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Certificado conforme

Tiblisi, 25 de junio de 2010

El Director General de la OIV

Secretario de la Asamblea general

Federico CASTELLUCCI

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RESOLUCIÓN OIV/OENO 343/2010

MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN DE ISÓTOPOS 13C/12C DEL GLICEROL

EN LOS VINOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN FASE GASEOSA O CROMATOGRAFÍA DE

ALTA RESOLUCIÓN EN FASE LÍQUIDA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS DE

RELACIÓN ISOTÓPICA (GC-C-IRMS O HPLC-IRMS)

LA ASAMBLEA GENERAL,

Visto el artículo 2 apartado 2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el cual se creó la

Organización Internacional de la Viña y el Vino,

Según propuesta de la Subcomisión « Métodos de análisis »,

DECIDE completar el anexo A del Compendio Internacional de los métodos de análisis con

el método de tipo IV siguiente:

Título Tipo de

método

Método para la determinación de la relación de isótopos 13C/12C

del glicerol en los vinos mediante cromatografía en fase gaseosa

o cromatografía de alta resolución en fase líquida acoplada a

espectrometría de masas de relación isotópica (GC-C-IRMS o

HPLC-IRMS)

IV

1. ÁMBITO DE APLICACIÓN

Los presentes métodos utilizan la cromatografía en fase gaseosa [1] o la cromatografía en

fase líquida [2] acopladas a un espectrómetro de masas de relaciones isotópicas (GC-C-

IRMS o HPLC-IRMS) para medir la relación de 13C/12C del glicerol. Cuando también sea

necesario cuantificar simultáneamente el glicerol, se debe utilizar la GC-IRMS.

El uso de 1,5-pentanodiol como patrón interno, permite determinar la concentración de

glicerol al mismo tiempo que la relación de 13C/12C.

2. DEFINICIONES

13C/12C: relación isotópica de carbono-13 (13C) con carbono-12 (12C) para una

muestra determinada.






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δ13C: contenido de carbono 13 (13C) expresado en partes por 1000 (‰, por mil).

GC-C-IRMS: técnica de cromatografía gaseosa acoplada mediante una interfase de

combustión a espectrometría de masas de relación isotópica.

HPLC-IRMS: técnica de cromatografía de alta resolución en fase líquida acoplada a

espectrometría de masas de relación isotópica.

V-PDB: Vienna-Pee-Dee-Belemnite. PDB es el material de referencia primario para

medir las variaciones naturales del contenido isotópico de carbono-13, consistente

en carbonato de calcio del fósil belemnite rostrum procedente de la formación

cretácea Pee Dee en Carolina del Sur (USA). Su relación isotópica 13C/12C o RPDB es

0.0112372. Las reservas de PDB se han agotado desde hace mucho tiempo, pero

sigue siendo la referencia primaria para expresar las variaciones naturales del

contenido isotópico de carbono 13 y con la que se calibra el material de referencia

disponible en la IAEA (Agencia Internacional de Energía Atómica) en Viena (Austria).

Las indicaciones isotópicas de carbono 13 natural usualmente se expresan en

relación con V-PDB.

3. FUNDAMENTO

Existe una diferencia significativa entre la cantidad de carbono-13 presente en los hidratos

de carbono de plantas C3 y C4, cuyas rutas fotosintéticas son distintas. La mayoría de las

plantas, como la vid y la remolacha, son de tipo C3, mientras que el maíz y la caña de

azúcar son de tipo C4. Existe una correlación entre la cantidad de carbono 13 presente en

los hidratos de carbono y la que aparece en los metabolitos correspondientes (etanol y

glicerol), que resultan de la fermentación.

Midiendo la concentración de carbono 13 del glicerol, se podría detectar la adición de

glicerol procedente de maíz (C4) o de origen sintético (fuentes fósiles) en vinos y bebidas

espirituosas.

Para separar el glicerol del vino se utiliza un cromatógrafo de gases o de líquidos.

