comparison of three rna extraction methods for gene...

ว.วทย. มข. 41(4) 1030-1042 (2556) KKU Sci. J. 41(4) 1030-1042 (2013)

การเปรยบเทยบการสกดอารเอนเอสามวธเพอใชในการศกษา การแสดงออกของยนดวยเทคนค RT-qPCR จากพชวงศพรกไทย

Comparison of Three RNA Extraction Methods for Gene Expression Analysis by RT-qPCR from Piperaceae Plants

ชนนษฏ ชพยคฆ1,2* ก ำไร วรนช3 รตตกำนต บวเรอง1 และ อนพนธ กงบงเกด3

บทคดยอ พชในวงศพรกไทยเปนพชสมนไพรทอยคสงคมไทยมานาน พบวาสารเซสควเทอรปนซงเปนสารออกฤทธ

ในพชกลมนมฤทธทางเภสชวทยาทนาสนใจ แตมราคาสงเนองจากโครงสรางโมเลกลทซบซอน ท าใหยากตอการผลตโดยกระบวนการเคม การใชเทคโนโลยชวภาพเขามาชวย จงเปนทางเลอกทจะสามารถผลตสารทมคณภาพด และราคาถกได ในการนตองทราบการควบคมการแสดงออกของยนส าหรบเอนไซมในวถการสงเคราะหสาร ซงตองการอารเอนเอทมคณภาพดแตปญหาอปสรรคทพบในการสกดอารเอนเอจากพชวงศนคอ ในใบพชมสารประกอบฟโนลคสงและมคลอโรฟลลสง วตถประสงคของงานวจยชนนเพอทจะหาวธการทมประสทธภาพทจะสามารถสกดแยกเอาอารเอนเอทมคณภาพสงออกมาจากใบพล ใบชะพล และใบดปล จากการเปรยบเทยบวธสกดอารเอนเอโดยใช RNeasy Plant Mini kit (QIAGEN), TRIzol Reagent (Life technologiesTM) และ Easy-REDTM Total RNA Extraction (iNtRON Biotechnology) พบวาการใชชด RNeasy Plant เปนวธการทมประสทธภาพทสด สามารถสกดอารเอนเอทมคณภาพสง ปรมาณสม าเสมอ จากพชทงสามชนดททดสอบ เมอน าอารเอนเอไปวเคราะหการแสดงออกของยนดวยเทคนค RT-qPCR พบวาอารเอนเอนสามารถใชเปนตนแบบในการเพมปรมาณทรานสครปตของ Actin และ Sesquiterpene synthase ได ชดสกดอารเอนเอ RNeasy Plant จงเปนวธการทเหมาะสมส าหรบการสกดอารเอนเอจากพชวงศพรกไทยเพอใชในการศกษาการแสดงออกของยนและการศกษาพชในระดบโมเลกล

1ภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตรการแพทย มหาวทยาลยนเรศวร จ.พษณโลก 65000 2สถานวจยเพอความเปนเลศทางวชาการ ดานเทคโนโลยชวภาพทางการแพทย มหาวทยาลยนเรศวร จ.พษณโลก 65000 3ภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยนเรศวร จ.พษณโลก 65000 *Corresponding Author, E-mail: [email protected]

วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 4 1031งานวจยงานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 4 1031

ABSTACT Piperaceae plants are medicinal herbs that coexist with Thai society for a long time.

Sesquiterpenes, the active components of those plants, have pharmacological interest. However, the complexity of molecular structure makes them still be expensive. Biotechnology should be the better choice for high quality and cheap chemical production. To achieve that goal, the regulation of biosynthetic gene expression needed to be studied that requires high quality of RNA. However, high phenolics and high chlorophyll contents in leaves obstructed RNA isolation from Piperaceae. The aim of this work was to obtain the efficient method for RNA isolation from P. betle, P. sarmentosum and P. retrofractum leaf. By comparison between different methods, RNeasy Plant Mini kit (QIAGEN), TRIzol Reagent (Life technologies TM) and easy-RED TM RNA extraction (iNtRON Biotechnology), it was found that RNeasy Plant was the most efficient method. RNA isolated from RNeasy Plant method was high quality, integrity and equal amount from three tested plant species. Afterwards, RNeasy Plant - isolated RNA was further used for gene expression analysis using RT-qPCR technique. It was demonstrated that the RNA could be used as a template for Actin and Sesquiterpene synthase transcript amplification. Taken together, RNeasy Plant Mini kit was the ideal method for isolation of RNA from Piperaceae plants using for gene expression analysis and molecular study. ค าส าคญ: พชวงศพรกไทย วธการสกดอารเอนเอ เทคนค RT-qPCR Keywords: Piperaceae plants, RNA isolation method, RT-qPCR บทน า

พชในวงศพรกไทย (Piperaceae) ไดแก พล (Piper betle Linn.) ชะพล (Piper sarmentosum Roxb.) และ ดปล (Piper retrofractum Vahl.) เปนตน เปนพชสมนไพรทมสรรพคณทางยามากมาย ตงแตอดตกาลถกใชในต ารายาไทย (Thai Pharmacopoeia) สามารถปลกและเจรญเตบโตไดดในทกครวเรอน ทกภาคของประเทศไทย มคณคาทงทางเศรษฐกจ สงคม และวฒนธรรมของคนไทยเปนอยางมาก พลถกใชรบประทานพรอมปนแดงและหมาก ใชประกอบพธกรรมศกดสทธในงานบญ ชะพลถกใชรบประทานในอาหารประเภทแกง เปน

