30-plex (Invitrogen, Carlsbad, California,

EE.UU.), Fluorokine MAP Kit Multiplex TGF-β (I + D, Minneapolis , Minnesota, EE.UU.), Fluorokine Kit Humanos

angiogénesis Multi analito Profiling (I + D, Minneapolis, Minnesota, EE.UU.) y MILLIPLEX MAP Humanos IGF-1

Single Plex Kit (Millipore, Billerica, Massachusetts, EE.UU.). Los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo las

instrucciones del fabricante.

Análisis estadístico

Los resultados se expresan como media ± desviación estándar para al menos tres repeticiones. La significación

estadística se evaluó mediante el análisis unidireccional no paramétrico de varianza seguido por la prueba de

Tukey post-hoc (para comparar todos los pares en el grupo) o la prueba de comparación múltiple de Dunnett

(para comparar cada condición con los datos de control, pero no uno con el otro). Un valor de P < 0,05 fue

considerado estadísticamente significativo. El análisis estadístico se realizó utilizando el software Prism 5.00

(GraphPad Software Inc, San Diego, California, EE.UU.).

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Optimización del método para la preparación del plasma rico en plaquetas

Después de los primeros análisis de los resultados experimentales, se decidió optimizar el procesamiento de

la sangre en dos etapas de centrifugación, que se describen de la siguiente manera. El objetivo de la primera

etapa era para agotar el producto de glóbulos rojos y blancos con una mínima pérdida de las plaquetas, y el

objetivo del segundo paso fue obtener la más alta recuperación y el mejor rendimiento de las plaquetas en

el volumen final de plasma más pequeño.

Primera etapa de centrifugación

Sangre recién recogida se centrifugó como se describe en Materiales y Métodos, produciendo tres fracciones:

una capa inferior densa que contiene células rojas de la sangre que ocupa aproximadamente la mitad del

volumen total de sangre, una capa blanca delgada intermedia que contiene los leucocitos (capa leucocitaria) y

arriba, una fracción amarilla que contiene las plaquetas (PRP1).

La RCF, tiempo y temperatura se consideraron variables a optimizar, ya que potencialmente podrían influir en

el rendimiento final de plaquetas y su pureza. Estas tres variables están muy correlacionadas, por lo que de la

variación de los parámetros de a uno, no sería adecuado para encontrar las mejores condiciones, ya que, por

ejemplo, un aumento de la temperatura sería reducir la densidad del plasma y por lo tanto el comportamiento

de células de la sangre sería diferente bajo las mismas condiciones de centrifugación , los tiempos de

centrifugación más largos serían mejor combinarlo con poca RCF, por lo que las plaquetas siguen aisladas en

la fracción superior. Realizamos 17 experimentos, con 15 condiciones diferentes; una condición se repitió tres

veces para la estimación de error. Los resultados se presentan en la Tabla 1. Hemos observado que el aumento

de la RCF de 200 a 360 × g era perjudicial para el rendimiento y la recuperación. Se observó el mismo efecto

negativo al aumentar el tiempo de centrifugación. Al analizar la influencia de temperatura, no se detectó

ningún efecto cuando los tiempos de centrifugación eran cortos, pero cuando la etapa de centrifugación duró

16 minutos, la temperatura tuvo un efecto positivo en el aumento de la producción de plaquetas. En base a

estos análisis, hemos elegido cinco condiciones (carreras 5, 8, 11, 13 y 15) que se repite en diferentes muestras

de sangre. Se confirmó el rendimiento y la recuperación de las plaquetas, que muestra la reproducibilidad

entre días y entre los diferentes donantes (Figura 1). La recuperación de plaquetas y el rendimiento fueron

estadísticamente menor para la condición 2 (360 × g, 16 minutos, 16 ° C), llevado a cabo a la más alta RCF. El

mejor rendimiento se obtuvo utilizando los parámetros de la condición 3 (300 × g, 5 minutos, 12 ° C), el que

tiene el tiempo de centrifugación más bajo. Dado que una diferencia significativa no se observó con la

condición 1 (240 x g, 8 minutos, 16 ° C), elegimos la condición 3 como un primer paso para una mayor

optimización de la segunda etapa, debido a su tiempo más corto.