En el caso de la GC-C-IRMS, tras pasar por la columna de cromatografía, la muestra se

somete a una etapa de combustión y reducción pasando por los hornos de oxidación y de

reducción de la interfase de combustión. Para evitar daños en los hornos e interferencias en

los cromatogramas, una válvula expulsa todos los componentes, excepto el glicerol,

durante el proceso. El contenido de carbono-13 se determina en el gas de dióxido de

carbono que resulta de la oxidación del glicerol contenido en la muestra. Una vez que se

oxida el glicerol, se producen CO2 y H2O. El agua producida durante la combustión es

eliminada a través de una trampa de agua, que consiste en una membrana Nafion®. El

dióxido de carbono es transportado mediante un flujo de helio a la fuente IRMS para el

análisis 13C/12C.

En el caso de la HPLC-IRMS, tras la separación cromatográfica, la muestra se oxida en la

interfase antes de separarla de la fase móvil. El CO2 que se forma se separa de la fase

móvil mediante una membrana de intercambio gaseoso y es arrastrado por un flujo de

helio. El flujo de helio y CO2 atraviesa una membrana de Nafion® que retiene el agua y

llega a la fuente de ionización del espectrómetro de masas de relaciones isotópicas a través

de un dispositivo de división del flujo (open split).






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La combinaciones posibles de los isótopos 18O, 17O, 16O y 13C, 12C se reflejan en la masa 44

correspondientes al isotopómero 12C16O2, la masa 45 que corresponde a las especies 13C16O2 y 12C17O16O y la masa 46 al isotopómero 12C16O18O. Las combinaciones 13C17O16O y 12C17O2 no se tienen en cuenta, pues aparecen en muy baja abundancia. Las corrientes

iónicas correspondientes se miden en tres detectores distintos. La corriente iónica

correspondiente a m/z = 45 se corrige para tener en cuenta el aporte de 12C17O16O, que se

calcula en función de la intensidad de la corriente de m/z = 46, considerando las

concentraciones relativas de 18O y 17O (corrección de Craig). El uso de un patrón interno

cotejado con el patrón internacional V-PDB permite calcular la concentración de carbono 13 en la escala relativa δ13C ‰.

4. REACTIVOS

Se deben utilizar los siguientes reactivos y patrones:

4.1. Etanol (anhidro) (Núm. CAS 64-17-5).

4.2. Glicerol puro ≥ 99 % (Núm. CAS 56-81-5).

4.3. 1,5-pentanodiol (Núm. CAS 111-29-5).

4.4. Disolución de 1,5-pentanodiol (4.3) en etanol (4.1), a una concentración determinada

(entre 0,5 y 1,0 g l-1). Se utiliza para disolver las muestras de vino.

4.5. Ácido ortofosfórico

4.6. Peroxodisulfato de sodio, que se utiliza como oxidante.

4.7. Helio (Núm. CAS 07440-59-7), que se utiliza como gas portador.

4.8. Oxígeno (Núm. CAS 07782-44-7), como gas regenerante para el reactor de

combustión.

4.9. Bala de dióxido de carbono (CAS 00124-38-9), que se utiliza como patrón secundario

para la medida de carbono-13.

4.10. Patrones de glicerol de relación isotópica (13C/12C) conocida y cotejadas con patrones

internacionales de referencia.

4.11. Patrones de 1,5-pentanodiol de relación isotópica (13C/12C) conocida y cotejadas con

patrones internacionales de referencia.

5. INSTRUMENTAL

5.1. Espectrómetro de masas de relaciones isotópicas

Espectrómetro de masas de relaciones isotópicas (IRMS), capaz de analizar la relación de 13C en CO2 con una precisión interna de 0,05 ‰ como mínimo (véase el apartado número

8). Por precisión interna entendemos la diferencia entre dos medidas de una misma

muestra de CO2. El espectrómetro de masas que se utiliza para medir relaciones isotópicas

dispone de un detector triple, lo que permite medir simultáneamente las intensidades de

los tres valores de m/z (44, 45 y 46). El espectrómetro consta también de un programa

informático que controla el análisis, gestiona los datos y procesa los resultados para

calcular las relaciones isotópicas.






