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Colture cellulari
Colture cellulari
Cellule che si moltiplicano “in vitro” per una o più generazioni, utilizzate nella ricerca come modello sperimentale in innumerevoli tipi di esperimenti.
Sono utilizzate per analizzare l'effetto di farmaci e verificare tossicità, mutagenicità e cancerogenicità delle sostanze. Vengono inoltre utilizzate come modello in cui studiare effetto dell'espressione di particolari geni.
Vantaggi: ! Controllo condizioni ambientali ! plasticità dei modelli ! Caratterizzazione ed omogeneità ! Economicità e rapidità risposta ! Riduzione sperimentazione in vivo
Svantaggi: • Perdita di funzioni organo-specifiche e di alcune attività enzimatiche • Accelerazione del ciclo cellulare • Alterazioni morfologiche e delle proprietà antigeniche
Colture cellulari
Colture cellulari
Colture a termine (Colture Primarie)
La coltura da espianti viene definita coltura a termine per indicare che le cellule isolate da qualsiasi tessuto animale sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro per poi andare incontro a degenerazione e morte.
Colture continue (Linee Cellulari) Sono cellule in cui mutazioni spontanee o indotte hanno annullato il programma genetico della senescenza. Possono essere coltivate in vitro per un tempo indefinito
TIPO DI PREPARAZIONE
SISTEMI INTATTI
COLTURE D’ORGANO
COLTURE PRIMARIE
LINEE CELLULARI
Alterazioni rispetto alla situazione in vivo 0 ++ +++ ++++
Livello organizzazione tissutale ++++ ++++ + 0
riproducibilità ++++ ++++ + ++++ accessibilità + ++ +++ ++++ Manipolazioni genetiche + + + +++
Alterazioni genetiche per mutazione o selezione
+ + Da + a ++++
Controllo ambientale + ++ ++++ ++++
Colture cellulari: tipologie
Colture cellulari
ADERENTI SEMI-ADERENTI SOSPENSIONE
L’adesione è un fenomeno attivo che richiede l’interazione dei recettori di membrana, le integrine, con le proteine adesive, quali la fibronectina, adsorbite sulla piastra di coltura.
Colture cellulari: tipologie
cellule fusiformi fibroblasti
cellule poligonali cell. epiteliali
Colture di cellule aderenti
Le cellule aderenti vengono poste in piastra o in fiasca e crescono fino ad occupare l’intera superficie disponibile.
Piastrada6cmdidiametro:25cm2
Piastrada10cmdidiametro:55cm2
Fiaschepiccole:25cm2
Fiaschegrandi:75cm2
Le piastre per colture cellulari aderenti sono in polistirene ma sono trattate per renderle idrofile e cariche negativamente. In tal modo il polistirene lega stabilmente la fibronectina e la vitronectina presenti nel siero che permettono l’adesione di diversi tipi di cellule.
Dove trovare le linee cellulari:
• Produzione in laboratorio
• Banche cellule
– American Tissue Culture Centre (USA) (www.atcc.org)
– European Collection of Cell Culture (www.hpacultures.org.uk)
– National Cell Culture Center (USA) (www.nccc.com)
– German Collection of Microorganism and Cell Culture (www.dsmz.de)
– IZS Centro Substrati Cellulari (www.bs.izs.it)
– IST Servizio Biotecnologie (www.biotech.ist.unige.it)
– Interlab Cell Line Collection (www.iclc.it)
Fabbisogni nutrizionali/ambientali
• Terreni
• Reagenti
• Siero
• pH
• Temperatura
• Umidità relativa
• O2, %CO2
Terreni di coltura più usati
• Eagle’s Basal Medium (BME, EMEM) • Minimum Essential Medium (MEM) • Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) • Nutrient Mixture F-10 (HAM’s F-10) e Nutrient
Mixture F-12 (HAM’s F-12) • DMEM/HAM’s F-12 • Medium 199 • NCTC Medium • RPMI 1630 Medium • RPMI 1640 Medium
Questi terreni differiscono tra loro per il contenuto in a.a. e sali e per la concentrazione di glucosio
Terreni: composizione
Amminoacidi Arginina Cistina Glutammina Istidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Tirosina Valina
Vitamine Biotina Colina Folato Nicotinammide Pantotenato Piridossale Tiamina Riboflavina
Sali NaCl KCl NaH2PO4 NaHCO3 CaCl2 MgCl2
Vari Glucosio Rosso Fenolo
Penicillina Streptomicina
Siero
NEAA
Sodio Piruvato
MEM
Glutammina
Il terreno al momento dell’uso viene completato con:
• Formulazione aspecifica di fattori di crescita
• Sostegno alla crescita per molti tipi cellulari
• Aumenta la capacità tampone
• Protegge dai danni meccanici
• Facilita l’adesione
Siero Bovino (FBS, FCS, NCS)
Cavallo (DHS)
Prima del suo utilizzo, il siero viene disattivato in stufa a 56°C per 30’ allo scopo di eliminare il Sistema del Complemento, che potrebbe interferire con la crescita delle cellule.
