consejo superior de investigaciones cientÍficas …
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CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC)
ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL ZAIDÍN
UNIVERSIDAD DE GRANADA
FACULTAD DE CIENCIAS
IMPLICADOS EN EL CONTROL
IDAD DE FRUTOS DE PIMIENTO (Capsicum
annuum L.): PROTEÓMICA FUNCIONAL Y ANTIOXIDANTES
Mª DE LA PAZ ÁLVAREZ DE MORALES DÁVILA PONCE DE LEÓN
TESIS DOCTORAL
Granada 2015
Editorial: Universidad de Granada. Tesis DoctoralesAutora: María de la Paz Álvarez de Morales Dávila Ponce de LeónISBN: 978-84-9125-186-6URI: http://hdl.handle.net/10481/40532
IMPLICADOS EN EL CONTROL DE
CALIDAD DE FRUTOS DE PIMIENTO
(Capsicum annuum L.): PROTEÓMICA FUNCIONAL Y
ANTIOXIDANTES
Memoria que presenta la Licenciada en Biología
Mª de la Paz Álvarez de Morales Dávila Ponce de León
para optar al grado de Doctor
Fdo. Mª Paz Álvarez de Morales Dávila Ponce de León
VºBº
LOS DIRECTORES DEL TRABAJO
Dr. José Manuel Palma Martínez Dr. Francisco Javier Corpas Aguire
Profesor de Investigación del CSIC Investigador Científico del CSIC
El trabajo que se presenta en esta memoria de Tesis Doctoral ha sido realizado en el
Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Plantas, de la Estación
Experimental del Zaidín (CSIC) de Granada, dentro del grupo de investigación (BIO
192) con ayuda de una beca FPI a cargo de los proyectos AGL2008-00834 y AGL2011-
26044.
Parte de los resultados de esta Tesis Doctoral han sido presentados en los siguientes
congresos y reuniones científicas:
+ Reunión GEIRLI. Valencia 2013.
- Título: Protein nitration in pepper fruits and its involvement in ripening. Autores:
Álvarez de Morales P, Chaki M, Barroso JB, Corpas FJ, Palma JM .
+ 11th
International POG Conference. Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants.
17-19th
July 2013,m Warsaw, Poland.
- Título: Characterization of nitrated proteins from pepper (Capsicum annuum L.)
fruits. Autores: Álvarez de Morales P, Chaki M, Barroso JB, Corpas FJ, Palma
JM.
+ III Jornadas Jóvenes Investigadores en Proteómica, Sociedad Española de Proteómica
(SEPROT) Santiago de Compostela, 9-10 febrero de 2012.
- Título: Proteoma de peroxisomas y mitocondrias de frutos de pimiento
(Capsicum annuum L.) durante la maduración. Autores: Álvarez P, Jiménez A,
Chaki M, del Río LA, Sevilla F, Corpas FJ, Palma JM.
- Título: Nitroproteínas implicadas en la maduración de frutos y en el estrés por
baja temperatura en plantas de pimiento (Capsicum annuum L.). Autores: Chaki
M, Álvarez P, Airaki M, Begara-Morales JC, Sánchez-Calvo B, Barroso JB,
Corpas FJ, Palma JM.
+ XXIV Scandinavian Plant Physiology Society (SPPS) Congress. Stavanger,
Norway. 21-25 August 2011.
- Título: Proteomics of pepper (Capsicum annuum L.) fruits during ripening.
Autores: Álvarez de Morales P, Jiménez A, Chaki
M, Bonilla-Valverde
D,
Campos MJ, del Río
LA, Sevilla
F, Corpas
FJ, Palma
JM.
+ 10th International Conference on Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants.
July 5-8, 2011, Budapest, Hungary.
- Título: RNS metabolism in pepper fruit ripening. Autores: Chaki M. Airaki M,
Ruiz C, Álvarez P, Carreras A, Begara-Morales JC, Barroso JB, Corpas FJ, del
Río LA, Palma JM.
Parte de los resultados de esta Tesis han dado lugar a las siguientes publicaciones:
- Palma JM, Sevilla
F, Jiménez
A, del Río
LA, Corpas FJ, Álvarez de Morales
P,
Camejo DM (2015). Physiology of pepper fruits and the metabolism of antioxidants:
chloroplasts, mitochondria and peroxisomes. Ann Bot. (En revisión).
- Chaki M, Alvarez de Morales P, Ruiz C, Begara-Morales JC, Barroso JB, Corpas FJ,
Palma JM (2015). Ripening of pepper (Capsicum annuum) fruit is characterized by an
enhancement of protein tyrosine nitration. Ann Bot., en prensa,
doi:10.1093/aob/mcv016.
A mis padres
A Nacho, María y Clara
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN GENERAL .................................................................. 3
1.- EL FRUTO DE PIMIENTO (Capsicum annuum L.) ......................... 4
1.1 Historia, importancia económica y producción de pimiento ............................................ 4 1.2 Clasificación taxonómica, características morfológicas y tipos de pimiento ................ 4 1.3 Valor nutricional del fruto de pimiento ................................................................................. 7 1.4 Particularidades del cultivo ...................................................................................................... 8
2.- MADURACIÓN DE LOS FRUTOS DE PIMIENTO........................ 9
2.1 Definición del proceso de maduración. Madurez fisiológica y madurez comercial .... 9 2.2 Cambios que ocurren en los frutos durante la maduración .......................................... 10 2.4 Particularidades en la maduración del fruto de pimiento ¿climatérico o no? .......... 12
3.- METABOLISMO DE LAS ESPECIES DE OXIGENO
REACTIVO Y LOS SISTEMAS ANTIOXIDANTES .......................... 13
3.1 Especies de oxígeno reactivo (Reactive oxygen species; ROS) ....................................... 13 3.1.1 Estrés oxidativo ................................................................................................................................ 15 3.1.2 Producción de ROS en plantas .................................................................................................... 15
3.2 Sistemas antioxidantes de plantas ........................................................................................ 16 3.2.1 Antioxidantes no enzimáticos ..................................................................................................... 16 3.2.2 Antioxidantes enzimáticos............................................................................................................ 18
4.- METABOLISMO DE LAS ESPECIES DE NITRÓGENO
REACTIVO ............................................................................................... 24
4.1 El óxido nítrico (NO), origen e historia............................................................................... 24 4.2 Principales funciones del NO ................................................................................................ 25 4. 3 Producción de NO en plantas ............................................................................................... 26 4. 4 Control y eliminación del NO ............................................................................................... 28 4. 5 Estrés nitrosativo y especies de nitrógeno reactivo (reactive nitrogen species; RNS)
............................................................................................................................................................. 29 4. 6 Modificaciones postraduccionales mediadas por NO y otras RNS ............................. 31
5. PEROXISOMAS VEGETALES ......................................................... 33
5.1 Historia, definición, y tipos de peroxisomas ...................................................................... 33 5.2 Principales funciones de los peroxisomas ........................................................................... 34 5.3 Proteínas peroxisomales ......................................................................................................... 35 5.4 Biogénesis de peroxisomas ..................................................................................................... 36 5.5 Herramientas para la identificación del proteoma de los peroxisomas ...................... 37 5.6 Particularidades de los peroxisomas de frutos de pimiento ........................................... 38
6.- INTRODUCIÓN A LA PROTEÓMICA........................................... 39
OBJETIVOS .............................................................................................. 42
MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................... 45
1.-MATERIAL VEGETAL Y CONDICIONES DE CULTIVO .......... 46
2.- PREPARACIÓN DE EXTRACTOS CRUDOS PARA ENSAYOS
BIOQUÍMICOS ........................................................................................ 46
3.- DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE
PROTEÍNAS .............................................................................................. 46
4.- DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD CATALASA ...................... 47
5.- NITRACIÓN DE CATALASA .......................................................... 47
6.- AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE PEROXISOMAS .......... 48
7.- ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA
(EGPA) Y TINCIÓN DE GELES ............................................................ 49
7.1.- EGPA en condiciones desnaturalizantes. EGPA-SDS .................................................. 49 7.2.- Tinción de geles con azul-Coomassie ................................................................................ 50 7.3.- Tinción de geles con plata .................................................................................................... 50
8.- TRANSFERENCIA E INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS
(Técnica de Western) ................................................................................ 50
8.1.- Transferencia de proteínas .................................................................................................. 50 8.2.- Inmunodetección de proteínas por quimioluminiscencia ............................................ 51
9.- ANÁLISIS PROTEÓMICO ............................................................... 51
9.1.- Limpieza de muestras y solubilización ............................................................................. 51 9.2.- Electroforesis bidimensional (2-D) y tinción de geles ................................................... 52 9.3.- Transferencia a membranas de nitrocelulosa ................................................................. 52 9.4.- Adquisición de imágenes ...................................................................................................... 53 9.5.- Selección y digestión de proteínas ...................................................................................... 53 9.6.- Identificación de proteínas por huella petídica .............................................................. 54
10.- ESTUDIOS BIOINFORMÁTICOS ................................................. 54
CAPÍTULO 1: PROTEÓMICA DE LA MADURACIÓN DE FRUTOS
DE PIMIENTO. ......................................................................................... 56
INTRODUCCIÓN ..................................................................................... 57
RESULTADOS .......................................................................................... 63
1.1 Patrón polipeptídico de frutos de pimiento ................................................................ 64 1.2 Análisis del proteoma de frutos de pimiento mediante electroforesis
bidimensional (2-D) ........................................................................................................................ 64 1.3 Identificación de proteínas y análisis mediante MALDI-TOF/TOF .................... 68
DISCUSIÓN ............................................................................................... 74
CAPÍTULO 2: NITROPROTEOMA Y EFECTO DEL NO EN LA
MADURACIÓN DE LOS FRUTOS. ...................................................... 88
INTRODUCCIÓN ..................................................................................... 89
RESULTADOS .......................................................................................... 93
2.1.- Detección de proteínas nitradas en extractos crudos de pimiento ............................. 94 2.2.- Análisis de las proteínas nitradas mediante electroforesis bidimensional (2-D) e
inmunoblot ........................................................................................................................................ 94 2.3. Identificación de proteínas nitradas y análisis mediante MALDI-TOF/TOF .......... 97 2.4. Nitración de catalasa .............................................................................................................. 99
DISCUSIÓN ............................................................................................. 100
CAPÍTULO 3: FUNCIÓN DE LOS PEROXISOMAS EN LA
MADURACIÓN DE LOS FRUTOS DE PIMIENTO (Capsicum
annuum L.): APROXIMACIONES PROTEÓMICAS Y
BIOINFORMÁTICAS. ........................................................................... 105
INTRODUCCIÓN ................................................................................... 106
RESULTADOS ........................................................................................ 116
3.1 Purificación de peroxisomas de frutos de pimiento verde y rojo tipo California ... 117 3.2 Análisis del proteoma de peroxisomas de frutos de pimiento mediante electroforesis
bidimensional (2-D) ...................................................................................................................... 117 3.3 Identificación de proteínas y análisis mediante MALDI-TOF/TOF ......................... 119 3.4 Análisis in silico del proteoma de peroxisomas ............................................................... 121
DISCUSIÓN ............................................................................................. 125
CONCLUSIONES ................................................................................... 141
BIBLIOGRAFIA ..................................................................................... 143
ANEXO I.1 ............................................................................................... 179
ANEXO I.2 ............................................................................................... 183
ANEXO I.3 ............................................................................................... 187
ANEXO I.4 ............................................................................................... 191
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Tipos de pimiento dulce------------------------------------------------------------------------------------6
Figura 2: Frutos climatéricos y no climatéricos de interés nutricional-----------------------------------------12
Figura 3: Formación de especies de oxígeno reactivo (ROS) durante la reducción del O2 a H2O2-------- 13
Figura 4: Formación de radicales ·OH por la reacción de Haber-Weiss---------------------------------------14
Figura 5: Reacción catalizada por la superóxido dismutasa-----------------------------------------------------19
Figura 6: Ciclo ascorbato-glutation---------------------------------------------------------------------------------21
Figura 7: Síntesis y eliminación de NO en las células de las plantas-------------------------------------------28
Figura 8: Regulación de la formación del peroxinitrito por la NOS y la SOD--------------------------------30
Figura 9: Biogénesis de peroxisomas-------------------------------------------------------------------------------37
Figura 10: Estrategias para el estudio del proteoma en muestras vegetales----------------------------------137
Figura 11: Histograma de los grupos funcionales de las proteínas identificadas de frutos verdes y rojos
de pimiento------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----139
Figura 1.1: Estrategia para el análisis proteómico de la maduración de los frutos de pimiento-----60
Figura 1.2: Patrón polipeptídico de extractos crudos de pimiento verde y rojo-------------------------------64
Figura 1.3: Análisis comparativo por electroforesis bi-dimensional (2-D) entre frutos de pimiento verde
y rojo-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
65
Figura 1.4: Imagen correspondiente al gel 2-D de proteoma de fruto de pimiento verde con todos los
spots que se han picado------------------------------------------------------------------------------------------------66
Figura 1.5: Spots identificados en el proteoma de fruto de pimiento verde-----------------------------------67
Figura 1.6: Imagen correspondiente al gel 2-D de proteoma de fruto de pimiento rojo con todos los spots
que se han picado-------------------------------------------------------------------------------------------------------67
Figura 1.7: Spots identificados en proteoma de fruto de pimiento rojo----------------------------------------68
Figura 2. 1: Patrón de proteínas nitradas en extractos crudos de pimiento verde y rojo---------------------94
Figura 2.2: Imagen representativa de electroforesis 2-D correspondiente al extracto crudo de fruto de
pimiento verde----------------------------------------------------------------------------------------------------------95
Figura 2.3: Imagen representativa de electroforesis 2-D correspondiente al extracto de fruto de pimiento
rojo----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 96
Figura 2.4: Inmunoblot representativo correspondiente a proteínas nitradas de frutos de pimiento verde y
rojo----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 97
Figura 2.5: Efecto del SIN-1 en la actividad catalasa de frutos de pimiento---------------------------------99
Figura 3.1: Número de proteínas identificadas en distintas especies de plantas mediante la comparación
de sus proteomas nucleares------------------------------------------------------------------------------------------109
Figura 3.2: Proteínas mitocondriales de Arabidopsis clasificadas en categorías funcionales-------------110
Figura 3.3: Definición de los tripéptidos PTS1 mayoritarios y minoritarios de proteínas peroxisomales de
plantas superiores ----------------------------------------------------------------------------------------------------113
Figura 3.4: Definición de los nonapéptidos PTS2 mayoritarios y minoritarios de proteínas peroxisomales
de plantas superiores -------------------------------------------------------------------------------------------------114
Figura 3.5: Método de aislamiento y purificación de peroxisomas de frutos de pimiento mediante
centrifugaciones diferenciales y en gradientes de densidad de sacarosa--------------------------------------117
Figura 3.6: Imagen de geles correspondientes a matrices concentradas de peroxisomas de fruto de
pimiento verde y rojo-------------------------------------------------------------------------------------------------118
Figura 3.7: Imagen de gel correspondiente a la superposición de los dos anteriores en el que se han
señalado las proteínas que presentaron diferencias de intensidad en peroxisomas de fruto de pimiento
verde y rojo------------------------------------------------------------------------------------------------------------119
Figura 3.8: Enzimas de las fotorrespiración de la b-oxidación de ácidos grasos y del ciclo del glioxilato
identificadas en peroxisomas mediante análisis proteómico----------------------------------------------------130
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Filogenia del fruto de pimiento----------------------------------------------------------------------------4
Tabla 2: Composición del fruto de pimiento por cada 100 g de material fresco-------------------------------8
Tabla 3: Producción de ROS en plantas----------------------------------------------------------------------------15
Tabla 4: Tipos de isoenzimas de SOD y localización------------------------------------------------------------19
Tabla 5: Principales funciones descritas en peroxisomas de plantas-------------------------------------------35
Tabla 1.1: Categorías funcionales de las proteínas que se expresan de manera diferencial en los frutos
bajo diferentes condiciones de desarrollo y de maduración -----------------------------------------------------59
Tabla 1.2: Proteínas descritas e identificadas de forma exclusiva en frutos de pimiento verdes o rojos y
su número de identificación en la base de datos Uniprot---------------------------------------------------------69
Tabla 1.3: Proteínas coincidentes entre los dos tipos de fruto de pimiento------------------------------------72
Tabla 1.4: Proteínas identificadas de frutos de pimiento y agrupadas por grupos funcionales-------------76
Tabla 2.1: Proteínas nitradas identificadas en fruto de pimietno verde y rojo--------------------------------98
Tabla 3.1: Comparación de los distintos proteomas nucleares-------------------------------------------------109
Tabla 3.2: Proteínas identificadas en peroxisomas de fruto de pimiento verde y rojo----------------------120
Tabla 3.3: Clasificación de las proteínas identificadas en los peroxisomas de fruto de pimiento verde y
rojo en función del grupo funcional al que pertenecen----------------------------------------------------------121
Tabla 3.4: Funciones principales y localización subcelular descrita hasta el momento de las proteínas
seleccionadas AT1G61680, AT2G38760, AT3G46170 y AT3G14660---------------------------------------122
1
RESUMEN
2
P
frutos de pimiento (Capsicum annuum l.): proteómica funcional y antioxidantes
La maduración de la mayoría de las especies del género Capsicum está caracterizada
por un intenso metabolismo, emisión de compuestos volátiles, destrucción de las
clorofilas y síntesis de nuevos pigmentos, formación de pectinas, síntesis de proteínas,
alteración en el sabor, etc. El proceso de maduración ha sido objeto de interés de
muchos investigadores, no solo por los espectaculares cambios que sufren los frutos,
sino por la complejidad del mecanismo de biosíntesis de capsantina, una sustancia
exclusiva que les da color a los mismos. Muchos de los cambios bioquímicos
observados se corresponden con modificaciones en la célula. De hecho, los cloroplastos,
que son los que contienen clorofila, se convierten en cromoplastos, que contienen
carotenoides como pigmentos mayoritarios. En las mitocondrias, sin embargo, no se han
descrito modificaciones ultraestructurales ni metabólicas destacables durante la
maduración de los frutos. En los peroxisomas, se han descrito importantes cambios
metabólicos; así se ha comprobado que la fotorrespiración es inhibida, mientras que la
actividad de las enzimas del ciclo del glioxilato aumenta a lo largo del proceso de
maduración. Teniendo en cuenta la importancia que tienen los peroxisomas en muchos
procesos intrínsecos de la planta y como respuesta a estímulos externos, nos planteamos
la importancia que puedan tener dichos orgánulos en la homeostasis celular durante el
proceso de maduración de los frutos. Las aproximaciones tradicionales han permitido
descifrar las principales rutas metabólicas y las funciones celulares en las que se
encuentran implicados los distintos orgánulos. No obstante, quedan muchas incógnitas
sobre determinados procesos fisiológicos que subyacen al proceso de maduración. A
diferencia del genoma, que es un elemento estático a lo largo de la vida de un individuo,
el proteoma tiene un carácter dinámico, puesto que la expresión de las proteínas cambia
en las diferentes etapas del ciclo celular, así como en respuesta a acciones externas.