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Segunda etapa de centrifugación

En la optimización de la segunda etapa de centrifugación, la temperatura se fijó en 12 ° C, ya que los análisis de

la primera etapa indicaron que no afectó significativamente la recuperación de plaquetas y el rendimiento. La

Tabla 3 muestra los resultados para las diferentes condiciones estudiadas, donde se determinaron la

producción de plaquetas en PRP, PRP2, la recuperación de plaquetas parcial en el PRP2 y el PPP. En algunas

condiciones de centrifugación, la recuperación total de las plaquetas (PRP2 más los valores de recuperación

PPP) no alcanzó el 100%, posiblemente debido a la agregación de plaquetas. Pérdidas importantes se

observaron con baja RCF y el mejor rendimiento se obtuvo con alta RCF y largos tiempos de centrifugación.

Condición 4 (700 x g, 17 minutos), la condición 5 (450 x g, 12 minutos) y la condición 9 (800 x g, 12 minutos),

donde confirmó además con el uso de diferentes muestras de sangre (n = 3). A pesar de que la recuperación

de las plaquetas no fue estadísticamente diferente de las otras dos condiciones (P = 0,3222), fue elegida la

condición 4 (700 x g, 17 minutos) ya que permitió una pérdida de plaquetas inferior en la fracción PPP (Figura

2A) y produjo un sedimento que fue fácilmente resuspendible. Para las tres condiciones, se cuantificaron

eritrocitos y leucocitos en ambas muestras, PRP2 y PPP. La fracción PPP estaba libre de eritrocitos y leucocitos.

Todas las células contaminantes restantes se centrifugaron junto con las plaquetas; menos del 0,3% de los

glóbulos rojos y blancos iniciales se mantuvo en PRP2, definiendo nuestra preparación como un plasma pobre

en leucocitos.

Efecto de la temperatura sobre la preparación del plasma rico en plaquetas.

Teniendo en cuenta que la temperatura no afectó el aislamiento de plaquetas durante la primera etapa, todo

el procedimiento se ensayó a 12 ° C y a 18 ° C (temperatura ambiente). Los resultados se muestran en la Tabla

4 y también en la Figura 2. No se observaron diferencias significativas entre ambas temperaturas.

Reproducibilidad del método

Hemos probado el mismo procedimiento para los distintos pacientes y en días diferentes. Los resultados se

muestran en la Figura 3. Para algunos pacientes (por ejemplo, pacientes 1, 5 y 7) la reproducibilidad era alta,

mostrando que casi no hay diferencia entre los dos días.

Intervalo de confianza

Considerando 18 muestras diferentes y α = 0,05, nuestro método de preparación de PRP recién optimizado

permitió obtener una recuperación final de plaquetas de 46,9 a 69,5%, y el coeficiente de concentración

entre 5.4 y 7.3, con una concentración de plaquetas final de 1,4 x 106 a 1,9 x 106 plaquetas / µL.

Comentarios

En conclusión, el presente estudio desarrolló y caracterizó el método de dos pasos para obtener PRP, la

maximización de la pureza de las plaquetas, la recuperación y el rendimiento:

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1) Las muestras de sangre se recogieron en tubos de 5 ml que contienen 3,2% de citrato de sodio; una muestra

de 100 µl se separó para determinar la concentración inicial de células sanguíneas.

2) Toda la sangre se centrifugó a 300 × g durante 5 minutos a 18 ° C.

3) La fracción superior (PRP1) se separó sin perturbar la capa leucocitaria, y se transfirió a un tubo estéril; el

volumen PRP1 se cuantificó y una muestra de 100 µl se separó para determinar la concentración de las

plaquetas y la pureza.

4) PRP1 se centrifugó a 700 × g durante 17 minutos a 18 ° C.

5) PPP se transfirió a un tubo estéril y se cuantificaron la concentración de plaquetas y la pureza.

6) El sedimento de plaquetas obtenido a partir de 1 ml de PRP1 se resuspendió en 300 µl de PPP (PRP2).

7) La activación plaquetaria se realizó inmediatamente mediante la adición de 20 mM de CaCl2 y 25 UI / ml de

trombina humana o CaCl2 solo, incubando a 37 ° C durante 1 hora y a 4 º C durante 16 horas.