SIERO
I terreni sono provvisti dell’indicatore rosso fenolo
7.3 6.8-7.0 > 7.6 pH
Il colore viola indica che le cellule non sono metabolicamente attive o che la regolazione della CO2 è errata.
Terreni: indicatore
Con il proliferare delle cellule il terreno tenderà al giallo a causa dell’acidificazione prodotta dalla CO2 proveniente dal metabolismo cellulare.
L’equilibrio di dissociazione del sistema tampone HCO3
-/H2CO3 è descritto dalla legge d’azione di massa, espressa come equazione di Henderson-Hasselbach, nella quale l’H2CO3 è inserito sotto forma di pCO2 moltiplicata per un coefficiente di solubilità della CO2 in H2O (si ottiene un dato in mEq/L)
HCO3-
0.0301 pCO2
pH = 6.1 + log
CO2 + H2O H2CO3 HCO3- + H+
CO2 e pH La pressione parziale di CO2 usata nella coltura delle cellule corrisponde alla pCO2 misurata all’interno dei tessuti (35-45 mmHg). In questo modo l’incubatore riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle cellule.
Zavizion et al., 1996 Doubling Time, h 33°C 37°C 39
BME-UV1 cells 52-54 22-24 36-38
Crescita e Temperatura Le cellule possono sopportare l’ipotermia (sono conservate congelate) ma la loro attività metabolica è notevolmente disturbata.
Non possono sopportare l’ipertermia (anche piccoli aumenti di temperatura per brevi periodi possono far morire le cellule). Una temperatura di 43°C per pochi minuti provoca la morte per apoptosi.
L’umidità relativa RH è un parametro che è portato ad un livello elevato (RH >98%) senza necessariamente essere controllato. L’energia fornita dall’incubatore serve sia a mantenere la temperatura che ad evaporare l’acqua dall’apposito vassoio per portare il livello di umidità relativa alla giusta percentuale. L’obiettivo è di limitare l’evaporazione dell’acqua contenuta nei terreni di coltura per non provocare un aumento della pressione osmotica.
Crescita e umidità relativa
Disidratazione del terreno di coltura: ogni punto corrisponde ad una apertura della porta dell’incubatore
Miniaturizzazione supporti di crescita e RH
Piastra a 96 pozzetti: disidratazione del terreno di coltura dopo 72 h (% di disidratazione)
Colture di cellule aderenti
Le cellule aderenti vengono poste in piastra e crescono fino ad occupare l’intera superficie disponibile
Coltura confluente
A confluenza la crescita si arresta e le cellule devono essere trasferite in nuove piastre
72h48h24h 96h
Diagramma di crescita cellulare in vitro
arresto della crescita a confluenza
fase logaritmica di crescita
Subcolture Routine
conteggio
37°C, 5% CO2, 100% umidità, 3-5 giorni
esperimento
Tripsina 0.05% EDTA 0.53 nM
congelamento
scongelamento
semina
Prevenzione della contaminazione
Sono possibili differenti tipi di contaminazione
I principali tipi di contaminanti microbici :
Batteri e funghi
Micoplasma
Virus
La contaminazione può avvenire:
Errore dell’operatore
Terreni contaminati
Cappa a flusso laminare non funzionante
Incubatore contaminato
Conservazione in azoto liquido contaminato
Precauzioni per la prevenzione delle contaminazioni: 1) I terreni e le soluzioni che si usano devono essere tutti sterili
2) Aggiungere penicillina-streptomicina per scongiurare il pericolo di
contaminazioni da batteri; anfotericina B (se non tossica per le
cellule) contro i miceti.
3) Destinare il laboratorio solo alle colture cellulari
4) Operare sempre sotto cappa a flusso laminare
5) Utilizzare solo materiale sterile (di vetro o di plastica)
6) Utilizzare sempre pipettatori elettrici
7) Pulire bene la cappa a inizio e fine lavoro
8) Controllare periodicamente i filtri della cappa
9) Mantenere con attenzione ben pulito l’incubatore a 37°C
Prevenzione della contaminazione
Il laboratorio per le colture cellulari
incubatorecappa
centrifuga
microscopio
Test di vitalità cellulare e Citotossicità
La citotossicità è la proprietà di una sostanza di produrre a livello cellulare un qualche effetto tossico che si manifesta sottoforma di deviazioni dalla normale morfologia e funzionalità cellulare. I test di citotossicità rappresentano un “metodo di valutazione“ dei danni biologici provocati dalle sostanze.
Test più diffusi:
Trypan Blue
MTT
LDH
Test di vitalità cellulare
Saggio con il Trypan Blue Il Blu Tripano è un colorante utilizzato nel test di determinazione della vitalità cellulare. Questo colorante permette di discriminare tra le cellule vitali e quelle morte in quanto è assunto solo dalle cellule morte.