สวนประกอบของอาหารเม ยงค า ดปลถกใชเปนเครองเทศ เปนตน แตคนรนปจจบน ไมคอยเหนความส าคญของพชวงศน ด งนนควรมการศกษาเกยวกบพชกลมนใหมากขน เพอใหเหนถงคณคาทแฝงอย ท าใหสามารถใชประโยชนจากความหลากหลายทางชวภาพของบานเราไดอยางเตมท โดยเฉพาะการศกษาเกยวกบสารออกฤทธทางชวภาพ บทบาทของสารในธรรมชาต และกลไกการสงเคราะหสารในพชในระดบโมเลกล ขอมลทไดจะเปนประโยชนในการพฒนาวธการเพมการผลตสารทมคณภาพด ราคาถก และปรมาณเพยงพอตอการทจะน าไปประยกตใช

KKU Science Journal Volume 41 Number 41032 Research1032 KKU Science Journal Volume 41 Number 4 Research ทางดานการแพทย เภสชวทยา และทางดานการเกษตรตอไปได

จากรายงานของฐานขอมลน ามนหอมระเหยไทย แ ละ จ า ก ผล ก า ร ศ ก ษ าขอ งค ณะ ผ ว จ ย ทท าการศกษามากอนหนานพบวาองคประกอบทางเคมทพบในน ามนหอมระเหยของพชวงศนจะอย ในกลม ฟนลโพรพานอยดและกลมเซสควเทอรปน (Qin et al., 2010) ไดแก β-caryophyllene (Choopayak et al., 2010) สารนมฤทธตานการอกเสบ (Gertsch et al., 2008; Ugusman et al., 2011) ตานมะเรง (Zheng et al., 1992) มฤทธเปนยาชาเฉพาะท (Ghelardini et al., 2001) และมฤทธก าจดจลชพ (Nalina and Rahim, 2007; Ramji et al., 2002) เปนสารทพชใชเพอขมการเจรญเตบโตของพชอน (allelopathy) (Pukclai and Kato-Noguchi, 2011)ทงๆทมคณคามากมาย แตการใชประโยชนจากสารในกลมนยงคงมอยอยางจ ากด ขอจ ากดทส าคญคอ ความยากในการผลต เนองจากโครงสรางโมเลกลทซบซอนท าใหการผลตโดยกระบวนการทางเคมท าไดยาก เปนผลใหราคาของสารนยงคงสงอย (β-caryophyllene ผลตภณฑของ Sigma ราคาประมาณ 5,000 บาทตอมลลลตร) ดงนนการใชเทคโนโลยภาพเขามาชวย ไดแก การใชพชเปนแหลงผลตสาร หรอการใหแบคทเรยเปนแหลงของการผลตสารทไดจากยนของพช จงเปนทางเลอกทนาสนใจ แตการจะใชเทคโนโลยทางชวภาพไดนนจ าเปนทจะตองเขาใจถงกระบวนผลตสารในพชกอน วายนส าหรบเอนไซมหลกของวถชวสงเคราะห มลกษณะโมเลกลอยางไร และมกลไกการควบคมการแสดงออกของยนอยางไร มปจจยอะไรเปนตวควบคมการแสดงออกของยน ยนนนมการแสดงออกเมอไหร แสดงออกทไหน เปนตน ขอมลพนฐานดงกลาวจะ

สามารถน ามาประยกตใชในการเพมการผลตสารดวยเทคโนโลยชวภาพได

โดยเฉพาะอยางยงการศกษาโดยใชเทคนค real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) ทมความไว (sensitivity) และความจ าเพาะ (selectivity) สงนน ตองการอารเอนเอเรมตนทมคณภาพสง มความบรสทธปราศจากสารป น เ ป อ น (purity) ม ค ว า ม ส ม บ ร ณ ไ ม แ ต ก ห ก (integrity) มปรมาณทเพยงพอ และปรมาณทใกลเคยงกนในแตละตวอยางทตองการศกษาเปรยบเทยบ ซงท าใหเปนปญหาตอการศกษาพชวงศพรกไทยในระดบโมเลกล เนองจากพชวงศนมขอจ ากดทเปนปญหาและอปสรรคทส าคญคอ ในเนอเ ยอสวนใบของพช มสารประกอบฟโนลคสงและมคลอโรฟลลสง ท าใหปนเปอนออกมาพรอมอารเอนเอสงผลใหอารเอนเอนนไมสามารถน าไปใชในการศกษาระดบโมเลกลตอได ดงนนการหาวธการสกดอารเอนเอทมประสทธภาพจงเปนขนตอนเรมตนทส าคญส าหรบการศกษาพชวงศพรกไทยในระดบโมเลกลตอไป งานวจยนไดท าการศกษาเปรยบเทยบวธการสกดอารเอนเอจากใบของพชวงศพรกไทย 3 ชนดคอ พล ชะพล และดปล โดยใชวธการสกด 3 วธ คอ 1. RNeasy Plant (QIAGEN,Germany) 2. TRIzol Reagent (Life technologiesTM, USA) และ 3. easy-REDTM (iNtRON Biotechnology, Korea) หลงจากนนวดปรมาณและคณภาพของอารเอนเอทสกดได ดวยเครอง Nanodrop spectrophotometer และท าการวเคราะหใน agarose gel electrophoresis แลวน าอาร เอนเอไปว เคราะหการแสดงออกของยนหาความสมพนธระหวางปรมาณทรานสครปของยน sesquiterpene synthase (STS) ซงเรงปฏกรยาการสงเคราะหสารเซสควเทอรปนเทยบกบยนควบคม

วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 4 1033งานวจยงานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 4 1033 Actin (Actin) ซงเปน house keeping gene ส าหรบโปรตนโครงสรางซงมหนาทเกยวกบการเคลอนไหว และพบวาการแสดงออกของยนไมขนอยกบปจจยบ าบดทใชในการทดสอบครงน วธการด าเนนการวจย ตวอยางพช ตวอยางพชทใชในการทดลองครงนคอ ใบพล ใบชะพล และใบดปล ซงไดมาจากพชทปลกในโรงเรอนเพาะเลยง ของคณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยนเรศวร จงหวดพษณโลก โดยไดท าการเกบตวอยางใบพชในชวงเดอนพฤษภาคม 2556 ท าความสะอาดดวยน าประปา ซบใหแหง ชงตวอยาง 0.1 กรม หอดวยกระดาษอลมเนยม แลวน าไปแชในไนโตรเจนเหลวกอนทจะน ามาสกดอารเอนเอ การสกดอารเอนเอ

วธ RNeasy Plant Mini kit สกดอารเอนเอตามคมอการสกดจากบรษท โดยมขนตอนดงน 1. บดใบพชแชแขงในไนโตรเจนเหลว 0.1 กรม ดวย

โกรง จนไดเปนผงละเอยดสเขยวถายผงใสหลอด 1.5 มล.

2. เตมบฟเฟอร RLT 450 l ลงในหลอด ผสมอยางแรงใหเขากนทนท

3. ดดสารผสมทไดใสลงในคอลมม QIA shredder spin

4. ปนดวยความเรว 8000xg ทอณหภมหอง เปนเวลา 2 นาท ดดของเหลวทผานคอลมมออกมาใสหลอดใหม

5. เตม 96% เอธานอลปรมาตรครงเทา ผสมใหเขากน แลวดดสารผสมทใสในคอลมม RNeasy Mini spin

6. ปนดวยความเรว 8000xg ทอณหภมหองเปนเวลา 15 วนาท เกบคอลมมไปท าตอ

7. เตมบฟเฟอร RW1 700 l ลงในคอลมม ปนดวยความเรว 8000xg ทอณหภมหอง 15 วนาท ทงของเหลว เกบคอลมมไปท าตอ

8. เตมบฟเฟอร RPE 500 l ลงในคอลมม ปนดวยความเรว 8000x g ทอณหภมหอง 15 วนาท ทงของเหลว เกบคอลมมไปท าตอ

9. เตมน าปราศจาก RNase ปรมาตร 50 l ลงในคอลมม น าไปปนดวยความเรว 8000x g ทอณหภมหอง เปนเวลา 15 วนาท เกบสารละลายอารเอนเอ

วธ TRIzol Reagent สกดอาร เอนเอท าตามคมอการสกดจาก

บรษท โดยมขนตอนดงน 1. บดใบพชแชแขงในไนโตรเจนเหลว 0.1 กรม ดวย

โกรง จนไดเปนผงละเอยดสเขยว ถายผงใสหลอด 1.5 มล.

2. เตมบฟเฟอร Trizol 1 มล. ลงในหลอด ผสมอยางแรงใหเขากนทนท

3. น าไปปนท 12,000xg ทอณหภม +4 °C เปนเวลา 10 นาท เกบของเหลวใสสวนบนถายใสหลอดใหม

4. เตมคลอโรฟอรม 0.2 มล. เขยาอยางแรง แลววางไวทอณหภมหอง ประมาณ 3 นาท

5. น าไปปนท 12,000xg ทอณหภม +4 °C เปนเวลา 15 นาท

6. ดดของเหลวสวนบนใสหลอดใหม 7. เตม isopropanol 0.5 มล. ผสมใหเขากน แลวตง

ทงไวทอณหภมหอง 10 นาท 8. น าไปปนท 12,000xg ทอณหภม +4 °C เปนเวลา

10 นาท เกบตะกอนอารเอนเอ และลางตะกอนดวย 70% เอธานอล ปรมาตร 0.5 มล.

KKU Science Journal Volume 41 Number 41034 Research1034 KKU Science Journal Volume 41 Number 4 Research 9. น าไปปนท 7500xg ทอณหภม +4 °C เปนเวลา 5

นาท เทของเหลวทง ระเหยของเหลวออก 10. ละลายตะกอนอารเอนเอในน าปราศจาก RNase

ปรมาตร 20 l วธ easy-REDTM Total RNA Extraction สกดอาร เอนเอท าตามคมอการสกดจาก

บรษท โดยมขนตอนดงน 1. บดใบพชแชแขงในไนโตรเจนเหลว 0.1 กรม ดวย

โกรง จนไดเปนผงละเอยดสเขยว ถายผงใสหลอด 1.5 มล.

