comparacion de tres mÉtodos microbiolÓgicos en la
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COMPARACION DE TRES MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS EN LA CUANTIFICACION DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES Y Escherichia
coli EN JAMONES DE PLAZAS DE MERCADO
MAYRA VIVIANA MEDRANO MEDINA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS AREA DE MICROBIOLOGIA
BOGOTÁ D.C. 2004
2
COMPARACION DE TRES MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS EN LA CUANTIFICACION DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES Y Escherichia
coli EN JAMONES DE PLAZAS DE MERCADO
MAYRA VIVIANA MEDRANO MEDINA
Monografía presentada como Requisito parcial para culminar
OPCION EN MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS E
INDUSTRIA
Directora: Dra . MARIA CONSUELO VANEGAS Profesor Asistente
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS AREA DE MICROBIOLOGIA
BOGOTÁ D.C. 2004
3
AGRADECIMIENTOS
A mi directora, Maria Consuelo Vanegas, por su confianza y apoyo incondicional,
por su experiencia y conocimientos siendo una guía constante, por haberme permitido
profundizar mis conocimientos en el área de alimentos y por permitirme desarrollar
mis capacidades como microbióloga.
A Johanna Rojas, por su colaboración.
A Aida Juliana Martinez por su constante ayuda..
Al Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos (LEMA), lugar donde realicé
todos mis análisis.
A Riguey Cecilia Medina, por su confianza y su apoyo incondicional.
4
CONTENIDO
pág
1.INTRODUCCIÓN......................................................................................................7
2. JUSTIFICACIÓN ...............................................................................................9
3. OBJETIVOS .............................................................................................10
3.1 GENERALES ............................................................................................10
3.2 ESPECÍFICOS ............................................................................................10
4. MARCO TEORICO ............................................................................................11
4.1 ESCHERICHIA COLI ...........................................................................................11
4.1.1 GENERALIDADES............................................................................................11
4.1.2 ECOLOGIA ............................................................................................13
4.1.3 VIROTIPOS ............................................................................................15
4.1.4. PATOGENESIS ...........................................................................................11
4.1.4.1 E. COLI ENTEROTOXIGENICA (ETEC) ....................................................16
4.1.4.2. E. COLI ENTEROPATOGENA (EPEC) .......................................................18
4.1.4.3. E. COLI ENTEROHEMORRAGICA (EPEC)...............................................18
4.1.4.4. E. COLI ENTEROINVASIVA (EPEC)..........................................................19
4.1.4.5. E. COLI ENTEROAGREGATIVA (EAggEC)..............................................20
4.1.5 IMPORTANCIA EN ALIMENTOS ................................................................ 20
4.2 PLAZAS DE MERCADO.....................................................................................24
4.3 JAMONES DE CERDO ........................................................................................26
4.4 RECUENTO EN PLACA EN VIOLETA ROJO BILIS
AGAR (VRBA)............................................................................................................28
4.5 DETERMINACION DE COLIFORMES Y E. COLI POR
5
NÚMERO MAS PROBABLE (NMP) ........................................................................29
4.6 SIMPLATE PARA COLIFORMES TOTALES Y E. COLI.................................30
5 MATERIALES Y METODOS..............................................................................31
5.1 SITIOS DE MUESTREO......................................................................................31
5.2 MUESTRAS..........................................................................................................32
5.3 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS.........................................................32
5.3.1 RECUENTO EN PLACA EN VRBA..............................................................33
5.3.2 NMP EN CALDO LMX..................................................................................34
5.3.3 SIMPLATE......................................................................................................35
6. RESULTADOS........................................................................................................36
6.1 CODIFICACION DE MUESTRAS.......................................................................36
6.2 DISTRIBUCION DE MUESTRAS SEGÚN PLAZA...........................................36
6.3 RESULTADOS SIMPLATE.................................................................................38
6.4 RESULTADOS RECUENTO EN PLACA:VRBA...............................................42
6.5 RESULTADOS NMP............................................................................................44
7. ANALISIS ESTADÍSTICOS...................................................................................47
8. DISCUSION DE RESULTADOS.........................................................................51
8.1 SIMPLATE............................................................................................................51
8.2 VRBA....................................................................................................................54
8.3 NMP.......................................................................................................................55
8.4 COMPARACIÓN DE LOS TRES MÉTODOS....................................................57
8.5 CALIDAD MICROBIOLÓGICA DE LOS JAMONES.......................................59
9. CONCLUSIONES.................................................................................................62
10. SUGERENCIAS....................................................................................................64
BIBLIOGRAFÍA.........................................................................................................65
6
ANEXOS......................................................................................................................68
ANEXO 1. Codificación de muestras..............................................................68
ANEXO 2. Resultados Simplate para Coliformes Totales..............................71
ANEXO 3. Resultados Simplate para E. coli..................................................73
ANEXO 4. Recuento en UFC/g de Coliformes Totales Por el método
Recuento en Placa en VRBA............................................................................75
ANEXO 5. Resultados NMP Para Coliformes Totales y E. coli......................77
ANEXO 6. Tabla Simplate ..............................................................................79
ANEXO 7. Tabla del NMP .............................................................................80
7
1. INTRODUCCIÓN
La familia Enterobacteriaceae (6) comprende bacilos cortos y cocobacilos gram
negativos, no esporulados, anaerobios facultativos, quimiorganotrofos y que producen
ácido a partir de carbohidratos. El grupo de coliformes incluye varios géneros, siendo
el más importante el género Escherichia. Es un grupo muy importante de
microorganismos que fermentan la lactosa, y se encuentran ampliamente distribuidos
en la naturaleza, el agua y el suelo. Existen varios métodos para detectar coliformes
en aguas, bebidas y alimentos,(12) utilizando medios de cultivos como Agar Mac
Conkey, Agar EMB, Agar VRBA, Caldo LMX y Agar Fluorocult entre otros. Desde
hace algunos años, se han incluidos sustratos en el medio de cultivo para detectar de
esta forma enzimas específicas de algunos grupos de microorganismos, que se pueden
evidenciar por métodos fluorogénicos (fluorescencia con luz UV) o cromogénicos
(cambio de color). Para coliformes, es común la enzima β-galactosidasa y para E. coli
se busca detectar la enzima glucuronidasa.
E. coli es un coliforme que ha sido muy estudiado desde hace muchos años debido
a que es un instrumento muy importante de genética y fisiología bacteriana. Es un
bacilo corto gram negativo, habitante natural del intestino de los seres humanos y de
animales de sangre caliente y es una causa común de enfermedades transmitidas por
alimentos (ETA’s). Causa infecciones intestinales y gastrointestinales debido a
potentes factores de virulencia, especialmente por ingestión de alimentos o bebidas
contaminadas. Fermenta la lactosa, por esta razón el medio VRBA (Violeta Rojo Bilis
8
Agar) es útil para identificarla. Su crecimiento óptimo es a 37 °C, Es glucoroxidasa +,
por esta razón presenta fluorescencia en medios como LMX ( Fluorocult).
Su identificación está contemplada dentro de los análisis de rutina de varios
alimentos, entre ellos el agua, ya que existen algunas cepas altamente patógenas,
causantes de diarrea e infecciones alimentarias. En ciertos casos, puede ser indicativo
de contaminación fecal, especialmente cuando se encuentra en verduras frescas. Por
esta razón, la legislación Colombiana dicta que no debe estar presente en alimentos
como agua potable, y existen unos rangos de tolerancia para ciertos tipos de
alimentos.
Existen algunos serotipos altamente patógenos, como es el serotipo O157:H7. E. coli
0157:H7 vive en el intestino del ganado vacuno que es saludable y puede contaminar
la carne durante el sacrifico del animal. La bacteria se destruyen cuando la carne se
cocina completamente .La fuente de transmisión más común es la carne molida
(hamburguesa), porque al ser molida riega los gérmenes en toda la carne. Estos
microorganismos también se han encontrado en la leche sin pasteurizar, carne asada
cruda, zumo de manzana sin pasteurizar, salami y a veces en vegetales que se
fertilizaron con estiércol (abono) de la vaca. Aunque no es posible evaluar de manera
rutinaria en la industria de alimentos si las cepas que se encuentren son de este
serotipo debido a recursos económicos, no se descarta la posibilidad que circule en
nuestro país.
9
2. JUSTIFICACIÓN
Dado que E. coli es una bacteria que además de ser indicador de contaminación fecal,
puede llegar a ser altamente patógena y causar inclusive hasta la muerte, y debido a
que los jamones de cerdo son productos de consumo masivo en las plazas de mercado
de Bogotá, este estudio aporta información clave sobre la circulación de esta bacteria
en este tipo de alimentos. Se tomaron muestras de distintos tipos de jamones de cerdo
en plazas de mercado, ya que un alto porcentaje de la población adquiere sus
alimentos en estos lugares. Los costos de los alimentos en plazas de mercado son un
poco más bajos que los precios de los supermercados, y debido a la situación
económica de nuestro país, cada vez son más los clientes de plazas de mercado.
Adicionalmente existe el factor cultural, el común de la gente piensa que los
alimentos son más sanos si vienen directamente del campo y si tienen menos
procesamiento. Por cultura, algunos bogotanos compran sus alimentos en plazas de
mercado; comprar en la plaza de mercado es una tradición. Sin embargo, se sabe que
las condiciones higiénicas y de manipulación de alimentos en las plazas de mercado
no son las ideales. Para evaluar estas condiciones higiénicas, es necesario realizar
análisis microbiológicos a los alimentos. Cada día son más los métodos rápidos de
detección que surgen, no solo para E. coli sino también para otras bacterias y
microorganismos en general. El Sistema SimPlate es uno de ellos. Se evaluó la
incidencia y la calidad microbiológica de los Jamones de cerdo según la Norma
Técnica Colombiana (NTC) 1325 para coliformes totales y E. coli por tres métodos
microbiológicos: NMP, recuento en placa en VRBA y Simplate, para lograr una
comparación de los tres métodos.
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3. OBJETIVOS
3.1 Generales
- Estudiar la calidad microbiológica de los jamones de cerdo en las plazas de
mercado determinando la incidencia bacterias coliformes totales y
Escherichia coli en Jamones de cerdo por tres métodos microbiológicos.
3.2 Específicos
- Comparar los resultados obtenidos para determinación de coliformes totales y
E. coli por tres métodos microbiológicos: recuento en Placa en VRBA,
Número mas Probable (NMP) en caldo LMX y el método de detección rápida
Simplate.
- Comparar la sensibilidad de cada método en la determinación de coliformes
totales y E. coli en Jamones de cerdo.
- Determinar el porcentaje de muestras fuera de Norma según la Norma Técnica
Colombiana NTC 1325 de acuerdo a los tres tipos de Jamones evaluados.
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4. MARCO TEORICO
4.1 Escherichia coli
4.1.1 Generalidades Escherichia
El género Escherichia comprende bacilos rectos cortos, gram negativos, que ocurren
naturalmente solos o en pares. Incluye las especies E. coli, E. blattae, E. fergusonii, E.
hermannii y E. vulneris. Su tamaño varía entre 1.1-1.5 X 2.0-6.0 µm (7). Muchas
cepas de este género poseen cápsulas o microcápsulas y algunos son mótiles
porflagelos peritricos y otras especies son no mótiles. Son quimiorganotrofos y
poseen un metabolismo respiratorio y fermentativo simultáneamente. Son anaerobios
facultativos y su temperatura óptima de crecimiento son 37˚C. Puede catabolizar D-
Glucosa y otros carbohidratos con la formación de ácido y gas. En cuanto a
bioquímicas, se presentan en la Tabla 1.
PRUEBA RESULTADO OXIDASA - CATALASA + ROJO METILO + VOGES PROSKAUER - CITRATO Usualmente - NITRATOS + L-ARABINOS + MALTOSA + D-MANITOL + D-MANOSA + L-RHAMNOSA + TREHALOSA + D-XILOSA + O-Nitrofenil-β-D-Galactopiranosida
+
H2S - UREA - LIPASA -
Tabla 1. Bioquímicas características del genero Escherichia
Ocurren naturalmente como flora normal en la parte baja del intestino de los animales
de sangra caliente.
12
Existen varias cepas de E. coli, y las que contienen enterotoxinas y/o otros
factores de virulencia, incluyendo factores de invasión y colonización, pueden causar
enfermedad diarreica. E. coli, también es causa común de infecciones en el tracto
urinario e infecciones nosocomiales incluyendo septicemia y meningitis (7).
Escherichia coli, generalmente es subdividida serológicamente o por la presencia de
factores de virulencia para identificar y caracterizar cepas patógenas
epidemiológicamente. La serotipificaación completa incluye los antígenos: somáticos
(O), capsulares (K) y flagelares (H).
E. coli, puede presentar problemas para su diferenciación de otras especies, ya que
junto son Shigella representa una sola especie genética, en donde las shigelas son
biogrupos no mótiles, metabólicamente inactivas. Existe un biogrupo de E. coli que
son no mótiles, lactosa negativas y anaerogénicas, las cuales se pueden confundir
fácilmente con el género Shigella.
De las cinco especies de este género, E. coli es la especie que generalmente se aísla de
humanos(10). Como ya se mencionó anteriormente, es parte de la flora normal del
intestino, sin embargo, ciertas cepas pueden causar infecciones extraintestinales e
intestinales en humanos sanos y en inmunosuprimidos. También causa comúnmente
bacteremia, meningitis y diarrea.
E. coli (Figura 1) se caracteriza por ser un anaerobio facultativo, fermentador de la
lactosa. Produce colicinas, que son bacteriocinas codificadas en plásmidos. Aunque
típicamente son indol positivas y lactosa positivas, se han reportado cepas lactosa
negativas, indol negativas, altamente patógenas.
13
Figura 1. Escherichia coli. Imágenes tomadas de www.nirgal.net/graphics/e_coli.jpg
(Izq) http://www.nature.com/genomics/images/e_coli_200.jpg (der).