Bajo esta premisa, este trabajo se planteó como la posibilidad de sentar las bases
moleculares que permitieran conocer el desarrollo y la maduración de los frutos a nivel
molecular, y así poder vincularlos con las características nutricionales de los mismos,
haciendo para ello uso de la proteómica. Los resultados obtenidos indican que, en base a
la abundancia relativa de las proteínas, en la maduración de los frutos, interviene de
manera fundamental el metabolismo oxidativo y el relacionado, sobre todo, con la
degradación de proteínas. Los datos obtenidos en el análisis del proteoma de los
peroxisomas corroboran la importante función que desarrollan la catalasa y las
superóxido dismutasas, además de la existencia de enzimas características de rutas que
hasta ahora se creía que se producían de manera alternativa. Por último, el análisis del
nitro-proteoma, revela que esta modificación post-traduccional, propiciada
probablemente por el peroxinitrito, es un evento consustancial a la maduración de los
frutos de pimiento, donde la catalasa vuelve a ejercer un papel crucial.
3
T
Introducción general
4
1.- EL FRUTO DE PIMIENTO (Capsicum annuum L.)
1.1 Historia, importancia económica y producción de pimiento El origen del pimiento (Capsicum annuum L.) es incierto, parece que se sitúa en el
continente americano desde donde se importó a Europa por Cristóbal Colón. La
importancia económica del pimiento se debe a que se trata del segundo fruto hortícola
más consumido en todo el mundo después del tomate. Son varios los usos del pimiento,
el más extendido es su consumo en fresco, no siendo menos importantes la preparación
del pimiento para pimentón, para fabricación de conservas y el consumo de variedades
picantes, usadas como especias (http://faostat3.fao.org/).
El pimiento forma parte de las hortalizas cultivadas en casi todos los lugares del
mundo y en la actualidad una parte importante de la producción mundial se da en la
Cuenca del Mediterráneo entre España, Italia y Turquía. En España, el pimiento es uno
de los cultivos hortícolas bajo invernadero con mayor superficie cultivada,
localizándose casi la mitad de la producción entre Almería y Murcia. Almería se
caracteriza por los cultivos de pimiento de otoño-invierno, mientras que Murcia se
caracteriza por los cultivos de primavera-verano.
1.2 Clasificación taxonómica, características morfológicas y tipos de pimiento
El pimiento es una planta de origen tropical que pertenece a la familia Solanaceae
(Tabla 1) siendo una planta herbácea, perenne, de porte variable, entre 0,5 m (en
determinadas variedades de cultivo al aire libre) y más de 2 m cuando es cultivado en
invernadero.
Tabla 1: Filogenia del fruto de pimiento.
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Solanales
Familia Solanacea
Subfamilia Solanoidea
Tribu Capsiceae
Género Capsicum
Introducción general
5
El sistema radicular del fruto de pimiento se compone de una raíz pivotante
que luego desarrolla un sistema radicular lateral muy ramificado que puede llegar a
cubrir hasta 1,2 m de diámetro en los primeros 0,6 m de suelo en función de la
profundidad y textura del mismo. Además se compone de un tallo principal de
crecimiento limitado y dependiendo de la variedad, presentan un número determinado
de tallos secundarios que a su vez se ramifican de forma dicotómica. La hoja es entera,
lampiña y lanceolada con un pecíolo largo y poco aparente. El haz es glabro (liso y
suave al tacto) y de color verde más o menos intenso (dependiendo de la variedad) y
brillante. Las hojas se insertan en el tallo de forma alterna y su tamaño es variable en
función de la variedad, existiendo cierta correlación entre el tamaño de la hoja adulta y
el peso medio del fruto. Las flores aparecen solitarias en cada nudo del tallo, con
inserción en las axilas de las hojas. Son pequeñas y constan de una corola blanca. La
polinización es autógama, aunque puede presentarse un porcentaje de alogamia que no
supera el 10% (Cochran, 1938; DeWitt and Boslan, 1993).
El pimiento es una hortaliza de carácter anual, cuyo fruto tiene forma de baya
hueca, de diferente coloración y tamaño en función de la variedad. Las semillas se
encuentran insertas en una placenta cónica de disposición central. Son redondeadas,
ligeramente reniformes, de coloración amarillo pálido y longitud variable, entre 3 y 5
mm.
El pimiento se considera una especie no climatérica (Saltveit, 1977; Lurie et al.,
1986), es decir, que su maduración es independiente de la síntesis de etileno y de la
respiración. En el nombre de C. annuum se agrupan muchas variedades que se
diferencian en la forma, el color y el sabor, entre otras características. Generalmente los
pimientos son verdes cuando son inmaduros, desde un punto fisiológico y viran a rojos
en la maduración; sin embargo, con el tiempo, se han obtenido nuevos cultivares con
frutos maduros de otros colores, como el amarillo, naranja, morado o marrón (DeWitt
and Boslan, 1996).
Según su sabor los frutos de pimiento se diferencian en dulces o picantes. Los
frutos picantes suelen ser variedades de fruto largo y delgado. La capsicina es el
componente responsable del sabor amargo o picante de los frutos del género Capsicum
que se concentra en los tabiques divisorios, placenta y semillas (Sharma et al., 2013;
Srinivasan, 2014).
Introducción general
6
Dentro de la variedad de fruto dulce, se distinguen tres tipos de pimiento (Fig. 1;
(Mateos et al., 2013); http://www.infoagro.com/hortalizas/pimiento.htm;
http://es.scribd.com/doc/16619403/Capsicum-Annumm:
California: son frutos cortos, anchos, con tres o cuatro cascos bien marcados, con el
cáliz y la base del pedúnculo por debajo o a nivel de los hombros y un mesocarpio
carnoso más o menos grueso. Son los cultivares más exigentes en temperatura, por lo
que su plantación se realiza temprano (desde mediados de mayo a comienzos de agosto,
dependiendo de la climatología de la zona), para alargar el ciclo productivo y evitar
problemas de cuajado con el descenso excesivo de las temperaturas nocturnas.
Lamuyo: son frutos alargados y cuadrados de carne gruesa. Los cultivares
pertenecientes a este tipo suelen ser más vigorosos (de mayor porte y entrenudos más
largos) y menos sensibles al frío que los de tipo California, por lo que es frecuente
cultivarlos en ciclos más tardíos.
Dulce italiano: frutos alargados, estrechos, acabados en punta, de carne fina, más
tolerantes al frío, que se cultivan normalmente en ciclo único, con plantación tardía en
septiembre y octubre y recolección entre diciembre y mayo.
California Lamuyo Dulce italiano
Figura 1: Tipos de pimiento dulce
.
Introducción general
7
1.3 Valor nutricional del fruto de pimiento
Sobre el valor nutricional del pimiento cabe destacar que, además del agua, que
representa más del 90% del contenido del fruto fresco, contiene fibra, pectinas, glucosa
y fructosa como principales componentes. Esto hace que sea una hortaliza con bajo
aporte calórico y, al igual que el resto de las verduras, su contenido proteico es muy
bajo y apenas aporta grasas. En la Tabla 2 se indican los principales componentes del
fruto de pimiento. Éstos son, además, fuentes naturales de antioxidantes como los
carotenoides o vitamina A, vitamina C o ascorbato y vitamina E o -tocoferol (Howard
et al., 2000; Navarro et al., 2006; Mateos et al., 2013), entre otros. Los carotenoides
(carotenos y xantofilas) son los responsables del color en los frutos maduros de
pimiento, cualidad que deben principalmente a la capsantina. Dentro de las
propiedades de los carotenoides destaca que son precursores de la vitamina A o retinol
(De, 2003). Asimismo, el fruto fresco de pimiento destaca por su alto contenido en
vitamina C, pudiendo ser éste más del doble del que se encuentra en frutas como las
naranjas y las fresas (Davey et al., 2000; Proteggente et al., 2002; Martínez et al., 2005;
Mateos et al., 2013). La vitamina C además de ser un potente antioxidante, interviene en
la formación de colágeno, glóbulos rojos, huesos y dientes, al mismo tiempo que
favorece la absorción del hierro de los alimentos y aumenta la resistencia frente a las
infecciones (Yu and Schellhorn, 2013). La vitamina E retarda o inhibe la oxidación
lipídica, ya que actúa como un secuestrador de radicales lipídicos (Smirnoff, 2000). En
menor cantidad están presentes otras vitaminas del grupo B (B6, B3, B2 y B1). El
contenido de algunos antioxidantes en el pimiento depende además de muchos factores,
como el estado de maduración, las condiciones medioambientales o el almacenamiento
de dichos frutos (Jiménez et al., 2003; Martínez et al. 2005; Navarro et al., 2006). Entre
los minerales cabe destacar la presencia de hierro y potasio y, en menor proporción,
magnesio, fósforo y calcio (De, 2003).
Introducción general
8
Tabla 2: Composición del fruto de pimiento por cada 100 g de material fresco.
(http://www.botanical-online.com)
Pimiento
verde/rojo
Agua 92,1 g
Energía 31 Kcal
Hidratos de carbono 6,43 g
Fibra 1,8-2,0 g
Proteína 0,89 g
Grasa 0,19 g
Potasio 177 mg
Fósforo 19 mg
Magnesio 10 mg
Calcio 9 mg
Hierro 1,2 mg
Vitamina C 89,3 mg
Vitamina B2 0,03 mg
Vitamina B6 0,248 mg
Vitamina A 632 IU
Vitamina E 0,69 mg
1.4 Particularidades del cultivo
Son varios los factores que hay que tener en cuenta en el cultivo de pimiento. En cuanto
a la temperatura, se trata de una planta que no aguanta las heladas y que exige un
clima cálido o templado. De hecho, en temporadas de otoño e invierno sólo es posible
cultivarlos en invernaderos. La temperatura mínima para germinar y crecer es de 15C y
para florecer y fructificar necesitan como mínimo 18C. Las temperaturas óptimas
oscilan entre 20 y 26C. Si se dan bajas temperaturas durante la floración, entre 10 y
15C, se originan anomalías en las flores, dando lugar a frutos pequeños y con
deformaciones (Erickson and Markhart, 2002).
La humedad relativa óptima para el cultivo de esta especie oscila entre el 50 y
el 70%. Si la humedad es más elevada, origina el desarrollo de enfermedades en las
partes aéreas de la planta y dificulta la fecundación. Si la humedad es demasiado baja,
como por ejemplo durante el verano, con temperaturas altas, se produce la caída de
Introducción general
9
flores y frutos recién cuajados. Por otro lado, el pimiento requiere una gran cantidad de
luz, sobre todo durante el primer periodo de crecimiento después de la germinación
(Erickson and Markhart, 2001).
Los suelos más adecuados para el pimiento son los sueltos y arenosos
profundos, ricos en materia orgánica y con un buen drenaje. Los suelos con posibilidad
de encharcamiento favorecen el desarrollo de hongos en raíces y la pudrición de éstas.
En cuanto al riego, debe ser moderado y constante en todas las fases del cultivo, a pesar
de que aguantan bien una falta puntual de agua. El riego por goteo resulta ideal no
siendo apropiada la aspersión, ya que mojando las hojas y los frutos se favorece el
desarrollo de hongos (DeWitt and Boslan, 1993).
Todos estos requerimientos hacen que, los frutos de pimiento, sean cultivados en
invernaderos donde es posible el manejo de las condiciones del medio
(http://www.redpermacultura.org/).
2.- MADURACIÓN DE LOS FRUTOS DE PIMIENTO
2.1 Definición del proceso de maduración. Madurez fisiológica y madurez
comercial
La maduración es un complejo proceso en el desarrollo de los frutos por el cual se
transforman de inmaduros a maduros. Además es específica de cada especie de planta y
depende de las condiciones medioambientales (Palma et al., 2011b).
La maduración es un acontecimiento altamente coordinado, programado
genéticamente e irreversible y conlleva una serie de cambios físiológicos, bioquímicos
y organolépticos que desembocan finalmente en un fruto maduro, comestible y apto
para el consumo humano en aquellos que se destinan a este fin (Prasanna et al., 2007).
La elección del momento para la cosecha de frutas que estén en su justo punto
de maduración es una consideración importante de precosecha que tendrá gran
influencia en la vida postcosecha del producto y en su comercialización.
En el desarrollo del órgano de una planta existen tres fases (crecimiento,
madurez y envejecimiento) y no siempre es posible distinguirlas ya que las transiciones
entre las etapas son a menudo muy lentas y poco diferenciadas. Sin embargo, es
importante distinguir claramente entre madurez fisiológica y comercial. La madurez
fisiológica se refiere a la etapa del desarrollo de la fruta en que se ha producido el
Introducción general
10
máximo crecimiento y maduración. Generalmente está asociada con la completa
madurez de la fruta. Esta etapa de madurez fisiológica es seguida por el envejecimiento
o senescencia. La madurez comercial refleja simplemente las condiciones de un
órgano de la planta, requerido por un mercado. Comúnmente la madurez comercial
guarda escasa relación con la madurez fisiológica y puede ocurrir en cualquier fase del
desarrollo o envejecimiento (http://www.fao.org/;
http://www.fao.org/docrep/x5055s/x5055S03.htm).
2.2 Cambios que ocurren en los frutos durante la maduración Las características fundamentales que determinan que la fruta recién recolectada sea
aceptable para su comercio son la apariencia y la textura (Toivonen and Brummell,
2008).
El ablandamiento y los cambios que ocurren en la textura de la fruta durante su
maduración son característicos de cada especie y son debidos a diferencias en el grosor
de la pared celular y a su composición (Brummell et al., 2004).
Los cambios en la apariencia se deben principalmente a variaciones en el color
de los frutos. La diferenciación de cloroplastos en cromoplastos conlleva una serie de
cambios bioquímicos que culminan con la acumulación de carotenoides, tales como
licopenos y capsantina entre otros. Estas modificaciones son aparentes a nivel de
coloración ya que van desde el verde característico de las clorofilas hasta el amarillento
o rojizo de los carotenoides (Bouvier et al., 1998).
Los cambios en el aroma de los frutos maduros se deben a la producción de
compuestos volátiles (aldehídos, ésteres, cetonas, terpenoides, compuestos azufrados)
que se forman al romperse las células (Csoka et al., 2013).
El sabor que se percibe de las frutas se ha descrito como la sensación
procedente de la interacción entre gusto, aroma, tacto en boca, vista y sonido (Luning
et al., 1994). El sabor puede variar en función del contenido de ácidos y azúcares.
Cuando un fruto alcanza la madurez el almidón se transforma en azúcares simples y al
mismo tiempo se van acumulando los ácidos orgánicos. Además se produce un
aumento de los compuestos fenólicos que provocan el amargor o la astringencia de los
Introducción general
11
frutos. La función de los compuestos fenólicos es contrarrestar la peroxidación de los
lípidos que se produce a medida que maduran los frutos (Namiki, 1990).
A nivel celular, durante la maduración, también se produce un deterioro
oxidativo del metabolismo debido al aumento de las especies de oxígeno reactivo que
causan daños en membranas (peroxidación lipídica), proteínas y mutaciones en el DNA
(Halliwell and Gutteridge, 2000; Jiménez et al., 2002). Terminada la fase de
maduración, el fruto pierde su turgencia, aumenta su sensibilidad a las condiciones del
medio, pierde el control metabólico e inicia su senescencia.