2. เตมบฟเฟอร easy-REDTM solution 750 l ลงในหลอด ผสมอยางแรงใหเขากนทนท

3. วางหลอดไวทอณหภมหอง เปนเวลา 5 นาท 4. น าไปปนท 12,000xg ทอณหภม +4 °C เปนเวลา

10 นาท เกบของเหลวใสสวนบนปรมาตร 400 l ใสหลอดใหม

5. เตม 0.8M Sodium citrate/1.2M NaCl 250 l และ isopropanol 250 l ลงในหลอดผสมใหเขากน วางไวทอณหภมหอง เปนเวลา 10 นาท

6. น าไปปนท 12,000xg ทอณหภม +4 °C เปนเวลา 10 นาท เกบตะกอนอารเอนเอและลางตะกอนดวย 70% เอธานอลปรมาตร 0.5 มล.

7. น าไปปนท 7500xg ทอณหภม +4 °C เปนเวลา 5 นาท เทของเหลวทง ระเหยของเหลว

8. ละลายตะกอนอารเอนเอในน าปราศจาก RNaseปรมาตร 20 l

การบ าบดอารเอนเอหลงสกด และการตรวจวเคราะหอารเอนเอทสกดได 1. หลงจากไดสารละลาย RNA แลว น าอารเอนเอทได

ไปบ าบดดวย DNase (Sigma, USA) และหยดปฏกรยาดวย stop solution ของชด DNase

2. วเคราะหหาปรมาณและคณภาพของอารเอนเอทสกดไดดวยเครอง Nanodrop spectrophotometer และ1% agarose gel electrophoresis

3. เกบสารละลายอารเอนเอท –80 °C พรอมส าหรบน าไปสงเคราะห cDNA

การสงเคราะห complementary DNA (cDNA) การสราง cDNA สายแรกจากอารเอนเอโดย

การท าปฏกรยาในหลอดทมอารเอนเอ 500 นาโนกรม ไพรเมอร Oligo dT12-18 (Invitrogen, USA) RiboLock RNase Inhibitor (Thermo Scientific, USA) และRevertAid Reverse Transcriptase (Thermo Scientific, USA) หลงจากบมท 42 °C เปนเวลา 90 นาท จะได cDNA ทพรอมส าหรบท า RT-qPCR การศกษาการแสดงออกของยนดวยเทคนค Real-Time quantitative PCR (RT-qPCR)

โดยใช cDNA เปนตนแบบ ท าปฏกรยาดวยชด iTaqTM Universal SYBR® Green Supermix (BIO-RAD, USA) และไพรเมอรทจ าเพาะ โดย 1 ตวอยาง ท าการเพมปรมาณ 2 ยน คอ ยน Actin ใชเป น ย นค วบค ม และย น STS ส าห ร บ เ อน ไ ซม sesquiterpene synthase ซงเปนยนทตองการศกษาการแสดงออก โดยในหลอดทเพมปรมาณยนควบคมจะใชไพรเมอร Actin-F 5’-CATGAGACTACATACAACTCCATC-3’ และ Actin-R 5’-TCGTACTCAGCCTTGGCAATCCAC-3’ ส าหรบหลอดทวดการแสดงออกของยน STS จะใช ไพรเมอร STS-F 5’-CGATATAGAAGGCATGTTGAGC-3’ และ STS-R 5’-CATGAGATTGACCTCCTTGC-3’ หลงจากผสมปฏกรยาเสรจจะน าไปท าปฏกรยาในเครอง C1000 Touch Thermal cycler รน CFX96 Real-Time system (BIO-RAD, USA) โดยสภาวะทใชในการท าปฏกรยาคอ ทอณหภม 96 °C เวลา 3 นาท แลวตอดวย 30 รอบของ 96 °C 10 วนาท 55 °C 10 วนาท

วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 4 1035งานวจยงานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 4 1035 หลงจากนนเปนการวดจดหลอมเหลวของผลตภณฑโดยตงสภาวะท 95 °C เปนเวลา 10 วนาท แลวเพมอณหภมจาก 65 °C ถง 95 °C โดยเพมทละ 0.5 °C เปนเวลา 5 วนาท หลงจากนนวเคราะหผลทไดดวยโปรแกรม CFX managerTM version 3 การแสดงออกของยน STS รายงานเปนจ านวนเทาของความสมพนธ (relative normalized expression; ∆∆cq) ระหวางยน STS และยนควบคม Actin

ผลการวจย พชวงศพรกไทยทใชในการศกษา คอ พล ชะพล และดปล (รปท 1) ใบของพชในวงศนมสารประกอบฟโนลคสง และมคลอโรฟลลสง ท าใหเปนอปสรรคตอการสกดอารเอนเอใหมคณภาพดเพยงพอทจะน าไปใชในการศกษาระดบโมเลกลตอได การวจยนไดท าการสกดอารเอนเอ โดยเปรยบเทยบวธการสกด 3 วธคอ วธ RNeasy Plant Mini kit วธTRIzol Reagent และวธ easy-REDTM total RNA extraction พชแตละชนดจะท าการศกษา 2 ซ า โดยเกบใบพชจากพชตนเดยวกน ทชวงเวลาเดยวกน และ

ใบพชมอาย ขนาด ความสมบรณของใบเทากน (รปท 1)