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5.2. Cromatógrafo de gases

Cromatógrafo de gases (GC) acoplado, mediante un sistema de combustión, a un

espectrómetro de masas de relaciones isotópicas (5.1).

El cromatógrafo de gases debe estar provisto de una columna capilar polar de

cromatografía de gases para separar el glicerol del resto de sustancias del vino (ej.

columna capilar de sílice fundida Chrompack WCOT con recubrimiento de polietilenglicol CP-

Wax-57 CB, 25 m, 0,25 mm di, 0,20 μm de espesor).

El sistema de combustión consta generalmente de un reactor de oxidación (tubo de

cerámica con hilos de níquel, platino y cobre) y un reactor de reducción (tubo de cerámica

con hilos de cobre).

5.3. Cromatógrafo de líquidos

Cromatógrafo de líquidos (LC) conectado a un espectrómetro de masas de relaciones

isotópicas (5.1) mediante una interfase LC Isolink.

El cromatógrafo de líquidos debe estar provisto de una columna para separar

cromatográficamente el glicerol del resto de sustancias del vino sin utilizar disolventes

orgánicos ni aditivos (ej. HyperREZ Carbohydrate H+, 30 cm, 8 mm).

La interfase Isolink consta de un reactor capilar en el que se produce la reacción de

oxidación y de un intercambiador formado por 3 membranas.

5.4. Material

Material común de laboratorio y en particular:

- Jeringuillas para inyectar las muestras o inyector automático.

- Matraces aforados, filtros de 0,2 µm, viales de cromatografía y una jeringuilla de 10 µl.

No obstante, se pueden utilizar otros instrumentos o materiales que tengan las mismas

prestaciones.

6. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

6.1. Determinación de la relación de 13C/12C del glicerol mediante GC-C-IRMS

Para filtrar las muestras de vino se utilizan filtros de 0,2 μm. Después, se toma una alícuota

y se diluye (1:4) con etanol. Se vierte cada muestra en un vial de cromatografía adecuado.

Se tapan bien los viales y se conservan en frío (T ≤ 4 °C) hasta que se vayan a analizar.






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6.2. Relación de 13C/12C del glicerol y cuantificación mediante GC-C-IRMS


y se diluye (1:4) con la solución de 1,5-pentanodiol (4.4). Se vierte cada muestra en un

vial de cromatografía adecuado. Se tapan bien los viales y se conservan en frío (T ≤ 4 °C)

hasta que se vayan a analizar.

6.3. Determinación de la relación de 13C/12C del glicerol mediante HPLC-IRMS


y se diluye con agua. Se vierte cada muestra en un vial de cromatografía adecuado. Se

tapan bien los viales y se conservan en frío (T ≤ 4 °C) hasta que se vayan a analizar.

7. PROCEDIMIENTO

7.1 GC-C-IRMS

La siguiente descripción se refiere a los métodos que se suelen utilizar para determinar la

relación isotópica 13C/12C del glicerol con los sistemas automatizados de GC-C-IRMS

disponibles en el mercado.

Los distintos procedimientos pueden adaptarse en función de los cambios que introduzcan

los fabricantes. Los volúmenes, la temperatura, los caudales y los tiempos indicados son

orientativos y se deben ajustar los valores según las recomendaciones del fabricante.

7.1.1. Condiciones de trabajo

Si se utilizan la columna y el sistema de combustión descritos en el ejemplo (5.2), se

pueden aplicar los parámetros siguientes:

A. La temperatura de inyección es de 270 °C.

B. El ciclo de temperatura comienza a 120 °C y se mantiene durante 2 minutos. Después

aumenta progresivamente, a razón de 10 °C por minuto, hasta los 220 °C. Esta

temperatura final se mantiene durante 2 minutos. Cada ciclo dura 14 minutos, si no se

tiene en cuenta el tiempo de enfriamiento.