2.3 Tipos de frutos en función de su maduración
El inicio y el progreso de la maduración es un fenómeno sumamente complejo que
depende de muchos factores como el tipo de fruta y la actuación de las fitohormonas,
principalmente el etileno, y de factores externos como luz, temperatura, y elementos
bióticos (Bapat et al., 2010).
El etileno es una fitohormona que juega un papel crucial en el desarrollo y en la
respuesta de las plantas al medio ambiente (Cara and Giovannoni, 2008). En función
de la respuesta de los frutos al etileno se pueden clasificar en climatéricos y en no
climatéricos.
Los frutos climatéricos son aquellos en los que se produce un aumento en la
síntesis de etileno, que controla la tasa respiratoria y hace que ésta aumente. Los frutos
no climatéricos, son independientes de dicha producción de etileno y por tanto la
respiración se mantiene invariable (Palma et al., 2011b).
Los factores medioambientales a los que los frutos están expuestos durante el
transporte, almacenaje y manejo postcosecha influyen fuertemente en la biosíntesis del
etileno. Algunos ejemplos de frutos climatéricos son: manzana, plátano, pera, melón,
melocotón, kiwi, tomate, ciruela, etc y ejemplos de frutos no climatéricos son: naranja,
limón, pepino, cereza, aceituna, uva, fresa y pimiento, entre otros. En la Figura 2 se
muestran algunos ejemplos de frutos climatéricos y no climatéricos.
Introducción general
12
Figura 2: Frutos climatéricos y no climatéricos de interés nutricional (Palma et al., 2011b).
Este comportamiento es independiente de cada especie, y no está asociado con la
clasificación taxonómica. De ahí que especies de la misma familia, como por ejemplo
el pimiento y el tomate (ambos solanáceas), presenten una respuesta distinta al etileno
(Palma et al., 2011b).
No obstante, tanto frutos climatéricos como frutos no climatéricos comparten los
principales aspectos del proceso de maduración, que incluyen cambios de color,
alteración del metabolismo del azúcar, cambios en la textura y síntesis de compuestos
volátiles que los hacen susceptibles a patógenos (Cara and Giovannoni, 2008).
2.4 Particularidades en la maduración del fruto de pimiento ¿climatérico o no?
Existe un grupo de compuestos fenólicos que son característicos de los frutos del género
Capsicum, que son la capsaicina y sus productos derivados que se conocen con el
nombre de capsaicinoides (Estrada et al., 2001), siendo fundamentalmente la
capsaicina el compuesto responsable de la acrimonia del fruto de pimiento. Durante la
maduración, las concentraciones de capsaicina alcanzan un máximo hasta llegar a un
punto en el que son degradados en sus productos secundarios mediante la acción de la
peroxidasas (Sung et al., 2005). Tradicionalmente los pimientos han sido considerados
Introducción general
13
como frutos no climatéricos basándose en su comportamiento frente a esta hormona. No
obstante se ha descrito que en determinados cultivares el etileno interno era capaz de
iniciar la maduración de los frutos, lo que traslada la cuestión de climatérico vs no
climatérico a los niveles de etileno que propician la respuesta de maduración (Gross et
al., 1986; Biles et al., 1993; Tan et al., 2012).
3.- METABOLISMO DE LAS ESPECIES DE OXIGENO REACTIVO Y LOS
SISTEMAS ANTIOXIDANTES
3.1 Especies de oxígeno reactivo (Reactive oxygen species; ROS) La aparición del oxígeno en nuestro planeta data de aproximadamente 2.700 millones
de años y aparece como un producto de la fotosíntesis de las cianobacterias. Todos los
organismos aerobios eucariotas necesitan O2 para producir energía en las mitocondrias.
Sin embargo, la necesidad del O2 choca con el hecho de que se trata de un gas que
puede llegar a ser tóxico y mutagénico (Halliwell, 2006). La toxicidad del oxígeno es
debida a la producción de especies de oxígeno reactivo (ROS, en inglés reactive oxygen
species), que se pueden producir durante la actividad metabólica normal de la célula o
como consecuencia de distintas perturbaciones medioambientales y que reaccionan con
todo tipo de biomoléculas (Bartosz, 1997; Scandalios, 2005b).
Figura 3: Formación de especies de
oxígeno reactivo (ROS) durante la
reducción del O2 a H2O2 (Salin,
1988).
Las especies de oxígeno reactivo son tanto los intermediarios de la reducción del
oxígeno molecular a agua, como su forma excitada, el oxígeno singlete (1O2)
(Scandalios, 2005b); Halliwell, 2007. La reducción completa del O2 a agua, requiere
cuatro electrones y en ella los intermediarios son: el radical libre superóxido (O2•−
), el
peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical libre hidroxilo (·OH) (Fig. 3). . Un radical
libre es una molécula que tiene un electrón desapareado en su orbital externo (Halliwell
and Gutteridge, 2000).
Introducción general
14
El radical superóxido se produce por la reducción del oxígeno con un sólo electrón
(Halliwell and Gutteridge, 2000). Es inestable en solución acuosa y más estable en
disolventes orgánicos. Tiene una vida media de milisegundos (Donelly and Robinson,
1995).
El peróxido de hidrógeno es de todas las ROS el más estable en solución y tiene
una vida media relativamente alta. El H2O2 puede comportarse como oxidante o reductor
y tiene baja capacidad para reaccionar con la mayoría de las moléculas orgánicas si no
existen catalizadores metálicos (Karpinski et al., 1997; Dat et al., 2000; Halliwell and
Gutteridge, 2000).
El radical hidroxilo es considerado el oxidante más potente de todas las ROS.
Tiene una vida media muy corta, de nanosegundos (Halliwell and Gutteridge, 2000).
Uno de los efectos más tóxicos del radical O2•−
surge cuando éste reacciona con el H2O2
en presencia de metales como Fe y Cu, llevándose a cabo la reacción de Haber-Weiss
catalizada por metales (Fe3+
/Cu2+
) que conlleva la producción del radical ·OH (Fig. 4).
Figura 4: Formación de radicales ·OH por la reacción de Haber-Weiss.
El oxígeno singlete es la forma excitada del oxígeno no radical y se trata de una
especie muy reactiva. La excitación del oxígeno ocurre en algunos compuestos como las
clorofilas, que son iluminados a una determinada longitud de onda, produciendo
reacciones de fotosensibilización. Esta energía de excitación se transmite al O2,
formándose el 1O2 (Lledías et al., 1998; Halliwell and Gutteridge, 2000).
Las ROS fueron consideradas en principio solamente como elementos tóxicos
del oxígeno; sin embargo a día de hoy se sabe que, en bajas concentraciones, estas
especies reactivas juegan un papel central en procesos de señalización, esenciales en la
célula (Scandalios, 2005b).
Introducción general
15
3.1.1 Estrés oxidativo
En condiciones normales las ROS son eliminadas por las distintas defensas
antioxidantes (Alscher et al., 1997). El equilibrio entre la producción y la eliminación
de ROS puede ser alterado por un gran número de factores adversos medioambientales,
bióticos y abióticos lo que resultaría en un rápido aumento de los niveles celulares de
ROS (Elstner, 1991; Apel and Hirt, 2004). Un exceso de ROS en relación con los
antioxidantes es lo que se conoce como estrés oxidativo (Halliwell, 2006). El daño
oxidativo está relacionado con la elevada reactividad del oxígeno molecular y sus
intermediarios que pueden causar daños en las proteínas, los lípidos y el DNA
(Ludovico and Burhans, 2013).
3.1.2 Producción de ROS en plantas Existen muchas fuentes potenciales de ROS en plantas. En condiciones normales se
producen constantemente como subproductos de las rutas metabólicas localizadas en los
distintos compartimentos subcelulares, principalmente a nivel de cloroplastos,
mitocondrias y peroxisomas (Tabla 3). Pero las ROS también se pueden producir como
respuesta a los distintos tipos de estreses a los que se pueden someter las plantas, tales
como sequía, salinidad, alta y baja temperatura, metales pesados, contaminantes
atmosféricos, ataque de patógenos, etc. (Dat et al., 2000; Mittler, 2002).
Tabla 3: Producción de ROS en plantas.
ROS Localización Producción Referencias
O2•− Mitocondrias Cadena de transporte electrónico
(complejo I y III) (Moller, 2001; Bailly, 2004)
Cloroplastos Fotosistemas I y II (Salin, 1988; Asada, 1999, 2006)
Peroxisomas Matriz peroxisomal
Cadena de transporte electrónico
dependiente de NADH en la membrana
peroxisomal
Xantina oxidasa
(del Río et al., 1992; López-Huertas
et al., 1999; Mittler, 2002; Palma et
al., 2002; Corpas et al., 2008b)
Membrana Plasmática NADPH oxidasa (HammondKosack and Jones, 1996;
Grant and Loake, 2000; Sagi and
Fluhr, 2006)
Pared celular Peroxidasas, Mn2+
, NADH (HammondKosack and Jones, 1996;
Grant and Loake, 2000)
H2O2 Peroxisomas Glicolato oxidasa
-oxidación de ácidos grasos (Palma et al., 1991; Corpas et al.,
2001; Sandalio et al., 2013)
Apoplasto Oxalato oxidasa
Amina oxidasa (Dat et al., 2000)
(Allan and Fluhr, 1997)
Pared celular Peroxidasas, Mn2+
, NADH (HammondKosack and Jones, 1996;
Grant and Loake, 2000) 1O2 Cloroplastos Clorofila excitada (Asada and Takahashi, 1987; Asada,
2006)
Introducción general
16
3.2 Sistemas antioxidantes de plantas Debido a que las ROS causan daños en proteínas, lípidos y DNA, su producción y
eliminación debe estar estrictamente controlada. Todos los compartimentos celulares,
por tanto, han de tener mecanismos para prevenir y reparar los daños causados por
dichas especies (Moller, 2001). Los organismos aerobios sobreviven gracias a que han
desarrollado defensas antioxidantes capaces de eliminar las ROS de manera directa o
indirecta (Halliwell, 2006).
3.2.1 Antioxidantes no enzimáticos
3.2.1.1 El ácido ascórbico es el antioxidante más abundante en las células de las
plantas. El ácido ascórbico se denomina también vitamina C y se trata de un nutriente
esencial en la dieta de los humanos, quienes no pueden sintetizarlo (Ohta and
Nishikimi, 1999; Palma et al., 2009a; Alos et al., 2013). El ácido ascórbico está
presente prácticamente en todos los compartimentos celulares incluida la pared celular
(Noctor and Foyer, 1998; Asada, 1999; Foyer and Noctor, 2011). Participa en una
gran cantidad de procesos celulares como la fotosíntesis, la fotoprotección, el
crecimiento de la pared celular, la expansión celular, la resistencia a estreses
medioambientales y la síntesis de etileno, giberelinas, antocianinas e hidroxiprolina,
entre otras. A pesar de sus múltiples funciones y de que es la principal fuente de
vitamina C en humanos, se sabe muy poco de su metabolismo en plantas (Smirnoff and
Wheeler, 2000).
En animales ya se demostró que el AsA era sintetizado a partir de la D-glucosa y
transformado a L-gulono-1,4-lactona (L-GulL), siendo los intermediarios el ácido D-
glucurónico (GlucA) y el L-gulonato. Finalmente, la L-GulL es oxidada a AsA
mediante la L-gulono-1,4-lactona oxidasa (Burns and Mosbach, 1956; Agius et al.,
2003; Gallie, 2013). Los humanos no podemos sintetizar el AsA debido a una mutación
en el gen de la L-gulono-1,4-lactona oxidasa y tenemos que obtener la vitamina C a
través de la ingestión regular de frutas y vegetales (Nishikimi et al., 1994).
En plantas se han descrito varias posibles vías para la síntesis del AsA. De todas
ellas la principal es la ruta de Smirnoff-Wheeler (Wheeler et al., 1998; Ishikawa et al.,
2008; Linster and Clarke, 2008) que está considerada como la ruta esencial para la
Introducción general
17
síntesis de novo del AsA y que conlleva la conversión de la manosa en AsA mediante
una serie de intermediarios de la L-galactosa (Wheeler et al., 1998). Otras rutas son las
llevadas a cabo a partir de la L-gulosa (Wolucka and Van Montagu, 2003), del D-
galacturónico (D-GalA) (Agius et al., 2003) y a partir de mio-inositol (Lorence et al.,
2004; Ren et al., 2013).
3.2.1.2 El glutatión (GSH) es el compuesto tiólico de bajo peso molecular no proteico
más abundante distribuido principalmente en las células eucarióticas. Se trata de un
tripéptido formado por glutamato (Glu), cisteína (Cys) y glicina (Gly). La presencia de
la cisteína, la reactividad química y la elevada solubilidad en agua del grupo tiol del
GSH es lo que le confiere sus propiedades y hace de él un metabolito crucial para
muchas funciones importantes tales como crecimiento, desarrollo y respuesta frente a
las fluctuaciones medioambientales (Gill et al., 2013). Lo que comúnmente se conoce
como glutatión (GSH o -glutamil-L-cisteínglicina) es el glutatión reducido que
constituye, por lo general, el 90% del glutatión total presente en las células. El GSH
puede oxidarse a disulfuro de glutatión (GSSG) que a su vez se puede reducir por la
glutatión reductasa a expensas de NADPH y formar de nuevo GSH (Li et al., 2004).
El glutatión está implicado en muchos procesos fisiológicos siendo su principal
función la de actuar como antioxidante en la eliminación de ROS. En dicho papel
participa junto al ascorbato en el ciclo ascorbato-glutatión para eliminar el H2O2
intracelular (Creissen et al., 1992; Wingsle and Karpinski, 1996) y además reacciona
con el 1O2 y con los radicales ·OH
protegiendo a los grupos tioles de las proteínas
(Lascano et al., 1998; Gechev et al., 2002). Algunos de los procesos en los que el
glutatión se ve involucrado son la destoxificación de xenobióticos, prevención de la
peroxidación lipídica y la regulación de la expresión de genes relacionados con la
respuesta a estrés medioambiental y al ataque por patógenos (Meister and Anderson,
1983; Alscher, 1989; Creissen et al., 1992). A nivel ultraestructural, el glutatión se
ubica en la mayor parte de los compartimentos celulares (citosol, cloroplasto,
mitocondria, nucleo y peroxisoma) pero también se ha localizado en el apoplasto
(Noctor and Foyer, 1998; Asada, 1999; Muller et al., 2004; Tausz et al., 2004; Foyer
and Noctor, 2005; Zechmann et al., 2008; Fernández-García et al., 2009).
Introducción general
18
3.2.1.3 Los carotenoides, término en el que se agrupan carotenos y xantofilas, son
moléculas liposolubles sintetizadas por plantas y por microrganismos. Los carotenoides
actúan como antioxidantes y además son los precursores de un macronutriente esencial,
el retinol o vitamina A (Collins, 2001). En las plantas, a nivel subcelular se localizan en
las membranas tilacoidales. A medida que los cloroplastos se transforman en
cromoplastos se produce una disminución de la clorofila y un aumento de los
carotenoides, quienes dan un color rojizo o amarillento a hojas, frutos y flores. En
plantas estos pigmentos coloreados atraen a los animales polinizadores y “avisan” de
que las frutas están maduras. Los carotenoides junto con el ascorbato protegen a las
membranas fotosintéticas del estrés oxidativo (Hormaetxe et al., 2004).
3.2.1.4 Los flavonoides, con más de 4.000 componentes, son los polifenoles más
abundantes presentes en la dieta. Debido a su capacidad antioxidante, se trata de
compuestos bioactivos que ayudan a tener una buena salud y que protegen de la
aparición de enfermedades crónicas (Birt and Jeffery, 2013). En plantas desempeñan
importantes funciones no sólo como pigmentos, sino también como bactericidas,
(Yamaguchi et al., 2005). Existen numerosos estudios que demuestran que los
flavonoides ayudan en la eliminación de ROS, protegiendo a las plantas de la acción de
numerosos tipos de estrés. A nivel subcelular se localizan principalmente en vacuolas y
cloroplastos (Yamasaki et al., 1997).
3.2.2 Antioxidantes enzimáticos 3.2.2.1 Las superóxido dismutasas (SOD; EC 1.15.1.1) son una clase de
metaloenzimas cuya naturaleza depende del metal situado en el sitio activo de la
proteína. En plantas se han descrito tres tipos de SODs: cuprozinc, ferro y manganeso
SOD (Fridovich, 1986; Rodríguez-Serrano et al., 2007; Palma et al., 2013). La
función principal de estas enzimas es el desproporcionamiento del radical superóxido
(McCord and Fridovich, 1969; Bannister et al., 1987; Halliwell and Gutteridge,
2007).
Introducción general
19
Figura 5: Reacción catalizada por la superóxido dismutasa.
El número y tipo de isoformas de SODs varían en función de la especie, del
órgano, del crecimiento y de las condiciones medioambientales (Corpas et al., 2006b).