8) El plasma activado PRP2 se recuperó por centrifugación a 3000 × g durante 20 minutos a 18 ° C.

Decidimos recoger la sangre en tubos de vidrio con citrato. Aunque Araki y sus colegas recomiendan el uso de

EDTA para maximizar la recuperación de plaquetas [42], el uso de EDTA resultó en plaquetas dañadas de

acuerdo con Landersberg y colegas [43]. Anitua propuso en 1999 un método simple para la obtención de PRP

que se ha utilizado con frecuencia en estudios posteriores y en la aplicación clínica [44]. Se recogió una

fracción de 0,5 ml de plasma situada justo encima de la capa leucocitaria separó después de un solo ciclo de

centrifugación (460 × g, 8 minutos). La fracción superior se considera PPP, ya que el autor argumentó que la

densidad de plaquetas fue aumentando gradualmente desde la parte superior de la capa leucocitaria. Por el

contrario, no hemos encontrado ningún gradiente de plaquetas en cualquiera de las fracciones PRP1 (datos no

presentados), y hemos decidido recuperar todo el volumen de PRP1 para la próxima etapa de centrifugación.

El segundo paso de centrifugación de alta velocidad de plaquetas concentradas por una décima parte del

volumen de sangre inicial, dejando una fracción PPP con <1% de pérdida de plaquetas. Concentramos

plaquetas, alcanzando una línea de base de 1 millón de plaquetas /µ l, finalmente, la recuperación de al menos

el 50% de la cantidad inicial de plaquetas. Estos parámetros son más altos que los reportados para los equipos

comerciales PRP: Sundman y sus colegas informaron de un aumento de 1,99 veces en la concentración de

plaquetas utilizando un equipo ACP Arthrex, minimizando el contenido de leucocitos (0,13 veces), los mismos

autores reportaron un 4,69 veces y 4,26 veces mayor en la concentración de plaquetas y leucocitos,

respectivamente, utilizando un kit de Biomet GPS III [45]. El Dr. Mazzucco y colegas compararon cuatro

protocolos diferentes: tres equipos comercialmente disponibles (Fibrinet, RegenPRP-Kit y Plateltex) y un

procedimiento de fabricación casera, la obtención de un aumento de 1,6 veces a 4,4 veces en la concentración

plaquetaria [29]. El Dr. Le y colegas compararon equipos Curasan PRP, Plateltex, GPS II, RegenLab y un

protocolo casero [30]. Obtuvieron un rendimiento de 2,75 veces, 3,43 veces, 1,89 veces, 1,55 veces y 1,77

veces en la concentración de plaquetas y una recuperación de plaquetas de 32,0%, 20,0%, 22,6%, 79,0% y

45,6%, respectivamente. Castillo y colaboradores compararon equipos Biomet GPS III, MTF Cascade y

sistemas Magellan Arteriocyte y mostraron que la recuperación de plaquetas fue del 22,6%, 67,6% y 65,5%,

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con un amento de 2,07 veces, 1,62 veces y 2,80 veces en la concentración de plaquetas, respectivamente

[31]. Se obtuvo una alta recuperación de las plaquetas y un aumento de 6,4 veces en la concentración de

plaquetas, lo que hace un mejor uso de la sangre del donante y requieren un volumen más pequeño para

obtener la misma cantidad de plaquetas. Nuestra preparación de PRP es altamente purificada y casi no

contiene otros tipos de células derivadas de la sangre distintos de las plaquetas. Los leucocitos se deben

evitar en la preparación de PRP debido a su potencial efecto proinflamatorio [23, 37, 45]. Sundman y colegas

recientemente llegaron a la conclusión con estudios in vitro, que los leucocitos aumentaron el perfil

catabólico del PRP, ya que la concentración de citoquinas catabólicas (metaloproteinasa de matriz-9 e IL-1β)

se correlacionaron positivamente con la concentración de leucocitos, pero no hay correlación entre el

contenido de leucocitos y los efectos clínicos in vivo que sea de nuestro conocimiento [45].

