CONGRESO INTERNACIONAL DE QUIMICOS FARMACEUTICOS BIOLOGOS 2011.

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON.

Monterrey, Nuevo León a 23 de Agosto de 2011.

EL ANALISIS DE SEMEN HUMANO: ACTUALIZACION DEL MANUAL DE LA OMS 2010.

Biol. Gerardo Cerezo Parra

Director de LABORATORIO FERTIMEXICO S.A. DE C.V.Director de PRO-SEMEN.

Secretario General de PLEAS.México D. F.

www.analisisdesemen.com.mx

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IMPORTANCIA DEL ANALISIS DEL SEMEN.

El análisis de semen nos proporciona información esencial sobre el estado clínico del individuo.

Toda alteración de la función endocrina o exocrina del testículo se refleja en el análisis de semen, ya sea en sus aspectos morfológicos y/o funcionales.

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LA CALIDAD DEL SEMEN

La calidad del eyaculado depende de la movilidad, vitalidad, concentración, morfología y el volumen (Fluidos seminales), estos son importantes para la función del espermatozoide y que logre la fertilización.

La calidad del eyaculado también va a depender de la forma en que se obtenga, el lugar (Zavos y Goodpasture, 1989), la actividad sexual (Cooper et al., 1993), la edad del paciente (Ng et al., 2004), el tamaño del testículo (Holstein et al., 2003), estaciones del año y los días de abstinencia sexual (Cooper et al., 1993) (Tyler et al., 1982a).

4

5 %lubricació

n

70%

5 %

20%

EL SEMEN HUMANO

5

¿Cuál es el problema?No se ha logrado una estandarización del Análisis de semen.

Se han encontrado variabilidad en los resultados de análisis de semen entre los laboratorios (Keel B.A. et. al. 2000, Auger J. et. al. 2000, Björndahl L. 2002).

En muchos casos existe falta de control de calidad en los laboratorios.

1999

2002

Manual de Análisis Básico2002 NAFA - ESHRE

Génesis del nuevo Manual 2010.

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-Es imposible caracterizar la calidad del semen masculino al evaluar solo 1 muestra del paciente.

-Es recomendable examinar 2 o 3 muestras para obtener datos confiables y una media. (Carlsen et al., 2004 Castilla et al., 2006).

¿Cuántas Muestras Analizar?

8

99

AREA ESPECIAL PARA AREA ESPECIAL PARA COLECCION DE LAS MUESTRAS COLECCION DE LAS MUESTRAS DE SEMENDE SEMEN

-Área Privada y cercana al laboratorio.

-Limitar la exposición del semen a fluctuaciones de temperatura.

-Darle las instrucciones precisas al paciente:1)Colectar la muestra completa.2) Comunicarnos si perdió alguna fracción del eyaculado.

1010

INSTRUCCIONES AL PACIENTEINSTRUCCIONES AL PACIENTE

-Abstinencia Sexual de 2--Abstinencia Sexual de 2-7 días.7 días.

-Aseo con agua y jabón de -Aseo con agua y jabón de genitales.genitales.

-Toma de muestra en el -Toma de muestra en el laboratorio.laboratorio.

-Colección de muestra -Colección de muestra por masturbación.por masturbación.

-No se permite el coito interrumpido.

-No se debe perder ninguna fracción del eyaculado.

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COLECCION DEL EYACULADOCOLECCION DEL EYACULADO

-COLECCIÓN DE LA MUESTRA CON -COLECCIÓN DE LA MUESTRA CON CONDON ESPECIAL:CONDON ESPECIAL:

1) Incapacidad para colectar la muestra por 1) Incapacidad para colectar la muestra por masturbación en el laboratorio y en casa.masturbación en el laboratorio y en casa.

2) Darle al paciente las indicaciones para la 2) Darle al paciente las indicaciones para la colección de la muestra de semen con colección de la muestra de semen con condón.condón.

3) Utilizar condones especiales.3) Utilizar condones especiales.

4) Registrar la hora de la colección del 4) Registrar la hora de la colección del semen.semen.

5) Entregar la muestra al laboratorio 5) Entregar la muestra al laboratorio dentro de la hora después de la colección dentro de la hora después de la colección de la muestra de semen.de la muestra de semen.

6) Mantener la muestra de semen entre 20 6) Mantener la muestra de semen entre 20 y 37°C durante el transporte al laboratorio.y 37°C durante el transporte al laboratorio.

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LICUEFACCIONLICUEFACCION

Proceso en el cual el semen pasa de un estado hiperviscoso a un estado liquido (manejable).

-El semen generalmente se licua dentro de los primeros 15 minutos.