C. Se utiliza helio como gas portador.

D. La temperatura de los reactores de combustión y de reducción del sistema de

combustión conectado al cromatógrafo de gases se ajusta a 960 °C y 640 °C

respectivamente.

E. En cada inyección se introducen 0,3 μL de solución de la muestra en la columna en modo

high-split (120 mL min-1).

Se debe someter el reactor de oxidación a un proceso de reoxidación con O2 con

regularidad (una vez a la semana, por ejemplo); la frecuencia dependerá de la cantidad de

sustancias que pasen por él.

7.1.2. Relación de 13C/12C del glicerol

Con cada análisis 13C/12C se introducen al menos dos pulsos de CO2 patrón (4.9) de la bala.

Existe una cadena ininterrumpida de calibraciones entre este patrón, los patrones V-PDB y






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los patrones internacionales del IAEA. El CO2 patrón puede también calibrarse frente a

patrones internos.

Se realizan tres inyecciones de cada muestra de vino (6.1). Se deben incluir muestras de

control adecuadas en cada serie.

Ejemplo de una serie típica:

• Muestra de control


• Muestra 1

• Muestra 1

• Muestra 1

• Muestra 2

Cada muestra se analiza 3 veces

• …

• Muestra 6

• Muestra 6

• Muestra 6



La muestra de control es una disolución de glicerol en etanol cuya concentración de carbono 13 (δ13C) se ha determinado con mucha precisión (por medio de un analizador

elemental- IRMS, por ejemplo) y permite comprobar posibles desviaciones durante la serie

de medidas por revisar y la corrección de los resultados.

7.1.3. Relación de 13C/12C del glicerol y cuantificación

Cuando además de medir la relación isotópica también sea necesario cuantificar el glicerol,

se aplicará a las muestras, preparadas según se indica en el apartado 6.2, el procedimiento

descrito en el apartado anterior (7.1.2).

El 1,5-pentanodiol (4.3) permite determinar la concentración de glicerol. Además, pueden utilizarse los valores de δ13C del patrón interno para corregir las inyecciones y controlar de

calidad del análisis isotópico y de la etapa de combustión.

Para obtener la concentración de glicerol de las muestras de vino se utiliza el método del

patrón interno. Se prepara una curva de calibrado usando una concentración constante y

conocida de patrón interno (1,5-pentanodiol) y serie de 5 disoluciones de glicerol de

concentraciones distintas conocidas, de 0,50 a 10 g l-1. Estas disoluciones se preparan en

matraces aforados: se pesan el glicerol (4.2) y el 1,5-pentanodiol en una balanza y se

disuelven en etanol (4.1). Se analizan sucesivamente y por triplicado cada una de las

disoluciones de la serie, para asegurarse de que la respuesta es lineal.

7.2. HPLC-IRMS

La siguiente descripción se refiere a los métodos que se suelen utilizar para determinar la

relación isotópica 13C/12C del glicerol con los sistemas automatizados de HPLC-IRMS

disponibles en el mercado.






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Los distintos procedimientos pueden adaptarse en función de los cambios que introduzcan

los fabricantes. Los volúmenes, la temperatura, los caudales y los tiempos indicados son

orientativos y se deben ajustar los valores según las recomendaciones del fabricante.

7.2.1. Condiciones analíticas

Si se utilizan la columna y el sistema descritos en el ejemplo (5.3), se pueden aplicar los

parámetros siguientes:

A. Ajustar el caudal del eluyente a 400 μl min-1.

B. Ajustar el caudal del ácido y del oxidante en la interfase LC a 40 μl min-1 y 30 μl min-1,

respectivamente.