A= media delle cellule vive B= media delle cellule morte C= fattore di diluizione D= fattore di conversione in ml
Concentrazione cellule vive= A*C*D Concentrazione cellule morte=B*C*D
Volume della conta = 0,1x 1 mm2=0,1 mm3 Fattore di conversione= 104
(0,1 mm3=0,1ul= 10-4ml)
Punti cruciali
" Un’adeguata accuratezza della misura si ottiene contando almeno 100 cellule
" Il Trypan blue è tossico ed è un potenziale cancerogeno
" Le cellule devono essere ben distinte e uniformemente distribuite
" Evitare la presenza di bolle e detriti
" Non riempire eccessivamente la camera
" Se le cellule sono poche, operare una nuova centrifugazione e risospendere in meno terrreno
Test di vitalità cellulare
MTT(giallo)
Formazano(azzurro)
Il saggio MTT è un saggio colorimetrico standard per la misurazione dell'attività degli enzimi che riducono l‘MTT (bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio) a formazano, conferendo alla sostanza un colore blu/violaceo. L'enzima mitocondriale succinato deidrogenasi (reduttasi), è attivo infatti soltanto nelle cellule vive e la sua funzione consiste nel tagliare l'anello di tetrazolio dell‘ MTT (sostanza di colore giallo) con la formazione, di conseguenza, di formazano (blu).
Saggio dell’MTT
Tale reazione è valutata e misurata mediante la lettura spettrofotometrica del campione, alla lunghezza d'onda di 570 nm. Ciò accade prevalentemente nei mitocondri; questo saggio può essere utilizzato per determinare la citotossicità di farmaci o altri tipi di sostanze chimicamente attive e potenzialmente tossiche.
Saggio dell’MTT
Un test di citotossicità sfrutta una reazione che normalmente avviene
all’interno delle cellule. L’enzima Lattato Deidrogenasi (LDH) è un enzima
Saggio di Citotossicità
LDHLDH
normalmente presente nel citoplasma
delle cellule e catalizza la reazione di
trasformazione del lattato in
piruvato.
In seguito ad un danno alla parete
cellulare l’enzima LDH dal citoplasma
si riversa all’esterno della cellula, e nel
caso di cellule in vitro, nel mezzo di
coltura.
Il test di citotossicità accoppia alla reazione dell’enzima Lattato
Deidrogenasi una reazione contraria dove il substrato è un composto
profluorescente (la Resazurina) che viene trasformato dall’enzima
Diaphorase in un composto fluorescente (la Resorufina).
Eccitatoa560nm
Emissionea590nm
Saggio di Citotossicità
Trasfezione
DNA TRASFEZIONE Non virale
INFEZIONE virale
Transiente Stabile
Linee ingegnerizzate: Linee transfettate con un gene di interesse (es. espressione di particolari recettori, modificazione di vie metaboliche, ecc)
Trasfezione
Transiente: Si usa per saggi a breve termine o
quando non è possibile ottenere cloni stabili
Stabile: si usa quando si devono fare esperimenti di lunga durata, quando si vuole maggiore
riproducibilità o quando l’efficienza di trasfezione in transiente è troppo bassa.
HBS 2X
DNA +
CaCl2
Coprecipitato DNA/Fosfato di Calcio
Principali metodiche di trasfezione di cellule di mammifero
Il coprecipitato si deposita sulle cellule e viene
fagocitato
Il DNA entra nel nucleo e il gene estraneo viene
espresso
1) Precipitazione con Fosfato di Calcio
! NO attrezzature particolari ! Reagenti facilmente disponibili e a basso costo ! OK diversi tipi cellulari ! OK trasfezioni stabili
2) Lipofezione 3) Elettroporazione
Principali metodiche di trasfezione di cellule di mammifero
Per staccare le cellule dal fondo si utilizza una soluzione di EDTA e tripsina
EDTA = chela il Ca++ ed il Mg++ indispensabili per l’adesione
Tripsina = degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule aderenti.
Le cellule staccate devono essere riseminate in numero adeguato: non crescono in modo efficiente e vanno incontro
a morte se seminate al di sotto di una certa densità
Conteggio
Camera di Burker
1 mm
V=1mm2x0,1mm=10-4 ml
Crioconservazione delle colture cellulari
Banca Cellulare
Indicazioni generali:
• Congelamento lento (pochi gradi al minuto)
• Scongelamento rapido (subito a 37 °C)
• Vitalità superiore al 90%
• Cellule in fase di crescita logaritmica
• Alta percentuale di siero (>20%)
• Criopreservante: DMSO (10%) o glicerolo
• Conservazione a T < -135°C (vapori di azoto, o azoto liquido)
• Sistema di catalogazione