“COLORACIÓN VITAL”

1. Objetivo: Reconocer y diferenciar las bacterias gram positivas y negativas.

2. Marco teorico:

Bacterias

Una bacteria es un «organismo formado por una sola célula, de pequeño tamaño. La estructura celular bacteriana es procariótica y se caracteriza porque su región nuclear, nucleoide, no está rodeada de membrana, consta de una sola molécula de DNA y su división no es mitótica. Carece de estructuras citoplásmicas, por lo que los ribosomas están repartidos por el citoplasma y le confieren un aspecto granular. Además, el citoplasma puede contener gránulos o inclusiones con material de reserva de lípidos, glucógeno, azufre, etc.La pared celular rodea a la membrana citoplasmática y da forma, rigidez y resistencia a la célula; también puede contener peptidoglicano y lipopolisacáridos, compuestos que únicamente se encuentran en estos microorganismos. La estructura y la composición de la pared dividen a la mayoría de las bacterias en dos grupos: grampositivas y gram-negativas. Ciertas especies de bacterias producen en su interior estructuras especiales denominadas endosporas y la mayoría de las especies tienen una morfología celular característica: pueden ser esféricas, bacilares, helicoidales, con forma de coma e incluso cuadradas. Unas son móviles y otras no; algunas obtienen energía de los compuestos orgánicos; otras, mediante fotosíntesis, y las hay que utilizan compuestos inorgánicos, como azufre o hierro, como fuente de energía. Aunque la mayoría se multiplican a temperaturas medias, hay algunas que crecen a -20º C y otras se desarrollan en ambientes de 110º C. También la función de las bacterias en la naturaleza es muy diversa: unas especies son patógenas para el hombre y otras lesionan a las plantas. Un grupo de especies bacterianas interviene en la degradación de la materia, manteniendo el ambiente y la atmósfera en un equilibrio que permite la vida, y distintas especies participan en la producción de alimentos y bebidas fermentadas, así como en la obtención de productos químicos. Entre las distintas bacterias cabe mencionar a los Mycoplasmas, que carecen de pared; los flagelos, que intervienen en la movilidad; las fimbrias, que favorecen la fijación de bacterias sobre las superficies, y la cápsula, que también tiene funciones de adherencia». Para realizar una clasificación preliminar de las bacterias se utiliza su tamaño (de 1 a 20 Jim o más), forma (esferas, bastoncillos, espirales) y disposición espacial (células aisladas, en cadenas y formando cúmulos)- morfologías microscópicas y macroscópica-; mientras que su clasificación definitiva se refiere a sus propiedades fenotípicas y genotípicas.

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Las paredes celulares gram-negativas son más complejas (tanto desde el punto de vista estructural como químico) que las de las células grampositivas. Desde el punto de vista estructural, una pared celular gram-negativa contiene dos

capas situadas en el exterior de la membrana citoplásmica. Inmediatamente por fuera de la membrana citoplásmica se encuentra una delgada capa de peptidoglicano que representa tan sólo un 5% a 10% del peso de la pared celular. Además, la pared celular gram-negativa no contiene ácidos teicoicos ni lipoteicoicos.En la parte externa de la capa de peptidoglicano se halla la membrana externa, la cual es exclusiva de las bacterias gramnegativas.

La zona comprendida entre la superficie externa de la membrana citoplásmica y la superficie interna de la membrana externa se conoce como espacio periplásmico. Este espacio es un compartimento que contiene diversas enzimas hidrolíticas importantes para la degradación y metabolización por la célula de las macromoléculas de gran tamaño. Habitualmente, estas enzimas son proteasas, fosfatasas, lipasas, nucleasas y enzimas metabolizadoras de hidratos de carbono.En el caso de las especies bacterianas gram-negativas patógenas, muchos de los factores de virulencia líricos (p. ej., colagenasas, hialuronidasas, proteasas y betalactamasa) se encuentran en el espacio periplásmico. Además, este espacio contiene también componentes de los sistemas de transporte de azúcares, así como otras proteínas de unión que facilitan la captación de diferentes metabolitos y otros compuestos. Asimismo, algunas de estas proteínas de unión pueden formar parte de un sistema quimiotáctico encargado de «percibir» el entorno extracelular.