เมอไดอารเอนเอแลว น าอารเอนเอทไดไปวดปรมาณ และคณภาพโดยการวดคาการดดกลนคลนแสงทความยาวคลน 230 260 และ 280 นาโนเมตร ดวยเครอง Nanodrop Spectrophotometer (ตารางท 1) ผลทได แสดงใหเหนวาวธ RNeasy Plant Mini kitเปนวธการทสกดอารเอนเอไดดจากพชทง 3 ชนด อารเอนเอทไดมปรมาณเพยงพอทจะน าไปท า RT-q PCR ได มความสม าเสมอ ปรมาณใกลเคยงกนในการสกดแตละครง มความบรสทธจากการปนเปอนของโปรตนสง ดไดจากคา OD260/280 ทมคามากกวา 1.8 จากคา OD260/230 ทมคามากกวา 1.0 แสดงวายงมการปนเปอนสารประกอบฟโนลคอยบางแตไมสงนก ส าหรบวธการใช TRIzol Reagent และeasy-RED นนพบวาใหผลในการสกดทไมสม าเสมอ อารเอนเอทไดจากใบพลและใบชะพลมทงทดและไมด มเพยงบางตวอยางเทานนทสามารถน าไปท า RT-qPCR ตอได ในขณะทสกดอารเอนเอจากใบดปลไดในปรมาณทต ามากจนถงไมไดเลยไมเพยงพอทจะน าไปท า RT-qPCRตอได

รปท 1 พชทใชในการศกษา (ก) พล (ข) ชะพล และ (ค) ดปล

ก ข ค

KKU Science Journal Volume 41 Number 41036 Research1036 KKU Science Journal Volume 41 Number 4 Research ตารางท 1 ผลการสกดอารเอนเอจากใบพล ใบชะพล และใบดปล ดวยวธ RNeasy Plant, TRIzol Reagent และ

easy-RED TM แตละตวอยางท า 2 ซ าจากตวอยางทเกบจากธรรมชาตพรอมกน

เนอเยอ RNA extraction method ปรมาณ คณภาพ

[RNA] ng/l OD260/280 OD260/230

ใบพล

RNeasy Plant mini kit 108.88 2.25 0.83 RNeasy Plant mini kit 118.47 2.24 1.04

TRIzol Reagent 146.46 1.88 1.23 TRIzol Reagent 81.08 2.17 0.27

easy-RED RNA extraction kit 18.08 2.12 0.91 easy-RED RNA extraction kit 16.85 2.12 0.51

ใบชะพล



easy-RED RNA extraction kit 58.01 2.12 1.09 easy-RED RNA extraction kit 39.7 2.12 0.65

ใบดปล



easy-RED RNA extraction kit 80.85 2.14 1.23 easy-RED RNA extraction kit 0 0 0

รปท 2 ผลการวเคราะหอารเอนเอทสกดไดจากใบ (ก) พล (ข) ชะพล (ค) ดปลโดยใชวธการ RNeasy Plant

Mini Kit, TRIzol Reagent และ easy-RED Reagent ใน 1% agarose gel electrophoresis แตละตวอยางจะท า 2 ซ า

) RNA

RNeasy Trizol Easy Red

) RNA


) RNA


วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 4 1037งานวจยงานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 4 1037

นอกจากนนยงท าการวเคราะหอารเอนเอโดยการท าอเลคโทรโฟรซสใน 1% agarose gel (รปท 2) ผลจากเจลสอดคลองกบผลการวดอารเอนเอ ดวยเครอง Nanodrop ผลทไดเหนชดเจนวาวธ RNeasy นนสามารถสกดอารเอนเอทดไดจากพชทง 3 ชนด อารเอนเอทสกดไดมคณภาพด ปรมาณเพยงพอ ขณะทวธ TRIzol และวธ easy-RED นนใหผลอารเอนเอทไมสม าเสมอ บางครงไดผลด บางครงไดอารเอนเอทมการแตกหก บางครงไดอารเอนเอปรมาณนอยจนถงนอยมากไมเพยงพอทจะน าไปศกษาตอ เมอน าอารเอนเอทไดจากวธการสกด RNeasy Plant ไปวเคราะหตอดวยการสราง cDNA แลวน า cDNA ไปหาประสทธภาพของการท า real time โดยการเจอจาง cDNA ทใชเปนตนแบบของปฏกรยาเปนล าดบจาก 1:5 1:10 1:100 และ1:1000 จากผล RT-qPCR ดวยไพรเมอรส าหรบ

ยน Actin ในรปท 3ก และ ข แสดงใหเหนวาอารเอนเอทเจอจาง 1:5 และ 1:10 นนใหผลใกลเคยงกน คอ สามารถใชทงสองความเขมขนท า PCR ได ในขณะทความเขมขนทต าลงมาใหผลตภณฑ PCR ทนอยไมเหมาะสมทจะใชในการวเคราะหในขณะทผล RT-qPCR ดวยไพรเมอรส าหรบยน STS ในรปท 3ค และ 3ง ความเขมขนของอารเอนเอทเหมาะสมทจะใชวเคราะหการแสดงออกของยน STS นน ควรจะเปน 1:5 เนองจากความเขมขนทต ากวานจะใหผลตภณฑทต าลงมามาก และจากการวเคราะหจดหลอมเหลวของผลตภณฑพบวา ผลตภณฑทไดจากไพรเมอร Actin และ STS มจดหลอมเหลวท 81 °C และ 79 °C ตามล า ดบ ซ งสอดคลองกบจดหลอมเหลวของผลตภณฑ Actin และ STS ทควรจะเปน