-El semen puede contener gránulos gelatinosos.

PARAMETRO VALOR DE REFERENCIALICUEFACCION 10 – 60 MIN.

Transferencia al recipiente de recolección

Transferencia desde el recipientede recolección con pipeta o decantando a un cilindro graduado:

• Falsos volúmenes bajos • 0.4 a 0.8 ml (14%)

EVALUACION DEL VOLUMEN

Medición indirecta a partir del peso, asumiendo que la densidad del semen es 1g/ml (1,014g/ml).

1)Pesar el recipiente (con la etiqueta).

2)Pesar el recipiente con el semen (g).

3)Calcular la diferencia de peso (g = ml).

Valor de referencia: >1.5 ml. Menor a esto: Hipospermia.Valor de referencia: >1.5 ml. Menor a esto: Hipospermia.

1515www.analisisdesemen.com.mx

APARIENCIA

VALOR DE VALOR DE REFERENCIA:REFERENCIA:GRIS OPALESCENTEGRIS OPALESCENTE

-Menos Opaco:-Menos Opaco:Concentración Concentración Disminuida.Disminuida.

-Rojo ó Marrón:-Rojo ó Marrón:Hemospermia.Hemospermia.

-Amarillo:-Amarillo:Vitaminas.Vitaminas.

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VISCOSIDAD

VALOR DE REFERENCIA:VISCOSIDAD NORMAL : Se forman gotas de semen al dejarlo caer.

VISCOSIDAD AUMENTADA:: Se forma una filancia mayor a 2 cm.

Nota 1.- La viscosidad puede interferir con la Nota 1.- La viscosidad puede interferir con la determinación de la movilidad, concentración, determinación de la movilidad, concentración, detención de anticuerpos antiespermatozoides. detención de anticuerpos antiespermatozoides.

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pH

PARAMETRO VALOR DE REFERENCIApH >7.2

El pH normal del semen recién eyaculado El pH normal del semen recién eyaculado debe ser mayor a 7.2; Con el transcurso debe ser mayor a 7.2; Con el transcurso del tiempo el pH del semen se alcaliniza, del tiempo el pH del semen se alcaliniza, es por eso que es preferible medirlo es por eso que es preferible medirlo inmediatamente después de la inmediatamente después de la licuefacción (si sucede en los primeros 30 licuefacción (si sucede en los primeros 30 minutos), pero si sucede hasta la hora el minutos), pero si sucede hasta la hora el pH es cambiado por la perdida de CO2.pH es cambiado por la perdida de CO2.

Refleja el balance entre las vesículas seminales y la próstata.

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Análisis del semen: representación de una alícuota

El semen es viscoso

Área 1: -Elevada concentración de espermatozoides. -Espermatozoides rápidos. -Buena morfología.

Área 2 : -Baja concentración de espermatozoides. -Espermatozoides lentos. -Mala morfología.

¡MEZCLAR BIEN LA MUESTRA.!

Contar a Tª ambiente o 37ºC en cámaras con una profundidad de ~20 µm, para permitir el movimiento libreLa profundidad (D,µm) es el volumen (V, µl=mm³) dividido por el área (A, mm²)

Movilidad espermática: profundidad de la cámara

Contar 2 x 200 espermatozoides (si es posible) en al menos 5 campos diferentes

Usar un ocular reticulado para limitar el área examinada evitando los limites del cubreobjetos

a) b) > 5 mm

2020

Movilidad Progresiva (PR): Movilidad Progresiva (PR): Espermatozoide con Espermatozoide con movimiento activo; lineal o en círculos grandes movimiento activo; lineal o en círculos grandes independientemente de la velocidad.independientemente de la velocidad.

Movilidad no Progresiva (NP): Movilidad no Progresiva (NP): Movimientos “in Movimientos “in situ”: Movimientos en el mismo lugar (sin situ”: Movimientos en el mismo lugar (sin desplazamiento).nado en círculos pequeños, la desplazamiento).nado en círculos pequeños, la fuerza del flagelo no puede desplazar a la cabeza del fuerza del flagelo no puede desplazar a la cabeza del espermatozoide o cuando solo el flagelo se observa.espermatozoide o cuando solo el flagelo se observa.

Inmóviles Inmóviles (IM): Sin movimiento.Sin movimiento.

Valor de referencia: >32% PR. Menor a esto: Valor de referencia: >32% PR. Menor a esto: Astenozoospermia.Astenozoospermia.