Tal como se ha mencionado anteriormente, las membranas externas son características de los procariotas gram-negativos. La membrana externa forma una especie de rígido saco de lona alrededor de la bacteria. La membrana externa mantiene la estructura bacteriana y constituye una barrera impermeable a moléculas de gran tamaño (p. ej., proteínas como la lisozima) y moléculas hidrófobas. También ofrece protección frente a condiciones ambientales adversas (p. ej., el sistema digestivo del organismo anfitrión, un factor importante en los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae). La membrana externa posee una configuración asimétrica y es una bicapa lipídica que difiere de cualquier otra membrana biológica por la estructura de su zona externa. … Sin embargo, la zona externa está formada fundamentalmente por una molécula anfipática (es decir, con terminaciones tanto hidrófobas como hidrófilas) denominada lipopolisacárido (LPS).

Con excepción de las moléculas de LPS presentes en el proceso de síntesis, la zona externa de la membrana externa es la única localización donde aparecen moléculas de LPS.

El LPS también es conocido como endotoxina y constituye un potente estimulador de las respuestas inmunitarias. El lipopolisacárido se encarga de activar a los linfocitos B y de inducir la liberación de interleucina-1, interleucina-6, factor de necrosis tumoral y otros factores por parte de los macrófagos, las células dendríticas y otras células. El lipopolisacárido provoca también la aparición de fiebre e, incluso, shock. Tras la liberación de grandes cantidades de endotoxina al torrente circulatorio tiene lugar la llamada reacción de Schwartzman (coagulación intravascular diseminada). El lipopolisacárido se libera tanto hacia el medio como hacia el entorno

intercelular del organismo anfitrión a partir de las bacterias presentes. Asimismo, las bacterias pertenecientes al género Neisseria se desprenden de grandes cantidades de un compuesto afín, el lipooligosacárido (LOS), que también provoca la aparición de fiebre y síntomas graves.Aunque la gama de proteínas presentes en las membranas externas de los gram-negativos es limitada, algunas de ellas se encuentran a una concentración elevada, con lo que el contenido proteico total es superior al que existe en la membrana citoplásmica. Muchas de estas proteínas atraviesan toda la bicapa lipídica, por lo que se habla de proteínas transmembrana.

Un grupo de ellas recibe el nombre de porinas puesto que forman poros que permiten la difusión a través de la membrana de moléculas hidrófilas de menos de 700 Da de peso. Aunque el canal de la porina permite el paso de metabolitos y antibióticos hidrófilos de pequeño tamaño, actúa como barrera frente a antibióticos hidrófobos o de gran tamaño, así como frente a proteínas como la lisozima.Igualmente, la membrana externa contiene proteínas estructurales y moléculas receptoras para los bacteriófagos y otros ligandos. La membrana externa se conecta a la membrana citoplásmica a través de unas zonas de adhesión y, por otra parte, se une al peptidoglicano por medio de una lipoproteína.Esta lipoproteína se une al peptidoglicano por un enlace covalente y también se ancla a la membrana externa.

Las zonas de adhesión proporcionan una vía membranosa para el paso de los componentes recién sintetizados de la membrana externa hacia esta.La membrana externa se mantiene mediante enlaces catiónicos divalentes (Mg+2 y Ca+2) formados entre los fosfatos de las moléculas de LPS y por interacciones hidrófobas entre el LPS y las proteínas existentes. Estas interacciones producen una membrana rígida y fuerte que puede verse afectada por la acción de antibióticos (p. ej., polimixina) o mediante la eliminación de los iones de magnesio y calcio (quelación con ácido etilendiamino-tetraacético [EDTA] o tetraciclina). La alteración de la membrana externa debilita a la bacteria y favorece el paso de moléculas hidrófobas de gran tamaño. La adición de lisozima a células con una membrana externa alterada produce unos esferoplastos que, al igual que los protoplastos, son sensibles a los cambios osmóticos.