La sobreexpresión de SOD está normalmente relacionada con la defensa de las plantas
frente al estrés oxidativo generado bajo condiciones de estrés biótico y abiótico (Gill
and Tuteja, 2010; Fernández-Ocaña et al., 2011).
Tanto las CuZn- como la Fe-SODs son, por lo general, proteínas
homodiméricas, mientras que la Mn-SOD es una proteína homotetramérica. La
identificación del tipo de las distintas isoenzimas se realiza mediante electroforesis en
geles de poliacrilamida en condiciones nativas y tinción específica de los geles en
presencia y ausencia de inhibidores específicos. De este modo, las CuZn-SODs son
inactivadas por el cianuro y por el H2O2, las Fe-SODs sólo por el H2O2 y las Mn-SODs
no se afectan por ninguno de los dos (del Río et al., 1992; Palma et al., 1997; Asada,
2006; Rodríguez-Serrano et al., 2007). En la Tabla 4 se indican algunas de las
características de las SODs descritas en plantas hasta la fecha.
Tabla 4: Tipos de isoenzimas de SOD y localización (Palma et al., 2013).
Tipo de isoenzima Tamaño (kDa) Localización
subcelular
Inhibidores
CuZn-SOD 32 Cloroplastos (estroma y tilacoides),
citosol, núcleo, apoplasto y peroxisomas
Cianuro y H2O2
Fe-SOD 23-36
Cloroplastos (estroma y tilacoides),
mitocondrias y peroxisomas
H2O2
Mn-SOD 90-100 Mitocondrias y peroxisomas -
3.2.2.2 La catalasa (CAT; EC 1.11.1.6) es una hemoproteína tetramérica cuyas
subunidades tienen un tamaño comprendido entre 55 y 59 kDa y cuya estructura
cuaternaria oscila entre 220 y 240 kDa (Corpas et al., 1999; M. and Gerhardt 2002;
Palma et al., 2013). A nivel subcelular, la catalasa se localiza en los peroxisomas y, de
hecho, es utilizada como marcador de estos orgánulos (M. and Gerhardt 2002; del Río
Introducción general
20
et al., 2006). Los polipéptidos de la catalasa están codificados en el núcleo y son
dirigidos de manera post-traduccional a los peroxisomas (Purdue and Lazarow, 2001;
Baker and Graham, 2002). El principal papel de la catalasa es la eliminación del H2O2
que es generado en dichos orgánulos como consecuencia de su propio metabolismo o el
que se acumula en ellos, derivados de otros orgánulos (Dat et al., 2001; Halliwell and
Gutteridge, 2007). Se ha demostrado que la catalasa tiene una doble función,
principalmente, eliminando los elevados niveles de H2O2 que se producen en
situaciones de estrés (Scandalios, 2005a) y en procesos de señalización controlando los
niveles de H2O2 (Palma et al., 2013).
3.2.2.3 Las enzimas del ciclo ascorbato-glutatión (CAG), también denominado ciclo
de Foyer-Halliwell-Asada, constituyen el principal sistema antioxidante, exclusivo de
plantas, para mantener los niveles de H2O2 controlados, especialmente en los
compartimentos celulares en los que se produce este metabolito y no existe catalasa,
como son los cloroplastos y el citosol (Doulis et al., 1998; Halliwell and Gutteridge,
2000). La primera enzima antioxidante del ciclo ascorbato-glutatión es la ascorbato
peroxidasa (APX), y además existen tres etapas enzimáticas adicionales catalizadas
sucesivamente por la monodeshidroascorbato reductasa (MDAR), la deshidroascorbato
reductasa (DAR) y la glutatión reductasa (GR). En el ciclo participan también el
ascorbato y el glutatión que, cuando se oxidan, se transforman en
monodeshidroascorbato (MDA) y deshidroascorbato (DA), y glutatión oxidado
(GSSG), respectivamente. Para el funcionamiento del ciclo es necesaria la presencia de
NADPH, un coenzima ubicuo de naturaleza nucleotídica que, por su potencial redox,
tiene capacidad reductora (Halliwell and Foyer, 1976; Asada and Badger, 1984; Foyer
et al., 1997). En la Figura 5 se muestra un esquema del CAG.
Introducción general
21
Figura 6: Ciclo ascorbato-glutation (Palma et al., 2011c). APX, ascorbato peroxidasa; MDAR,
monodeshidroascorbato reductasa; DAR, deshidroascorbato reductasa; GR, glutatión reductasa.
La ascorbato peroxidasa (APX; EC 1.11.1.11) es una enzima hemínica que
lleva a cabo la primera reacción del CAG y reduce el H2O2 a H2O empleando el
ascorbato como sustrato reductor, el cual se oxida a monodeshidroascorbato (MDA). La
APX es una familia de isoenzimas cuyo número y distribución varían en función de la
especie vegetal. A nivel subcelular, en plantas superiores, se han descrito en citosol,
cloroplastos (estroma y tilacoides), mitocondria y peroxisomas (Bunkelmann and
Trelease, 1996; Shigeoka et al., 2002; del Río et al., 2003a; Palma et al., 2013).
Aunque esta proteína ha destacado en procesos relacionados con estrés
fotooxidativo o de alta temperatura, también se ha descrito su relevancia frente a
procesos de estrés mediados por metales pesados tales como cadmio, plomo, mercurio,
etc. o metaloides como el arsénico (Karpinski et al., 1997; Yabuta et al., 2002; Ball et
al., 2004; Kangasjarvi et al., 2008; Koussevitzky et al., 2008; Palma et al., 2013).
La monodeshidroascorbato reductasa (MDAR; EC 1.6.5.4) cataliza la
reducción de MDA a ascorbato usando NAD(P)H como donador de electrones (Asada
Introducción general
22
and Takahashi, 1987). La MDAR es una enzima que contiene un grupo tiol en el sitio
catalítico. A nivel subcelular ha sido detectada en distintos compartimentos celulares,
como cloroplastos (Hossain et al., 1984) mitocondrias y peroxisomas (Jiménez et al.,
1997; López-Huertas et al., 1999; Mittova et al., 2003; Leterrier et al., 2005;
Lisenbee et al., 2005; Gest et al., 2013) y citosol (Dalton et al., 1993). Se ha
demostrado que la MDHA se activa bajo condiciones de estrés. En el caso de guisante,
esta enzima aumenta su actividad en respuesta a alta intensidad lumínica y a metales
pesados (Leterrier et al., 2005) así como a radiación UV-B (Kubo et al., 1999; Shin et
al., 2013).
La deshidroascorbato reductasa (DAR; EC 1.8.5.1) es una enzima clave en el
ciclo ASC-GSH ya que mantiene los niveles adecuados de ascorbato y actúa como
antioxidante (Tang and Yang, 2013). Esta enzima cataliza la reducción divalente del
deshidroascorbato (DHA) a ascorbato (ASC) empleando para ello el glutatión reducido
(GSH) (Hossain and Asada, 1984). Se ha descrito la activación de esta enzima en
respuesta a varios tipos de estrés, tales como salinidad, sequía, ozono, etc.(Shin et al.,
2013). A nivel subcelular, además de la localización en cloroplastos, mitocondrias y
peroxisomas (ver referencias anteriores de las enzimas del ciclo), existen evidencias de
la presencia de una isoenzima citoplasmática de DAR en arroz (Kim et al., 2013).
La glutation reductasa (GR; 1.6.4.2) es una flavoproteína que cataliza la
reducción del glutatión oxidado (GSSG) a glutatión reducido (GSH), utilizando
NADPH como donador de electrones (Halliwell and Gutteridge, 2007). A nivel
subcelular, la GR se localiza en cloroplastos, citosol, mitocondrias y peroxisomas
(Jiménez et al., 1997; Ashraf, 2009; Anjum et al., 2010). En la mayoría de las plantas
la GR es un homodímero con un peso molecular que oscila entre los 100 y los 150 kDa
y contienen un FAD por monómero (Romero-Puertas et al., 2006; Gill et al., 2013).
Como componente del ciclo ASC-GSH, la GR juega un importante papel en la
destoxificación de ROS y en la tolerancia frente a determinados tipos de estrés, tales
como, salinidad, sequía y otros (Hasanuzzaman et al., 2012; Gill et al., 2013).
3.2.2.4 Deshidrogenasas dependientes de NADP+
El NADPH, como donador de electrones, es una molécula clave en el estrés oxidativo,
durante el cual es producido por varias deshidrogenasas dependientes de NADP, y
Introducción general
23
normalmente citosólicas, aunque también se han descrito e otros compartimentos
celulares (Corpas and Trelease, 1997; Corpas et al., 1998; Mateos et al., 2009; Li et
al., 2013a). Dentro de este grupo se encuentran las enzimas que forman parte del ciclo
de las pentosas fosfato, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y la 6-fosfogluconato
deshidrogenasa, así como la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP (NADP-
ICDH; EC 1.1.1.42) y la enzima málico dependiente de NADP (NADP-EM; 1.1.1.40).
En cloroplastos, existe una potente fuente adicional de NADPH que es la ferredoxina
NADP reductasa del fotosistema I, que suele ser la que contribuye en mayor proporción
al contenido celular de NADPH en tejidos fotosintéticos durante la fase luminosa
(Carrillo et al., 1981).
La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH; EC 1.1.1.49) es la primera
enzima implicada en la ruta de las pentosas fosfato, que reduciendo NADP a NADPH,
cataliza la oxidación de la glucosa 6-fosfato a 6-fosfogluconato, metabolito que es
oxidado por la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (E.C 1.1.1.44) hasta ribulosa-5-
fosfato, utilizando también NADP (Corpas and Trelease, 1997).
La isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP cataliza la conversión
reversible de isocitrato a 2-oxoglutarato y CO2 con la producción del coenzima reducido
NADPH (Gálvez and Gadal, 1995). La NADP-ICDH pertenece a un grupo con
múltiples isoenzimas cuyos miembros se localizan a nivel de citosol, mitocondrias,
plastidios y peroxisomas (Corpas et al., 1998; Gálvez et al., 1999).
La enzima málico dependiente de NADP es una enzima ampliamente
distribuida relacionada con distintas rutas metabólicas tanto en procariotas como en
eucariotas. En la reacción que cataliza esta enzima el malato es oxidado a piruvato y
CO2, mientras que el NADP+ es reducido a NADPH. Dentro de sus funciones hay que
destacar su importante papel en la fotosíntesis de algunas plantas en la que la enzima
málico es la principal enzima que dona CO2 a la Rubisco del ciclo de Calvin (Pengelly
et al., 2012; Saigo et al., 2013). A nivel subcelular se localiza principalmente en
cloroplastos (Drincovich et al., 2001), citosol y mitocondrias (Davies and Patil, 1974).
Introducción general
24
4.- METABOLISMO DE LAS ESPECIES DE NITRÓGENO REACTIVO
4.1 El óxido nítrico (NO), origen e historia La importancia de los óxidos de nitrógeno [óxido nítrico, (NO) y dióxido de nitrógeno
(NO2)] es debida fundamentalmente a su relación con la polución del aire, ya que, junto
con otros factores, son los causantes de la lluvia ácida y de la destrucción de la capa de
ozono, provocando, por tanto, efectos nocivos sobre la salud pública (Corpas et al.,
2011). En 1960, Fewson & Nicholas publicaron un breve artículo sobre cómo los
microorganismos y las plantas podían usar el NO como un intermediario del
metabolismo del nitrógeno (Fewson and Nicholas, 1960). En 1979, Klepper descubrió
que las plantas, bajo determinadas condiciones, podían generar esta molécula y emitirla
a la atmósfera (Klepper, 1979). En 1987, el NO fue identificado de manera separada
por dos grupos de investigadores diferentes y fue identificado en ser el compuesto
previamente designado como factor de relajación endotelial (EDRF) (Ignarro et al.,
1987; Palmer et al., 1987). Fueron dichos descubrimientos por los que estos autores
obtuvieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1998.
En 1992, el NO fue calificado como la molécula del año por la revista Science
(Koshland, 1992), y en 1996, Leshem aportó datos sobre la función del NO en los
sistemas vegetales (Leshem, 1996). En el año 1998 aparecieron dos publicaciones que
describían su participación como señal de defensa en plantas tanto a nivel intra- como
intercelular (Delledonne et al., 1998; Durner et al., 1998), y de ahí hasta al día de hoy
se han publicado miles de artículos sobre la importancia de dicha molécula en la
biología celular (del Río et al., 2004; Corpas et al., 2009d; Wendehenne and Hancock,
2011).
El óxido nítrico o monóxido de nitrógeno (NO) es un gas inorgánico, incoloro,
de pequeño tamaño, considerado como una molécula de tipo radical libre debido a que
presenta en el átomo de nigrógeno un electrón desapareado en su orbital π externo, lo
cual explica su elevada reactividad. Es inestable en medio acuoso y en presencia de
oxígeno se oxida a nitritos y nitratos que son sus metabolitos más estables. El NO
presenta una vida media in vivo relativamente corta, menos de 10 s. Además su
naturaleza lipofílica le permite atravesar las membranas celulares y de esta forma
Introducción general
25
reaccionar con diferentes macromoléculas como proteínas, lípidos o ácidos nucléicos,
entre otras (Corpas et al., 2011).
El NO puede presentarse como tres especies distintas e interconvertibles, ya que
puede adoptar una estructura energéticamente más favorable ganando o perdiendo un
electrón dando como resultado la formación de anión nitroxilo (NO-) o de catión
nitrosonio (NO+), los cuales difieren en sus propiedades físicas y en su reactividad
química (Stamler et al., 1992; Hughes, 1999; Wojtaszek, 2000).
4.2 Principales funciones del NO En los animales, el NO ejerce un importante papel como neurotransmisor y está
relacionado con la regulación de la respuesta inmune, relajación del músculo,
percepción del oxígeno y con la producción de energía mediante respiración (Schmidt
and Walter, 1994; Ignarro, 2000; Hagen et al., 2003; Berchner-Pfannschmidt et al.,
2010). Desde que se descubrió que el NO tenía un importante papel en plantas, a las que
ayudaba frente a la infección por patógenos (Delledonne et al., 1998; Durner et al.,
1998), su función en el desarrollo, metabolismo y respuesta frente a enfermedades ha
sido ampliamente estudiado (Lamattina et al., 2003; Shapiro, 2005; Gupta et al.,
2011). El NO puede ejercer su función de distintas maneras: modulando la expresión de
los genes, mediante la actuación de segundos mensajeros, ó interactuando con proteín
kinasas (Astier and Lindermayr, 2012). Al ser el NO una molécula pequeña, puede
difundir fácilmente a través de las membranas y desencadenar distintos procesos en
cortos periodos de tiempo (Beligni and Lamattina, 2001). Es por esto que se ha
relacionado al NO con múltiples fenómenos en plantas tales como crecimiento y
desarrollo, germinación de semillas, formación de raíces secundarias, floración, cierre
de los estomas, maduración de frutos, senescencia, muerte celular programada (PCD) y
metabolismo de nódulos en leguminosas (Beligni and Lamattina, 2000; Zhang et al.,
2003; Bethke et al., 2004; Corpas et al., 2004; del Río et al., 2004; Shapiro, 2005;
Neill et al., 2008a). Además se ha demostrado la producción de NO en plantas bajo
situaciones de estrés tanto biótico como abiótico (Lamattina et al., 2003; del Río et al.,
2004; Wendehenne et al., 2004; Delledonne, 2005; Shapiro, 2005; Corpas et al.,
2007; Valderrama et al., 2007).
Introducción general
26
La influencia del NO sobre el metabolismo de las plantas ha sido ampliamente
estudiada mediante la incorporación de donadores de NO exógenos en diferentes
concentraciones. El nitroprusiato sódico (SNP) es el donante de NO más usado debido a
que su coste es relativamente bajo (Floryszak-Wieczorek et al., 2006; Ederli et al.,
2009) y a que su aplicación está bien documentada (Zandonadi et al., 2010; Filippou
et al., 2013). Aunque hay otros donadores como los NONOatos o el propio S-
nitrosoglutation (GSNO) que proporcionan la generación de NO de una forma más
controlada.
Dependiendo de su concentración en la célula el NO puede actuar como
antioxidante o como prooxidante. Hay estudios que indican que el NO es una molécula
inductora de estrés (Leshem et al., 1997), mientras que otros describen al NO de una
capacidad protectora (Beligni and Lamattina, 1999b), funcionando como antioxidante
y eliminando las ROS (Filippou et al., 2013). De hecho, se ha descrito cómo la
combinación del NO con las ROS puede ejercer sobre las células un papel tóxico o
protector en función de las circunstancias (Beligni and Lamattina, 1999a). No
obstante, esta función antioxidante es todavía debatida, ya que la reacción del NO con
radicales superóxido genera el ión peroxinitrito (ONOO-), una especie que tiene mucha
mayor reactividad que las moléculas de las que procede (ver más adelante).