4.1.2 Ecologia
E. coli se encuentra ampliamente distribuida en aguas, alimentos y es parte de la flora
normal del intestino animales de sangre caliente. El tracto intestinal consiste del
intestino delgado y el intestino grueso (figura 2), cada uno de los cuales esta
subdividido en estructuras anatómicas diferentes.
Figura 2. El Tracto Gastrointestinal. Imagen Tomada de http://www.tusalud.com.mx/ 120412.htm
El intestino delgado, está separado en dos partes: el duodeno y el íleo, y están
conectados por el yeyuno. El duodeno es bastante ácido, y por lo tanto no posee
microflora, pero el pH desde el duodeno hacia el íleo se vuelve menos ácido y el
número de bacterias aumenta. En el íleo bajo, se encuentran bacterias en la cavidad
14
intestinal (lumen), mezcladas con material digestivo. Números de 105-107 células/g
son comunes. En el colon, ya en el intestino grueso, se encuentran altos números de
bacterias, y se puede visualizar esta región como una cavidad de fermentación
especializada (9) . Muchas bacterias viven en el lumen, probablemente utilizando
algunos productos de la digestión de la comida como nutrientes. Aerobios
facultativos, como E. coli, están presentes en números inferiores a 107 células/g de
contenido intestinal. Dado que la actividad de estos aerobios facultativos consume
oxígeno, esto hace el ambiente del intestino grueso estrictamente anaeróbico y
favorable para el crecimiento de anaerobios obligados (9).
E. coli también contamina alimentos de consumo animal y humano. Hay
reportes de aislamientos de E. coli a partir de yogurt, aguas, carnes de pavo,
hamburguesas, vegetales, lácteos, mayonesa, jugos de manzana, cidra de manzana,
vinagretas de ensaladas, salami y carnes de cerdo, entre ellas, jamones de cerdo. La
contaminación de las carnes en canal ocurre comúnmente durante el sacrificio de los
animales, cuando se riega el contenido intestinal. Aunque generalmente no causa la
descomposición de frutas y hortalizas, si puede descomponer productos cárnicos
porque su hábitat es el intestino de animales de sangre caliente (9). También se
encuentra en el compost y en el abono que se le agrega a los cultivos de hortalizas. Es
muy resistente a condiciones ácidas y al congelamiento, pero no es termodúrico.
Puede sobrevivir 42 días a 37˚C, 56 días a 22˚C y 70 días a 5˚C. Su pH óptimo es
neutro, pero tiene una ligera tendencia a tolerar pH ácido, y puede tolerar algunos pH
ligeramente alcalinos (12).
Su transmisión ocurre generalmente a través de carne de ganado, cerdos y
pollos. Es mas frecuente en animales jóvenes y sobretodo en alimentos crudos de
origen animal. Su supervivencia en aguas contaminadas a temperatura ambiente de
15
90 días, y a través de los sistemas de riego con aguas contaminadas es que
generalmente se contaminan los cultivos de vegetales y otros cuerpos de agua.
También es común su transmisión por malas prácticas higiénicas, a través de
operarios o utensilios(12).
Cuando los alimentos contaminados no son sometidos a buenos procesos de cocción,
es común su transmisión. Por esta razón, es sumamente importante la higiene, la
cocción y el empleo de aguas cloradas para evitar su transmisión(5).
4.1.3 Virotipos
Existen cinco clases de Escherichia coli, clasificados con base en los mecanismos de
producción de la diarrea (9). Estos grupos se presentan en la tabla 2. Las cepas de E.
coli pueden causar una gran variedad de diferentes tipos de enfermedad, incluyendo
diarrea, disentería, síndrome hemolítico urémico, infecciones de riñón y vejiga,
septicemia, pneumonia y meningitis (5) Esta versatilidad se debe a que las cepas han
adquirido diferentes genes de virulencia; sin embargo, la mayoría de cepas son
avirulentas porque carecen de estos genes. (3).
Virotipo Generalidades Sintomas E. coli enterotoxigénico (ETEC)
Se adhieren a la mucosa del intestino delgado y producen los síntomas no por la invasión de la mucosa sino por la elaboración de toxinas que actúan en las células para causar diarrea. Puede ser fatal en infantes. En el adulto, es conocida como diarrea del viajero.
Diarrea, vómito, fiebre.
E. coli enteropatógena (EPEC)
Se adhieren por parches a las células de mamíferos e inducen alteraciones histológicas; ocurre desaparición de las microvellosidades del intestino. Son más invasivas que ETEC o EAGGEC.
Causan respuesta inflamatoria. Diarrea, por lo general fatal.
E. coli Enteroinvasiva (EIEC)
enfermedad indistinguible sintomáticamente de la disentería causada por Shigella sp. Invaden activamente las células del colon y se extienden lateralmente a células adyacentes. No produce toxina Shiga .
Daño a tejidos infectados.
E. coli Enterohemorrágica (EHEC)
El serogrupo y serotipo predominante es el O157:H7. Se unen fuertemente a células de mamíferos en cultivo y eliminan microvellosidades. Aún no se ha dilucidado bien su mecanismo de acción.
Diarrea sanguinolienta. Complicación Síndrome hemolítico urémico.
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E. coli enteroagregativo (EAGGEC)
Es el virotipo más nuevo. Causa una forma de diarrea persistente en niños. Se unen a las células del intestino delgado, no son invasivas y no causan cambios histológicos. No se adhieren uniformemente en la superficie de la mucosa; se agregan. Producen una toxina ST (termoestable) y una toxina tipo hemolisina
Diarrea persistente
Tabla 2. Clasificación de las cepas de E. coli con base en los mecanismos de producción de diarrea. (3).
4.1.4 Patogénesis
4.1.4.1 E. coli Enterotoxigénica
La ETEC es una causa muy importante de gastroenteritis infantil en los países en
desarrollo, como Colombia. Es de especial importancia en niños menores de dos años
de edad, y con menor frecuencia en adultos. También es una causa importante de
cuadros diarreicos que se presentan en los viajeros (1). La infección ocurre por lo
general por ingerir aguas y alimentos contaminados, una vez que pasan el pH ácido
del estómago, las bacterias se establecen en la mucosa del intestino delgado. El paso
más importante de la interacción huésped-parásito es la adhesión, y la posterior
colonización de la mucosa intestinal. Una vez se adhiere por medio de los pilis
(factores de colonización), puede tolerar los movimientos peristálticos del intestino.
Debido a que los pilis están codificados en plásmidos, sólo aquellas cepas que los
poseen pueden adherirse a las células intestinales, y por ende causar la enfermedad
diarreica. Aunque no es invasiva, puede permanecer unida a la superficie del lumen, y
una vez comienza a producir la toxina la enfermedad se manifiesta sintomáticamente.
El efecto de las enterotoxinas ocurre en la mucosa intestinal que conlleva a pérdida de
agua y electrolitos, pero sin efectos invasivos (3). Como no hay respuesta
inflamatoria, no hay fiebre ni sangre en las heces.
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Las cepas ETEC presentan fimbrias con adhesinas especie específicas, que ayudan a
la bacteria a adherirse. En las cepas de origen animal, se denominan antígenos K, y en
las de origen humanos de conocen como factores de colonización (FAC) u antígenos
F. En humanos, puede haber inmunidad conferida por anticuerpos que se secretan al
lumen, los cuales actúan directamente contra los factores de adherencia y
colonización. (5).
Las enterotoxinas que producen son: la toxina termolábil (LT) que tiene un alto peso
molecular y una capacidad antigénica fuerte y la termoestable (ST), que se caracteriza
por tener un bajo peso molecular y su capacidad antigénica no es tan fuerte (3).
Existen cepas que pueden producir ambos tipos de toxinas, mientras otras solo pueden
producir una de las dos. En la tabla 3 se resumen las características generales de estas
toxinas.
TOXINA GENERALIDADES LT (Termolábil) Es inactivada a 65˚C por 30 minutos, su peso molecular es de 100,000Da, es
de naturaleza proteica y su modo de acción es estimular la adenilato ciclasa, lo cual incrementa el AMP cíclico, lo cual genera poros y ocurre pérdida de
electrolitos y agua ST (Termoestable) Es estable a 65˚C, se inactiva parcialmente a 100˚C por 30 minutos. Su peso
molecular varia entre 4000-5000Da y es un polipéptido poco antigénico. Estimula la Guanilato cilcasa, lo cual incrementa los niveles de GMP cíclico,
lo cual también genera poros. Tabla 3. Generalidades de las Toxinas LT y ST de E. coli(3)
Ambas toxinas están formadas por cinco subunidades B, que unen la toxina a los
receptores epiteliales. También tiene una subunidad A, la cual es enzimáticamente
activa y es sintetizada como un polipéptido que es activado después para formar los
polipéptidos A-1 y A-2 unidos por puentes disulfuro. Las subunidad B está compuesta
por polipéptidos idénticos y su función es transportar a la toxina activa A-1. Una vez
la subunidad A entra en la célula, se activa la enzima intracelular adenilato ciclasa y
guanilato ciclasa, respectivamente, lo cual lleva a a la acumulación de adenosin
monofosfato cíclico (AMPc) y Guanosin Monofosfato Ciclico (GMPc). La
18
acumulación de estos productos, conlleva a un cambio en la función de las células del
intestino, lo cual causa un incremento en la secreción y una función de absorción
disminuida. Esto causa una diarrea liquida abundante, pero como el transporte de
sodio permanece intacto, es fácil la rehidratación oral (3).
4.1.4.2 E. coli Enteropatógena
La infección ocurre por la ingestión de alimentos o aguas contaminadas con la
bacteria. La adhesión de estas bacterias causa alteraciones dramáticas en la
ultraestructura de las células de la mucosa del hospedero. Normalmente, las celulas de
la mucosa intestinal tienen numerosas proyecciones cortas llamadas
microvellosidades en sus superficies apicales. (5) Las células a las cuales las cepas de
EPEC se han adherido, muestran microvellosidades elongadas en los sitios donde no
hay adhesión, y donde la adherencia ha ocurrido se observa la ausencia de las
microvellosidades. Este fenómeno es el resultado de reareglos extensivos de la actina
del hospedero en la vecindad de las bacterias adherente que resulta en la formación de
una estructura tipo pedestal bajo las bacterias. Las cepas de EPEC son más invasivas
que ETEC y EaggEC, y causan una respuesta inflamatoria. (5). Por esta razón, los
síntomas asociados son fiebre, vómito, malestar y diarrea con una cantidad
predominante de moco. Los síntomas son causados por la invasión bacteriana de las
células del hospedero y la alteración de sistemas de transducción de señales, y no por
la producción de exotoxinas. (3).
4.1.4.3 E. coli Enterohemorragica
Este serotipo se identificó por primera vez en 1982 (3) como causante de brotes y
casos esporádicos de colitis hemorrágica. El serotipo causante es el O157:H7. Se
diferencia a la disentería en que la fiebre no es dominante y las deposiciones
sanguinolentas son muy abundantes. No se pueden observar leucocitos en las heces
19
(16) y se ha observado una fuerte relación de este serotipo con el síndrome urémico
hemolítico. Su mecanismo de patogenicidad aún no se ha dilucidado por completo, ya
que no poseen un plásmido enteroinvasor como las cepas de EIEC y por lo tanto no
invaden las células epiteliales. Se ha observado que poseen un plásmido de 60
megadaltons (13), que codifica para un tipo distinto de fimbrias, el cual es necesario
para que puedan adherirse a las células epiteliales. Se ha visto que las cepas aisladas
de pacientes con enterocolitis hemorrágicas o con síndrome urémico hemolítico,
pueden elaborar una citotoxina activa sobre los cultivos de células Hela y Vero. Se le
llama Verotoxina tipo 1(14).
4.1.4.4 E. coli Enteroinvasiva
Se refiere a un pequeño grupo de bioserotipos de E. coli que tienen la capacidad de
invadir y penetrar la mucosa intestinal provocando una respuesta inflamatoria
significativa. Después de la destrucción de la mucosa, se da lugar a diarreas en niños y
adultos, tipo disentería, similares a las producidas por Shigella sp. Aunque no causa
síndrome hemolítico urémico, los síntomas son muy parecidos a la disentería. No
producen la toxina Siga (5).
La infección ocurre por la ingestión de alimentos u aguas contaminadas con la
bacterias. Los síntomas incluyen fiebre, malestar general, dolor abdominal fuerte y
disentería con heces escasas con sangre y moco. Si se realiza una tinción de gram del
moco fecal, se puede observar una capa de polimorfos nucleares neutrófilos (PMN)
(3).
No son mótiles, y se han reportado cepas que no pueden fermentar la lactosa. Posee
plásmidos de 120 y 140 megadaltons que codifican para los factores de virulencia. Se
ha visto que el cromosoma determina un grupo de antígenos O, que son necesarios
para expresar completamente la virulencia invasiva(3).
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4.1.4.5 E. coli Enteroagregativa
Como ya mencioné anteriormente, es el virotipo más reciente y se ha observado que
causa una diarrea persistente en los niños. No son invasivas, se adhieren a las células
intestinales y no causan cambios histológicos en las células a las cuales se adhieren.
Sin embargo, a diferencia de ETEC, su adherencia no es uniforme sino que ocurre en
agregados pequeños. Aún no se han establecido el número de serogrupos que
contiene, y su significancia como causa de enfermedad humana aún es
controversial(5).
4.1.5 Importancia en Alimentos
Adicionalmente a la transferencia pasiva de toxinas microbianas, los alimentos
pueden contener suficientes cantidades de microorganismos patógenos para causar
infección y enfermedad en el hospedero. La infección por alimentos consiste en el
crecimiento de los microorganismos en el cuerpo después de la ingestión de alimentos
contaminados, y es una causa común de enfermedades transmitidas por alimentos
(ETA’s) en el mundo (9).