BACTERIAS GRAMPOSITIVAS Una bacteria grampositiva posee una pared celular gruesa que, consta de varias capas y está formada principalmente por peptidoglicano (150 a 500 A) que rodea la membrana citoplásmica. El peptidoglicano es un exoesqueleto en forma de malla con una función semejante a la del exoesqueleto de los insectos.Sin embargo, y a diferencia de esta última estructura, el peptidoglicano de la célula es lo suficientemente poroso como para permitir la difusión de los metabolitos a la membrana plasmática.

El peptidoglicano es un elemento clave para la estructura, la replicación y la supervivencia de las células en las condiciones normalmente hostiles en las que proliferan las bacterias. Durante una infección, el peptidoglicano puede

interferir en la fagocitosis y estimular diversas respuestas inmunitarias, como procesos pirogénicos (es decir, que inducen la aparición de fiebre).

El peptidoglicano puede degradarse mediante el tratamiento con lisozima. La lisozima es una enzima presente en la mucosidad y las lágrimas del ser humano que también producen las bacterias y otros microorganismos. Esta enzima es capaz de degradar el esqueleto de glicano del peptidoglicano.Sin el peptidoglicano, la bacteria sucumbe a las grandes diferencias de presión osmótica existentes a uno y a otro lado de la membrana citoplásmica y experimenta un fenómeno de lisis.

La eliminación de la pared celular produce un protoplasto, el cual experimenta un proceso de lisis a no ser que se estabilice osmóticamente.La célula grampositiva puede poseer también otros componentes, como los ácidos teicoicos y lipoteicoicos, y polisacáridos complejos (generalmente denominados «polisacáridos C»). La proteína M de los estreptococos y la proteína R de los estafiloco-cos también se asocian al peptidoglicano.Los ácidos teicoicos son unos polímeros hidrosolubles de fosfatos de poliol que están unidos al peptidoglicano mediante enlaces covalentes y son fundamentales para la viabilidad celular. Los ácidos lipoteicoicos poseen un ácido graso y se encuentran unidos a la membrana citoplásmica. Estas moléculas son antígenos de superficie frecuentes que diferencian los serotipos bacterianos y favorecen la fijación a otras bacterias y a receptores específicos localizados en la superficie de las células de los mamíferos (adherencia).

Los ácidos teicoicos constituyen unos señalados factores de virulencia. Los ácidos lipoteicoicos son expulsados hacia el medio circundante y al medio intercelular del organismo anfitrión y, aunque débiles, son capaces de desencadenar respuestas inmunitarias semejantes a las de las endotoxinas.

Se llaman bacterias grampositivas a las que no poseen una membrana externa para proteger el citoplasma bacteriano, tienen una gruesa capa de peptidoglicano y presentan ácidos teicoicos en su superficie. Así mismo presentan una mayor resistencia a los antisepticos. Desde el punto de vista morfológico encontramos en esta clasificación, cocos y bacilos.

La pared celular de las bacterias Gram positivas

Sus principales características son:

La red de mureína esta muy desarrollada y llega a tener hasta 40 capas Los aminoácidos implicados varían de una especie a otra. La constitución del esqueleto es característica de la especie y constituye

una buen parámetro taxonómico Es frecuente la presencia de los aminoácidos L-diaminopimélico o de

lisina Los polisácaridos están unidos por enlaces covalentes (en el caso de

tenerlos) Su contenido proteico es bajo. En ella se encuentran ácidos teicoicos

La pared celular de las bacterias Gram negativas

La red de mureína presenta una sola capa La constitución del saco de mureína es igual en todas las bacterias Gram

negativas. Contiene siempre únicamente meso-diaminopimélico Nunca contiene lisina No se encuentran puentes interpeptídicos. Se encuentran grandes cantidades de lipoproteínas y lipopolisacáridos

que representan hasta el 80 % del peso seco de la pared celular. Para mantener la estabilidad de las capas de lipopolisacáridos es necesario el ión Ca++.