4. 3 Producción de NO en plantas En animales se ha identificado la fuente endógena de NO. Se trata de una enzima
designada como óxido nítrico sintasa (NOS) (EC 1.14.13.39) y que genera NO y
citrulina a partir del amino ácido L-arginina (Moncada et al., 1989). Esta formación de
NO requiere NADPH como donador de electrones y O2 como cosustrato (Griffith and
Stuehr, 1995). Los cofactores de esta reacción son FMN, FAD, y tetrahidrobiopterina
(BH4). Existes tres isoformas de NOS, las isoformas de NOS neuronal y endotelial son
constitutivas (nNOSn y eNOS, respectivamente) pues dependen de Ca2+
y calmodulina,
mientras que la isoforma inducible (iNOS) es independiente de calcio (Beligni and
Lamattina, 2001).
Las plantas pueden generar NO por mecanismos enzimáticos y no enzimáticos;
además se han descrito otras dos enzimas necesarias en el control y eliminación del NO
(Gupta et al., 2011; Astier and Lindermayr, 2012) (ver más abajo).
Introducción general
27
En plantas, se ha demostrado la generación enzimática de NO dependiente de
la L-arginina similar a la NOS animal en diferentes especies, aunque no se ha
descubierto el gen que la codifica (Corpas et al., 2009d). Se ha descrito una actividad
tipo NOS en peroxisomas y cloroplastos de plantas (Barroso et al., 1999; Jasid et al.,
2006). En este proceso la L-arginina actúa como substrato y el NADPH actúa como
donador de electrones. Numerosos estudios relacionan la participación de una actividad-
tipo NOS con varios procesos tales como germinación de semillas, la muerte celular
programada, cierre de estomas, desarrollo de raíces y en respuestas a estreses de tipo
bióticos y abióticos (Delledonne et al., 1998; Bright et al., 2006; Besson-Bard et al.,
2009; De Michele et al., 2009; Corpas et al., 2011). También se ha descrito la
producción de NO mediada por poliaminas (Tun et al., 2006) en respuesta a
determinados tipos de estrés y por hidroxilaminas mediada por ROS (Rumer et al.,
2009).
Además se han descrito otros posibles mecanismos enzimáticos de producción de
NO en distintos compartimentos celulares de las células de las plantas (Figura 6). En el
citosol, la nitrato reductasa (NR) reduce el nitrato a nitrito quien posteriormente
producirá NO, en dos reacciones en las que el NADH es el donador de electrones (Lillo
et al., 2004; Gupta et al., 2011). Otra posible fuente enzimática de NO descrita en
plantas es la nitrito-óxido nítrico reductasa (Ni-NOR), que es una enzima unida a la
membrana plasmática de la raíz de tabaco y que cataliza la reducción de nitrito a NO,
usando el citocromo c como donador de electrones (Stohr and Ullrich, 2002; Stohr and
Stremlau, 2006). La reducción del nitrito en la membrana interna de las mitocondrias
da también como resultado la producción de NO (Stoimenova et al., 2007; Gupta et
al., 2011).
Introducción general
28
Figura 7: Síntesis y eliminación de NO en las células de las plantas. (Modificado de Gupta et al., 2011).
Ni-NOR: nitrito-óxido nítrico reductasa. NOS: óxido nítrico sintasa. NR: nitrato reductasa. NiR: nitrito
reductasa. GSNOR: nitrosoglutatión reductasa. Hb: hemoglobinas vegetales
4. 4 Control y eliminación del NO
El NO puede ser eliminado tanto por mecanismos enzimáticos como por mecanismos
no enzimáticos (Baudouin, 2011). En plantas, como en otros organismos, el S-
nitrosoglutatión (GSNO) es considerado como un reservorio de NO y sus niveles son
Membrana plasma tica
Citosol NR
Peroxisomas
Tipo-NOS
Cloroplastos
Tipo-NOS
Ni-NOR
Mitocondria
NiR
Pared celular
NO
NO
GSNOR
Hb
Introducción general
29
controlados por la S-nitrosoglutatión reductasa (GSNOR), también conocida como
alcohol deshidrogenasa de clase III o formaldehido deshidrogenasa dependiente de
glutatión (FALDH) (Dolferus et al., 1997; Liu et al., 2001; Sakamoto et al., 2002).
Esta enzima cataliza la reducción del GSNO a GSSG y NH3.
El NO puede interaccionar también con las hemoglobinas vegetales a través de
hierro presente en su grupo hemo. Por ejemplo, las hemoglobinas no simbióticas
(nsHbs) de cebada, alfalfa y Arabidopsis interaccionan con el NO eliminándolo del
medio (Perazzolli et al., 2006; Neill et al., 2008b).
4. 5 Estrés nitrosativo y especies de nitrógeno reactivo (reactive nitrogen species;
RNS)
Se denomina estrés nitrosativo a la sobreproducción no controlada de NO y a sus
moléculas derivadas, lo que conlleva efectos tóxicos en las células (Klatt and Lamas,
2000; Valderrama et al., 2007). El término especies de nitrógeno reactivo (reactive
nitrogen species, RNS) sirve para englobar tanto al NO como a otras moléculas
derivadas como el peroxinitrito (ONOO-), el dióxido de nitrógeno (NO2), el trióxido de
dinitrógeno (N2O3) y los nitrosotioles (SNOs) (Hausladen and Stamler, 1999;
Gutteridge and Halliwell, 2000; Halliwell and Gutteridge, 2007). Las RNS son
altamente reactivas y pueden reaccionar con diferentes macromolélulas como proteínas,
lípidos y DNA, dando lugar a modificaciones químicas que pueden producir
alteraciones de función y/o estructura e incluso muerte celular.
Peroxinitrito (ONOO-)
El peroxinitrito es un potente oxidante que se genera por la reacción no enzimática entre
el NO y el anión superóxido (O2.-). La formación del peroxinitrito depende de las
concentraciones tanto del NO como de radical superóxido y, por lo tanto, está
directamente relacionado con la actividad de la NOS y de la SOD. Así, una vez que el
NO es producido por la NOS, la fracción de NO que forma peroxinitrito depende de la
concentración de superóxido, que a su vez está controlada la SOD según se indica en la
Figura 7 (Squadrito and Pryor, 1998).
Introducción general
30
Figura 8: Regulación de la formación del peroxinitrito por la NOS y la SOD.
El peroxinitrito es un peróxido reactivo de vida corta (menos de 10 ms) con un pKa de
6,8; es un buen agente oxidante y nitrante que además puede dañar las membranas
biológicas. Estas características son las que determinan sus funciones in vivo (Radi,
2013). El peroxinitrito es capaz de interrumpir el metabolismo normal redox y del NO
actuando, por tanto, como un oxidante biológico importante que media en una gran
cantidad de enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas e inflamatorias
(Ferrer-Sueta and Radi, 2009).
El peroxinitrito puede reaccionar con diferentes biomoléculas como aminoácidos
y proteínas modificando su estructura y su función (Alvárez and Radi, 2003). Se ha
demostrado cómo el peroxinitrito nitra los residuos de tirosina de las proteínas bajo
determinadas condiciones fisiológicas (Goldstein and Merenyi, 2008) dando lugar a
nitroproteínas. Actualmente se considera que un incremento en los niveles de
nitrotirosina libre como de proteínas nitratadas podría ser un buen marcador de estrés
nitrosativo (Corpas et al., 2007), de la misma manera que el aumento en la oxidación
de proteínas o de peroxidación lipídica son considerados marcadores de estrés
oxidativo.
S-Nitrosotioles (SNOs) y S-nitrosoglutatión (GSNO)
Los nitrosotioles son compuestos que se forman por la reacción del NO con el grupo
tiol de un residuo de cisteína de un polipéptido, en presencia de oxígeno (Singh et al.,
1996; Foster et al., 2003). Los SNOs tienen varias funciones dentro de las cuales se
incluyen la liberación del NO, la transnitrosación y la S-tiolación (Liu et al., 1998;
Hogg, 2000). Una vez formados los nitrosotioles son muy sensibles a la luz y a los
cambios redox (Astier et al., 2011).
NO + O2
.- ONOO
-
Activada por la NOS
Reprimida por la SOD
Introducción general
31
Dentro de los nitrosotioles hay que destacar al S-nitrosoglutatión (GSNO). El
GSNO se forma por la reacción de S-nitrosilación del NO con el glutatión (GSH) y
tiene un importante papel en animales y plantas en los que actúa como reservorio móvil
de NO. Asimismo, el GSNO puede mediar en rutas de señalización celular mediante
modificaciones post-traduccionales de proteínas (Barroso et al., 2013). La importancia
de esta molécula además proviene de que el GSH es el mayor antioxidante soluble de
bajo peso molecular en plantas (Durner and Klessig, 1999; Foster et al., 2003; Airaki
et al., 2011; Corpas et al., 2013a).
Los niveles de GSNO y, por tanto, de nitrosotioles están determinados por la
actividad de la enzima GSNOR que cataliza su reducción, dependiente de NADH del
GSNO. Se ha demostrado que la GSNOR es imprescindible en levaduras, plantas y
mamíferos para proteger a las células frente al estrés nitrosativo (Valderrama et al.,
2007; Leterrier et al., 2011; Kubienova et al., 2013).
4. 6 Modificaciones postraduccionales mediadas por NO y otras RNS Además de otros mecanismos de señalización, el NO también puede mediar
modificaciones post-traduccionales a través de la nitración (Corpas et al., 2013c), la S-
nitrosilación y la nitrosilación metálica de las proteínas (Astier et al., 2012; Astier and
Lindermayr, 2012).
La nitración consiste en la reacción de un agente nitrante con un residuo de
tirosina de una proteína, por la que se añade un grupo nitro (NO2) en la posición orto del
anillo de un residuo de tirosina (Y), formando 3-nitrotirosina (Schopfer et al., 2003).
Otros aminoácidos como el triptófano (W), la cisteína (C) y la metionina (M) pueden
ser nitrados, aunque este proceso se da preferentemente en las tirosinas (Corpas et al.,
2009b). La nitración es un proceso selectivo que sólo afecta a unas pocas tirosinas
dentro de las proteínas en función de determinados factores como la estructura de la
proteína o su localización (Bartesaghi et al., 2007). La nitración produce cambios
conformacionales, lo que puede implicar tanto la inhibición como la activación de las
proteínas afectadas o, incluso, no provocar efecto (Ischiropoulos, 2003; Bayden et al.,
2011; Astier and Lindermayr, 2012). En otros casos se ha descrito cómo la nitración
de los residuos de tirosina puede prevenir la fosforilación o, por el contrario, aumentar
la fosforilación en las proteínas (Rayala et al., 2007; Shi et al., 2007; Corpas et al.,
Introducción general
32
2009b). Aunque en principio se pensó que esta modificación post-traduccional era
irreversible, existen algunas evidencias de que la desnitración de las proteínas podría
producirse tanto de manera enzimática como no enzimática (Abello et al., 2009;
Vandelle and Delledonne, 2011).
Debido a sus características químicas, el NO puede interaccionar con metales de
transición como Fe, Zn o Cu de metaloproteínas y formar complejos metal-nitrosilo
(Ford, 2010). Se trata en este caso de una reacción reversible que puede alterar la
actividad de las proteínas afectadas (Astier and Lindermayr, 2012; Toledo and
Augusto, 2012).
La S-nitrosilación se refiere a la unión covalente del NO con el grupo tiol de un
residuo de cisteína de una proteína, con la subsiguiente formación de los S-nitrosotioles
(SNOs) (Hess et al., 2005). A pesar de que los residuos de cisteína aparecen en la
mayoría de las proteínas, la S-nitrosilación sólo se da en residuos específicos. Dicha
especificidad parece que puede ser debida, entre otros factores, a que el medio en el que
se encuentra la proteína sea ácido o básico (Seth and Stamler, 2011; Astier and
Lindermayr, 2012).
La S-nitrosilación de proteínas es un mecanismo específico y reversible que
modula distintas funciones biológicas en las células. Además se trata de un proceso que
es altamente sensible a la luz y al estado redox celular y por lo tanto la acción de
distintos agentes reductores como el GSH, el ascorbato, e incluso determinados iones
metálicos reducidos pueden causar la desnitrosilación de las proteínas (Astier et al.,
2011). La desnitrosilación de las proteínas se produce de manera enzimática y no
enzimática (Astier and Lindermayr, 2012). En los últimos años se han descrito varias
desnitrosilasas, es decir, las enzimas que promueven la desnitrosilación de las proteínas,
de las que dos en particular, la GSNOR y las tiorredoxinas, son especialmente
importantes puesto que regulan diferentes procesos de señalización celular protegiendo,
por tanto, frente al estrés nitrosativo (Benhar et al., 2009).
Introducción general
33
5. PEROXISOMAS VEGETALES
5.1 Historia, definición, y tipos de peroxisomas Los peroxisomas fueron descritos por primera vez en 1954 a partir de imágenes de
microscopía electrónica de células renales de ratón (Rhodin, 1954) y, en un principio,
estos orgánulos se designaron como “microcuerpos”, nombre que no hacía alusión a
ninguna de sus funciones bioquímicas (del Río et al., 2002). Más adelante, en los años
60 se llevó a cabo su aislamiento y su caracterización bioquímica por el equipo del
Profesor Christian de Duve (De Duve and Baudhuin, 1966); fueron entonces
designados como “peroxisomas” debido a que sus constituyentes básicos eran flavín
oxidasas productoras de peróxido de hidrógeno y la catalasa que lo descomponía.
Fueron esos descubrimientos los que le valieron a de Duve para obtener el Premio
Nobel de Fisiología y Medicina, junto a Claude y Palade en 1974 (Tolbert and Essner,
1981).
Los peroxisomas son orgánulos subcelulares de pequeño tamaño (0,1-1,7 m )
constituidos por una membrana simple que rodea a una matriz granular o fibrilar y que
en algunas especies presentan inclusiones amorfas o cuerpos cristalinos (nucleoides)
(Tolbert and Essner, 1981; Huang et al., 1983; del Río et al., 2002; del Río, 2011).
Además el número de peroxisomas por célula suele ser bajo (Palma et al., 2009b). A
diferencia de mitocondrias y de cloroplastos estos orgánulos no poseen ADN, ni
ribosomas y sus proteínas son sintetizadas en el núcleo e importadas post-
traduccionalmente a los peroxisomas desde el citosol (Kaur et al., 2009).
El metabolismo peroxisomal se caracteriza por su elevada plasticidad debido a
que su composición enzimática depende no sólo del tipo celular, sino del estado de
desarrollo y de las condiciones medioambientales (Corpas et al., 2009a). Los
peroxisomas se encuentran en casi todas las células eucarióticas y el número de
orgánulos por célula varía en función del tejido y de la especie vegetal (del Río et al.,
2002).
En plantas, se han descrito distintos tipos de peroxisomas atendiendo a sus
funciones metabólicas específicas. Los principales tipos son: peroxisomas de hojas,
glioxisomas, peroxisomas de nódulos de raíz y peroxisomas no especializados (Huang
et al., 1983; Baker and Graham, 2002; Mateos et al., 2003). Los peroxisomas de
Introducción general
34
hojas son orgánulos especializados presentes en los tejidos fotosintéticos en los que se
llevan a cabo algunas reacciones de la fotorrespiración (Tolbert et al., 1987; Douce
and Heldt, 2000; del Río, 2011). Los glioxisomas son peroxisomas especializados que
aparecen en los tejidos de reserva de las semillas oleaginosas, contienen las enzimas
para la -oxidación de los ácidos grasos y del ciclo del glioxilato y convierten los
lípidos de reserva de las semillas en azúcares que son utilizados para la germinación y
para el crecimiento de la planta (Huang et al., 1983; Baker and Graham, 2002; del
Río, 2011). Los peroxisomas de nódulos de raíz se dan en determinadas leguminosas
tropicales que llevan a cabo la biosíntesis de alantoína, que es el mayor metabolito para
el transporte de nitrógeno en estas plantas (Schubert, 1986; del Río, 2011). Sin
embargo, actualmente se tiende a llamarlos a todos de forma genérica como
peroxisomas (Pracharoenwattana and Smith, 2008).
5.2 Principales funciones de los peroxisomas Los peroxisomas intervienen en multitud de procesos cruciales para el desarrollo de las
plantas. Los peroxisomas son el principal orgánulo en las células vegetales donde se
produce la -oxidación de los ácidos grasos, aunque existe datos de una -oxidación
mitocondrial (Masterson and Wood, 2001). Aparte de los productos normales de la -
oxidación de los ácidos grasos, en peroxisomas estos pueden derivar hacia la generación
de fitohormonas: el ácido indolacético (IAA), el ácido salicílico (SA) y el ácido
jasmónico (JA). Asimismo, estos orgánulos juegan un importante papel en la
fotorrespiración, junto con mitocondrias y cloroplastos.
Intervienen también, en otros procesos metabólicos y de señalización, como en
el ciclo del glioxilato, destoxificación de xenobióticos, generación de moléculas señal
(SA), y metabolismo de ureidos, purinas, poliaminas, sulfitos, así como en el
metabolismo de las especies de oxígeno y nitrógeno reactivo (Corpas et al., 2009a; del
Río et al., 2009; Hu et al., 2012; Corpas et al., 2013b). La capacidad de los
peroxisomas para generar moléculas señal supone cambios en el metabolismo celular de
las plantas, relacionados con la respuesta a estrés tanto biótico como abiótico (Huang et
al., 1983; del Río et al., 1998; Corpas et al., 2001). En la Tabla 5 se muestran las
principales funciones de los peroxisomas vegetales.