Varias cepas de E. coli han emergido recientemente como patógenos transmitidos por
alimentos. Se caracterizan por su habilidad de producir enterotoxinas potentes y por lo
tanto se les llama E. coli enterotoxigénicas (ETEC). Particularmente, la cepa
O157:H7 causa por lo menos 20,000 casos de infección alimentaria y 250 casos de
muerte (tan solo se reporta aproximadamente el 10% de los casos) (3). La EHEC es
una causa común de falla renal en niños, y por lo general su desenlace es fatal ya que
produce una exotoxina potente que causa diarrea hemorrágica y falla renal. La fuente
más común de esta infección es carne contaminada cruda o con procesos deficientes
de cocción, particularmente carnes procesadas en masa (Como carnes de
21
hamburguesas y jamones) (10). La contaminación de los alimentos ocurre por lo
general durante el sacrificio.
La diarrea del viajero, es causada en un 50% por E. coli enterotoxigénico (ETEC), y
el vehículo de transmisión más común son alimentos como verduras y aguas. Por lo
general las aguas de riego de las hortalizas se encuentran contaminadas, y de esta
forma se contaminan los vegetales frescos. Aunque se ha visto que los residentes de
una determinada zona presentan cierta resistencia a las cepas circulantes debido a
anticuerpos, los viajeros que son ajenos a la zona carecen de dichos anticuerpos y por
ende desarrollan la enfermedad (9).
Puede causar descomposición notoria en los alimentos cárnicos, con cambios notorios
en las propiedades organolépticas de los alimentos. En muchos casos, esto evita que
las personas consuman los alimentos descompuestos, pero cuando contamina otros
productos como verduras y aguas, no afecta notoriamente la apariencia o el sabor de
los alimentos, aún en los perecederos. Debido a que estos alimentos no presentan
signos de deterioro, las personas los ingieren tranquilamente sin saber que el alimento
contiene altos números de E. coli.
En Colombia, existe un sistema de vigilancia que incluye las enfermedades
transmitidas por alimentos (ETA’s) llamado SIVIGILA (Sistema de Vigilancia en
Salud pública). Es un esfuerzo conjunto del Instituto nacional de Salud y el Ministerio
de Salud. En el boletín epidemiológico Semanal del año 2002, semana epidemiológica
No 6 se establece: “Durante los últimos cuatro años la notificación de casos de ETA
en el país ha ido en aumento, aunque debe tenerse presente que se mantiene un amplio
subregistro, si se tienen en cuenta los estimados de la OMS que refieren como entre el
15% y el 70% de los casos de diarrea en menores de cinco años de edad es debida a
alimentos contaminados. En Colombia se estima que pueden ocurrir anualmente
22
372.000 casos de diarrea en menores de cinco años.”(28). Si bien existe un sistema de
registro de ETA’s, en muy pocos casos es posible realizar la confirmación del agente
etiológico causante, debido a la demora del reporte por parte de las IPS y EPS que
reciben al paciente. Por ejemplo, en el año 2001, durante las semanas epidemiológicas
No 18 y 19 fueron reportados al sistema SIVIGILA un total de 309 casos de
intoxicaciones alimentarias reportados como brotes por varias de las localidades de la
ciudad de Bogotá, provenientes principalmente de establecimientos escolares y de
salas de retenidos del IMPEC(29). “En los brotes presentados en escolares solo se
tomaron algunas muestras que no permitieron determinar de forma precisa la etiología
de la intoxicación y solo mediante la evaluación y seguimiento a los antecedentes de
los casos fue posible establecer como fuente de común a algunas de las empresas
proveedoras de alimentos preparados”(29). Sin embargo, en los pocos alimentos que
se pudieron analizar, se determinaron como inaceptables para el consumo humano
debido a un alto recuento de bacterias mesófilas y de coliformes totales. También se
detectó la presencia de E. coli en algunos alimentos.
Análisis de alimentos en la planta proveedora para las salas de retenidos. 2001 (Tabla tomada del Boletín Epidemiológico No 19 (29)
ALIMENTO CAUSA DE NO ACEPTACION
Vísceras picadas cocidas pH y NBD alto Recuento alto de mesófilos coliformes totales y E. coli
Alas de pollo cruda pH alto, recuentos altos de mesófilos y coliformes totales Carne cruda molida para chorizo Proteina baja y E. coli
Chorizo Proteina baja y E. coli Papa salada Mesófilos y recuento alto de coliformes Papa sudada Recuentos altos de mesófilos, coliformes totales y E. coli.
Es altamente probable que E. coli sea una causa común de infección alimentaria.
Sumado a los factores mencionados anteriormente, existen muchas personas
inescrupulosas que disfrazan los malos olores de las carnes con condimentos y
aditivos, y venden alimentos en proceso de descomposición a precios muy bajos.
23
En las Normas Técnicas Colombianas, específicamente la Norma NTC 1325 se
establece que el nivel máximo tolerable de Coliformes Totales para carnicos cocidos o
escaldados es de 120-1100 ufc/g de alimento. E. coli debe estar en concentraciones
inferiores 100 ufc/g alimento(8).
24
4.2 Plazas de Mercado
En Bogotá existen 18 plazas de Mercado, que pertenecen al Distrito Capital. En estos
sitios se venden alimentos como frutas y hortalizas, derivados lácteos, cárnicos,
pollos, pescados, plantas y otro tipo de mercancías como son materas, canastos,
bolsas plásticos e inclusivo ropa(26). La regulación de las plazas de mercado está bajo
la responsabilidad de la Unidad Ejecutiva de Servicios Públicos:
“Mediante Decreto 01 del 04 de Enero de 1999, El Alcalde Mayor delegó en la
Unidad Ejecutiva de Servicios Públicos , la función de coordinar, dirigir, vigilar y
controlar la gestión eficiente de las plazas de mercado a cargo del Distrito Capital y de
señalar las tarifas por concepto de la utilización de las áreas, espacios y servicios de
las mismas. El mencionado Decreto, delegó en los Alcaldes locales la función de
gestionar y asegurar la prestación eficiente del servicio público de las plazas de
mercado y la celebración de los contratos de concesión, para la operación de las
mismas. La Unidad Ejecutiva de Servicios Públicos formuló y radicó ante el
Departamento Administrativo de Planeación Distrital, el proyecto 7104 - Intervención
de Plazas de Mercado, referido a las 18 plazas de mercado propiedad del Distrito
Capital, proyecto que tiene por objeto la gestión, el control y supervisión, el estudio
tarifario en el proceso licitatorio para la entrega en concesión y el establecimiento de
un modelo piloto, conjuntamente con otras dependencias o instancias del Distrito
Capital. (26)”
Si bien las plazas de mercado están bajo la supervisión de una entidad gubernamental,
las buenas prácticas higiénicas para la manipulación y almacenamiento de los
alimentos de consumo humano no se controlan estrictamente. Por esta razón, los
productos alimenticios, especialmente los más perecederos, poseen cantidades
importantes de microorganismos patógenos y potencialmente patógenos. Los jamones
25
de cerdo, por ser productos cárnicos, deben tener una manipulación controlada y un
almacenamiento a temperaturas de nevera (a no ser que sean productos curados, como
por ejemplo el salchichón). Sin embargo, en muchos expendios de derivados cárnicos,
son mantenidos a temperatura ambiente, lo que favorece la proliferación bacteriana en
este tipo de alimentos.
26
4.3 Jamones de Cerdo
Las clasificaciones de los productos cárnicos son diversas y se basan en criterios tales
como los tipos de materias primas que los componen, la estructura de su masa, si
están o no embutidos, si se someten o no a la acción del calor o algún otro proceso
característico en su tecnología de elaboración, la forma del producto terminado, su
durabilidad o cualquier otro criterio o nombres derivados de usos y costumbres
tradicionales (15). En Colombia se clasifican en tres grandes grupos según se aplique
o no un tratamiento térmico y el tipo de éste: productos procesados cocidos, productos
procesados enlatados y productos procesados crudos que a su vez se subdividen en
crudos frescos y crudos madurados (8, 11). Existen varias clases de jamones de cerdo,
y su precio depende de la calidad de la materia prima y el contenido de grasa
principalmente. El jamón York es un jamón de primera calidad, elaborado con carne
de pierna de cerdo, libre de ligamentos, grasa y tendones. El jamón york pasa por un
cuidadoso proceso de curado, prensado, masaje y cocción de la carne (24). El jamón
ahumado es un jamón elaborado con carne seleccionada de pierna de cerdo, curado y
condimentado con especias y otros ingredientes. Presenta un punto preciso de
ahumado, lo que le da un sabor característico . Es un producto de alto contenido
nutricional, libre de grasa y sin colesterol. El pernil de cerdo es un jamón elaborado
con pierna de cerdo seleccionada, curada, condimentada con especias naturales y
cocida. Posee un sabor característico de un ahumado artesanal, lo que lo hace muy
apetecible. En el control del proceso de elaboración de un jamón curado es clave la
materia prima. En efecto, su calidad influye sobre la calidad del jamón. Un jamón
fresco debe presentar una buena cohesión de sus músculos, un color rosado y
homogéneo. El músculo no debe ser ni viscoso, ni pegajoso, ni tener un olor muy
marcado. Hay una gran cantidad de ingredientes no cárnicos que son importantes en la
27
elaboración de productos cárnicos. Algunos de ellos, como la sal, no pueden omitirse.
Otros son simplemente auxiliares cuya función principal depende de factores
económicos, tales como los cereales de rellenos(27). Estos jamones, en su proceso de
elaboración, se les agregan aditivos para mejorar el sabor, y para conservar el
producto. Entre los aditivos se encuentran: sal, nitritos, nitratos, y extendedores (o
rendidores). La sal es el ingrediente más crítico en la elaboración de embutidos
después de la carne. Se podría considerar que históricamente es casi imposible
fabricar embutidos sin sal. Entre sus funciones básicas está: acción conservante,
solubilización de las proteínas contráctiles a partir de la fibra muscular, mejorar el
sabor y olor. En la mayoría de los productos embutidos, el porcentaje utilizado es de
2,5 a 3,0 % de sal. Posee un especial efecto bacteriostático, especialmente contra
coliformes. Este efecto es sólo parcial debido al nivel de uso (generalmente, inferior al
2,5%). Se considera generalmente que a la concentración del 10%, inhibe el
crecimiento de numerosos microorganismos, en cambio, a la concentración del 5% es
tan solo efectiva contra anaerobios.(27). Los nitratos y los nitritos son los
ingredientes de “curado” adicionados para elaborar un embutido tipo “curado”. Su
efecto más reconocido es el desarrollo de un color rojizo característico. El proceso de
curado tiene un efecto conservante, especialmente frente al crecimiento de las esporas
de Clostridium botulinum. El nitrito es el componente más importante usado para el
curado de las carnes, siendo también un potente antioxidante. Las propiedades
bacteriostáticas de los nitritos son criticas en carnes curadas, particularmente en
jamones enlatados. Entre los extendedores o rendidores se utiliza leche en polvo,
harinas de cereales, proteínas de soya, y otras proteínas de origen vegetal.
Vale la pena resaltar que el proceso de elaboración de los jamones de plazas es
desconocido, ya que no se conoce a ciencia cierta el control que se ejerce sobre estos
28
productos y no existe información contundente sobre ingredientes reales utilizados.
Los distribuidores son reacios a suministrar cualquier tipo de información sobre éste
tipo de productos.
4.4 Recuento en Placa en Violeta Rojo Bilis Agar (VRBA)
El medio VRBA es un medio de cultivo que contiene cristal violeta y sales biliares.
Estos componentes actúan como inhibidores de la flora acompañante, ya que inhibe el
crecimiento de la mayoría de bacterias diferentes a la familia Enterobateriaceae. Un
ingrediente muy importante es la lactosa, el cual nos permite detectar coliformes
mediante el viraje del indicador rojo neutro a rojo. Además ocurre la precipitación de
ácidos biliares alrededor de las colonias. De esta forma, las bacterias coliformes se
ven de un color morado-fucsia con un halo fucsia alrededor, mientras que las no
coliformes se verán color crema o rosa pálido. (Figura 3)
Figura 3. E. coli en VRBA. Imagen tomada de http://service.merck.de/microbiology/tedisdata/prods/4970-1_01406_0500_5000.html
Para realizar el recuento, se procesa el alimento y se realizan las diluciones
respectivas de la muestra. Dado que este medio no se autoclava, se sirve 1ml en fondo
de la dilución a enumerar y se agregan aproximadamente 20ml del medio recién
preparado. Se homogeniza suavemente, se deja solidificar y se lleva a incubar a 37˚C
por 48 horas. Una vez transcurrido el periodo de incubación, se hace recuento de las
colonias típicas de coliformes.
29
4.5 Determinación de Coliformes y E. coli por el método del Numero Mas
Probable (NMP)
El método del número más probable se emplea para obtener una cantidad estimada de
coliformes totales y E. coli presentes en alimentos, aguas y bebidas de naturaleza no
alcohólica. La técnica emplea tres series de tres tubos cada una, o tres series de cinco
tubos cada una. En cada serie de tubos se siembra 1ml de la dilución del alimento.
Los medios que pueden emplearse para el NMP son: Caldo Bilis Verde Brillante,
Caldo Bilis Verde Brillante mas MUG, Caldo LMX, Caldo Fluorocult, y caldo Lauril
sulfato con campana de Durham. (4).
El medio LMX es un caldo de enriquecimiento selectivo para la identificación de
coliformes totales y E. coli en la investigación bacteriológica de aguas y en alimentos.
Es un medio fluorogénico y cromogénico, lo cual agiliza la detección de estos
microorganismos. El Lauril Sulfato inhibe la flora acompañante Gram positiva. Por la
presencia de X-GAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosida), el cual es
clivado por los coliformes, y el sustrato fluorogenico MUG (4-metilumbelliferil-β-D-
Glucoronida), el cual es altamente especifico para E. coli, permite la detección
simultánea de Coliformes Totales y E. coli (31). La presencia de coliformes es
indicado por un viraje del medio a un color azul verdoso, y E. coli se puede ver como
fluorescencia con luz UV (Figura 4).