En las bacterias Gram negativas la capa de mureína puede ser atacada por la lisozima cuando se las trata con EDTA (Etilen-diamino-tetracético). Este agente, al quelar el Ca++ libera una parte de los lipopolisacáridos y permite la acción de la enzima.

Hasta ahora no han podido demostrarse ácidos teicoicos

Según se cuenta el descubrimiento de la lisozima tuvo lugar cuando las lagrimas de un niño (que estaba en el laboratorio donde trabajaba Fleming), caen en un tubo y aclaran una suspensión Micrococcus lysodeikticus, que, hoy se sabe, es la bacteria mas sensible a la lisozima, ma siii....

Este hecho esta un poco menos difundido que la novelesca historia de la espora de Penicilium que entro por la ventana del laboratorio de Fleming, cayo en una placa de Petri y al crecer puso de manifiesto la acción bactericida del antibiótico que llamo penicilina....( Florey y Chain en Oxford la aislaron, dieron las pautas de su producción industrial y al hacerlo pusieron en marcha la era de los antibióticos, por ello, Fleming , Florey y Chain recibieron el premio Nobel en 1945 )

La lisozima descubierta en 1922, es una enzima que rompe el enlace beta glucosídico de la mureína. Se la encuentra en el líquido lagrimal, secreciones nasales y en la clara de huevo. También se la ha aislado de bacterias y bacteriófagos. La acción de la lisozima se pone en evidencia por un aclaramiento rápido de una suspensión bacteriana, Micrococcus lysodeikticus ya se lisa con 1 ug de lisozima / ml. Para lisar otras bacterias p.e Bacillus megaterium se necesitan 50 ug / ml . La capa de mureína de muchas bacterias Gram negativas solo es atacada por la lisozima cuando se añade EDTA (Etilen-diamino-tetracético).

El mecanismo de lisis es el siguiente: la destrucción de la pared celular deja al protoplasma de las bacterias rodeado únicamente por la membrana celular ("protoplasto"), lo cual convierte a la bacteria en un organismo extraordinariamente sensible a las variaciones de tonicidad del medio, esta es la base del fenómeno de aclaración que tiene lugar luego de la acción de la lisozima, cuando la solución es  hipotónica.

3. Materiales

Microscopio electrónico. Laminillas Laminas Cultivo vivo de bacterias Set gram

o Cristal de violetao Lugolo Alcohol acetonao Safranina

4. Procedimiento.

Procedimiento de coloración Gram

o Cristal de violeta: agregamos unas gotas a la muestra y dejamos un minuto, lavamos.

o Lugol: agregamos unas gotas, y dejamos reposar 30 segundos, lavamos

o Alcohol acetona: agregamos unas gotas, dejamos reposar un minuto y lavamos, si la muestra esta transparente se deja de lo contrario nuevamente se realiza este paso.

o Safranina: colocamos unas gotas y dejamos reposar por 30 segundos, lavamos y lo dejamos secar para llevarlo al microscopio.

Primera muestra- estaphylococus

- raspamos un poco de piel- Hacemos el frotis en la lamina- Dejamos secar y coloreamos con el set gram

Segunda muestra- Bacilo de koch

- La muestra ya perparada la colocamos al microscipio y observamos

Tercera muestra- gonococus

- La muestra ya perparada la colocamos al microscipio y observamos

5. Observaciones/resultados

¿Por qué las gram negativas se tiñen de color rojo y las gram positivas de azul?

Esa característica es debida a diferencias en la composición química de sus psaredes celulares, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa.El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas).

El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen. Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.

6. Conclusiones

- Aprendimos a diferenciar bacterias gram positivas y negativas, gracias a la coloración gram.

- Las bacterias gram negativas se tiñen de rojo.- Las gram positivas se tiñen de azul- Mayormente los cocos son gram positivos- Mayormente los vacilos son gram negativos

100*10

zoom optico

7. recomendaciones

- actuar con mucho cuidado, con respecto a la utilización de materiales y de muestras, se sebe tratar con sumo cuidado los microscopios.

- Realizar los procedimientos correctamente para no tener inconvenientes ni fallas en los resultados.