Introducción general
35
Tabla 5: Principales funciones descritas en peroxisomas de plantas (del Río, 2011).
Función Referencia
Fotorrespiración (Tolbert et al., 1987; Douce and Heldt, 2000)
-oxidación de los ácidos grasos (Baker and Graham, 2002; Baker et al., 2006)
Ciclo del glioxilato (Baker and Graham, 2002; Pracharoenwattana and
Smith, 2008)
Metabolismo de ureidos (Schubert, 1986; Baker and Graham, 2002)
Catabolismo de purinas (Corpas et al., 1993a)
Catabolismo de poliaminas (Kamada-Nobusada et al., 2008; Moschou et al., 2008)
Metabolismo del azufre (Hansch et al., 2006; Lang et al., 2007; Corpas et al.,
2009a)
Metabolismo de las especies de oxígeno y
nitrógeno reactivo (ROS y RNS)
(Corpas et al., 2001; del Río et al., 2002)
Fotomorfogénesis (Hu et al., 2002; Desai and Hu, 2008)
Biosíntesis de fitohormonas (auxinas,
ácido jasmónico y ácido salicílico)
(Baker et al., 2006; Kaur et al., 2009)
Senescencia de hojas (del Río et al., 1998)
Defensa contra patógenos (Koh et al., 2005; Kuzniak and Sklodowska, 2005; Lipka
et al., 2005; Kaur et al., 2009)
5.3 Proteínas peroxisomales Todas las proteínas peroxisomales están codificadas en el núcleo. Dichas
macromoléculas pueden está localizadas en la matriz o estar integradas en la membrana
y en función del tipo siguen distinta ruta de integración en el orgánulo. Las proteínas de
matriz son sintetizadas en el citoplasma y se dirigen de manera post-traduccional a los
peroxisomas mediante dos señales peptídicas distintas, PTS1 o PTS2 (peroxisomal
targeting signal) (Reumann, 2004; Kessel-Vigelius et al., 2013). La gran mayoría de
proteínas peroxisomales de la matriz conocidas contienen una PTS1 unida al extremo
carboxilo terminal y consiste en un tripéptido que se corresponde con el prototipo
SKL, SRM o variaciones conservadas de esta tripleta (donde “” indica el extremo
C-terminal de la proteína) (Reumann, 2004; Chowdhary et al., 2012). Un pequeño
grupo de proteínas de matriz contienen una PTS2 que es un nonapéptido unido al
extremo amino terminal de las proteínas (Swinkels et al., 1991; Glover et al., 1994;
Reumann, 2004). Las secuencias PTS son reconocidas por dos receptores solubles
distintos situados en el citosol (Pex5 para PTS1 y Pex7 para PTS2); a continuación el
complejo proteína-receptor avanza hasta la membrana del peroxisoma y la atraviesa.
Posteriormente el receptor se libera y vuelve al citosol (Murphy et al., 2003). Mientras
que el tripéptido C-terminal o PTS1 no se escinde de la proteína una vez dentro del
peroxisoma, el nonapéptido N-terminal o PTS2 es degradado proteolíticamente tras
llegar a la matriz peroxisomal (Reumann, 2004). Algunas proteínas de matriz
Introducción general
36
peroxisomales no contienen ninguno de los PTS (Karpichev and Small, 2000) y la
hipótesis es que dichas proteínas son dirigidas al orgánulo por secuencias internas
específicas (Reumann, 2004).
En comparación con las proteínas de matriz peroxisomal, se sabe mucho menos
sobre las proteínas de la membrana peroxisomal (PMP), sobre cuáles son sus señales
peptídicas y cómo son integradas en la membrana del orgánulo. Ello se debe no sólo al
pequeño número de proteínas que aparecen en la membrana, sino también a su carácter
hidrofóbico, que hace que las proteínas de membrana precipiten en medio acuoso
(Corpas et al., 1994; Palma et al., 2009b). Se considera que la mayoría de las PMPs
son sintetizadas en el citosol e insertadas de manera post-traduccional en el peroxisoma
al igual que las proteínas de matriz. Sin embargo no se sabe el papel de las peroxinas, es
decir, de las proteínas relacionadas con el direccionamiento e inserción de las proteínas
en la membrana o de cómo sería la secuencia de dichas señales de las proteínas de
membrana peroxisomal (Murphy et al., 2003).
5.4 Biogénesis de peroxisomas El origen de los peroxisomas ha sido objeto de debate durante muchos años. Los
últimos estudios de visualización de orgánulos en células vivas indican la existencia de
dos mecanismos de biogénesis de peroxisomas. En el primero de ellos, los peroxisomas
se forman de novo a partir de vesículas pre-peroxisomales que nacen del retículo
endoplasmático y que a continuación se unen con otras formando peroxisomas maduros
(Hoepfner et al., 2005; van der Zand et al., 2012). En el segundo mecanismo los
peroxisomas se forman por la división de orgánulos pre-existentes mediante crecimiento
y división (fisión) de los mismos, usando nuevas proteínas y lípidos que serán aportadas
por el retículo endoplasmático en forma de vesículas (Motley and Hettema, 2007). Las
principales diferencias entre estos dos mecanismos de biogénesis de peroxisomas son:
la formación de novo es un proceso más lento que el proceso de fisión; además en la
formación de novo los nuevos peroxisomas contienen todo el material nuevo, mientras
que en la fisión se requiere de la presencia de peroxisomas anteriores (Smith and
Aitchison, 2013). En la Figura 8 se muestra un modelo integrado de los biogénesis de
los peroxisomas por los dos mecanismos descritos anteriormente.
Introducción general
37
Figura 9: Biogénesis de peroxisomas (modificado de Smith and Aitchison, 2013).
5.5 Herramientas para la identificación del proteoma de los peroxisomas
No basta con los estudios genéticos y bioquímicos realizados hasta ahora para conocer
el papel crucial de los peroxisomas. Los primeros estudios sobre el proteoma de los
peroxisomas de las plantas aparecieron poco después de la publicación del genoma de
Arabidopsis (Initiative, 2000; Reumann, 2011b). Una descripción del proteoma total de
los peroxisomas es determinante para identificar nuevas funciones de los mismos.
Asimismo, cuando hablamos de proteoma, hablamos de un elemento cambiante que
varía en función del tejido, del estado de desarrollo y de las condiciones
medioambientales (Hu et al., 2012).
Para abordar el estudio del proteoma peroxisomal son necesarias tres
aproximaciones principales:
1) Predicción de PTSs mediante estudios de bioinformática, los cuales usan
modelos matemáticos para predecir las señales peptídicas a partir de las
secuencias genómicas.
Introducción general
38
2) Identificación de proteínas mediante estudios estrictamente proteómicos, es
decir, electroforesis bidimensional, seguida de digestión tríptica de proteínas y
análisis por espectrometría de masas (MALDI-TOF).
3) Verificación de dichas proteínas putativas peroxisomales mediante localización
subcelular in vivo con proteínas de fusión fluorescentes o mediante
inmunolocalización mediante microscopía electrónica.
Los principales problemas a la hora de identificar una nueva proteína son la falta de
información sobre el genoma de la mayoría de las especies modelo de plantas y la
imposibilidad de intercambio de protocolos de aislamiento de peroxisomas entre
distintas especies, lo que, unido a las posibles contaminaciones en fracciones
peroxisomales de proteínas de mitocondrias y cloroplastos, hace de la descripción de
una proteína anteriormente desconocida una ardua tarea (Reumann 2011).
A pesar de todo, la proteómica se considera como una potente herramienta para
descubrir nuevas funciones de estos orgánulos y así comprender en su totalidad el
metabolismo de los mismos (Hu et al., 2012).
5.6 Particularidades de los peroxisomas de frutos de pimiento La purificación y caracterización de peroxisomas en plantas superiores ha sido
ampliamente descrita. Sin embargo y debido a que los peroxisomas están rodeados por
una membrana simple se trata de orgánulos tremendamente frágiles. En el caso de los
frutos de pimiento y a partir de homogenados de los mismos, el aislamiento de
peroxisomas se hace por centrifugaciones diferenciales seguidas de centrifugaciones en
gradientes de densidad de sacarosa (Mateos et al., 2003) en las que las bandas de
peroxisomas se corresponden a una zona de densidad de aproximadamente 1,24 g ·cm-3
.
A continuación se usan marcadores enzimáticos para verificar la existencia de
peroxisomas y diferenciarlos, así, de las bandas de plastidios, mitrocondrias y de
retículo endoplasmático (Mateos et al., 2003).
La principal particularidad de los peroxisomas de los frutos de pimiento consiste
en la presencia simultánea de las enzimas de la fotorrespiración y del ciclo del
glioxilato, en fruto verde, a diferencia de lo que ocurre en peroxisomas de tejidos verdes
de otras especies vegetales, en los que sólo están presentes las enzimas de la
fotorrespiración. Por el contrario, es en hojas senescentes donde desaparecen dichas
Introducción general
39
enzimas y se detectan las del ciclo del glioxilato estableciéndose una conversión de
peroxisomas de hojas en glioxisomas (Huang et al., 1983; Sandalio and del Río, 1988;
del Río et al., 1998; Hayashi et al., 2000; Baker and Graham, 2002; Mateos et al.,
2003).
6.- INTRODUCIÓN A LA PROTEÓMICA
A día de hoy la proteómica se ha convertido en una poderosa herramienta de
investigación y estudio de los seres vivos ya que proporciona una gran cantidad de
información y, por tanto, un mayor conocimiento de la biología vegetal.
La proteómica es la ciencia que se encarga del estudio del proteoma, es decir,
del conjunto total de las proteínas que se expresan en un momento determinado en un
material biológico de cualquier naturaleza, ya sea célula, órgano, individuo o especie
(Wasinger et al., 1995). A diferencia del genoma, que es un elemento estático a lo
largo de la vida de un individuo, el proteoma tiene un carácter dinámico, puesto que la
expresión de las proteínas cambia en diferentes etapas del ciclo celular así como en
respuesta a acciones externas. La proteómica, sin embargo, va más allá de la mera
catalogación de proteínas, pretendiendo establecer, en último término, su estructura,
actividad biológica, modo de acción, localización celular, modificaciones post-
traduccionales e interacción con otras proteínas o moléculas (Palma et al., 2009b,
2011b).
En general, la biología depende de la lectura selectiva de genes individuales del
genoma. Dichos genes son convertidos en transcritos primarios, posteriormente
procesados en mRNA y por último traducidos en proteínas, las cuales son susceptibles
de modificaciones post-traduccionales e incluso de formación de complejos con otras
proteínas. Todos estos procesos influyen en la función final de las proteínas (Kersten et
al., 2002).
El hecho de trabajar con proteínas implica una serie de problemas debido a que
se trata de elementos físicoquímicamente heterogéneos así como estructuralmente
complejos, lo que hace de su extracción, solubilización, manejo e identificación un
arduo trabajo (Rose et al., 2004).
El dogma central de la biología molecular ADNARNproteína dio lugar a
uno de los paradigmas esenciales de la biología que prevaleció durante la segunda mitad
Introducción general
40
del siglo pasado: Un genuna proteína; sin embargo, esta relación aparentemente
simple, no refleja la realidad (HumpherySmith et al., 1997). Aunque es cierto que un
gen codifica una secuencia de aminoácidos, existen dos eventos que incrementan
considerablemente el número de proteínas que pueden ser originadas por un gen y estar
presentes en una célula en un momento dado y por tanto hace más complejo el
proteoma de una célula. Uno de esos eventos es el fenómeno conocido como
acoplamiento, empalme o ajuste alternativo (alternative splicing). El otro evento, es el
hecho de que una proteína puede ser modificada durante o después de la traducción en
un proceso que se conoce como modificación post-traduccional (PTM). Por ello, una
secuencia única de aminoácidos puede generar muchas especies químicas diferentes
(Castellanos et al., 2004). En el caso del genoma humano que contiene
aproximadamente unos 30.000 genes se calcula que puede codificar unas 200.000 - 2
millones de proteínas. De igual forma se puede concluir que el proteoma de las plantas
alcanzará una magnitud similar (Rose et al., 2004).
La mayoría de estudios proteómicos de plantas se pueden dividir en dos categorías
diferentes:
1) Caracterización del proteoma de un organismo, es decir, identificar el perfil
proteico de una especie en concreto, con el fin de separar, secuenciar y catalogar
el mayor número de proteínas posibles. La identificación del proteoma de
células individuales es altamente complicado, por lo tanto se ha recurrido al
trabajo con orgánulos subcelulares, por lo que no sólo se ha reducido la
complejidad sino que además se obtiene información complementaria sobre la
localización de determinadas proteínas (Rose et al., 2004).
2) Identificación de las diferencias existentes en el proteoma celular entre dos
situaciones distintas lo que se conoce como proteómica de "expresión
diferencial” (Rose et al., 2004).
3) Identificación de las interacciones entre proteínas, así como de las proteínas con
otras moléculas (Castellanos et al., 2004).
Para un completo estudio del proteoma es necesario disponer de técnicas que
permitan a) separar miles de especies proteicas; b) identificar las especies de interés y c)
cuantificar la magnitud de los cambios en la expresión de proteínas. La proteómica
aborda este complejo problema técnico con variadas herramientas. Los elementos clave
Introducción general
41
de un estudio proteómico incluyen la extracción y detección del mayor número de
proteínas posibles a la vez que se minimizan los artefactos post-extracción, la
cuantificación apropiada y comparación de muestras y la identificación de proteínas e
integración de la información proteica obtenida con otros conjuntos de datos. A pesar de
que se incide en el desarrollo de tecnologías que permitan la separación e identificación
de las proteínas de una muestra, el paso más crítico de cualquier estudio de proteómica
es la extracción de proteínas y la preparación de la muestra (Rose et al., 2004; Palma et
al., 2011b).
Las herramientas básicas de la proteómica clásica se asientan en dos técnicas
principales: la electroforesis en gel de poliacrilamida como método de separación y
selección de proteínas diana y la espectrometría de masas como método de
identificación. Estas técnicas se benefician de los conocimientos ya existentes sobre el
genoma y proteoma humano y de otras especies. Dicha información se encuentra
disponible en bases de datos de libre acceso y puede utilizarse mediante programas de
búsqueda específicos que relacionan las secuencias en la base de datos con los datos
espectrométricos obtenidos (Newton et al., 2004).
42
J T V
Objetivos
43
La maduración de la mayoría de las especies del género Capsicum está caracterizada
por un intenso metabolismo, emisión de compuestos volátiles, destrucción de las
clorofilas y síntesis de nuevos pigmentos, formación de pectinas, síntesis de proteínas,
alteración en el sabor, etc. El proceso de maduración ha sido objeto de interés de
muchos investigadores, no solo por los espectaculares cambios que sufren los frutos,
sino por la complejidad del mecanismo de biosíntesis de capsantina, una sustancia
exclusiva que les da color a los mismos. Muchos de los cambios bioquímicos
observados se corresponden con modificaciones en la célula. De hecho, los cloroplastos,
que son los que contienen clorofila, se convierten en cromoplastos, que contienen
carotenoides como pigmentos mayoritarios. En las mitocondrias, sin embargo, no se han
descrito modificaciones ultraestructurales ni metabólicas destacables durante la
maduración de los frutos. En los peroxisomas, se han descrito importantes cambios
metabólicos; así se ha comprobado que la fotorrespiración es inhibida, mientras que la
actividad de las enzimas del ciclo del glioxilato aumenta a lo largo del proceso de
maduración. Teniendo en cuenta la importancia que tienen los peroxisomas en muchos
procesos intrínsecos de la planta y como respuesta a estímulos externos, nos planteamos
la importancia que puedan tener dichos orgánulos en la homeostasis celular durante el
proceso de maduración de los frutos.
Las aproximaciones tradicionales han permitido descifrar las principales rutas
metabólicas y las funciones celulares en las que se encuentran implicados los distintos
orgánulos. No obstante, quedan muchas incógnitas sobre determinados procesos
fisiológicos que subyacen al proceso de maduración. El análisis de la expresión de
varios genes, realizado en diversas variedades de pimiento en distintos estados de
maduración, no ha revelado diferencias notorias que permitieran emplear una
caracterización molecular de los frutos basada en estos parámetros. Por tanto, se
contempla la proteómica como un elemento de estrategia a la hora de abordar la
investigación molecular de las variedades comerciales de pimiento dulce. La
proteómica es una disciplina que va más allá de la mera catalogación de proteínas,
pretendiendo establecer, en último término, su estructura, actividad biológica, modo de
acción, localización celular, modificaciones post-traduccionales e interacción con otras
proteínas o moléculas. La contribución de la proteómica, por tanto, es fundamental no
solo para identificar las proteínas y su relación con los distintos orgánulos, sino cómo
Objetivos
44
en conjunto todas ellas contribuyen a descifrar los factores que intervienen en el
crecimiento de la planta y en su desarrollo.
Es por esto que nuestro grupo en la Estación Experimental del Zaidín inició una
línea de investigación orientada a sentar las bases moleculares que permitieran conocer
el desarrollo y la maduración de los frutos a nivel molecular, y así poder vincularlos con
las características nutricionales de los mismos.