Factores de crecimiento y cuantificación del contenido de citoquinas

Un total de 37 factores de crecimiento y citoquinas se cuantificaron en diferentes fracciones obtenidas

durante la preparación del PRP: muestra inicial de sangre, PRP1, PRP2, activados por calcio de PRP2 (PRP2-

Ca), calcio más PRP2 con trombina-activada (PRP2-Thr), PPP, y el lavado del coágulo. Sólo 12 factores y

citoquinas se secretan a partir de plaquetas activadas, lo que se define por diferencia estadística: PDGF-AA,

PDGF-AB, PDGF-BB, TGF-β1, TGF-β2, el EGF, IL-4, IL-8, IL-13, IL-17, IFNα y TNFα (Tabla 5). El TGF-β3 y el IFNϒ no

se detectaron en ninguna de las fracciones analizadas.

Los factores de crecimiento

La Figura 4 muestra las concentraciones de factores de crecimiento secretados durante la activación de las

plaquetas (PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, TGF-β1, TGF-β2 y EGF). El PDGF-AB y PDGF-BB mostraron cantidades

significativamente diferentes no sólo en fracciones activados de PRP2, sino también en los coágulos de

lavados. El TGF-β1 y TGF-β2 se mostraron en cantidades significativamente altas en PRP2-Ca, pero no en

PRP2-Thr. El contenido en el coágulo de TGF fue el más alto en comparación con otros factores de crecimiento.

No tenemos ninguna información sobre el estado de activación de las dos isoformas de TGF-β, porque solo se

detectó el TGF total.

Para comparar la secreción del factor de crecimiento con otras publicaciones, se calculó la cantidad de

citoquinas secretadas por las plaquetas, ya que los diferentes protocolos descritos resultaron en diferentes

concentraciones de plaquetas. Po lo tanto expresado en 106 plaquetas, PRP2-Ca contenía 7,9 ± 5,6 pg PDGF-

AA, 37,6 ± 14,9 pg PDGF-AB, 20,1 ± 10,0 pg PDGF-BB, 318,6 ± 118,4 pg de TGF-β1, 965,2 ± 389,5 fg TGF-β2 y

438.5 ± 195,3 fg EGF.

De acuerdo con nuestros criterios, los factores de crecimiento que ya están presentes en el plasma son IGF-1,

con una concentración de 105,30 ± 48,44 ng / ml (p = 0,9734), y el factor de crecimiento de hepatocitos, cuyo

nivel fue 61,20 ± 39,71 pg / ml (p = 0,1455). La concentración plasmática no dio una diferencia significativa con

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PRP2-concentraciones de Ca y PRP2-Thr, pero alcanzó valores de 2,6 veces y 2,5 veces más altos que el nivel

plasmático, respectivamente, y consideramos los valores indicativos de la secreción.

Informes sobre las citoquinas en PRP se centran principalmente en los factores de crecimiento TGF, PDGF,

VEGF, EGF, bFGF, HGF e IGF-1, y dispone de datos cuantitativos relevantes de PDGF, TGF y EGF. Mazzocca y

colaboradores informaron que se secreta de 1498,1 a 3,020.7 fg EGF por 106 plaquetas, un valor más alto que

lo que encontramos [46]. En comparación con nuestros resultados, el mismo grupo informó de una

concentración de PDGF-AB similares (27,4-48,8 pg/106 plaquetas) y una secreción de TGF-β1 ligeramente

inferior (161,7-185,4 pg/106 plaquetas) [46]. Otros autores informaron valores similares para el TGF-β1: 120

pg/106 plaquetas [47], 240 pg/106 plaquetas [48] y 55,4 a 126,7 pg/106 plaquetas [45]. Castilho y sus colegas

informaron valores similares a los nuestros con respecto a PDGF-AB (21,9-44,1 pg/106 plaquetas) y PDGF-BB

(33,3-42,3 pg/106 plaquetas) [31]. Las diferencias informadas refuerzan la necesidad de normalización de los

métodos, con el fin de hacer factible los análisis clínicos comparativos.