30
Figura 4. Caldo LMX. Tubos negativos para coliformes color amarillo, coliformes positivos color azul verdoso, E. coli fluoresce con luz UV. Imagen tomada de:
http://service.merck.de/microbiology/tedisdata/prods/4968-1_10620_0500.html
4.6 Simplate Para Coliformes Totales y E. coli
Cada día surgen nuevas innovaciones tecnológicas, y las pruebas de Simplate es una
de ellas. Estas pruebas fueron desarrolladas para sobrepasar las limitaciones de los
procedimientos de recuento, como en los métodos de recuento en placa.. Además,
busca dar resultados más rápidos y de mayor precisión. El sistema Simplate incluye
formulaciones particulares de medio y cajas patentadas especiales. Cada medio ha
sido formulado específicamente para ser sensible y específico. Este método provee un
rango de recuento amplio lo cual minimiza el número de diluciones necesarias para
obtener resultados acertados. Es muy fácil de usar, y se obtienen resultados en tan
solo 24 horas. En general, para cada muestra se reconstituye el medio en 9ml de agua
destilada estéril. Se agrega 1 ml de la muestra o la dilución a analizar, se homogeniza
y se sirve en la caja. Se lleva a incubar y a las 24 horas se pueden analizar los
resultados. Los pozos positivos para coliformes tienen un color morado-fucsia, los no
coliformes se ven amarillos, y E. coli fluoresce con luz UV (Figura 5). Se cuenta en
número de pozos y se consulta en la tabla del folleto Simplate para obtener el recuento
en ufc/g.
31
Figura 5. SimPlate Para Coliformes y E. coli. Imagen tomada de
http://www.rapidmethods.com/products/simcoli.html
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Sitios de Muestreo Se eligieron dos plazas de mercado de Bogotá, para realizar el muestreo (Figura 6).
Las plazas elegidas fueron:
• Plaza del Doce de Octubre, ubicada en la Calle 72#39-62. Está en la localidad
de Barrios Unidos y tiene un área de 1850m2 construidos en servicio. Posee
aproximadamente 305 puestos(26). Posee siete puestos de expendios de carnes
frías
• Plaza del Siete de Agosto, ubicada en la calle 66#23-30. También está en la
localidad de Barrios unidos y el área construida en servicio es de 1850m2.
Posee 252 puestos (26). Posee ocho puestos de expendio de carnes frías,
quesos, crema de leche y cuajada.
Figura 6. Plazas de mercado Elegidas. Siete de Agosto (Izquierda), Doce de
Octubre (derecha). Imágenes tomadas de: http://www.uesp.gov.co/html/plazas_de_mercado.html
Las muestras se adquirieron en los distintos puestos de expendio de carnes frías y
quesos ubicados en el interior de las plazas.
32
5.2 Muestras
Todos los productos analizados fueron de carne de cerdo. Se tomaron un total de 85
durante seis semanas, la primera semana se tomaron diez muestras, y las siguientes
semanas se tomaron 20 muestras pertenecientes a tres tipos de productos:
• 47 muestras de Jamón de Cerdo de Diversas Variedades (York, Económico,
Prensado),
• 16 muestras de Jamón Ahumado de Cerdo
• 22 muestras de Pernil de Cerdo.
5.3 Procesamiento de Las Muestras
Se pesaron bajo condiciones de esterilidad 10g de la muestra a analizar con ayuda de
un bajalenguas estéril, en una balanza. Se agregaron los 10g del jamón a un vaso de
licuadora estéril con 90 ml de solución salina estéril al 0.85%. Se homogenizó la
muestra durante 1 minuto, y de esta forma se obtuvo la dilución 10-1. Se realizaron
diluciones seriadas en tubos con 9ml de solución salina estéril al 0.85% hasta la
dilución 10-4(4). Dado que se realizó un sondeo previo para determinar las diluciones
ideales para poder obtener un recuento de Coliformes totales, se eligieron las
diluciones 10-2, 10-3 y 10-4. Como se podrá observar más adelante, las primeras cinco
muestras se trabajaron con diluciones de 10-4, 10-5 y 10-6 y como no hubo detección,
se decidió bajar las diluciones para poder realizar recuento.
Todas las diluciones se realizaron con una Micropipeta y puntas de 1000µl estériles
para obtener una mayor precisión.
Una vez realizadas las diluciones, se procedió a analizar la muestra por cada uno de
los tres métodos como se explica a continuación.
33
5.3.1 Recuento en Placa en VRBA
Se preparó el medio Violeta Rojo Bilis Agar (OXOID) con material completamente
estéril según indicaciones. Una vez hervido el medio, se dejó enfriar a 48˚C antes de
utilizarlo para no eliminar las bacterias por la acción de temperatura excesiva.
De las diluciones preparadas como se explicó en la sección anterior, se sembró 1ml en
fondo en distintas cajas de las siguientes diluciones: 10-2, 10-3 y 10-4.
Se agregaron aproximadamente 20ml del medio y se homogenizó suavemente. Una
vez solidificado, se llevó a incubar a por 48h a 37˚C.
Una vez pasadas las 48 horas se realizó recuento de las colonias tipicas de coliformes
(Colonias rosadas en VRBA) (Figura 7).
Como ya se mencionó anteriormente, todas las diluciones se realizaron con
micropipeta de 1000µl para poder obtener una mayor exactitud en las mediciones de
inoculo.
Figura 7. Siembra en VRBA. Colonias Tipicas Coliformes
34
5.3.2 NMP en Caldo LMX
Se preparó el medio caldo LMX-Fluorocult (MERCK) según indicaciones del
fabricante. Para cada muestra, se utilizaron tres series de tres tubos, cada uno con 10
ml de caldo LMX. La primera serie correspondió a la dilución 10-2, la segunda a 10-3
y la tercera 10-4. De esta forma, para cada muestra se obtuvo un total de nueve tubos
tapa rosca grandes inoculados. Se llevaron a incubar los tubos por 48horas a 37˚C y
una vez transcurrido el tiempo de incubación, se realizó lectura.
En los tubos positivos para coliformes totales se observa un viraje del medio a un
color verde azulado. Con ayuda de Lámpara ultravioleta, se evaluaron los tubos
positivos para coliformes por fluorescencia.
Se realizó confirmación de E. coli de la siguiente forma y se consultó el NMP en la
tabla Anexo 7:
• De los tubos que presentaron fluorescencia, se hizo pase en el medio Eosin
Methilen Blue Agar (EMB, OXOID) para confirmar brillo metálico, antes de
evaluar Indol. Las cajas de EMB se llevaron a incubar a 37˚C por 24-48 horas
y se evaluó la presencia de brillo metálico.
• A cada tubo que presentó fluorescencia, se le agregaron dos gotas del reactivo
de Kovac’s para confirmar Indol. Se consideraron Indol positivo los tubos que
presentaron la formación de un anillo rojo.
• Solo se consideraron positivos aquellos tubos que viraron a azul verdoso,
fluorescieron, dieron brillo metálico en EMB y presentaron prueba de Indol
positiva. De éstos tubos se hizo un cepario de E. coli aislando en EMB.
35
5.3.3 SimPlate
Se empleó el método de detección rápida SimPlate (BIOCONTROL) para evaluar la
presencia de coliformes totales y E. coli. Por los resultados obtenidos en la prueba de
sondeo, solamente se trabajó cada muestra en la dilución de 10-2 ya que con éste
método fue posible cuantificar en esta dilución. Se rehidrató el medio de SimPlate con
9ml de Agua destilada Estéril. De las diluciones preparadas anteriormente, se tomó 1
ml de la dilución 10-2 con Micropipeta y se agregó en el medio ya rehidratado (Figura
8,1). Se homogenizó durante 30 segundos y se agregó al medio Figura 8,2, teniendo la
precaución de que todos los pozos quedaran con medio (Figura 8,3). Para eliminar
burbujas se dieron golpes secos suaves y se dejó caer el medio sobrante sobre el cojín
de la placa (Figura 8,4). Se llevaron a incubar las placas a 37˚C por 24 horas(Figura
8,5) y se contaron los pozos positivos para coliformes (morados) (Figura 8,6). y con
lámpara UV, se contaron los pozos fluorescentes (E. coli) Luego, con la tabla de
SimPlate (ANEXO 6) se obtuvo el recuento en cada muestra. Dado que se trabajó con
la dilución 10-2, se multiplica el resultado de la tabla por 102 (100) según indicaciones
del fabricante BIOCONTROL. Se realizaron lecturas también a las 48horas.
Figura 8. Pasos del Método Simplate. Imágenes tomadas del Folleto de Simplate guia
Rápida (BIOCONTROL)
36
6. RESULTADOS
6.1 Codificación de Muestras
Las muestras se codificaron en orden de procesamiento. En la tabla anexo 1 se
encuentra el código de la muestra, la fecha de adquisición, el origen y el tipo de
alimento. A continuación en la tabla 4 se presenta un resumen de las muestras
evaluadas.
Plaza No Muestras Pernil de
Cerdo
No Muestras Jamón de
Cerdo
No Muestras Jamón de
Cerdo Ahumado
No total de muestras
Paloquemao 1 3 1 5 Doce de Octubre
8 19 8 35
Siete de Agosto
13 25 7 45
TOTAL 22 47 16 85 Tabla 4. Muestras evaluadas
6.2 Distribución de Muestras según plaza
Se muestrearon un total de 3 plazas. Inicialmente se trabajó con la Plaza de
Paloquemao, pero por razones de cercanía se decidió trabajar solo con las plazas del
Doce de octubre y del Siete de agosto. Se tomaron un total de 85 muestras, de las
cuales 45 pertenecen al Siete de Agosto, 35 a la plaza del Doce de Octubre y 5 a
Paloquemao (Figura 9). En cuanto al tipo de alimento, se analizaron un total de 16
muestras de Jamón ahumado, 22 de Pernil de Cerdo y 47 de Jamón de Cerdo (Figura
10).
37
53%41%
6%
Siete de AgostoDoce de OctubrePaloquemao
Figura 9. Distribución de Muestras según Sitio de Muestreo
55%19%
26%Jamon de CerdoJamon AhumadoPernil de Cerdo
Figura 10. Distribución de Muestras según Tipo de Alimento
En la plaza del Siete de Agosto, se tomaron 7 muestras de Jamón ahumado, 13 de
Pernil de Cerdo y 25 de Jamón de Cerdo. En la plaza del Doce de Octubre se tomaron
8 muestras de Jamón ahumado, 8 de Pernil de Cerdo y 19 de Jamón de Cerdo. En
Paloquemao, se tomaron 3 muestras de Jamón, 1 de Pernil y 1 de Jamón Ahumado
(Figura 11)
38
0
5
10
15
20
25
No
Mue
stra
s
Jamon deCerdo
JamonAhumado
Pernil deCerdo
Tipo de Alimento
Siete de AgostoDoce de OctubrePaloquemao
Figura 11. Distribución de Muestras según Plaza y Tipo de Alimento
6.3 Resultados Simplate
La enumeración de Coliformes Totales (CT) y E. coli se realizó a las 24 horas y a las
48 horas. Los coliformes se pueden observar como pozos color fucsia, y E. coli
fluoresce con luz ultravioleta(Figura 12). Una vez contados los pozos, se consultó en
la tabla de Simplate (Anexo 6) la población total, y éste número fue multiplicado por
el factor de dilución (en este caso es 102) según indicaciones del fabricante
BIOCONTROL. De esta manera se obtuvo el recuento total de Coliformes totales y E.
coli
Figura 12. Resultados Simplate. Obsérvese los pozos positivos para CT son de color fucsia y los de E. coli fluorescen con luz UV.
39
En la tabla anexo 2 se presentan los resultados para Coliformes Totales evaluados por
el método Simplate.
Se detectaron coliformes totales en 70 de las 85 muestras analizadas a las 24 horas.
Con la incubación de 24 horas adicional, se logro detectar Coliformes Totales en 74
de las 85 muestras (Color verde en la tabla). Las muestras en las que no se logró
detectar Coliformes totales a las 24 horas(Ver color azul en la tabla) fueron 10 de
jamón de Cerdo, 2 de Pernil de cerdo y 4 de Jamón Ahumado. En el resto de los
casos, 48 de las 85 muestras excedieron la Norma Técnica Colombiana (NTC)1325
(color Fucsia en la tabla) que dicta que el nivel máximo tolerable de Coliformes
Totales para Carnicos Cocidos o Escaldados es 1100 ufc/g. Esto representa el 56.47%
de las muestras fuera de la norma. En 21 de las 85 muestras se detectaron Coliformes
Totales en niveles aceptables bajo la NTC 1325.
En la siguiente figura se presenta el porcentaje de muestras con niveles inaceptables
de Coliformes Totales según la NTC 1325; 26 de 47 muestras de jamón analizadas
excedieron la norma; 16 de 22 de las muestras de Pernil de Cerdo y 6 de 16 muestras
de Jamón ahumado analizadas excedieron los niveles de la norma.
55.32
72.73
37.544.68
27.27
62.5
01020304050607080
Jamon
de C
erdo
Pernil d
e Cerd
o
Jamon
Ahu
mado
Tipo Alimento
Porc
enta
je
Fuera NormaDentro Norma
Figura 13. Porcentaje de Muestras Fuera de Norma para Coliformes Totales según tipo de Alimento Evaluado por el Metodo Simplate
40
En la tabla anexo 3 se presentan los resultados de E. coli evaluados por el método
Simplate. Se detectó E. coli en 44 de las 85 muestras analizadas a las 24 horas. Con
la incubación de 24 horas adicional, se logro detectar E. coli en 50 de las 85 muestras
(Color verde en la tabla). Las muestras en las que no se logró detectar E. coli a las 24
horas(Ver color azul en la tabla) fueron 24 de jamón de Cerdo, 9 de Pernil de cerdo y
8 de Jamón Ahumado. En el resto de los casos, las muestras restantes analizadas
excedieron la Norma Técnica Colombiana (NTC)1325 (color Fucsia en la tabla) que
dicta que el nivel máximo tolerable de E. coli para Carnicos Cocidos o Escaldados es
100 ufc/g. Esto representa el 51.76% de las muestras fuera de la norma al analizarlas a
las 24 horas y un 58.82% de las muestras fuera de la norma al analizarlas a las 48
horas.