C. Ajustar la temperatura del reactor de la interfase a 99,9 °C y la de la columna a 65 °C.

D. Ajustar el caudal de helio de la unidad de separación a 1 μl min-1.

Hay que desgasificar las botellas de reactivos con helio a lo largo de todo el proceso de

separación cromatográfica.

7.2.2. Relación de 13C/12C del glicerol

Con cada análisis 13C/12C se introducen al menos dos pulsos de CO2 patrón (4.9) de la bala

(véase ejemplo de cromatograma en 11.2). Existe una cadena ininterrumpida de

calibraciones entre este patrón, los patrones V-PDB y los patrones internacionales del OIEA.

El CO2 patrón puede también calibrarse con patrones internos.

Se realizan tres inyecciones de cada muestra de vino (6.3). Se deben incluir muestras de

control adecuadas en cada serie.

Ejemplo de una serie típica:



• Muestra 1

• Muestra 1

• Muestra 1

• Muestra 2

Cada muestra se mide 3 veces

• …

• Muestra 6

• Muestra 6

• Muestra 6



La muestra de control es una disolución de glicerol cuya concentración de carbono-13 (δ13C) se ha determinado previamente con mucha precisión (por ejemplo, mediante un

analizador elemental-IRMS) y que permite comprobar posibles desviaciones a lo largo de la

serie de medidas y, así, corregir los resultados.






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8. CÁLCULOS

8.1. Relación 13C/12C

La relación isotópica 13C/12C puede expresarse a partir de la desviación que presenta con respecto a un patrón interno. La desviación isotópica del carbono-13 (δ13C) se calcula en

una escala delta por mil ( δ ‰), comparando los resultados obtenidos para la muestra

analizada con los de un patrón interno previamente calibrado con el patrón primario

internacional (V-PDB). Durante el análisis isotópico, se introduce CO2 patrón, existiendo una

cadena de calibraciones entre este patrón y los patrones V-PDB.

Los valores de δ

13C se expresan en función del patrón interno como se explica a

continuación:

13Cmuestra/ref ‰= (Rmuestra / Rref - 1) × 1000

donde Rmuestra y Rref son respectivamente las relaciones isotópicas (13C/12C) de la muestra y

del dióxido de carbono utilizado como patrón (4.9).

Los valores de δ 13C se expresan en función del patrón V-PDB como se explica a

continuación:

δ

13C muestra/V-PDB ‰ = δ 13C muestra/ref + δ 13C ref/V-PDB + (δ 13C muestra/ref × δ 13C ref/V-PDB)/1000

dondeδ

13Cref/V-PDB es la desviación isotópica del patrón interno con respecto del V-PDB

determinada anteriormente.

Al efectuar las mediciones en serie pueden observarse ligeras variaciones debidas a cambios en las condiciones instrumentales. En ese caso, los valores de δ 13C de las

muestras se deben corregir en función de la diferencia entre el valor de δ 13C medido en el

patrón y su valor real, calibrado previamente con respecto al V-PDB mediante algún

material de referencia internacional. Se puede considerar que la variación entre dos

mediciones del patrón y, por consiguiente, la corrección que hay que aplicar a los

resultados obtenidos de las muestras, son lineales. El patrón debe medirse al principio y al

final de las series, de modo que pueda calcularse la corrección para cada muestra por

interpolación lineal.

8.2. Concentración de glicerol mediante GC-IRMS

Al elaborar la curva de calibración, para cada inyección, el parámetro medido que es tenido

en cuenta es el área S (en V*s) dado por el espectrómetro. Calcular la relación R tal como

se muestra en la ecuación 1 que aparece a continuación y dibujar la gráfica de R frente a la

concentración de glicerol respecto al patrón interno (IS) C glicmuestra. La gráfica ha de ser

lineal y el coeficiente de correlación, al menos 0,99.






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En las condiciones experimentales descritas (7.1.1), el tiempo de retención del glicerol es

de 460 segundos (véase el ejemplo de cromatograma del apartado 11.1) y el del 1,5-

pentanodiol, que es menos polar, es de unos 310 segundos.