รปท 3 ผลการหาประสทธภาพของ RT-qPCR โดยใช cDNA ทไดจากอารเอนเอทสกดจากใบพล โดยวธ RNeasy

Plant Mini kit แลวน ามาเจอจางทความเขมขนตาง ๆ ไดแก ไมเจอจาง (Un) เจอจางทความเขมขน 1:5 1:10 1:100 และ 1:1000 กอนทจะท า RT-qPCR ดวยไพรเมอรส าหรบยน Actin (ก และ ข) และ STS (ค และ ง)

KKU Science Journal Volume 41 Number 41038 Research1038 KKU Science Journal Volume 41 Number 4 Research

เมอไดสภาวะท เหมาะสมส าหรบการท า qPCR แลว จงไดทดสอบกบตวอยางทตองการทดสอบจรง โดยน าใบพล ใบชะพล และใบดปล ทเกบจากธรรมชาตในชวงเวลาตาง ๆ ของวน มาสกดอารเอนเอดวยวธ RNeasy Plant แลวน าอารเอนเอมาท า RT-

qPCR พบวาอารเอนเอทสกดได และสภาวะททดสอบนนสามารถใชในการวดปรมาณการแสดงออกของยน STS ได โดยวดเปนจ านวนเทาความสมพนธระหวางยน STS กบยน Actin (รปท 4)

Actin STS ของพล STS ของชะพล STS ของดปล

รปท 4 ผลการท า RT-qPCR โดยใช cDNA ทไดจากอารเอนเอทสกดจากใบพล ใบชะพล และใบดปลทเกบจากธรรมชาตในชวงเวลาตาง ๆ ของวน (ก และ ข) จากใบพล (ค และ ง) จากใบชะพล (จ และ ฉ) จากใบดปล

วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 4 1039งานวจยงานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 4 1039 สรปและวจารณผลการวจย พชวงศพรกไทยนน แมวาจะมคณคา และมประโยชนมากมาย แตยงไมคอยมการศกษาในเชงลกในระดบโมเลกลมากนก เทาทพบรายงานการวจยจะเปนการศกษาเกยวกบการสกดดเอนเอของพชในวงศพรกไทยหลายชนด ไดแก พรกไทย (P. nigrum) พล (P. betle) ชะพล (P. sarmentosum) ดปล (P. retrofractum) P. colubrinum, P. pendulispicum, P. ribesioides (Azevedo et al., 2003; Parker et al., 2007) แตยงไมมรายงานการศกษาในระดบอารเอนเอ หรอการศกษาการแสดงออกของยนเลย อปสรรคใหญทท าใหยงไมมการศกษาอารเอนเอนน นาจะเปนเพราะความยากในการทจะสกดอารเอนเอทมคณภาพด ออกมาจากพชวงศนได เนองจากในใบของพช มสารท ต ย ภ ม เ ป น อ ง ค ป ร ะ ก อบ ม า ก ไ ม ว า จ ะ เ ป นสารประกอบฟโนลค สารอนทรยระเหยงายหรอสาร อลคาลอยด เปนตน จากผลการตรวจวดชนดของสารอนทรยระเหยงายในน ามนหอมระเหยจากใบของพล ชะพล และดปล จากจงหวดพษณโลก โดยใชตวอยางเดยวกบทน ามาสกดอารเอนเอในการศกษาครงน ดวยวธ GC-MS พบวาสารประกอบหลกในน ามนจากใบพชทงสามชนดเปนสารประกอบฟโนลคน ามนพลพบ isoeugenol 34.75% น ามนจากใบชะพลพบ croweasin 22.62% และ isoeugenol 16.7% น ามนจากใบดปลพบ crowesin 22.6% (ขอมลยงไมไดเผยแพร) พบวาสารเหลานเมอถกออกซไดซจะเขาจบกบอารเอนเออยางถาวร โดยเฉพาะในขนตอนการสกดทไมมประสทธภาพ สารออกซไดซเหลานจะเขาจบกบอารเอนเอ และไมสามารถก าจดแยกสารปนเปอนออกไปได ท าใหอารเอนเอไมบรสทธไมสามารถน า อารเอนเอนนไปใชตอได ดงนนเพอทจะใหไดอารเอนเอทมคณภาพด มความบรสทธสง และมความสมบรณไม