En la siguiente figura se presenta el porcentaje de muestras con niveles inaceptables
de E. coli según la NTC 1325; 26 de 47 muestras de jamón analizadas excedieron la
norma; 16 de 22 de las muestras de Pernil de Cerdo y 8 de 16 muestras de Jamón
ahumado analizadas excedieron los niveles de la norma.
55.32
72.73
5044.68
27.27
50
01020304050607080
Jam
on d
eC
erdo
Per
nil d
eC
erdo
Jam
onA
hum
ado
Tipo Alimento
Porc
enta
je
Fuera NormaDentro Norma
Figura 14. Porcentaje de Muestras Fuera de Norma para E. coli según tipo de Alimento Evaluado por el Metodo Simplate
41
En general, la incidencia de Coliformes totales (70 de las 85 muestras) a las 24 horas
fue de 82.35%, y de 85.89%. (73 de las 85 muestras analizadas) en 48 horas. De estas
70 muestras a las 24 horas, 44 tuvieron presencia de E. coli (62.86%) y a las 48 horas
se detectó su presencia en 50 de las muestras (71.43%). Estos resultados generales se
ven reflejados en la siguiente figura.
SimPlate 24 Horas
82.35
17.65
CT
No CT
SimPlate 48 Horas
85.89
14.41
CTNo CT
Figura 15. Incidencia en Porcentaje de Coliformes Totales Evaluada por Simplate
Simplate E. coli 24 Horas
62.86
37.14E. coliNo E. coliCT
Simplate E. coli 48 horas
71.43
28.57 E. coliNo E. coliCT
Figura 16. Incidencia en Porcentaje de E. coli Evaluada por Simplate
42
6.4 Resultados Recuento en Placa en VRBA
El recuento de Coliformes Totales (CT) y se realizó a las 48 horas de incubación. Se
sembraron tres cajas para cada muestra, las diluciones 10-2, 10-3 y 10-4(Figura 17). Los
coliformes se pueden observar como colonias color morado-fucsia con halo morado
(Figura 18).
Figura 17. Serie de izquierda a derecha 10-2, 10-3 y 10-4 en VRBA
Figura 18. Colonias Típicas de Coliformes en VRBA
Los resultados del recuento hecho para cada muestra se presentan en la tabla anexo 4.
En color azul se presentan las muestras donde no se detectaron coliformes. En color
fucsia se resaltan aquellas muestras que excedieron la NTC 1325 y en verde las
muestras donde se detectaron Coliformes Totales, pero que están dentro de la norma.
No se lograron detectar Coliformes Totales en 10 muestras, las cuales coinciden con
las muestras que el método SimPlate no pudo detectar: 5 muestras de Jamón de Cerdo,
1 de Pernil y 4 de Jamón ahumado. Vale la pena recalcar que éste método logró
43
detectar Coliformes totales en 4 muestras que SimPlate no detectó coliformes Totales
(Muestras No 30, 65, 66, 70).
De acuerdo a este método, se encontraron 57 de 85 muestras analizadas fuera de la
NTC 1325. A continuación se presenta el porcentaje de muestras fuera de la norma
según el tipo de alimento. En las muestras No 18, 32 y 35 donde Simplate no pudo
detectar Coliformes, el recuento en placa VRBA excedió la norma NTC 1325.
65.96
34.04
86.37
13.63
43.7556.25
0102030405060708090
Porcentaje
Jamon deCerdo
Pernil deCerdo
JamonAhumado
Tipo Alimento
Fuera de NormaDentro de Norma
Figura 19. Porcentaje de Muestras Fuera de Norma para Coliformes Totales según tipo de Alimento Evaluado por el Método Recuento en Placa VRBA
En general, la incidencia de Coliformes totales (75 de las 85 muestras) a las 48 horas
fue de 88.24%. Estos resultados generales se ven reflejados en la siguiente figura.
88.24
11.76Coliformes TotalesNo Coliformes
Figura 20. Incidencia en Porcentaje de Coliformes Totales Evaluada por Recuento en Placa en VRBA
44
6.5 Resultados NMP Como ya se explicó anteriormente, se empleó el Medio LMX (Fluorocult) para este
análisis. El viraje del medio a azul verdoso se considera positivo para Coliformes y
con la lámpara UV se determina la presencia de E. coli por fluorescencia. (Figura 21).
Figura 21. NMP Los primeros dos tubos son positivos para Coliformes, pero solo el primero es positivo para E. coli
Aunque el método de LMX establece que no es necesaria la confirmación (31)se ha
visto que puede presentarse fluorescencia por otro tipo de Microorganismos (Como
por ejemplo Pseudomonas). Por esta razón, de cada tubo fluorescente se hizo un pase
a Agar Eosin Methilene Blue (EMB) para observar la presencia del brillo metálico y
también se realizó la prueba de Indol con el reactivo de Kovacs (Figura 22).
Figura 22. Confirmación de Tubos NMP Fluorescentes. Se evaluó el brillo metálico y la prueba de Indol.
45
Solo aquellos tubos que presentaron tanto brillo metálico como Indol + se
consideraron confirmados como E. coli. Los resultados de NMP para coliformes
totales y E. coli se presentan en la tabla anexo 5. En azul se resaltan las muestras
donde no se pudo detectar, en Fucsia las muestras que exceden la NTC 1325 y en
verde aquellas donde sí se pudo detectar, pero que están dentro del los limites de la
norma. Este método no detectó coliformes Totales en tan solo 4 muestras (1,3,5,63),
de resto fue posible detectarlos en todas las muestras. De estas muestras analizadas,
57 excedieron la norma NTC 1325, de las cuales eran 7 muestras de jamón ahumado,
19 de pernil de cerdo y 31 de Jamón de Cerdo (Figura 23).
Estos resultados coinciden exactamente con los resultados obtenidos por el método
recuento en placa en VRBA, es decir que las muestras fuera de norma por el método
recuento en placa en VRBA fueron las mismas por el método del NMP para
coliformes totales.
65.96
34.04
86.37
13.63
43.7556.25
0102030405060708090
Porcentaje
Jamon deCerdo
Pernil deCerdo
JamonAhumado
Tipo Alimento
Fuera de NormaDentro de Norma
Figura 23. Porcentaje de Muestras Fuera de Norma para Coliformes Totales según tipo de Alimento Evaluado por el Método NMP
En general, la incidencia de Coliformes totales (81 de las 85 muestras) a las 48 horas
fue de 95.29% Estos resultados generales se ven reflejados en la siguiente figura.
46
95.29%
4.71%
Coliformes Totales
No Coliformes
Figura 24. Incidencia de Coliformes Totales Evaluada por NMP
En cuanto a E. coli, sin confirmar la detectó en 60 de las 85 muestras analizadas, pero
al realizar la confirmación con Indol y pase a EMB sólo se encontró en 46 muestras.
De estas 46 muestras confirmadas, 26 estaban fuera de norma para E. coli, (figura 25)
14 de 47 muestras de jamón analizadas excedieron la norma; 10 de 22 de las muestras
de Pernil de Cerdo y 2 de 16 muestras de Jamón ahumado analizadas excedieron los
niveles de la norma. En la grafica se presenta el porcentaje respecto a cada tipo de
alimento de las muestras confirmadas y no confirmadas.
51.0648.94
29.79
70.21
59.09
40.9145.45
54.55
31.25
68.75
12.5
87.5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Porcentaje
Jamon de Cerdo Pernil de Cerdo Jamon Ahumado
AlimentoFuera Norma No ConfirmadaDentro Norma No ConfirmadaFuera Norma ConfirmadaD t N C fi d
Figura 25. Porcentaje de Muestras Fuera de Norma para E. coli según tipo de Alimento Evaluado por el Método NMP
47
7. ANÁLISIS ESTADISTICOS
Se tabuló la incidencia general en porcentaje encontrada por cada método tanto para
Coliformes totales como para E. coli determinada por cada uno de los tres métodos y
se realizo una grafica (Figura 26) comparativa (Debido a que solo se tiene un dato por
cada método, no fue posible compararlos estadísticamente).
Tabla 5. Incidencia General de Coliformes Totales y E. coli METODO Coliformes Totales Incidencia (%) E. coli Incidencia (%)
SIMPLATE24H 70/85 82.35 44/85 51.76SIMPLATE48H 74/85 87.06 50/85 58.82
VRBA 75/85 88.24 NO APLICA NO APLICANMP Sin Confirmar NO APLICA 60/85 70.59
NMP Confirmada 81/85 95.29 46/85 54.12
INCIDENCIA COLIFORMES TOTALES
82.3587.06 88.24
95.29
7580859095
100
Simplate 24H Simplate 48H VRBA NMP
METODO
INC
IDEN
CIA
(%)
INCIDENCIA DE E. coli
51.7658.82
70.5954.12
020406080
Simplate 24H Simplate 48H NMP SinConfirmar
NMPConfirmada
Método
Inci
denc
ia (%
)
Figura 26. Comparación de Incidencia de Coliformes Totales y E. coli evaluada por diferentes métodos.
48
También se tabuló el porcentaje de muestras fuera de Norma para Coliformes Totales
y E. coli según tipo de Alimento (Tabla 6) para cada método y se realizó una gráfica
comparativa (Figura 27).
Tabla 6. Porcentaje De muestras fuera de norma De Coliformes Totales y E. coli según tipo de Alimento y Método.
METODO SIMPLATE 24H
SIMPLATE 48H
VRBA NMP Sin Confirmar
NMP Confirmada
(%)Fuera de Norma en Jamón de Cerdo
55.32/48.94 55.32/55.32 65.96 65.96/54.08 NA/29.79
(%)Fuera de Norma en Jamón Ahumado (%)
31.25/50 37.5/50 43.75 43.75/34.25 NA/12.5
(%)Fuera de Norma en Pernil de Cerdo (%)
72.73/59.09 72.73/72.73 86.37 86.37/59.09 NA/45.46
NA=No Aplica
Porcentaje De Muestras Fuera de Norma Segun Tipo de Alimento para Coliformes Totales
55.32
31.25
72.73
55.32
37.5
72.7365.96
43.75
86.37
65.96
43.75
86.37
0102030405060708090
100
Jamon de Cerdo Jamon Ahumado Pernil
Alimento
Porc
enta
je
Simplate 24 Horas Simplate 48H VRBA NMP
Figura 27a. Comparación de Porcentaje de Muestras fuera de Norma para Coliformes Totales evaluada por diferentes métodos según tipo de Alimento
49
Porcentaje de Muestras Fuera de Norma Segun tipo de Alimento para E. coli
48.94 5059.0955.32
50
72.73
54.08
34.25
59.09
29.79
12.5
45.46
01020304050607080
Jamon de Cerdo Jamon Ahumado Pernil
Alimento
Porc
enta
je
Simplate 24H Simplate 48HNMP Sin Confirmar NMP Confirmada
Figura 27b. Comparación de Porcentaje de Muestras fuera de Norma para E.
coli evaluada por diferentes métodos según tipo de Alimento
Se tomo el diseño de bloques aleatorios para analizar los resultados obtenidos por los
diferentes métodos.
Para los resultados de Coliformes totales, los bloques y tratamientos se definieron de
la siguiente forma:
Bloques = Número de Muestra
Tratamientos = Método empleado para el análisis.
T1=Simplate 24H, T2=Simplate 48H, T3=VRBA, T4=NMP
En primer lugar, se realizó la prueba de normalidad (Ho=Datos normales, Ha= Datos
no normales) para los datos con el Shapiro Wilk Normality Test donde se obtuvo un
valor p de 0.000, con lo cual se rechaza Ho. Como los datos no son normales, se
procedió a la transformación de los mismos, pero no fue posible normalizarlos. Por
esta razón se procedió a realizar una prueba no paramétrica que es la prueba Friedman
Two way AOV.
50
Ho: T1= T2= T3= T4
Ha: T1≠T2≠ T3≠T4
La prueba Friedman arrojó un p=0.000 para los bloques y un p=0.000 para los
tratamientos. Para ambos casos se rechaza Ho, y por lo tanto se concluye que sí
existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos para Coliformes
Totales por los diferentes métodos.
Para los resultados de E. coli, los bloques y tratamientos se definieron de la siguiente
forma:
Bloques = Número de Muestra
Tratamientos = Método empleado para el análisis.
T1=Simplate 24H, T2=Simplate 48H, T3=NMP Sin confirmar, T4=NMP Confirmada En primer lugar, se realizó la prueba de normalidad (Ho=Datos normales, Ha= Datos
no normales) para los datos con el Shapiro Wilk Normality Test donde se obtuvo un
valor p de 0.000, con lo cual se rechaza Ho. Como los datos no son normales, se
procedió a la transformación de los mismos, pero no fue posible normalizarlos. Por
esta razón se procedió a realizar una prueba no paramétrica que es la prueba Friedman
Two way AOV.
Ho: T1= T2= T3= T4
Ha: T1≠T2≠ T3≠T4
La prueba Friedman arrojó un p=0.000 para los bloques y un p=0.000 para los
tratamientos. Para ambos casos se rechaza Ho, y por lo tanto se concluye que sí
existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos para E. coli por los
diferentes métodos.
51
8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
8.1 Simplate
Las primeras cinco muestras que se procesaron, provenían de la plaza de
Paloquemao. Sin embargo, dado que se partió de una dilución muy alta (10-4) no fue
posible detectar coliformes totales y E. coli en estas muestras. Probablemente, si se
hubiera trabajado con la dilución que se trabajó en el resto de muestras (10-2), sí
hubiera sido posible detectarlas, ya que éste método muestra una alta sensibilidad. La
razón por la cual se empleó ésta dilución inicialmente, es que en la prueba de sondeo
de esta plaza los recuentos dieron muy altos. Sin embargo, al cambiar de plazas (el
resto de muestras fueron procedentes del Doce de Octubre y del Siete de Agosto) la
dilución 10-2 funcionó bastante bien.