En nuestro estudio, el VEGF se detectó en muestras PRP2-Ca de sólo dos de los seis donantes (1,93 y 1,06 pg /

ml), siendo en todas las otras muestras, más bajo que el límite de cuantificación del ensayo utilizado (1 pg /

ml). Según el fabricante, las isoformas de VEGF-121 y VEGF-165 se pueden detectar con el ensayo. Esto está

en contraste con la mayoría de la literatura sobre VEGF y PRP, en el que el VEGF se considera uno de los

principales factores: las concentraciones en sangre informadas por Eppley y colegas fueron de 155 ± 110 ng /

ml [49] y de 50 ± 10 pg / ml por el Dr. Sharkawy y colegas [27] y la activación del PRP resultaron en un

aumento de 6,2 veces y 4,4 veces en la concentración de VEGF, respectivamente.

Activamos PRP usando solamente cloruro de calcio (20 mM), y cloruro de calcio y trombina humana (25 UI /

ml). Se encontraron diferencias estadísticamente significativas para PRP2-Ca, pero no para PRP2-Thr sólo para

TGF-β1, TGF-β2 e IFNα. Incluso cuando las diferencias no eran grandes entre las dos fracciones activadas,

estos resultados sugieren una mejor secreción del contenido de los gránulos –α cuando las plaquetas se

activaron utilizando solo calcio.

Citoquinas antiinflamatorias

La IL-1RA, IL-5 e IL-10 no mostraron ninguna diferencia significativa entre PRP2 activado y la concentración

plasmática (p = 0,6837, 0,1483 y 0,5361, respectivamente). A juzgar por el análisis estadístico, la IL-4 es un

factor intraplaquetario; la concentración en el plasma (52,86 ± 1,63 pg / ml) y preparaciones de PRP activado

(55,53 ± 1,01 pg / ml para PRP2-Ca y 55,04 ± 1,30 pg / ml PRP2-Thr) fueron similares, pero la desviación

estándar era pequeña, por lo que las diferencias fueron estadísticamente significativas (P = 0,0079). La IFNα

plasmática (98,50 ± 13,79 pg / ml) aumentó en 22,09% y 13,26% en PRP2-Ca y PRP2-Thr, respectivamente (P =

0,0305).La IL-13 era dos veces más concentrada en ambos preparaciones activadas PRP2 en comparación con

la concentración plasmática (28,91 ± 31,67 pg / ml), pero estas diferencias se deben considerar solamente

indicativas, puesto que no fueron significativas (P = 0,0618 y 0,0509 para PRP2-Ca y PRP2-Thr,

respectivamente). Concentraciones de IFNα, IL-4 y IL-13 se muestran en la Figura 5. Cuando PRP2 se activa

sólo con cloruro de calcio se obtuvieron 34,9 ± 23,8 fg/106 plaquetas para IFNα, 30,3 ± 28,0 fg/106 plaquetas

para IL-4 y 25,2 ± 30,4 fg/106 plaquetas para IL-13.

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Las citoquinas proinflamatorias

IL-17, TNF e IL-8 fueron las únicas citoquinas proinflamatorias que mostraron un aumento significativo a

partir del plasma al PRP2 activado (P = 0,0206, 0,0008 y <0,0001, respectivamente). La IL-1β aumentó su

concentración de 3,6 veces en PRP1 y 9,5 veces en PPP en comparación con la concentración plasmática (0,17

± 0,27 pg / ml), pero las diferencias se debe considerar indicativas ya que no fueron estadísticamente

significativas (P = 0,7543). Se obtuvieron los mismos resultados para el factor estimulante de colonias de

granulocitos-macrófagos (P = 0,8456), con aumentos más pequeñas (aumento de 1,5 veces y 2,5 veces en

PRP1 y PPP, respectivamente; concentración plasmática: 5,48 ± 8,49 pg / ml). En el caso de IL-7, no hubo

diferencias significativas entre las plasmática (10,60 ± 25,96 pg / ml) y PRP2 activado (P = 0,3592). La figura 6

muestra las concentraciones de citoquinas proinflamatorias para esos factores secretados durante la

activación de plaquetas. Al calcular el contenido de plaquetas teniendo en cuenta la cantidad de citoquina

secretada durante la activación de calcio, se obtuvo 98,5 ± 10,4 fg/106 plaquetas para IL-8, 32.6 ± 24.2 fg/106

plaquetas para IL-17, y 3,1 ± 2,4 fg/106 plaquetas para TNFα.