มการแตกหกจากพชวงศพรกไทยนน จ าเปนทจะตองหาวธการทมประสทธภาพเหมาะสมส าหรบการสกดอารเอนเอจากผลการสกดอารเอนเอจากพชในวงศอนทมปญหาคลายกนคอมสารทตยภมสง ไดแก องน (Vitis rotundifolia Michx) (Louime et al., 2008; Reid et al., 2006) เมลดกาแฟ (Coffee Arabica) (Cordeiro et al., 2008) ผลลกพช (Prunus persica) (Meisel et al., 2005) สาหราย (Laminaria japonica) (Yoa et al., 2009) ใบพชพนเมองบราซล (Cordeiro et al., 2008) และหนามของตนไพน (Pinus pinaster Ait.) (Azevedo et al., 2003) พบวาวธการในการสกดทเหมาะสมส าหรบพชแตละชนดมความแตกตางกนโดยสวนใหญแลวจะใชวธการทตองเตรยมน ายาสกดเอง ซงมสวนผสมของเกลอความเขมขนสง CTAB และ PVP บางกรณมการใช LiCl ในกา รตกตะกอนอา ร เ อ น เ อ ส วน ใหญ พบว า ว ธ guanidium thiocyanate การใช phenol chloroform การใชชดน ายาส าเรจรป หรอชดสกดส าเรจรปมกไมประสบความส าเรจ จากความหลากหลายของวธการสกด อารเอนเอ จากพชทมสารทตยภมสงชนดตาง ๆ นน บงบอกวาวธการสกดอารเอนเอมาตรฐานทใชออยโ ด ย ท ว ไ ป ท ส ก ด บ น พ น ฐ า น ข อ ง guanidine thiocyanate-phenol choloroform นน ไมนาจะเปนวธการทเหมาะสมในการสกดอารเอนเอจากพชวงศพรกไทยได

ทางกลมผวจยจงไดท าการทดสอบหาวธการทมประสทธภาพในการทจะสกดอารเอนเอจากพชวงศน ทมคณภาพดเพยงพอทจะน าไปใชท า RT-quantitative PCR ได เทคนคนมความไวและมความจ าเพาะสงในการวดปรมาณการแสดงออกของยน แตขอเสยคอมความไวตอสารปนเปอนทตดมากบ อารเอนเอ ปฏกรยาจะถกยบยงในสภาวะทมสาร

KKU Science Journal Volume 41 Number 41040 Research1040 KKU Science Journal Volume 41 Number 4 Research ปนเปอนในอารเอนเอ ท าใหเปนอปสรรคในการศกษาวเคราะหเปรยบเทยบปรมาณระหวางตวอยาง ปรมาณอารเอนเอเรมตน และสารปนเปอนในอารเอนเอนนจะมผลตอการเพมปรมาณผลตภณฑจากปฏกรยาเปนอยางมาก ในการศกษาครงนไดเปรยบเทยบวธการสกดจากชดทางการคา 3 ชดคอ ชด RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany) ซงสกดอารเอนเอบนพนฐานของเยอ silica microspin technology และบฟเฟอรทมสวนผสมของ guanidine-thiocyanate วธท 2 คอ น ายาสกด TRIzol Reagent (Life technologies, USA) ซงสกดอารเอนเอ บนพนฐานของ guanidine thiocyanate-phenol-chloroform วธท 3 คอ น ายาสกด easy RED Total RNA extraction (iNtRON Biotechnology, Korea) ซงสกดอารเอนเอบนพนฐานเดยวกบ TRIzol จากผ ลกา ร ว เ ค ร า ะห อ า ร เ อ น เ อด ว ย nanodrop และ electrophoresis พบวาวธการใช RNeasy Plant นนสกดอารเอนเอไดจากทกตวอยาง ในปรมาณเพยงพอและสม าเสมอส าหรบการน าไปท า cDNA และ qPCR ปรมาณอารเอนเอทใกลเคยงกนนนเปนปจจยทส าคญตอการวเคราะหดวย qPCR เพราะถาอารเอนเอทสกดไดไมเทากนจะมผลตอการวเคราะหเปรยบเทยบการแสดงออกของยนเปนอยางมาก นอกจากนนการสกดอารเอนเอดวยชด RNeasy นนไมจ าเปนตองใชเครองปนทควบคมอณหภม ขนตอนในการท ากไมซบซอน ใชเวลาท าเพยงแค 1 ชวโมง กสามารถสกดเอนเอทมคณภาพสงได เหมาะทจะใชสกดอารเอนเอจากพชในวงศพรกไทยซงมสารทตยภมอยในปรมาณสง ส าหรบวธการสกดอารเอนเอโดยใชแตน ายา guanidine thiocyanate-phenol-chloroform ดงในวธการท 2 และ 3 นน พบวามปญหาตอคณภาพของอารเอนเอทสกดได ขนตอนทใชซบซอน ใชเวลาในการ

สกดนานกวา ตองใชเครองปนตกตะกอนควบคมอณหภม และสารเคมทเปนอนตราย เปนผลใหยากตอการทจะสกดอารเอนเอทมคณภาพสง และปรมาณใกลเคยงกนได ท าใหวธการสกดโดยใช TRIzol และ easy RED นนไมเหมาะตอการน ามาใชกบพชวงศพรกไทย

จากผลการทดลองแสดงใหเหนวาการใชชดสกด RNeasy Plant Mini Kit นนมประสทธภาพ สามารถน ามาใชกบพชในวงศพรกไทยทน ามาทดสอบทงสามชนดอารเอนเอทสกดไดนนสามารถน ามาใชในการศกษาระดบโมเลกล โดยเฉพาะเทคนคทมความไวสงอยาง Real time PCR ได จงนาจะน าไปใชในการศกษาระดบโมเลกลโดยเทคนคอน ๆ ไดอก วธการนนาจะเปนทางเลอกส าหรบนกวจยทตองการศกษาพชวงศพรกไทยในระดบโมเลกล โดยเฉพาะการศกษาการแสดงออกของยนไดเปนอยางด