Como se muestra en el anexo 3, a las 24 horas, se lograron detectar Coliformes
Totales en 70 de las 85 muestras. Las 15 muestras restantes eran 10 de jamón de
Cerdo, 2 de Pernil de cerdo y 4 de Jamón Ahumado. Estas muestras tenían niveles de
Coliformes Totales inferiores a 100ufc/g; por ésta razón ningún pozo dio positivo.
Aunque no fue posible cuantificar la concentración de bacterias coliformes totales en
éstas muestras, se puede inferir que éstos productos cumplen con la norma NTC 1325,
que tolera un nivel máximo de coliformes totales de 1100ufc/g. Con la incubación
adicional de 24 horas, fue posible detectar bacterias coliformes totales en 4 de las 15
muestras que no se habían podido cuantificar a las 24 horas. Aunque éste resultado
sugiere que es recomendable incubar 24 horas adicionales las placas Simplate para
poder cuantificar en aquellos casos donde los niveles son muy bajos, si el objetivo del
análisis es determinar si el producto cumple con la norma NTC 1325 no es necesario
realizar ésta incubación de 24 horas adicionales para coliformes totales. Se encontró
que 48 de las 85 muestras analizadas se encontraban fuera de norma para las bacterias
52
coliformes totales. Esto representa un 56.47% de muestras analizadas fuera de norma,
siendo un porcentaje alarmante que refleja la calidad microbiológica precaria de estos
alimentos. El jamón es un producto listo para el consumo, por lo cual no es sometido
a ningún tipo de cocción posterior. Como se puede ver, esto presenta un riesgo de
salud pública.
Cabe resaltar, que hubiera sido posible cuantificar la concentración de bacterias
coliformes totales en todas las muestras si se hubiera partido de la dilución 10-1, pero
como los recuentos estaban dando muy altos se decidió partir de 10-2. Algunas
muestras tenían niveles de coliformes totales tan altos, que no fue posible determinar
la concentración exacta de bacterias coliformes totales (se reporta >73800ufc/g).
Estos resultados reflejan la calidad microbiológica deficiente de los jamones
de plazas de mercado. Más de la mitad (55.32%), de las muestras de jamón de cerdo
analizadas se encontraban fuera de norma con niveles de coliformes totales que
excedían el nivel máximo tolerable de Bacterias Coliformes Totales establecido en la
NTC 1325. Las características físicas del producto favorecen la proliferación de las
bacterias, debido a que tiene un mayor contenido acuoso en comparación con el
jamón ahumado y el pernil de cerdo. En cuanto a pernil de cerdo, aunque es un
producto seco se encontró un porcentaje altísimo de muestras fuera de norma
(72.73%). Esto indica que la incidencia de coliformes totales en este producto es
sumamente alta, es más alta que en jamón de Cerdo y Jamón ahumado. El menor
porcentaje de muestras fuera de norma se encontró en el Jamón Ahumado (31.25%),
debido a que éste producto es el que menos favorece a las bacterias coliformes totales
debido a su alto contenido de sal y bajo contenido acuoso. Sin embargo, un 30% de
muestras fuera de norma es un porcentaje muy alto, ya que todos los alimentos deben
cumplir con las especificaciones microbiológicas. Con la incubación de 24 horas
53
adicionales, no se encontró un aumento significativo en el porcentaje de muestras
fuera de norma para bacterias coliformes Totales.
En cuanto a Escherichia coli, más del 50% de las muestras analizadas
excedieron el nivel máximo tolerable establecido en la NTC 1325; con niveles
superiores a 100ufc/g. En los tres tipos de jamones de cerdo analizados, se encontró
un mayor porcentaje de muestras fuera de norma en el pernil de cerdo, donde el
59.09% de las muestras de pernil analizadas se encontraban fuera de norma. Esto
coincide con los resultados obtenidos para coliformes totales, donde el 72.73% de las
muestras de Pernil estaba fuera de norma para coliformes Totales. El 48.94% de
muestras de jamón de cerdo analizadas se encontraron fuera de norma a las 24 horas,
y el 50% de muestras de jamón ahumado excedieron los niveles máximos tolerables.
Con la incubación adicional de 24 horas se logró encontrar que el porcentaje de
muestras fuera de norma de pernil de cerdo era 72.73%. Para Jamón ahumado los
resultados no cambiaron, y para Jamón de cerdo el porcentaje de muestras fuera de
norma aumentó ligeramente a 55.32%. Con estos resultados surge una inquietud muy
grande, debido a que unas muestras que mostraron cumplir con la norma a las 24
horas (ningún pozo fluoresció y por ende los niveles de E. coli eran <100ufc/g), con la
incubación adicional de 24 horas mostraron no ser aptas para el consumo humano
porque sus niveles de E. coli eran >100 ufc/g. Es muy probable que si se hubiera
trabajado con la dilución 10-1 sí hubiera sido posible detectar E. coli en niveles
inaceptables a las 24 horas.
En general, más del 50% de muestras de Jamones analizadas contenían niveles
inaceptables de E. coli por lo cual no eran productos aptos para el consumo humano.
La incidencia de Coliformes totales en las muestras analizadas por este método se
determinó en 82.35% a las 24h y la incidencia de E. coli fue de 51.76% a las 24 h en
54
las 85 muestras analizadas por éste método. Con las 24 horas de incubación
adicionales, la incidencia de E. coli fue de 58.82%. Se puede observar que en algunos
casos donde E. coli fue indetectable a las 24 horas, con la incubación de 24 horas
adicionales se detectó en algunos casos en niveles inaceptables, siendo el producto no
apto para el consumo humano. Este resultado es de suma importancia, ya que si se
está empleando el método para aceptar o rechazar un lote de alimentos, el tiempo de
incubación es un factor determinante en el resultado, sobretodo en lo que concierne a
E. coli. Se podría llegar a aceptar alimentos no aptos para el consumo, si solamente se
incuba la placa 24 horas, lo que presenta un riesgo para la salud del consumidor.
También se observó interferencia en la fluorescencia. En varias muestras analizadas
se presentó fluorescencia en pozos que no viraron al color fucsia típico de coliformes.
Se intentó aislar el microorganismo que produjo la fluorescencia, pero no fue posible
aislarlo en Agar Nutritivo. Sin embargo, este hallazgo presenta una señal de alerta en
el método, ya que hay que tener mucha precaución al contar los pozos fluorescentes
con la lámpara UV para cuantificar E. coli y verificar que la fluorescencia provenga
de un pozo color fucsia (coliforme), y no de uno amarillo (no coliforme) para
asegurarse de informar la concentración correcta de E. coli.
8.2 VRBA
Como ya se explicó anteriormente, con éste método solamente se cuantificaron las
bacterias coliformes totales en cada muestra. Como se puede observar en la tabla
anexo 4, hubo 10 muestras en las cuales no fue posible detectar coliformes totales, las
cuales coinciden con las muestras que el método Simplate no logró detectarlas
tampoco: 5 muestras de Jamón de Cerdo, 1 de Pernil y 4 de Jamón ahumado (estas
muestras incluyen a las 5 provenientes de Paloquemao, que se trabajaron con una
dilución más alta que el resto de las muestras). Vale la pena recalcar que éste método
55
logró detectar Coliformes totales en 4 muestras que SimPlate no detectó coliformes
Totales (Muestras No 30, 65, 66, 70), lo cual sugiere que éste método tiene una mayor
sensibilidad. De acuerdo a este método, se encontraron 57 de 85 muestras analizadas
fuera de la NTC 1325 y en las muestras No 18, 32 y 35 donde Simplate no pudo
detectar Coliformes, el recuento en placa VRBA excedió la norma NTC 1325, lo que
nuevamente refleja que éste método es muy sensible, ya que logra detectar niveles
muy bajos de Coliformes Totales.
La incidencia de coliformes totales determinada por éste método (88.24%, Ver tabla
5) fue un poco mayor que la determinada por el método Simplate (82.35% a las 24H),
debido a que este método es un poco más sensible que el método Simplate.
En cuanto a porcentaje de muestras fuera de norma, se observó el mismo
comportamiento que con el método Simplate; el porcentaje de muestras fuera de
norma más alto se presentó para el pernil de cerdo, donde el 86.37% de las muestras
de pernil analizadas estaban fuera de la norma NTC 1325; el más bajo se presentó en
el Jamón ahumado (43.75%) y para jamón de cerdo el porcentaje de muestras fuera de
norma fue de 65.96.
Vale la pena notar, que aunque el comportamiento fue similar en ambos métodos, se
encontró un mayor porcentaje de muestras fuera de norma por el método de recuento
en placa en VRBA, lo que refleja una mayor sensibilidad ya que logró detectar niveles
de Coliformes totales en muestras donde Simplate no logró detectar nada (incluso en
la misma dilución).
8.3 NMP
En cuanto a sensibilidad, éste método demostró tener la más alta, debido a que
no pudo detectar coliformes Totales en tan solo 4 muestras (Anexo 5, muestras
1,3,5,63), de resto fue posible detectarlos en todas las muestras. Se encontró que 57 de
56
las 85 muestras analizadas estaban fuera de norma para coliformes totales de las
cuales eran 7 muestras de jamón ahumado, 19 de pernil de cerdo y 31 de Jamón de
Cerdo.
Hay una alta congruencia de los resultados obtenidos con este método y los resultados
obtenidos por el método recuento en placa en VRBA, debido a que las muestras fuera
de norma por el método recuento en placa en VRBA fueron las mismas por el método
del NMP para coliformes totales, mientras que por el método Simplate se encontró
que 48 de las 85 muestras estaban fuera de norma para Coliformes totales.
Nuevamente, se observó el mismo comportamiento observado con los otros
dos métodos, donde el porcentaje de muestras fuera de norma más alto fue para el
pernil de cerdo (86.37%), lo cual coincide exactamente con los resultados obtenidos
por recuento en placa en VRBA. Lo mismo se observó con los otros dos tipos de
alimento, donde el porcentaje de muestras fuera de norma para coliformes totales fue
el mismo para NMP y recuento en place en VRBA.
En general, la incidencia de Coliformes totales (81 de las 85 muestras, ver tabla 5) a
las 48 horas fue de 95.29%, lo que representa la incidencia más alta al compararla con
la obtenida por los otros dos métodos. Esta altísima incidencia de coliformes totales
sugiere una altísima sensibilidad del método para detectar bacterias coliformes totales
en muestras de alimentos, en comparación con los otros dos métodos evaluados.
En cuanto a E. coli, surge un punto de discusión muy importante. En este
estudio, se decidió realizar la confirmación de todos los tubos que presentaron
fluorescencia y viraje del medio, por medio de siembra en EMB en busca de Brillo
metálico típico de E. coli, así como la prueba de Indol. Si se observa la tabla No 6,
donde se presenta el porcentaje de muestras fuera de norma para Coliformes Totales y
E. coli según tipo de Alimento y Método, se puede observar que al realizar la
57
confirmación de los tubos, el porcentaje de muestras fuera de norme disminuye
notablemente (10-20%). Sin confirmar los tubos, se determinó que el 54.08% de
muestras de jamón estaban fuera de norma, pero al confirmar los tubos se encontró
que tan solo el 29.79% lo estaba realmente. Si bien el método no sugiere confirmar los
tubos para E. coli, se observó durante el estudio que tubos con fluorescencia y viraje
del medio no presentaban E. coli. Vale la pena recalcar, que el hecho de que no haya
sido posible observar el brillo metálico de E. coli sea certeza de que no esté. En un
alimento puede haber una gran cantidad de bacterias, que pueden ejercer competencia
entre sí, y al sembrar en un medio como el EMB, puede que crezca una lactosa
negativo que está en niveles muy altos (como se observó en muchos casos) y si E. coli
está en niveles muy bajos, es poco probable que crezca en el medio.
Sin embargo, al comparar los resultados de la cuantificación de E. coli por
éste método de los tubos confirmados, con los no confirmados, se puede observar que
el porcentaje de muestras fuera de norma determinado por el NMP es notablemente
inferior. Se pudo observar el mismo comportamiento que se observó por los otros dos
métodos empleados, ya que el porcentaje de muestras fuera de norma para E. coli más
alto se encontró en el pernil y el más bajo en el jamón ahumado.
8.4 Comparación de Los tres Métodos
En cuanto a sensibilidad de detección de Coliformes totales, el método de
NMP en LMX fue el más sensible, ya que no logró detectarlos en tan solo 4 muestras
como se puede observar en la tabla 5, mientras que Simplate no logró detectar
coliformes totales en 15 muestras a las 24h y el recuento en placa en VRBA no logró
detectar coliformes totales en 10 muestras. La incidencia más alta de coliformes
totales se determinó por el método NMP, siendo ésta 95.29%. Esto indica que casi
todas las muestras analizadas tenían bacterias coliformes totales.
58
En lo que respecta a E. coli, el método de recuento en placa en VRBA no se
empleó para detectarla, ya que hubiera sido muy tedioso tener que realizar
confirmación de bioquímicas para cada colonia sospechosa y tinción de gram, o pases
a medios como EMB para observar el brillo metálico, y no fue posible emplear el
medio VRBA + MUG para detectar E. coli con fluorescencia.
Nuevamente, con el método de NMP sin confirmar, se determinó la incidencia
más alta de E. coli (70.59%); sin embargo, al realizar la confirmación se observó que
la incidencia era menor (54.12%). Tanto por el método Simplate, como por NMP
confirmada, la incidencia de E. coli estuvo alrededor del 50%.
Se observa que el método Simplate puede ser más sensible con la incubación
de 24 horas adicionales al tiempo sugerido, ya que inclusive en muestras negativas
para E. coli a las 24 horas, se presentaron como fuera de norma (>100ufc/g) a las 48
horas.
En cuanto a especificidad, obviamente el método recuento en placa en VRBA
es el menos específico, ya que no nos permite cuantificar E. coli directamente como
nos permite los otros dos métodos. Sin lugar a dudas, el método Simplate es el más
específico, ya que nos permite cuantificar fácil y rápidamente bacterias no coliformes,
coliformes totales y E. coli procesando la muestra en tan solo una siembra.