Considerando la importancia que tiene el fruto de pimiento a nivel agronómico,
profundizar en el conocimiento de los cambios moleculares asociados a la fisiología del
mismo aportaría datos relevantes sobre variedades con una calidad superior.
En base a todo ello, en esta Tesis Doctoral nos hemos planteado los siguientes
objetivos:
1. Caracterización del proteoma total de los frutos de pimiento verde y rojo, tipo
California, con el objeto de describir las proteínas que se expresan de manera
diferencial en cada uno de los estados de maduración.
2. Estudio de las modificaciones post-traduccionales de las proteínas mediante
nitroproteómica en extractos de fruto de pimiento verde y rojo, así como el estudio del
efecto del óxido nítrico (NO) sobre la maduración de los mismos.
3. Análisis de la función de los peroxisomas, orgánulos con un metabolismo oxidativo
muy relevante, y de su proteoma en frutos de pimiento durante la maduración.
45
T ÉT
Material y Métodos
46
1.-MATERIAL VEGETAL Y CONDICIONES DE CULTIVO
Se emplearon frutos de pimiento (Capsicum annuum L.) del tipo California, en dos
estados de maduración distintos, verdes y rojos, que fueron proporcionados por la
empresa Syngenta Seeds, S.A. (El Ejido, Almería). Los frutos, recogidos directamente
de las plantas cultivadas en los invernaderos experimentales de la empresa, no
presentaban malformaciones ni síntomas de ningún tipo de daño.
2.- PREPARACIÓN DE EXTRACTOS CRUDOS PARA ENSAYOS
BIOQUÍMICOS
Los frutos de pimiento tanto verdes como rojos fueron procesados de la siguiente
manera: se cortaron tiras longitudinales que a su vez fueron divididas en trozos de 1 cm2
de sección aproximadamente y se homogeneizaron con mortero y pistilo en presencia de
un tampón de homogeneización que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM,
Triton X-100 0,1% (v/v), glicerol 10% (v/v) y DTT 5 mM (relación 1:2, p/v). Tras la
homogeneización los extractos se filtraron y se centrifugaron a 27.000 g, durante 15
min a 4ºC, y los sobrenadantes se usaron para la precipitación de proteínas solubles con
acetona al 70% (v/v, volumen final). Para ello se añadió a los sobrenadantes acetona
pura preservada a -20ºC, con agitación suave durante 30 min, y posteriormente se
centrifugó a 16.000 g durante 15 min. El precipitado, que contenía la mayor parte de las
proteínas fue resuspendido en 5 ml de tampón Tris-HCl, 50 mM e incubado durante 12-
14 h a 4ºC con agitación. La mezcla muestra-acetona se centrifugó a 39.000 g durante
20 min. Los sobrenadantes se clarificaron a través de columnas Sephadex G-25 (NAP-
10, Amersham), previamente equilibradas con el mismo tampón en el que se encontraba
la muestra (Begara-Morales et al., 2013).
3.- DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS
Se empleó el método de Bradford (Bradford, 1976) que permite determinar
espectrofotométricamente el contenido de proteínas mediante la medida del complejo
que éstas forman con el azul Coomassie. Se empleó el reactivo comercial de BioRad
“Protein Assay Dye Reagent” y albúmina de suero bovino (BSA), fracción V, como
proteína estándar para preparar la curva patrón de proteínas (0, 3, 6, 12 y 18 g de
BSA). Se añadieron 200 l de reactivo de BioRad a 800 l de un volumen compuesto
por la muestra o BSA, convenientemente diluidas y agua destilada, y se midió la
Material y Métodos
47
absorbancia a 595 nm, transcurridos 5 min tras la adición del reactivo (periodo de
estabilidad del complejo). Conocidos los valores de absorbancia, se elaboró una recta de
regresión lineal con los datos de la curva patrón de albúmina y se calculó la
concentración de proteínas interpolando los valores de absorbancia de las muestras.
4.- DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD CATALASA
Se siguió el método espectrofotométrico descrito por Aebi (Aebi, 1984), basado en la
medida de disminución de la absorbancia a 240 nm debida a la descomposición del
H2O2 por efecto de la catalasa. En una cubeta de cuarzo se añadieron la muestra,
convenientemente diluida, y la mezcla de reacción, protegida de la luz y formada por
tampón fosfato-K 50 mM, pH 7,0 y H2O2 10,6 mM hasta completar un volumen final
de 1 ml en la cubeta. La reacción se registró durante 2 min a 25ºC en un
espectrofotómetro Beckman Coulter DU 640. La actividad enzimática, expresada en
mol de H2O2 . min
-1 . mg
-1 de proteína, se calculó a partir de la velocidad inicial de la
reacción y de un coeficiente de extinción molar para el H2O2 de 39,58 M-1 .
cm -1
(del
Río et al., 1977).
5.- NITRACIÓN DE CATALASA
La molécula SIN-1 (3- morfolinosidnonimina), es un compuesto que nitra a las
proteínas, puesto que de manera espontánea libera NO y O2.-, lo que conlleva como
resultado la formación de peroxinitrito (ONOO-) (Daiber et al., 2004).
Los extractos de fruto fueron incubados con concentraciones crecientes de SIN-1
(Calbiochem) desde 0,5 a 5 mM, durante 1 hora a 37C, preparado justo antes de su
utilización. Las muestras fueron entonces filtradas a través de columnas NAP-10
(Amersham) para evitar interferencias entre la molécula SIN-1 y la actividad
enzimática. Una vez transcurrido el tiempo se determinó la actividad de la enzima
catalasa para cada una de las muestras. Además se añadió urato 2 mM, ya que se ha
demostrado que es una agente protector de la nitración y se observó el comportamiento
del mismo frente a SIN-1 en nuestras muestras (Alamillo and García-Olmedo, 2001).
Material y Métodos
48
6.- AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE PEROXISOMAS
Todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC, con el objeto de preservar en todo
momento la integridad de los orgánulos. El método utilizado para el aislamiento de los
orgánulos fue el descrito anteriormente para frutos de pimiento (Mateos et al., 2003). El
método consiste en varias centrifugaciones diferenciales seguidas de una centrifugación
en gradiente de densidad de sacarosa. Los frutos se lavaron con agua desionizada y se
partieron manualmente en trozos de 5-10 cm2 de sección, e inmediatamente después se
incubaron durante 30 min a 4ºC con el tampón de homogeneización en una relación 1:4
(p/v). Transcurrido ese tiempo, los frutos se homogeneizaron en pulsos suaves en una
batidora de vaso separados por unos segundos. La composición del tampón de
homogeneización fue de Tricina-KOH 170 mM, pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl2 1 mM,
EDTA 1 mM, sacarosa 1,5 M, BSA 0,3% (p/v) para pimiento verde y 0,4% (p/v) BSA
para pimiento rojo, y DTT 5 mM. El homogenado se filtró a través de dos capas de
entretela y se centrifugó a 4.600 g durante 20 min para eliminar la mayor parte de
plastidios, núcleos y residuos celulares. El sobrenadante se centrifugó de nuevo a
12.000 g durante 15 min y el precipitado obtenido se resuspendió con un pincel suave
en un medio similar al de extracción pero con un pH de 7,0, sacarosa 1 M y sin DTT. La
suspensión de orgánulos se depositó con ayuda de una jeringa, en la parte superior de un
gradiente discontinuo de sacarosa compuesto por 3 ml del 60%, 6 ml del 57%, 9 ml del
51%, 9 ml del 47%, 6ml del 42% y 3 ml del 35% de sacarosa (p/v). Las soluciones de
sacarosa se prepararon a partir de una solución madre de sacarosa del 66% (p/v)
preparada en Na2-EDTA, 1 mM, pH 7,5. Los gradientes de sacarosa se prepararon en
tubos Quick Seal (Beckman) y se centrifugaron a 80.000 g durante 1 h y 30 min en una
ultracentrífuga Beckman con un rotor vertical Vti50. Finalizada la centrifugación, los
peroxisomas se situaban en la parte inferior del gradiente en la interfase entre las capas
de 57% y 51% (p/v) de sacarosa (López-Huertas et al., 1995), en una densidad media
de 1,24 g.cm
-3. La banda correspondiente a la fracción de los peroxisomas se extrajo
mediante perforación de los tubos con una jeringa.
Las matrices peroxisomales (fracción soluble) se separaron de las membranas
mediante choque osmótico por dilución 1:4 con tampón fosfato-K pH 7,8 Na2-EDTA 1
mM con agitación suave a 4ºC durante 1 h y posterior centrifugación a 120.000 g
durante 30 min en un rotor Beckman 70Ti.
Material y Métodos
49
El sobrenadante que contiene las proteínas solubles del orgánulo se concentró
por ultrafiltración usando una membrana PM-10 (Amicon), según se indica en la
siguiente figura:
En las matrices concentradas se analizaron los parámetros bioquímicos inmediatamente
o bien se congelaron a -20ºC hasta su uso.
7.- ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA (EGPA) Y
TINCIÓN DE GELES
7.1.- EGPA en condiciones desnaturalizantes. EGPA-SDS
El método seguido fue el descrito por Laemmli (Laemmli, 1970) utilizando un equipo
Mini Protean III de Bio-Rad. El método se basa en someter el extracto que contiene las
proteínas a electroforesis sobre geles discontinuos de poliacrilamida constituidos por
dos zonas distintas: el gel concentrador y el gel separador. El gel se dispone como una
lámina delgada situada verticalmente que al aplicarse un campo eléctrico permite al
complejo SDS-proteína migrar hacia el ánodo debido a su carga negativa. Los geles de
poliacrilamida son soportes químicamente inertes formados mediante la polimerización
de acrilamida y N,N´metilén-bis-acrilamida, con la participación de persulfato amónico
y TEMED. La polimerización se inicia al adicionar el TEMED que cataliza la
formación de radicales libres a partir del persulfato amónico.
Barra magnética
ULTRAFILTRACIÓN (Cámara fría)
Inyección de N2
Solución Membrana de ultrafiltración
Vaso para deshecho
Tapón para agregar solución y mecanismo para purgar
(Presión 60Psi)
Material y Métodos
50
Se prepararon geles de poliacrilamida a distintas concentraciones (10-15% p/v), con
un gel concentrador de poliacrilamina al 4% (p/v). Las muestras para electroforesis se
prepararon en un tampón de Tris-HCl 125 mM pH 6,8, SDS 4% (p/v), glicerol 20%
(v/v), azul de bromofenol 0,006% (p/v) y DTT 10 mM, y se calentaron a 95 durante 10
min para desnaturalizar las muestras. Después se cargaron en los geles, a los cuales se
les aplicó un voltaje de 200 V durante unos 45-60 min. El tampón de electrodos usado
para el cátodo fue Tris-HCl 25 mM pH 8,3, glicina 192 mM y SDS 0,1% (p/v), y el
tampón del ánodo de igual composición pero sin SDS.
7.2.- Tinción de geles con azul-Coomassie
Los geles se tiñeron con “Coomassie Brillant Blue” R-250 al 0,1% (p/v), preparado en
metanol al 50% (v/v) y ácido acético al 10% (v/v) durante 30 min. Después se
destiñeron con metanol al 40% (v/v) y ácido acético al 10% (v/v), hasta que quedaron
bandas azules sobre un fondo transparente.
7.3.- Tinción de geles con plata
Se utilizó la técnica descrita por Heukeshoven y Dernick (Heukeshoven and Dernick,
1985). Después de la electroforesis los geles se incubaron con etanol al 30% (v/v) y
ácido acético al 10% (v/v) durante 1-3 h para fijar las proteínas. A continuación los
geles se lavaron con agua desionizada 3 veces durante 5 min cada vez, y se incubaron
con una solución reductora de ferricianuro potásico 1% (p/v) y tiosulfato de sodio al
1.6% (p/v) durante 15 min. Posteriormente, los geles se lavaron abundantemente hasta
que desapareciese el color amarillento de los mismos y se incubaron en una solución de
nitrato de plata 0,1% (p/v) en oscuridad, durante 30 min. El revelado se efectuó en una
solución de carbonato sódico 0,3 M y formaldehido 0,02% (v/v), hasta que aparecieron
las bandas de proteínas. La reacción se detuvo añadiendo ácido acético al 3% (v/v).
8.- TRANSFERENCIA E INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS (Técnica de
Western)
8.1.- Transferencia de proteínas
Las proteínas separadas por EGPA-SDS se transfirieron a una membrana de difluoruro
de polivinilo (PVDF), utilizando el sistema de transferencia Trans-Blot Turbo de
BioRad. El tampón utilizado en la transferencia fue CAPS 10 mM, pH 11,0 con metanol
al 10% (v/v). Debido a la naturaleza hidrofóbica de las membranas, primero se
Material y Métodos
51
activaron durante 15 s con metanol puro y a continuación se lavaron 2 min con agua
milliQ para posteriormente equilibrarse con el tampón de transferencia. Se prepararon
papeles “extra thick blot paper” (BioRad) de las mismas medidas del gel, y estos
papeles y los geles se equilibraron igualmente en el mismo tampón. La transferencia se
llevó a cabo utilizando una intensidad de 2,5 mA/cm2 de gel, 25 V, durante 7 min.
8.2.- Inmunodetección de proteínas por quimioluminiscencia Una vez concluida la transferencia de proteínas, las membranas se lavaron con agua
destilada. Para bloquear los sitios inespecíficos de unión de las inmunoglubulinas, las
membranas se incubaron con leche en polvo desnatada al 1,5% (p/v), preparada en
tampón TBS (Tris-HCl 20 mM, pH 7,8, NaCl 0,18 M) durante 1,5-2 h a temperatura
ambiente. Después de lavar las membranas, se incubaron con el anticuerpo primario
correspondiente, en una dilución óptima, durante toda la noche a 4C, o bien durante 2 h
a temperatura ambiente. Posteriormente, las membranas se lavaron con TBS durante 40
min, cambiando el tampón cada 10 min, tras lo cual se incubaron durante 1 h a
temperatura ambiente con el anticuerpo secundario, anti-IgG unida a peroxidasa de
rábano. Las membranas se lavaron finalmente con TBS y se procedió a la detección de
las proteínas por quimioluminiscencia.
Como sustrato quimiloluminiscente para la detección, se añade sobre la
membrana una mezcla de los reactivos A y B (ECL plus Amersham Biosciences)
basado en la generación enzimática de un éster de acridina que produce una luz más
intensa y durante un periodo de tiempo más largo, en proporción 1:40 y se incuba en
oscuridad a temperatura ambiente durante 5 min sin agitación, siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Las membranas se expusieron a una película autorradiográfica “Hyperfilm”, de
Amersham Biosciences, en un accesorio para autorradiografía (Kodak). El tiempo de
exposición variaba desde unos segundos hasta 20 min, según la intensidad luminosa
obtenida en cada caso.
9.- ANÁLISIS PROTEÓMICO
9.1.- Limpieza de muestras y solubilización
Las muestras fueron limpiadas mediante el método de metanol-cloroformo (Wessel and
Flugge, 1984) y posteriormente solubilizadas en un tampón conteniendo urea 7 M,
Material y Métodos
52
tiourea 2 M y CHAPS 4% (p/v). A continuación se cuantificaron por el método de
Bradford (BioRad) indicado anteriormente.
9.2.- Electroforesis bidimensional (2-D) y tinción de geles
Para la electroforesis bidimensional a cada muestra cuantificada se le realizó la primera
dimensión y se utilizaron tiras (strips) IPG (geles de isoelectroenfoque de gradiente
inmovilizado) de 17 cm, pH 3-10, de gradiente no lineal (BioRad). Se aplicó 60 µg de
proteína por cada muestra para geles preparativos. La electroforesis tuvo lugar con un
incremento lineal de voltaje como sigue:
- rehidratación pasiva (sin voltaje), 2 h
- rehidratación activa 50 V, 10 h, rápido
- 1000 V, 1 h, rápido
- 4000 V, 2 h, lineal
- 8000 V, 30 min, lineal
- 8000V, hasta alcanzar 50000 V, rápido
Transcurrida la primera dimensión, las tiras fueron equilibradas por agitación,
primero durante 15 min en una solución Tris-HCl 375 mM, pH 8,8, urea 6 M, SDS 2%
(p/v), glicerol 20% (v/v)) y DTT 2% (p/v), y segundo, durante otros 15 min en la
misma solución conteniendo iodoacetamida 2.5% (p/v) en lugar de DTT.
Los geles de IPG fueron transferidos a un sistema vertical de geles al 12% de
poliacrilamidaProtean II xi Cell System de BioRad, y la electroforesis se llevó a cabo a
30 mA durante 15 min y 60 mA hasta que el frente alcanzaba el final del gel.
Una vez terminada la electroforesis en SDS-PAGE se tiñeron los geles con
Imidazol (Hardy et al., 1996). Primero se incubó en H2O destilada durante 30-60 s.
Segundo se incubó en Imidazol 0,2 M conteniendo 0,1 % SDS (p/v) durante 10 min.
Posteriormente se pasaron a 0,2 M de sulfato de zinc 30-40 s hasta que el gel adquirió
coloración blanca, dejándose ver las proteínas transparentes. La tinción se detuvo con
H2O destilada y se analizó mediante un escáner GS-800 Calibrated Densitometer
(BioRad).