กตตกรรมประกาศ ขอบพระคณมหาวทยาลยนเรศวร ส าหรบ

ทนอดหนนการท าวจย งบประมาณแผนดน ประจ าป พ.ศ. 2556 สถานบรการวชาการดานวทยาศาสตรการแพทย คณะวทยาศาสตรการแพทย มหาวทยาลยนเรศวร ส าหรบการอ านวยความสะดวกในการใชเครอง Real-Time PCR เครองปนเหวยงควบคมอณหภม และเครองมอทางวทยาศาสตรอกหลายชนด ขอบพระคณ ดร.สพชร เนตรพนธ ทเออเฟอไพรเมอรส าหรบยน Actin รศ.ดร.จไรทพย หวงสนทวกล ส าหรบตวอยางชดสกด RNeasy Plant Mini kit ทน ามาทดสอบใชสกดอารเอนเอ แนวคดวจย ค าแนะน า และ ดร.สทธ-รกษ รอยตระกล ส าหรบค าแนะน าและการวจารณผลการทดลอง

วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 4 1041งานวจยงานวจย วารสารวทยาศาสตร มข. ปท 41 ฉบบท 4 1041 เอกสารอางอง Azevedo, H., Lino-neto, T. and Tavares, R.M. (2003). An

improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees. Plant Molecular Biology Reporter 21: 333-338.

Choopayak, C, Laksuk, H, and K., A. (2010). Volatile compounds from Piper betle Linn. sample collected from Phitsanulok Thailand by SPME method. 6thNaresuan Research.

Cordeiro, M., Silva, M., Santos, E. Oliveira-Filho, Miranda, Z., Aquino, F. and Rocha, R. (2008). Optimization of a method of total RNA extraction from Brazilian native plants rich in polyphenols ad polysaccharides. Symposium international Savanas Tropicais: 12-17.

Gertsch, J., Leonti, M., Raduner, S., Racz, I., Chen, J.-Z., Xie, X.-Q., Altmann, K.-H., Karsak, M. and Zimmer, A. (2008). Beta-caryophyllene is a dietary cannabinoid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105: 9099-9104.

Ghelardini, C., Galeotti, N., Di Cesare Mannelli, L., Mazzanti, G. and Bartolini, A. (2001). Local anaesthetic activity of [beta]-caryophyllene. Il Farmaco 56: 387-389.

Louime, C., Vasanthaiah, H., Jittayasothorn, Y., Lu, J., Basha, S., Thipyapong, M.P. and Boonkerd, N. (2008). A simple and Efficient Protocol for High Quality RNA Extraction and Cloning of Chalcone Synthase Partial cds from Muscadine Grape Cultivars (Vitis Rotundifolia Michx.). European Journal of Scientific Research 22: 232-240.

Meisel, L., Fonseca, B., Gonzalez, S., Baezayates, R., Cambiazo, V. and Campos, R. (2005). A rapid and efficient method for purifying high

quality total RNA from Peaches (Prunus persica) for functional genomics analyses. Biol Res. 38: 83-88.

Nalina, T., and Rahim, Z.H.A. (2007). The crude aqueous extract of Piper betle L. and its antibacterial effect towards Streptococcus mutans. American Journal of Biotechnology and Biochemistry 3: 10-15.

Parker, M., Pollnitz, A., Cozzolino, D., Francis, I. and Herderich, M. (2007). Identification and quantification of a marker compound for 'pepper' aroma and flavor in shiraz grape berries by combination of chemometrics and gas chromatography-mass spectrometry. J Agric Food Chem. 55: 5948-5955.

Pukclai, P., and Kato-Noguchi, H. (2011). Allelopathic activity of Piper sarmentosum Roxb. Asian Journal of Plant Sciences 10: 147-152.

Qin, W., Huang, S., Li, C., Chen, S. and Peng, Z. (2010). Biological activity of the essential oil from the leaves of Piper sarmentosum Roxb. (Piperaceae) and its chemical constituents on Brontispa longissima (Gestro) (Coleoptera: Hispidae). Pesticide Biochemistry and Physiology 96: 132-139.

Ramji, N., Ramji, N., Iyer, R. and Chandrasekaran, S. (2002). Phenolic antibacterials from Piper betle in the prevention of halitosis. Journal of Ethnopharmacology 83: 149-152.

Reid, K., Olsson, N., Schlosser, J., Peng, F. and Lund, S. (2006). An optimized grapevine RNA isolation procedure and statistical determination of reference genes for real-time RT-PCR during berry development. BMC Plant Biol. 6: 27.

Ugusman, A., Zakaria, Z., Hui, C.K. and Nordin, N.A.M.M. (2011). Piper sarmentosum inhibits ICAM-1 and Nox4 gene expression in oxidative stress-induced human umbilical

KKU Science Journal Volume 41 Number 41042 Research1042 KKU Science Journal Volume 41 Number 4 Research

vien endothelial cells. BMC Complementary and Alternative Medicine 11.

Yoa, J., Fu, W. and Wang, X. (2009). Improved RNA isolation from Laminaria japonica Aresch (Laminariaceae, Phaeophyta). J Appl Phycol. 21: 233-238.

Zheng, G.-Q., Kenney, P.M. and Lam, L.K.T. (1992). Sesquiterpenes from Clove (Eugenia caryophyllata) as Potential Anticarcinogenic Agents. Journal of Natural Products 55: 999-1003.

comparison of three rna extraction methods for gene...

Documents