Mientras que el contenido de factores de crecimiento no fue mayor en el PPP, las citoquinas antiinflamatorias

IL-4 e IFNα mostraron un aumento, pero no de IL-13 en PPA. Las citoquinas proinflamatorias IL-17 y TNFα, se

incrementaron en PPA, pero no la de IL-8 después de la segunda centrifugación. La manipulación de las

plaquetas in vitro, así como el estrés en la circulación en el vaso sanguíneo, provoca la secreción de

mediadores citoplasmáticos presentes en las plaquetas al entorno pericelular, independientemente de su

degranulación. Entendemos que este es el origen de los cuatro citoquinas en el PPP. Revisiones recientes

discuten la existencia de diferentes gránulos α [50-52]. Blair y Flaumenhaft revisaron la incorporación de

proteínas plasmáticas en el citoplasma de la célula y después en los gránulos α, lo que significa que la rotura

de membranas de plaquetas puede liberar factores acumulados en el citoplasma que también se concentran

en los gránulos α [50]. Ma y otros, informaron de que los diferentes receptores de superficie de las plaquetas

desempeñan un papel en la regulación de la angiogénesis, con la activación mediada por PAR1 permitiendo la

agregación de plaquetas y la secreción de VEGF, mientras que la supresión de la liberación de endostatina, y

con la activación mediada por PAR4 también permite la agregación de plaquetas pero suprime el VEGF y la

secreción de endostatina [53]. Blanco y Rompietti sugirieron que esta teoría de segregación de factores en

diferentes tipos de gránulos, tiene más sentido que la secreción simultánea de factores pro-angiogénicos y

anti-angiogénicos que conducirían a la neutralización de los efectos de las proteínas secretadas [52].

Las quimiocinas

Se encontró que ninguna de las quimiocinas analizadas ha aumentado su contenido durante la activación de

las plaquetas a un nivel estadísticamente significativo, pero MIP-1β mostró un aumento de la concentración

plasmática (38,01 ± 34,23 pg / ml) en comparación con PRP2-Ca (118,39 ± 82,39 pg / ml) y PRP2-Thr (96,76 ±

49,60 pg / ml) - que consideran estos valores indicativos de un aumento, por lo que deberían ser estudiados

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más a fondo. La Eotaxina y MCP-1 mostraron concentraciones significativamente reducida en fracciones PRP

activado, la concentración de eotaxina se redujo de una concentración plasmática de 50,62 ± 16,95 pg / ml a

23,75 ± 8,52 pg / ml en PRP2-Ca y 22,19 ± 4,76 pg / ml en PRP2-Thr y el MCP-1 de concentración de 245,59 ±

187,52 pg / ml a 69,41 ± 43,27 pg / ml en PRP2-Ca y 78,97 ± 22,20 pg / ml en PRP2-Thr. La reducción puede ser

causada por la degradación de las quimiocinas por los productos secretados tras la degranulación, o su

asociación con moléculas secretadas, y estas cuestiones también deben ser estudiadas más a fondo.

Sólo se encontró una publicación para RANTES, reportando una concentración plasmática de 100 ± 20 ng / ml

y una concentración de 300 ± 100 ng / ml en PRP activado [27]. Nuestra investigación dio lugar a

concentraciones plasmáticas de RANTES 2,76 ± 1,97 ng / ml.

A juzgar por la composición PRP que se describe aquí, nuestros resultados apoyan el uso de PRP en la curación

de heridas y la regeneración de tejidos, ya que altas concentraciones de PDGF y TGF se secretan a partir de

gránulos -α de plaquetas después de la activación. También se puso de manifiesto que los factores de

crecimiento son altamente retenidos dentro del coágulo, es así, como ya han demostrado otros autores,

serían liberados lentamente en vivo [54,55]. Estos factores de crecimiento también se describieron como

mitogénicos y atrayente para las células madre mesenquimales, que pueden seguir secretando factores de

crecimiento y pueden mediar efectos regeneradores durante períodos más largos de tiempo [56]. Nuestra

preparación de PRP ahora debe ser probada in vitro en cultivos de células con el fin de revelar sus efectos

moleculares en diferentes tipos de células y en los ensayos clínicos con el fin de evaluar sus efectos in vivo en

diferentes patologías.