CATEGORIAS DE MOVILIDAD:CATEGORIAS DE MOVILIDAD:

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Tabla 1.- Intervalos de confianza del 95% aproximadamente para Tabla 1.- Intervalos de confianza del 95% aproximadamente para las diferencias entre dos porcentajes determinados de conteos las diferencias entre dos porcentajes determinados de conteos por duplicado de 200 (400 espermatozoides totales contados) 0 por duplicado de 200 (400 espermatozoides totales contados) 0 400 espermatozoides. 400 espermatozoides. Aplicable para movilidad, vitalidad y morfología.Aplicable para movilidad, vitalidad y morfología.

PORCENTAJEPORCENTAJEPROMEDIOPROMEDIO

DIFERENCIA DIFERENCIA MAXIMAMAXIMAACEPTABLEACEPTABLE

PORCENTAJEPORCENTAJEPROMEDIOPROMEDIO

DIFERENCIA DIFERENCIA MAXIMAMAXIMAACEPTABLEACEPTABLE

00 11 66-7666-76 99

11 22 77-8377-83 88

22 33 84-8884-88 77

3-43-4 44 89-9289-92 66

5-75-7 55 93-9593-95 55

8-118-11 66 96-9796-97 44

12-1612-16 77 9898 33

17-2317-23 88 9999 22

24-3424-34 99 100100 11

35-6535-65 1010

2222www.analisisdesemen.com.mx

Agregaciones: Adherencia de espermatozoides inmóviles o móviles a células no espermáticas o detritos .

Aglutinaciones: Espermatozoides móviles adheridos a otros espermatozoides móviles.

Espermatozoides con la membrana de la cabeza intacta: exclusión de colorantes impermeables

Ej. Eosina-nigrosinaEosina = colorante no permeableNigrosina = fondo oscuro

Cabeza roja = spz muerto (D1)Cabeza rosa = spz muerto (D2) Cabeza blanca = spz vivo (L)Cuello rosa = spz vivo (L)

PRUEBA DE VIABILIDAD USANDO EOSINA-PRUEBA DE VIABILIDAD USANDO EOSINA-NIGROSINANIGROSINA

2424www.analisisdesemen.com.mx

EVALUACION DE LA VIABILIDAD

• -Contar 200 espermatozoides (duplicado de diferentes preparaciones) en un campo de 40X

• y obtener el porcentaje de vivos y muertos.• Eosina Amarillenta

VIVO

MUERTO

•Hacer duplicados de dos diluciones separadas•No llenar ambas cámaras de una dilución•No contar la misma cámara dos veces

•Error de muestreo •Error de pipeteo •Error de dilución

Concentración espermática: cámara Neubauer Improved

Cámara de 100 µl de profundidad 9 rejillas de 100nl

Rejilla central 25 cuadrados grandes de 4nl

Cada cuadrado grande 16 cuadrados pequeños de 250pl

¿Qué espermatozoides se cuentan?

Contar todos los espermatozoides que estén dentro del cuadro central

La línea media muestra el cuadrado relevante

: contado

: no contado

¿Qué espermatozoides se cuentan?

Se cuentan los espermatozoides sólo cuando están sobre las líneasinferiores o izquierdas(“L”)

En la línea izquierda

En la línea inferior

: contado

: no contado

•PREPARACIÓN DEL FROTIS

•SECADO AL AIRE

•FIJACIÓN

•PAPANICOLAOU

•TREN CORTO DE TINCIÓN (Papanicolaou modificada o Diff-Quik)

•PLACAS PRETEÑIDAS

MORFOLOGIA NORMAL DE LA CABEZA Y PIEZA MEDIA

CABEZACABEZA CUELLO Y CUELLO Y PIEZA MEDIAPIEZA MEDIA

COLACOLA

•Grande. Grande. •Amorfa. Amorfa. •Pequeña.Pequeña.•Elongada.Elongada.•Piriforme.Piriforme.•Doble.Doble.•Vacuolada.Vacuolada.•Acrosoma Acrosoma pequeño.pequeño.

•Inserción Inserción Asimétrica.Asimétrica.•Cuello Doblado.Cuello Doblado.•Gruesa o Gruesa o Irregular.Irregular.•Fina,Fina,•Gotas Gotas Citoplásmica, Citoplásmica, >1/2 del área de >1/2 del área de la cabeza.la cabeza.

•Múltiple.Múltiple.•Corta.Corta.•Doblada.Doblada.•Irregular.Irregular.•Enrollada.Enrollada.