La concentración del glicerol de cada inyección se calcula con la ecuación siguiente:

Ecuación 2

Cglic.muestra= K . C1,5PD muestra .

muestra

muestra

PD

glic

S

S

5,1

x Factor de dilución

En la cual:

Cxmuestra es la concentración en g L-1 de la especie química en la muestra

Sxmuestra es el área de los picos obtenidos

K es el factor de respuesta. Se calcula como sigue:

K=

tS

St

tS

St

glic

PD

PD

glic

S

S

C

C 5,1

5,1

Ecuación 3 (véase 8.2)

El subíndice St se refiere a las concentraciones y áreas del 1,5-pentanodiol y del glicerol en

la serie de cinco disoluciones patrón empleado en la calibración (7.1.3).

Factor de dilución: según las condiciones descritas de preparación de muestras (7), el

factor de dilución es 4.

La concentración en g l-1 de cada muestra es la media de las tres inyecciones.

9. GARANTÍA Y CONTROL DE LA CALIDAD

9.1. GC-C-IRMS

Para cada muestra se deben medir tres viales consecutivamente y comprobar que la

desviación típica (SD) es inferior a 0,6 ‰. El resultado final para una muestra dada es la

media de las tres medidas. Si la desviación es superior a 0,6 ‰, se debe repetir la

medida.

Ecuación 1 R=ISpicoÁrea

glicerolpicoÁrea






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Para comprobar si las medidas son correctas se utiliza una corriente iónica m/z = 44, que

es proporcional a la cantidad de carbono que se inyecta en el sistema. En condiciones

normales, la corriente iónica debería ser prácticamente constante en las muestras

analizadas. Una desviación importante podría deberse a un problema de separación y

oxidación del glicerol, o a la inestabilidad del espectrómetro de masas.

9.2. HPLC-IRMS

Comprobar el valor de 13C del patrón interno: si difiere en más del 0,5 ‰ del valor

admisible, se debe verificar que el espectrómetro esté correctamente ajustado y, en caso

necesario, reajustarlo.

Para cada muestra se deben medir tres viales consecutivamente y comprobar que la

desviación típica (SD) sea inferior a 0,6 ‰. El resultado final para una muestra dada es la

media de las tres medidas. Si la desviación es superior a 0,6 ‰, se debe repetir la

medida.

Para comprobar si las medidas son correctas se utiliza una corriente iónica m/z = 44, que

es proporcional a la cantidad de carbono que se inyecta en el sistema. En condiciones

normales, la corriente iónica debería ser prácticamente constante en las muestras

analizadas. Una desviación importante podría deberse a un problema de separación y

oxidación del glicerol, o a la inestabilidad del espectrómetro de masas.

10. CRITERIOS DE EFICACIA

10.1. GC-C-IRMS

10.1.1. Precisión

Se han llevado a cabo varios estudios preliminares con 4 disoluciones sintéticas de vino (agua-etanol-glicerol), con muestras de glicerol de distintos orígenes y cuyo valor δ 13C se

ha determinado mediante EA-IRMS. Para la GC-C-IRMS se aceptó una desviación estándar

≤ 0,6 ‰ para las 3 repeticiones (n = 3).

En los vinos dulces la precisión puede verse afectada debido al solapamiento entre el 1,5-

pentanodiol y otros componentes o subproductos del vino.

10.1.2. Determinación de la concentración de glicerol

Se han usado 2 disoluciones de glicerol para validar el método. Dado que la concentración

de glicerol del vino seco está normalmente entre 4 y 10 g l-1, las concentraciones de las dos

disoluciones están comprendidas en este intervalo. Para la primera disolución (4,0 g l-1) se

obtuvo un valor experimental de 3,6 g l-1 (SD = 0,2, n = 8). Para la segunda disolución

(8,0 g l-1) se obtuvo un valor experimental de 7,9 g l-1 (SD = 0,3, n = 8).