Conclusiones

Nuestro estudio ha optimizado un procedimiento para la preparación de PRP de la sangre humana, la

recuperación de más del 50% de las plaquetas iniciales con una baja cantidad de otras células de la sangre.

Esta preparación se activó y diferentes fracciones recogidas a lo largo del procedimiento fueron analizados con

el fin de determinar el contenido de factores de crecimiento. De 37 proteínas cuantificadas, 12 resultaron ser

aumentadas sólo después de la activación plaquetaria.

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Figura 1. Rendimiento plaquetario, recuperación y volumen del plasma rico en plaquetas luego del paso 2 de

centrifugación. A: rendimiento, B: recuperación, C: Volumen de PRP1

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Figura 2. Efecto de la temperatura en la pérdida plaquetaria en la fracción del plasma pobre en plaquetas

después del segundo paso de centrifugación.

Figura 3. Variación individual y diaria del PRP2 a 18 grados centígrados.

A. Recuperación plaquetaria en PRP2 B. Rendimiento plaquetario en PRP2.Las muestras pertenecen a diferentes donantes y el procedimiento realizado por diferentes investigadores en días diferentes.

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Figura 4. Concentración de factores de crecimiento secretados luego de la activación plaquetaria.

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A. Factor de crecimiento derivado de plaquetas AA (PDFG) B. Factor de crecimiento derivado de plaquetas AB C. DGFG- BB D. Factor de crecimiento endotelial (EGF) E. Factor de crecimiento transformante β1 (TGF) F. TGF β2 *Diferencias estadísticamente significativas a partir de la concentración plasmática (Análisis de la varianza seguido de la comparación múltiple de Dunnett para n=6, α=0.05)

Figura 5. Concentración de citoquinas anti-inflamatorias

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A. IL-4 B. IL-13 C. IFNα * Diferencias estadísticamente significativas a partir de la concentración plasmática (Análisis de la varianza seguido de la comparación múltiple de Dunnett para n=6, α=0.05)

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Figura 6. Concentraciones de citoquinas proiinflamatorias

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A. IL-18 B.IL-17 C.TNFα * Diferencias estadísticamente significativas a partir de la concentración

plasmática (Análisis de la varianza seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett para n=6 y

α<0.05)

Tabla 1. Rendimiento y recuperación plaquetaria luego de la centrifugación de sangre entera.

RCF (x g)

Tiempo de centrifugación (minutos)

Temperatura (⁰C)

Rendimiento (veces)

Recuperación (%)

1 240 8 8 2.5 66.6

2 360 8 8 0.9 30.4

3 240 16 8 1.3 52.7

4 360 16 8 0.5 19.5

5 240 8 16 2.6 69.3

6 360 8 16 1.1 33.2

7 240 16 16 1.6 10.4

8 360 16 16 1.8 73.7

9 200 12 12 2.4 82.7

10 400 12 12 0.6 24.2

11 300 5 12 0.2 57.7

12 300 19 12 0.7 28.2

13 300 12 5 1.6 62.7

14 300 12 19 0.8 30.3

15 300 12 12 1.8 73.6

16 300 12 12 1.3 53.7

17 300 12 12 1.7 69.1

Tabla 2. Cuantificación de hematíes y leucocitos en sangre entera y fracción PRP1

Condición Volumen ( ml) Hematíes ( 106/µl) Leucocitos (103/µl)

Sangre entera 4.1+/-1.4 4.05+/-0.28 (100%) 4.38+/-0.47 (100%)

1-240 x g, 8 minutos, 16⁰C 1.7+/-0.2 0.02+/-0.00 (0.19%) 0.02+/-0.02 (0.21%)

2-360 x g, 16 minutos, 16⁰C 2.2+/-0.1 0.00+/-0.00 0.00+/-0.00

3-300 x g, 5 minutos, 12⁰C 1.5+/-0.4 0.03+/-0.01 (0.24%) 0.03+/-0.01 (0.28%)

4-300x g, 12minutos, 5⁰C 2.0+/-0.1 0.01+/-0.00 (0.12%) 0.01+/-0.00 (0.12%)