59
8.5 Calidad Microbiológica de los Jamones
Por todos los métodos, se determinó una incidencia altísima de coliformes
totales, que osciló entre el 80 y el 95%. Si bien es aceptable que los alimentos cocidos
tengan cierta carga de bacterias coliformes totales, es inaceptable que sus niveles sean
superiores a 1100ufc/g, según lo establecido en la NTC 1325. Se encontró que la gran
mayoría de muestras de pernil de cerdo (72-86%) estaban fuera de la norma para
bacterias coliformes totales, lo cual refleja una manipulación deficiente del producto
post proceso, aún cuando este tipo de jamón tiene un bajo contenido acuoso. Entre el
55-65% de las muestras de Jamón de cerdo analizadas se encontraban fuera de norma
para coliformes totales y aproximadamente el 40% de las muestras de Jamón
ahumado no cumplían con la NTC 1325.
Dado que E. coli no es esporulada, es una bacteria que debe ser eliminada
durante el proceso de cocción (escaldado) de los jamones, y por lo tanto su presencia
en los alimentos cocidos se debe principalmente a contaminación post proceso. Sin
embargo, la incidencia de E. coli determinada por los distintos métodos empleados
osciló entre el 50-70%. Esto refleja las deficientes condiciones de almacenamiento y
manipulación del producto terminado. La norma técnica colombiana NTC 1325
establece que la concentración de E. coli para carnicos escaldados o cocidos debe ser
inferior a 100ufc/g. Sin embargo, más del 50% de las muestras de pernil de cerdo no
eran aptas para el consumo según esta norma. El 35-50% de las muestras de jamón
ahumado estaban fuera de norma y entre el 29-55% de las muestras de jamón de
Cerdo. Los porcentajes de muestras fuera de norma según alimento varían de método
a método, pero para todos coincide que una altísima proporción de muestras
60
analizadas no eran aptas para el consumo humado, por un alto recuento de bacterias
coliformes totales y de E. coli.
Como ya se ha explicado anteriormente, una gran proporción de bogotanos
adquiere sus alimentos en las plazas de mercado, incluyendo las plazas del Siete de
Agosto y del Doce de Octubre. Se sabe que las ETA’s son un asunto importante de
salud pública, tanto que han sido incluidas dentro del Sistema de Vigilancia de Salud
pública SIVIGILA. Así lo establece el Informe de Comportamiento de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos desde 1999 hasta la semana
epidemiologica 53 de 2003: “A nivel mundial las Enfermedades Transmitidas por
Alimentos (ETA) constituyen una de las causas más importantes de morbilidad y
mortalidad. De acuerdo con los reportes estadísticos, los alimentos son la vía de
transmisión de numerosos agentes patógenos de orden bacteriano, parasitario, viral,
prionico y toxinas. Las ETA han alcanzado su mayoría de edad. Ya no son
solamente un malestar que causa diarreas, vómitos y fiebre. Se han descrito un listado
de aproximadamente 250 enfermedades, así mismo se ha demostrado que las ETA
dejan complicaciones y secuelas que comprenden entre otras meningitis, artritis,
desórdenes auto inmunes, enfermedades cardio-vasculares, neoplasias, invalidez física
permanente, alergias, etc. Por esta razón las ETA’s bien pueden ser consideradas
como uno de los problemas más graves y preocupantes de salud pública en la
actualidad.”(30)
Desgraciadamente, debido a la falta de reportes y a la demora de los mismos
en la mayoría de casos no es posible establecer el agente etiológico de la ETA. “La
mayor problemática se presenta en el subregistro del consumidor al automedicarse o
desconocer la magnitud de la etiología y del mismo personal de salud que no ordena
la practica de los exámenes pertinentes para determinar el agente causante de la
61
sintomatología”(29) Sin embargo, en el informe de comportamiento de las ETA’s
mencionado se establece, que en los pocos casos en donde ha sido posible realizar
análisis microbiológico a los alimentos, los microorganismos más comunes son
Coliformes fecales y Estafilococo coagulasa positivo (29).
Se sabe que Escherichia coli es causante de infecciones alimentarias, que
desencadena en diarrea en niños y adultos, y por ende existe un riesgo latente de
salud pública en lo referente a esta bacteria y a otros coliformes. Es altamente
probable que E. coli, entre otros coliformes, sea el agente causal de ETA’s en una
proporción considerable en Bogotá, especialmente en aquella población que adquiere
sus alimentos en plazas de mercado. Son de especial cuidado aquellos alimentos listos
para el consumo, como son los jamones de cerdo, que no son sometidos a ningún
proceso de cocción después de su adquisición. Es necesario realizar estudios
adicionales para evaluar la calidad microbiológica de los alimentos que se venden en
las plazas de mercado, especialmente aquellos listos para el consumo como los
quesos, crema de leche, jamones y cuajadas. De esta forma se puede exigir a la
secretaría de salud un control estricto de la calidad de los alimentos que se distribuyen
en las plazas, para la tranquilidad de los consumidores.
Así mismo, la información que este estudio aporta puede ser útil para el
desarrollo del análisis de riesgos de Escherichia coli en los jamones de cerdo. Se
presenta aquí que la calidad microbiológica de estos alimentos es deficiente en lo
concerniente a bacterias coliformes totales y E. coli. Se encontró una incidencia
alarmantemente alta de bacterias coliformes totales que quizás pueden ser causante de
ETA’s en Bogotá. Este trabajo es un pequeño aporte que nos muestra las condiciones
higiénicas y sanitarias de estos jamones; alimentos que un alto porcentaje de
bogotanos consume diariamente.
62
9. CONCLUSIONES
• La calidad microbiológica de los Jamones de Cerdo analizados es deficiente,
debido a contaminación post proceso durante el almacenamiento, distribución
y comercialización del producto.
• La incidencia de Coliformes Totales en los tres tipos de jamones de cerdo
muestreados es alarmantemente alta, estando presente en casi todas las
muestras analizadas (El 95.29% de las muestras analizadas por el método
NMP en LMX presentaron coliformes totales)
• El 86.37% de muestras de pernil, 43.75% de muestras de Jamón ahumado y el
65.96% de muestras de jamón de cerdo analizadas estaban fuera de norma
para coliformes totales. y el 72.73% fuera de norma para E. coli.)
• La incidencia de E. coli en los tres en los tres tipos de jamones de cerdo
analizados es muy alta, siendo 58.82%.
• El 72.73% de muestras de pernil, 50% de muestras de Jamón ahumado y el
55.32% de muestras de jamón de cerdo analizadas estaban fuera de norma
para E. coli.)
• Los métodos de Recuento en placa en VRBA y de Número Más Probable
(NMP) en LMX presentaron resultados comparables para la cuantificación de
bacterias coliformes totales, en lo que respecta a porcentaje de muestras fuera
de norma.
• Con el análisis estadístico se determinó que los resultados para las muestras
varían significativamente en los tres métodos evaluados, lo cual era de
esperarse debido a que la especificidad y sensibilidad de cada método es
diferente.
63
• El método de recuento en placa en VRBA es un método útil para cuantificar
las bacterias coliformes totales en alimentos para el consumo.
• El método Simplate presentó una mayor sensibilidad para determinar la
concentración de E. coli, especialmente con la incubación de 24 horas
adicionales al tiempo recomendado.
• Los tres métodos mostraron que el mayor porcentaje de muestras fuera de la
norma NTC 1325 se presentó en el Pernil de Cerdo, tanto para Coliformes
Totales como para E. coli.
• El jamón ahumado presentó el menor porcentaje de muestras fuera de la
norma, sin embargo, el porcentaje es considerablemente alto (50% Por el
método Simplate).
• Es muy importante confirmar E. coli con indol y brillo metálico si es posible
en EMB los tubos positivos de LMX y saber distinguir entre la fluorescencia
que presenta E. coli ya la que puede presentar Pseudomona para no informar
falsos positivos, ya que este microorganismo entre otros puede presentar
interferencia.
• También se observó cierta interferencia en la fluorescencia con el método
simplate, por lo cual hay que tener precaución al realizar las lecturas para no
informar falsos positivos, y solamente contar los pozos fluorescentes que
viraron a rojo.
• El método que detectó una mayor cantidad de muestras fuera de norma para
coliformes totales fue NMP en LMX, por lo cual se concluye que es un
método sensible pero presenta cierta interferencia al leer la fluorescencia.
• El método de recuento en placa en VRBA dio resultados muy buenos,
detectando un altísimo porcentaje de muestras de pernil fuera de norma para
64
coliformes totales (86.37%), y como no presenta interferencia se sugiere como
método de elección.
• Si se desea un método rápido de detección de coliformes totales y E. coli el
método simplate es una buena elección, pero es el método más costoso.
10. SUGERENCIAS
• Se sugiere que los vendedores de plazas de mercado se capaciten en las
Buenas Practicas de Manufactura establecidas en el decreto 3075, para
garantizar la calidad de los productos en venta; especialmente productos listos
para el consumo como son los Jamones de Cerdo. De esta forma se puede
minimizar la contaminación post proceso que se presenta en la manipulación,
venta y distribución de los alimentos.
• Se sugiere incubar 24 horas adicionales las placas de Simplate (48 Horas de
incubación total) para incrementar la sensibilidad del método, ya que es
posible detectar E. coli en muestras donde su concentración es muy baja,
especialmente cuando se trabajan diluciones superiores a 10-1.
• Se sugiere confirmar los tubos de caldo LMX que viren a azul verdoso y
presenten fluorescencia sembrando en un medio diferencial como EMB para
observar el brillo metálico y realizando la prueba de indol, para determinar si
realmente es E. coli la bacteria coliforme que causa la fluorescencia en el tubo.
• Dado que los resultados del método NMP para E. coli varían
considerablemente cuando se realiza la confirmación en los tubos, se sugiere
elegir el método Simplate como método de detección rápida que presenta una
alta sensibilidad y especificidad.
65
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(29) http://www.col.ops-oms.org/sivigila/2001/bole19_2001.htm
(30) http://www.panalimentos.org/panalimentos/files/Informe%20ETAGene
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(31) http://service.merck.de/microbiology/tedisdata/prods/4968-
1_10624_0500.html
68
ANEXO 1. Codificación de muestras
No Muestra Plaza Origen Fecha Alimento 1 Paloquemao Marzo 24/04 Pernil Cerdo 2 Paloquemao Marzo 24/04 Jamon Cerdo Ahumado 3 Paloquemao Marzo 24/04 Jamon Cerdo 4 Paloquemao Marzo 24/04 Jamon Cerdo 5 Paloquemao Marzo 24/04 Jamon cerdo 6 Doce Octubre Marzo 28/04 Jamon Cerdo 7 Doce Octubre Marzo 28/04 Jamon Cerdo 8 Doce Octubre Marzo 28/04 Jamon Cerdo Ahumado9 Doce Octubre Marzo 28/04 Jamon Cerdo Ahumado