NormalAnormalidades

DEFECTO DE CABEZA

MACROCEFALO

DEFECTO DE CABEZA

PIRIFORME

TAPERING

DEFECTO DE CABEZA

DEFECTO DE PIEZA MEDIA

PIEZA MEDIA DOBLADA

DEFECTO DE PIEZA MEDIA

GOTA CITOPLASMICA

DEFECTO DE FLAGELO

FLAGELO ENROLLADO

DEFECTO DE FLAGELO

FLAGELO CORTO

ESPERMATOZOIDE NORMAL

EVALUACIÓN DE LA MORFOLOGIA ESPERMATICA

Se valora en porcentaje de acuerdo a los siguientes criterios:

N = NormalesDC = Defectos de cabeza.

DPM = Defectos de Pieza Media.DF = Defectos de Flagelo.

DG = Residuo Citoplasmático

N DC DM DF

100X

40

TERATOZOOSPERMIA <4% NORMALES

O.M.S. O.M.S.

2 ed.2 ed.

O.M.S. O.M.S.

3 ed.3 ed.

O.M.S. O.M.S.

4 ed.4 ed.

O.M.S. O.M.S.

5ed.5ed.

%% >50>50 >30>30 >1>144 >4>4

OTRAS CELULAS PRESENTES EN EL SEMEN

El semen contiene células diferentes de los espermatozoides como son: células epiteliales del tracto uretral, células inmaduras (células de la espermatogénesis) y leucocitos. A estas células se les llama células redondas y pueden ser reportadas como número de células por campo.

CELULAS EPITELIALES

CELULAS INMADURASY LEUCOCITOS

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Mejorar los resultados de los laboratorio clínicos, para que puedan ser transferibles.

Comprobar el grado de imprecisión de los resultados obtenidos con los métodos analíticos empleados en el propio laboratorio.

Comparar la inexactitud de los métodos analíticos propios con la de otros participantes.

Apoyar el control de calidad interno.

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EXACTITUDNO SI

PRECISION

NO

SI

PRECISION

NO

NO

SI

SI

EXACTITUD

Análisis de SemenAnálisis de SemenPrecisión(CCI) / Exactitud(CCE)Precisión(CCI) / Exactitud(CCE)

PRECISION: Dispersión de una misma muestra alrededor de su promedio.EXACTITUD: Grado de coherencia entre el valor obtenido y el valor verdadero. de la muestra.

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PEEC EN ANALISIS DE SEMEN.

¿Es obligatorio participar?-La NOM-166-SSA1-1997.Para la Organización y

Funcionamiento de los laboratorios.

9.2 Deberán participar al menos en un programa de evaluación externa de la calidad en el cual deberán integrar los análisis que realice y que incluya el programa.

- La OMS(1999, 2010), Resalta la importancia de participar en PEEC.

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PROGRAMAS MUNDIALES DE PEEC EN ANALISIS DE SEMEN.

ESQUEMA PAISFertility Society of Australia (FSA). Australia

United Kingdom National External Quality Assesment Schemes (UKNEQAS).

Reino Unido

American Association of Bioanalysts (AAB).

Estados Unidos

Centro de Estudios e Investigación de la Fertilidad (CEIFER).

España

College of American Pathologists (CAP).

Estados Unidos

European Society of Human Reproduction and Embriology (ESHRE).

Europa

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1.- Viabilidad (2 muestras).

2.- Morfología (4 muestras).

3.- Concentración (4 muestras).

4.- Movilidad (4 muestras)

*European Society of Human Reproduction and Embriology.

PEEC- SEMEN en MEXICO

Programa Mexicano de Evaluación Externa de la Calidad en Análisis de Semen (PEEC-

SEMEN).

En colaboración con: Laboratorio de Andrología del Centro

de Andrología y Medicina Sexual, Hospital Universitario. Karolinska, Huddinge, Estocolmo, Suecia.

  Dr. Lars Björndahl Director

LIMITES INFERIORES DE REFERENCIA

51 51www.analisisdesemen.com.mx

OMS´5: Valores de referencia para el semen humano

Población de referenciaPadres (parejas con un embarazo hace ≤ 12 mesesN>1600 3 continentes 5 centros

Muestra -2-7 días de abstinencia.

-Muestras completas.

MétodosRecolección, preparación, análisis con metodología

de la OMSIQC + EQC – laboratorios controladosSólo hemocitómetro (ni CASA, ni cámara Makler)Morfología Tygerberg

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CONCLUSIONES

Los cambios en el manual de laboratorio de la OMS para el examen de semen humano están enfocados a:

• Aumentar la exactitud de los datos analíticos

• Suministrar más detalles experimentales de métodos

comunes.

Estos deberían ayudar a mejorar:

• La estandarización entre laboratorios.

• El valor diagnóstico de los resultados de los análisis de semen.

• y llevar a cabo tratamientos terapéuticos.

¡MUCHAS GRACIAS!¡MUCHAS GRACIAS!

Biol. Gerardo Cerezo Parra

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