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Por otra parte, para comprobar el método, se analizaron 5 muestras de vino (A, B, C, D y

E) cuya concentración de glicerol ya se había determinado por otros métodos ( BIPEA

Proficiency Test).

Las

conc

entr

acio

nes

de

glice

rol

obte

nida

s

por

GC-

C-

IRM

S

corresponden a los valores obtenidos utilizando otras técnicas analíticas, como la

determinación enzimática o HPLC.

10.2. HPLC-IRMS

10.2.1. Validación interna del método HPLC-IRMS

Para la validación del método por HPLC-IRMS, se han utilizado las siguientes muestras: un

patrón de glicerol, tres vinos sintéticos con diferentes concentraciones de glicerol dentro del

rango típico encontrado en vinos y un vino.

La precisión de la medida de δ13C del glicerol se determinó mediante diez medidas de cada

muestra, bajo condiciones de repetibilidad y en tres días diferentes, bajo condiciones de

reproducibilidad (Tabla 2).

Tabla 1: Comparación de la concentración de 5 vinos analizados

Muestra A B C D E

Tipo blanco rosado blanco tinto blanco

Intervalo 6,2 – 8,4 4,8 – 6,6 5,7 – 7,7 6,3 – 8,5 4,6 – 6,2

Valor medio 7,3 5,4 6,7 7,4 5,4

GC-C-IRMS 6,4 5,4 6,7 7,8 5,4

* Los análisis del BIPEA se realizaron mediante HPLC, análisis enzimático o ambos.

Las concentraciones están en g l-1. n > 3 y SD < 0,6.






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Tabla 2. Exactitud y precisión de valores δ13C de glicerol obtenidos mediante HPLC-IRMSa

aValores de δ13C expresados en ‰ vs V-PDB bValor del glicerol (estándar) por EA-IRMS: -28.02 + 0.09 ‰

La precisión en la determinación del δ13C del glicerol se obtiene a partir de una muestra de

vino:

- Repetibilidad r: 0,60 ‰

- Reproducibilidad R: 0,62 ‰

HPLC-IRMS

Día 1 Día 2 Día 3 Precisión

Muestra Repeticiones por muestra

Media δ13C (‰)

SD (‰)

Media δ13C (‰)

SD (‰)

Media δ13C (‰)

SD (‰)

r (‰)

R (‰)

Glicerol (estándar)b

10 -27.99 0.05 -27.94 0.04 -27.95 0.08 0.17 0.18

Vino sintético (6 g/l)

10 -28.06 0.13 -28.14 0.12 -28.14 0.11 0.34 0.35

Vino sintético

(8 g/l)

10 -28.11 0.12 -28.18 0.07 -28.21 0.07 0.25 0.28

Vino sintético (10 g/l)

10 -28.06 0.06 -28.06 0.09 -28.05 0.09 0.23 0.24

Vino 10 -28.88 0.10 -28.85 0.27 -28.72 0.23 0.60 0.62






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11. ANEXOS 11.1. Ejemplo de cromatograma (GC-C-IRMS) de análisis del glicerol del vino

pulsos de CO2 patrón

1,5-pentanodiol

glicerol






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11.2 Ejemplo típico de cromatograma de un análisis HPLC-IRMS de glicerol

pulsos de CO2 patrón

glicerol






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12. BIBLIOGRAFÍA

1. Calderone G., Naulet N., Guillou C., Reniero F., “Characterization of European

wine glycerol: stable carbon isotope approach”. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 2004, 52, 5902-5906

2. Cabanero A.I., Recio J.L., Ruperez M. ¨Simultaneous stable carbon isotopic

analysis of wine glycerol and ethanol by liquid chromatography coupled to isotope

ratio mass spectrometry¨. Journal of Agricultural and Food chemistry, 2010, 58,

722-728.

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