10 Doce Octubre Marzo 28/04 Jamon Cerdo 11 Siete Agosto Abril 11/04 Jamon Cerdo 12 Siete Agosto Abril 11/04 Pernil Cerdo 13 Siete Agosto Abril 11/04 Jamon Cerdo Ahumado14 Siete Agosto Abril 11/04 Jamon Cerdo 15 Siete Agosto Abril 11/04 Pernil Cerdo 16 Doce Octubre Abril 11/04 Pernil Cerdo 17 Doce Octubre Abril 11/04 Jamon Cerdo 18 Doce Octubre Abril 11/04 Jamon Cerdo 19 Doce Octubre Abril 11/04 Jamon Cerdo Ahumado20 Doce Octubre Abril 11/04 Jamon Cerdo Ahumado21 Siete Agosto Abril 11/04 Jamon Cerdo Ahumado22 Siete Agosto Abril 11/04 Pernil Cerdo 23 Siete Agosto Abril 11/04 Jamon Cerdo 24 Siete Agosto Abril 11/04 Jamon Cerdo 25 Siete Agosto Abril 11/04 Jamon Cerdo 26 Doce Octubre Abril 11/04 Pernil Cerdo 27 Doce Octubre Abril 11/04 Pernil Cerdo 28 Doce Octubre Abril 11/04 Jamon Cerdo 29 Doce Octubre Abril 11/04 Jamon Cerdo 30 Doce Octubre Abril 11/04 Jamon Cerdo Ahumado31 Doce Octubre Abril 18/04 Jamon Cerdo 32 Doce Octubre Abril 18/04 Jamon Cerdo 33 Doce Octubre Abril 18/04 Pernil Cerdo 34 Doce Octubre Abril 18/04 Jamon Cerdo 35 Doce Octubre Abril 18/04 Pernil Cerdo 36 Doce Octubre Abril 18/04 Jamon Cerdo Ahumado37 Doce Octubre Abril 18/04 Jamon Cerdo Ahumado38 Doce Octubre Abril 18/04 Pernil Cerdo 39 Doce Octubre Abril 18/04 Jamon Cerdo
69
40 Doce Octubre Abril 18/04 Jamon Cerdo 41 Siete Agosto Abril 18/04 Jamon Cerdo Ahumado42 Siete Agosto Abril 18/04 Pernil Cerdo 43 Siete Agosto Abril 18/04 Jamon Cerdo 44 Siete Agosto Abril 18/04 Pernil Cerdo 45 Siete Agosto Abril 18/04 Jamon Cerdo 46 Siete Agosto Abril 18/04 Jamon Cerdo Ahumado47 Siete Agosto Abril 18/04 Jamon Cerdo 48 Siete Agosto Abril 18/04 Jamon Cerdo 49 Siete Agosto Abril 18/04 Jamon Cerdo Ahumado50 Siete Agosto Abril 18/04 Pernil Cerdo 51 Siete Agosto Abril 25/04 Jamon Cerdo 52 Siete Agosto Abril 25/04 Jamon Cerdo 53 Siete Agosto Abril 25/04 Jamon Cerdo 54 Siete Agosto Abril 25/04 Jamon Cerdo 55 Siete Agosto Abril 25/04 Pernil Cerdo 56 Siete Agosto Abril 25/04 Jamon Cerdo 57 Siete Agosto Abril 25/04 Jamon Cerdo Ahumado58 Siete Agosto Abril 25/04 Pernil Cerdo 59 Siete Agosto Abril 25/04 Jamon Cerdo 60 Siete Agosto Abril 25/04 Pernil Cerdo 61 Doce Octubre Abril 25/04 Jamón Cerdo 62 Doce Octubre Abril 25/04 Jamón Cerdo 63 Doce Octubre Abril 25/04 Jamón Cerdo Ahumado64 Doce Octubre Abril 25/04 Pernil Cerdo 65 Doce Octubre Abril 25/04 Jamón Cerdo 66 Doce Octubre Abril 25/04 Jamon Cerdo 67 Doce Octubre Abril 25/04 Jamon Cerdo 68 Doce Octubre Abril 25/04 Pernil Cerdo 69 Doce Octubre Abril 25/04 Jamon Cerdo 70 Doce Octubre Abril 25/04 Jamon Cerdo 71 Siete Agosto Mayo 2/04 Jamon Cerdo 72 Siete Agosto Mayo 2/04 Jamon Cerdo 73 Siete Agosto Mayo 2/04 Jamon Cerdo 74 Siete Agosto Mayo 2/04 Pernil Cerdo 75 Siete Agosto Mayo 2/04 Jamon Cerdo 76 Siete Agosto Mayo 2/04 Pernil Cerdo 77 Siete Agosto Mayo 2/04 Jamon Cerdo 78 Siete Agosto Mayo 2/04 Jamon Cerdo 79 Siete Agosto Mayo 2/04 Jamon Cerdo 80 Siete Agosto Mayo 2/04 Jamon Cerdo 81 Siete Agosto Mayo 2/04 Pernil de Cerdo
70
82 Siete Agosto Mayo 2/04 Jamon Ahumado 83 Siete Agosto Mayo 2/04 Pernil de Cerdo 84 Siete Agosto Mayo 2/04 Jamon Cerdo 85 Siete Agosto Mayo 2/04 Jamon Cerdo
71
ANEXO 2. Resultados Simplate para Coliformes Totales
No Muestra Pozos CT 24h Recuento CT 24h
(ufc/g) Pozos CT 48h Recuento CT 48h
(ufc/g) 1 0 < 10^5 0 < 10^52 0 < 10^5 0 < 10^53 0 < 10^5 0 < 10^54 0 < 10^5 0 < 10^55 0 < 10^5 0 < 10^56 3 600 7 14007 0 <100 0 <1008 1 200 2 4009 6 1200 6 1200
10 1 200 2 40011 85 >73800 85 >7380012 85 >73800 85 >7380013 15 3200 19 420014 28 6800 36 940015 85 >73800 85 >7380016 51 15600 85 >7380017 0 <100 0 <10018 0 <100 2 40019 3 600 3 60020 2 400 5 100021 23 5400 47 1360022 85 >73800 85 >7380023 85 >73800 85 >7380024 78 44000 83 7380025 4 800 7 140026 84 >73800 85 >7380027 62 22400 80 5080028 2 400 5 100029 74 35400 83 7380030 0 <100 0 <10031 1 200 1 20032 0 <100 1 20033 4 800 5 100034 1 200 1 20035 0 <100 1 20036 0 <100 0 <10037 3 600 6 120038 6 1200 12 260039 14 3000 26 620040 8 1600 19 420041 2 400 5 100042 85 >73800 85 >7380043 56 18400 78 4400044 57 19000 73 3380045 80 50800 83 7380046 38 10000 63 2320047 47 13600 80 5080048 85 >73800 85 >73800
72
49 1 200 1 20050 68 27600 68 2760051 85 >73800 85 >7380052 46 13200 67 2660053 19 4200 37 960054 1 200 2 40055 2 400 3 60056 2 400 2 40057 14 3000 15 320058 71 31200 74 3540059 29 7000 42 1160060 83 73800 83 7380061 1 200 2 40062 3 600 3 60063 0 <100 0 <10064 3 600 11 240065 0 <100 0 <10066 0 <100 0 <10067 6 1200 14 300068 11 2400 13 280069 78 44000 78 4400070 0 <100 1 20071 83 73800 84 >7380072 9 1800 25 580073 85 >73800 85 >7380074 78 44000 84 >7380075 66 25600 71 3120076 85 >73800 85 >7380077 78 44000 85 >7380078 85 >73800 85 >7380079 26 6200 28 680080 3 600 20 460081 4 800 6 120082 82 62400 85 >7380083 77 41400 85 >7380084 54 17200 67 2660085 46 13200 66 25600
73
ANEXO 3. Resultados Simplate para E. coli
No Muestra Pozos E. coli 24h Recuento E. coli 24h Pozos E. coli 48h Recuento E. coli 48h
1 0 < 10^5 0 < 10^52 0 < 10^5 0 < 10^53 0 < 10^5 0 < 10^54 0 < 10^5 0 < 10^55 0 < 10^5 0 < 10^56 1 200 2 4007 0 <100 0 <1008 0 <100 0 <1009 6 1200 6 1200
10 0 <100 0 <10011 85 >73800 85 >7380012 85 >73800 85 >7380013 4 800 4 80014 2 400 2 40015 85 >73800 85 >7380016 0 <100 0 <10017 0 <100 0 <10018 0 <100 0 <10019 0 <100 0 <10020 0 <100 0 <10021 2 400 2 40022 1 200 1 20023 3 600 5 100024 0 <100 1 20025 0 <100 0 <10026 36 9400 59 2020027 0 <100 0 <10028 0 <100 0 <10029 0 <100 1 20030 0 <100 0 <10031 0 <100 0 <10032 0 <100 0 <10033 0 <100 1 20034 1 200 1 20035 0 <100 0 <10036 0 <100 0 <10037 1 200 1 20038 1 200 2 40039 0 <100 0 <10040 0 <100 0 <10041 0 <100 5 100042 5 1000 5 100043 5 1000 5 100044 3 600 3 60045 5 1000 16 360046 1 200 1 20047 0 <100 1 20048 2 400 2 400
74
49 0 <100 0 <10050 2 400 2 40051 85 >73800 85 >7380052 7 1400 15 320053 1 200 1 20054 0 <100 0 <10055 0 <100 0 <10056 0 <100 0 <10057 13 2800 13 280058 12 2600 26 620059 2 400 4 80060 83 73800 83 7380061 0 <100 1 20062 0 <100 0 <10063 0 <100 0 <10064 0 <100 1 20065 0 <100 0 <10066 0 <100 0 <10067 1 200 1 20068 0 <100 1 20069 17 3800 20 460070 0 <100 0 <10071 32 8000 33 840072 1 200 1 20073 10 2200 10 220074 4 800 4 80075 5 1000 6 120076 6 1200 6 120077 5 1000 5 100078 1 200 1 20079 21 4800 21 480080 0 <100 0 <10081 0 <100 0 <10082 3 600 19 420083 2 400 2 40084 2 400 2 40085 7 1400 8 1600
75
ANEXO 4. Recuento en UFC/g de Coliformes Totales Por el método Recuento en Placa en VRBA
No Muestra Recuento UFC/g Recuento UFC/g
1<104 <100002<104 <100003<104 <100004<104 <100005<104 <10000611*102 11007<102 <10082*102 200912*102 1200
101*102 10011127*104 1270000128*104 80000135*103 50001437*103 3700015>16*106 >16000000169*104 9000017<102 <1001844*102 4400191*102 100205*102 500217*104 7000022>16*106 >160000002312*105 11500002413*104 1300002516*102 16002631*104 310000279*104 90000283*102 3002914*104 140000301*102 100311*102 1003213*102 13003315*102 1500343*102 3003520*102 200036<102 <1003727*102 27003817*102 17003918*103 18000407*103 7000413*102 3004244*104 4400004331*103 310004449*104 4900004522*104 2200004628*104 2800004727*104 2700004836*104 360000
76
49<102 <1005019*103 190005113*103 130005214*104 1400005317*103 17000542*102 200559*102 900562*102 200572*104 200005880*103 80000593*103 30006019*102 1900618*103 8000624*102 40063<102 <1006416*103 16000651*102 1006611*102 1100679*103 9000684*102 400691*104 10000702*102 200712*104 200007228*104 2800007310*104 100000744*104 40000757*103 70007611*105 10700007724*104 2400007845*105 45200007974*102 7400803*103 30008122*102 22008281*103 810008324*104 2400008411*104 1050008510*104 102000
77
ANEXO 5. Resultados NMP Para Coliformes Totales y E. coli
No Muestra Tubos +CT NMP CT Tubos+E.coli NMP E. coli
Tubos Confirmados E. coli
NMP E. coliConf
1 000 <30 000 <30 000 <302 100 40 100 40 000 <303 000 <30 000 <30 000 <304 100 40 100 40 000 <305 000 <30 000 <30 000 <306 331 4600 220 210 220 2107 100 40 000 <30 000 <308 320 930 100 40 000 <309 331 4600 331 4600 000 <30
10 320 930 100 40 000 <3011 333 >24000 331 4600 220 21012 333 >24000 320 930 320 93013 330 2400 000 <30 000 <3014 333 >24000 320 930 100 4015 333 >24000 333 >24000 211 20016 333 >24000 000 <30 000 <3017 211 200 000 <30 000 <3018 220 210 000 <30 000 <3019 110 70 000 <30 000 <3020 310 430 100 40 100 4021 333 >24000 310 430 000 <3022 333 >24000 330 2400 300 23023 333 >24000 300 230 200 9024 333 >24000 301 390 301 39025 330 2400 100 40 100 4026 333 >24000 333 >24000 332 1100027 333 >24000 000 <30 000 <3028 311 750 200 90 200 9029 333 >24000 000 <30 000 <3030 301 390 000 <30 000 <3031 100 40 000 <30 000 <3032 320 930 000 <30 000 <3033 320 930 300 230 100 4034 310 430 310 430 100 4035 100 40 000 <30 000 <3036 000 <30 000 <30 000 <3037 321 1500 000 <30 000 <3038 322 2100 010 30 000 <3039 332 11000 210 150 000 <3040 333 >24000 120 110 000 <3041 320 930 010 30 010 3042 333 >24000 201 140 201 14043 333 >24000 321 1500 221 28044 333 >24000 320 930 210 15045 333 >24000 331 4600 221 28046 333 >24000 300 230 000 <3047 333 >24000 300 230 300 230
78
48 333 >24000 321 1500 321 150049 120 110 000 <30 000 <3050 333 >24000 310 430 210 15051 332 2100 331 4600 010 3052 333 >24000 332 11000 331 460053 332 11000 200 90 000 <3054 321 1500 000 <30 000 <3055 330 2400 000 <30 000 <3056 200 90 000 <30 000 <3057 331 4600 320 930 310 43058 333 >24000 301 390 101 7059 330 2400 310 430 300 23060 330 2400 320 930 320 93061 332 11000 300 230 200 9062 320 930 300 230 000 <3063 000 <30 000 <30 000 <3064 333 >24000 000 <30 000 <3065 110 70 000 <30 000 <3066 301 390 000 <30 000 <3067 331 4600 300 230 000 <3068 330 2400 100 40 100 4069 333 >24000 333 >24000 312 120070 332 1100 200 90 100 4071 333 >24000 330 2400 220 21072 333 >24000 100 40 100 4073 333 >24000 330 2400 100 4074 333 >24000 300 230 000 <3075 333 >24000 200 90 200 9076 333 >24000 211 200 010 3077 333 >24000 331 4600 331 460078 333 >24000 320 930 110 7079 333 >24000 210 150 210 15080 331 4600 300 230 100 4081 330 2400 310 430 210 15082 333 >24000 310 430 310 43083 333 >24000 300 230 300 23084 333 >24000 310 430 310 43085 333 >24000 310 430 200 90
79
ANEXO 6. Tabla Simplate (Tomada del Folleto de Instrucciones de BIOCONTROL) Pozos Positivos=Población Pozos Positivos=Población Pozos Positivos=Población
1=2 29=70 57=190 2=4 30=74 58=196 3=6 31=76 59=202 4=8 32=80 60=208
5=10 33=84 61=216 6=12 34=86 62=224 7=14 35=90 63=234 8=16 36=94 64=240 9=18 37=96 65=248
10=22 38=100 66=256 11=24 39=104 67=266 12=26 40=108 68=276 13=28 41=112 69=288 14=30 42=116 70=298 15=32 43=120 71=312 16=36 44=124 72=324 17=38 45=128 73=338 18=40 46=132 74=354 19=42 47=136 75=372 20=46 48=142 76=392 21=48 49=146 77=414 22=50 50=150 78=440 23=54 51=156 79=470 24=56 52=160 80=508 25=58 53=166 81=556 26=62 54=172 82=624 27=64 55=178 83=738 28=68 56=184 84=>738
Si no hay pozos positivos y la esponja es positiva la población es 1, si las esponja y
todos los pozos son negativos la población es <1. La población se puede expresar en
UFC/g o NMP.
Una vez obtenida la población, se multiplica por el factor de dilución para determinar
el número total de organismos.
80
ANEXO 7. Tabla del NMP (3)
Numero Tubos Positivos NMP/100ml o g
Limites debajo
Confianza 95% alto
10-2 10-3 10-4 0 0 0 <30 0 0 1 30 <0.5 9 0 1 0 30 <0.5 13 1 0 0 40 <0.5 20 1 0 1 70 1 21 1 1 0 70 1 23 1 1 1 110 3 36 1 2 0 110 3 36 2 0 0 90 1 36 2 0 1 140 3 37 2 1 0 150 3 44 2 1 1 200 7 89 2 2 0 210 4 47 2 2 1 280 10 150 3 0 0 230 4 120 3 0 1 390 7 130 3 0 2 640 15 380 3 1 0 430 7 210 3 1 1 750 14 230 3 1 2 1200 30 380 3 2 0 930 15 380 3 2 1 1500 30 440 3 2 2 2100 35 470 3 3 0 2400 36 1300 3 3 1 4600 71 2400 3 3 2 11000 150 4800 3 3 3 >24000