5-300 x g, 12minutos, 12⁰C 2.1+/-0.2 0.01+/-0.00 (0.13%) 0.01/-0.01 (0.08)

Valores expresados como Media+/- desvío estándar n=3

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Tabla 3. Rendimiento y recuperación plaquetaria luego de centrifugar PRP1

Corrida RFC(x g) Tiempo(minutos) Rendimiento Recuperación PRP2

Recuperación PPP

Total

1 200 7 1.8 47.1 51.3 98.4

2 700 7 1.4 39.7 0.0 39.7

3 200 17 2.1 55.9 8.5 64.4

4 700 17 3.6 97.4 0.5 97.9

5 450 12 2.7 75.5 3.6 79.1

6 450 12 2.8 78.1 3.4 81.5

7 450 12 3.2 88.9 5.3 94.2

8 100 12 1.4 38.9 52 90.9

9 800 12 3.3 93.2 0.0 93.2

10 450 5 1.8 48.3 20.1 38.4

11 450 19 2.5 65.7 0.0 65.7

Tabla 4. Efecto de la temperatura sobre la preparación del plasma rico en plaquetas

12 (⁰C) 18 (⁰C) Valor P

PRP1 (300 x g, 5 minutos)

Recuperación plaquetaria (%)

90.6+/-21.7 87.8+/-22.8 1.0000

Rendimiento plaquetario (veces)

3.1+/-0.7 2.9+/-0.6 0.5066

Volumen de PRP1 26.7+/-0.7 27.6+/-1.9 0.7000

PRP2 ( 700 x g, 17 minutos)

Recuperación 80.3+/-26.6 86.0+/-46.9 1.0000

Rendimiento 9.3/-2.6 8.8+/-3.6 0.8248

Análisis de la varianza (n=3, α=0.05)

Tabla 5. Comparación estadística (valor q) de la concentración de citoquinas entre Plasma y PRP activado

Citoquina PRP-calcio

PRP-Trombina y calcio Resultados

PDGF-AA 6.674 5.931 Factor secretado plaquetario

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PDGF-AB 9.352 9.556 Factor secretado plaquetario

PDGF-BB 8.072 7.886 Factor secretado plaquetario

IGF-1 0.038 0.302 Factor plasmático

TGF-β1 5.912 4.143 Factor secretado plaquetario

TGF-β2 5.574 3.850 Factor secretado plaquetario

TGF-β3

No detectado

EGF 9.243 8.386 Factor secretado plaquetario

IL-5 2.568 2.539 Factor plasmático

IL-6 0.303 0.388 Factor plasmático

Eotaxin 5.829 6.169 *

bFGF 0.101 1.173 Factor plasmático

G-CSF 0.081 0.097 Factor plasmático

GM-CSF 0.711 0.716 Factor plasmático

HGF 2.657 2.469 Factor plasmático

IFNα 4.188 2.514 Factor secretado plaquetario

IL-1β 0.480 0.590 Factor plasmático

IL-2 0.869 0.882 Factor plasmático

IL-2R 0.604 0.256 Factor plasmático

IL-4 4.894 4.003 Factor secretado plaquetario

IL-7 1.881 1.739 Factor plasmático

IL-1RA 1.216 0.856 Factor plasmático

IL-8 10.590 9.597 Factor secretado plaquetario

IL-10 1.433 1.357 Factor plasmático

IL-12 2.079 1.070 Factor plasmático

IL-13 3.884 3.901 Factor secretado plaquetario

IL-15 0.001 0.337 Factor plasmático

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IL-17 3.911 3.902 Factor secretado plaquetario

VEGF

No detectado

IFNγ

No detectado

IP-10 3.131 3.288 Factor plasmático

MCP-1 4.247 4.392 *

MIG 1.462 1.136 Factor plasmático

MIP-1α 0.750 1.046 Factor plasmático

MIP-1β 3.341 2.442 Factor plasmático

RANTES 0.463 0.839 Factor plasmático

TNFα 6.752 4.584 Factor secretado plaquetario

Determinación de citoquinas secretadas por plaquetas usando la prueba de Tukey post-hoc, valor q =3.68 (k=3,

n=6,α=0.05) *Diferencia estadísticamente significativa

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