9.3.- Transferencia a membranas de nitrocelulosa
Antes de realizar la transferencia se lavaron los geles con EDTA 100 mM durante 10
minutos. El tampón de transferencia (Buffer Towbin) estaba compuesto por Tris-HCl 25
mM, pH 8,3, glicina 192 mM, metanol 20 % (v/v) y SDS 0.02 % (p/v). Las membranas
Material y Métodos
53
se equilibraron durante 15 min en el “Buffer Towbin” antes de ser transferidas. El
sistema utilizado fue Trans-Blot Plus Electrophoretic Transfer Cell (BioRad). Las
condiciones de recorrido fueron: 30 V a 1 ºC durante 20 h.
9.4.- Adquisición de imágenes En las imágenes de la electroforesis 2-D deben marcarse aquellas proteínas que han de
ser analizadas mediante espectrometría de masas. Para ello, en nuestras condiciones de
trabajo, se realizaron nuevos geles 2-D con idénticas condiciones a las anteriores
(electroforesis bidimensional). Esta vez los geles fueron teñidos con el compuesto
fluorescente Sypro Ruby (BioRad) según instrucciones del manual. Las proteínas se
fijaron con una solución al 7% (v/v) de ácido acético y 10% (v/v) de metanol durante
30 min; posteriormente se incubaron en Sypro Ruby©
durante toda la noche y, por
último, se lavaron con la solución anterior de ácido acético y metanol durante 30 min
para eliminar la fluorescencia del fondo. Las imágenes fueron adquiridas a 535 nm con
el equipo Molecular Imagen FX ProPlus (BioRad), con una resolución de 100 µm.
9.5.- Selección y digestión de proteínas
Las proteínas de interés fueron recuperadas de los geles mediante la estación automática
ProPic Investigator™ (Genomic Solution), y digeridas según el protocolo de
Schevchenko (1996) con pequeñas modificaciones, mediante el digestor automático
ProGest Investigator™ (Genomic Solutions). Las proteínas recuperadas fueron lavadas
con bicarbonato amónico 25 mM y acetonitrilo (100%) antes de la reducción con DTT
10 mM en bicarbonato amónico 25 mM y posterior alquilación con iodoacetamida 100
mM, preparada en bicarbonato amónico 50 mM. Los restos de gel fueron así eliminados
con 50 mM de bicarbonato amónico y acetonitrilo, y secados bajo nitrógeno gaseoso. Se
añadió tripsina porcina (Promega, Madison WI) a una concentración final de 12,5 ng/l,
preparada en bicarbonato amónico 25 mM, y la digestión se llevó a cabo a 37 ºC
durante 12 h. Los péptidos resultantes fueron eluídos con bicarbonato amónico 25 mM
y ácido trifluoroacético 0.1% (v/v) para un volumen de extracción final de 50 l. Una
alícuota de 1 l de mezcla de la solución de extracción final junto con la solución de
matriz (ácido 2,5-dihidroxibenzoico en 33% (v/v) de acetonitrilo y 0,1% (p/v) de ácido
trifluoroacético (TFA) fue depositada en la placa MALDI seguido del secado a
temperatura ambiente.
Material y Métodos
54
9.6.- Identificación de proteínas por huella petídica Los péptidos resultantes de la digestión con tripsina se purificaron de manera
automática en una estación ProMS (Genomic Solutions), mediante una microcolumna
de resina C18 (ZipTip, Millipore), eluyéndose directamente con una solución de matriz
(3 mg/ml de ácido α-ciano-4-hidoxicinámico en 70% acetonitrilo/0,1% TFA) sobre la
placa MALDI en un volumen de 1 ml. Tras la co-cristalización sobre la placa, las
muestras se analizaron en el rango de masa/carga (m/z) de 800 a 4000 Da mediante
espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF para obtener la huella peptídica (MS) en un
espectrómetro 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems) en modo automático.
Se realizó calibración interna de los espectros utilizando las relaciones m/z de los
péptidos resultantes de la autolisis de la tripsina porcina (M+H+
= 842,509, M+H+
=
2211,104), obteniéndose de esta manera una precisión en la medida de las m/z de ± 20
ppm. De cada muestra se obtuvieron espectros de fragmentación (MS/MS) de las tres
m/z más intensas.
La identificación de proteínas se realizó combinando los espectros MS y sus
correspondientes MS/MS usando MASCOT (MatrixScience, UK) como motor de
búsqueda sobre la base de datos MSDB, limitando la categoría taxonómica a
Viridiplantae, con carbamidometilación completa de los residuos de cisteína y
oxidación parcial de los residuos de metionina. El error máximo permitido en la
búsqueda fue de 100 ppm y el número máximo de errores en el corte de la proteasa fue
uno.
10.- ESTUDIOS BIOINFORMÁTICOS
El análisis bioinformático para proteínas peroxisomales de pimiento se realizó de la
siguiente manera: a partir de una lista de proteínas de Arabidopsis con PTS1 conocido
se identificaron los ortólogos de Capsicum para lo cual se hizo uso del programa
“tblastn” en el que se compara una secuencia proteica con una base de datos de
nucléotidos, en nuestro caso EST. Antes de continuar las secuencias EST de Capsicum
fueron traducidas de nucleótidos a aminoácidos mediante “ExPASy”
(http://web.expasy.org/translate/) y de esta manera se realizó un alineamiento múltiple
con “MulTalin” (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) con el que se
comprobó si en esas secuencias existía un tripéptido en el extremo C-terminal, y si
Material y Métodos
55
además coincidía con aquel de Arabidopsis, lo que, por tanto, significaba que podría
tratarse de un PTS1.
Asimismo, mediante el uso de “TAIR” (http://www.arabidopsis.org/), “SUBA
II” (http://suba2.plantenergy.uwa.edu.au/flatfile.php?id=AT1G77750.1) y
“Genevestigator” (https://www.genevestigator.com/gv/) se estudiaron las funciones en
las que la proteína en cuestión podría estar implicada, su posible localización
subcelular, así como la expresión de esos genes o si se trataba de proteínas inducibles
bajo un determinado tipo de estrés.
56
ÍT 1: T
F T T .
57
T
Capítulo 1
58
OBJETIVO: Caracterización del proteoma total de los frutos de pimiento verde y rojo
con el objeto de describir las proteínas que se expresan de manera diferencial en cada
uno de los estadios.
La maduración de los frutos es un proceso altamente coordinado que, a su vez,
coincide con la maduración de las semillas. Este proceso está regulado por un elevado
número de genes que controlan el ablandamiento progresivo de la pared celular, la
acumulación de azúcares, ácidos y pigmentos así como la liberación de compuestos
volátiles. Es clave para la mejora de los cultivos un profundo conocimiento de los
procesos que subyacen al fenómeno de la maduración (Osorio et al., 2013).
Sin embargo y debido a la gran cantidad de cambios metabólicos que se
producen durante la maduración de los frutos, son necesarias una gran cantidad de
metodologías para poder evaluar la evolución natural de este proceso. La importancia de
la maduración proviene de la repercusión económica que ésta tiene, como resultado del
procesamiento de los frutos una vez que se han recolectado. Tradicionalmente el estudio
del proceso de maduración se ha abordado desde un punto de vista genético (Seymour
et al., 2008). Hasta hace pocos años existía poca información disponible sobre las
proteínas involucradas en el desarrollo de los frutos pero debido a la gran cantidad de
datos que pueden proporcionan las nuevas tecnologías de análisis, los estudios
proteómicos se han incrementado notablemente, sobre todo en especies vegetales de
gran importancia agronómica (Jansen et al., 2002; Sarry et al., 2004; Rocco et al.,
2006; Palma et al., 2011a).
La mayoría de las especies comparten perfiles de maduración comunes en el que
las proteínas están relacionadas con el metabolismo oxidativo, el metabolismo de los
azúcares, proteínas relacionadas con estrés y otras cuya expresión se ve modificada por
el proceso de maduración. La siguiente tabla muestra distintas categorías funcionales
entre las que se incluyen las proteínas que se han determinado para algunos de los
principales cultivos frutales como tomate, uva, naranja, manzana, melocotón, pera, o
albaricoque (Palma et al., 2011b).
Capítulo 1
59
Tabla 1.1: Categorías funcionales de las proteínas que se expresan de manera diferencial en los frutos
bajo diferentes condiciones de desarrollo y de maduración (Palma et al., 2011).
Categoria Funcional Proceso Especie Referencias Metabolismo de lípidos, de aminoácidos, carbono y carbohidratos
Maduración Tomate (Rocco et al., 2006; Faurobert et al., 2007)
Uva (Deytieux et al., 2007; Negri et al., 2008)
Naranja (Katz et al., 2007; Muccilli et al., 2009; Pan et al., 2009)
Senescencia Manzana (Qin et al., 2009a) Frío Tomate (Vega-García et al., 2010)
Respuesta a estrés/ Estrés oxidativo
Maduración Tomate (Rocco et al., 2006; Faurobert et al., 2007; Kok et al., 2008)
Uva (Deytieux et al., 2007; Negri et al., 2008; Giribaldi et al., 2010)
Naranja (Katz et al., 2007; Muccilli et al., 2009; Pan et al., 2009)
Albaricoque (Grimplet et al., 2005) Senescencia Manzana (Qin et al., 2009a; Qin et al., 2009b) Frío Tomate (Stevens, 1972; Vega-García et al., 2010)
Melocotón (Nilo et al., 2010) Transporte/ Transportadores de membrana
Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007) Uva (Zhang et al., 2008)
Senescencia Manzana (Qin et al., 2009a) Frío Melocotón (Nilo et al., 2010)
Energía Maduración Tomate (Rocco et al., 2006) Uva (Zhang et al., 2008) Naranja (Katz et al., 2007; Pan et al., 2009; Katz et al., 2010)
Frío Melocotón (Nilo et al., 2010; Zhang et al., 2010) Metabolismo Maduración Uva (Zhang et al., 2008)
Naranja (Katz et al., 2007) Senescencia Manzana (Qin et al., 2009a) Almacenamiento Pera (Bantscheff et al., 2007; Schulze and Usadel, 2010) Frío Melocotón (Nilo et al., 2010)
Síntesis/ Destrucción de proteínas
Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007; Kok et al., 2008) Uva (Zhang et al., 2008)
Almacenamiento Pera (Bantscheff et al., 2007; Schulze and Usadel, 2010) Frío Melocotón (Nilo et al., 2010; Zhang et al., 2010)
Fotosíntesis Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007; Kok et al., 2008; Barsan et al., 2010)
Uva (Deytieux et al., 2007) Frío Tomate (Vega-García et al., 2010)
Metabolismo secundario Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007) Uva (Giribaldi et al., 2010) Naranja (Muccilli et al., 2009)
Frío Melocotón (Nilo et al., 2010; Zhang et al., 2010) Estructura celular/Crecimiento
Frío Melocotón (Nilo et al., 2010; Zhang et al., 2010)
Transcripción Maduración Uva (Zhang et al., 2008) Frío Melocotón (Zhang et al., 2010)
Defensa Maduración Tomate (Rocco et al., 2006; Faurobert et al., 2007) Uva (Deytieux et al., 2007)
Almacenamiento Pera (Bantscheff et al., 2007; Schulze and Usadel, 2010) Frío Tomate (Stevens, 1972)
Melocotón (Zhang et al., 2010) Transducción de señales/Señalización celular
Maduración Tomate (Rocco et al., 2006) Uva (Giribaldi et al., 2010)
Frío Melocotón (Nilo et al., 2010) Metabolismo de lípidos Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007; Barsan et al., 2010) Movimiento/Biosíntesis de orgánulos
Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007; Barsan et al., 2010) Naranja (Katz et al., 2007)
Estado redox Maduración Tomate (Rocco et al., 2006) Destoxificación Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007) Biosíntesis de vitaminas Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007) Procesamiento de DNA Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007)
Capítulo 1
60
Proteómica y fruto de pimiento
El fruto de pimiento (Capsicum annuum L.) es el segundo vegetal más consumido a
nivel mundial y destaca por su elevado contenido en vitamina C (ácido ascórbico), pro-
vitamina A (caroteno) y calcio. De hecho, la ingesta de 50-100 gr de fruto en fresco
aportarían el 100% y el 60% de las cantidades diarias recomendadas de vitamina C y A,
respectivamente (Howard et al., 2000; Palma et al., 2011c; Mateos et al., 2013).
Los trabajos clásicos de construcción de proteomas descriptivos de orígenes
complejos tal como el proteoma del tallo del arroz (Komatsu et al., 1999) han ido
derivando hacia proteomas ligados a la función, analizando subproteomas de orgánulos
subcelulares propios de plantas, como el cloroplasto, así como en estudios comparativos
de proteomas de una misma especie bajo distintas condiciones fisiológicas o
medioambientales.
En el caso del pimiento, los métodos usados para la descripción del proteoma
total comienzan por la extracción de proteínas a partir de frutos completos en los dos
estadios de maduración, inmaduro y maduro, o lo que es lo mismo en nuestro caso,
verde y rojo, respectivamente. Una vez extraídas las proteínas éstas serán sometidas a
estudios proteómicos. Los resultados finales serán analizados con la ayuda de bases de
datos con motores de búsqueda apropiados, lo que permitirá identificar el mayor
número de proteínas posibles (Palma et al., 2011b). En la Figura 1.1 Se muestra un
modelo de análisis al proteoma de los frutos de pimiento.
Figura 1.1: Estrategia para el análisis proteómico de la maduración de los frutos de pimiento.
Capítulo 1
61
No son muchos los trabajos realizados hasta el día de hoy sobre proteómica de
frutos de pimiento. Ello se debe, en primer lugar, a que el genoma de esta planta no ha
sido secuenciado hasta hace pocos meses (Kim et al., 2013), lo cual dificultaba el
trabajo a lo hora de describir nuevas proteínas.
De hecho aunque se conocían trabajos pioneros en proteómica de solanáceas
(tomate y pimiento) anteriores (Rose et al., 2004), no fue hasta 2006 en que se
publicaron los primeros datos sobre un estudio comparativo de proteínas que se
expresaban de manera diferencial en los tejidos de pimientos en estados de maduración
diferente (Lee et al., 2006b).
El sabor picante de los frutos de pimiento es una característica peculiar de esos
frutos que se debe a la presencia en sus tejidos de la capsaicina y a sus derivados que
son un tipo de alcaloides fenólicos que aparecen de manera exclusiva en los miembros
de este género. Dichos alcaloides, se acumulan en la placenta de los frutos de pimiento
maduros. El contenido en capsaicinoides varía entre las distintas variedades de pimiento
y destacan por ser agentes antimicrobianos, antioxidantes y antiinflamatorios, , así como
porque ejercen un papel protector frente a determinados procesos patológicos como
cáncer, aterosclerosis y obesidad (Surh, 2002; Basu and De, 2003; Lee et al., 2006b).
Este estudio analizaba tejidos de placenta de pimientos dulces y de pimientos picantes y
se obtuvieron un total de 2600 proteínas, de los cuales 37 eran exclusivas de las
especies picantes, y de todos ellos sólo 22 proteínas fueron identificadas (Lee et al.,
2006b).
En otro estudio se comparó el daño que ocasionaba el frío en los frutos de
pimiento a nivel proteómico y se compararon por tanto, frutos sometidos a temperaturas
distintas (10ºC y 1ºC). Para mantener la calidad de los frutos y retrasar la pudrición de
los mismos, justo después de su recolección, los pimientos son refrigerados a una
temperatura de alrededor de 7,5ºC y no inferior, ya que son muy sensibles a las bajas
temperaturas. Entre las consecuencias de las bajas temperaturas en los frutos de
pimiento, destacan manchas y decoloración de tejidos, oscurecimiento de semillas,
pérdida de humedad y ablandamiento del pericarpo, entre otros. A nivel ultraestructural,
se altera la composición de las membranas y se dan cambios en cloroplastos y
peroxisomas. Y a nivel fisiológico, aumenta la producción de etileno, se producen
cambios en el contenido de azúcares y ácidos y se observa un aumento en la producción
Capítulo 1
62
de ROS. El análisis proteómico comparativo entre frutos control y sometidos a frío
mostró que las principales alteraciones provocadas por el frío afectaban a proteínas
relacionadas con la homeostasis redox celular y con el metabolismo de los
carbohidratos (Sánchez-Bel et al., 2012).
A medida que los frutos van madurando, los cloroplastos sufren una
transformación absoluta de sus estructuras hasta el punto en que se convierten en
cromoplastos. Los cromoplastos son los plastidios de acumulación masiva de
carotenoides en los frutos, a diferencia de los cloroplastos que acumulan principalmente
clorofilas. En un análisis de proteómica comparativa de cromoplastos entre 6 tipos de
cultivos diferentes (pimiento, sandía, coliflor, zanahoria, papaya y tomate) se
describieron un total de entre 953 y 2262 proteínas para los 6 cultivos, de las cuales casi
el 60% se localizaban en los plastidios. De todas ellas, tan solo 17 eran enzimas
metabólicas de carotenoides (Wang et al., 2013b).
La proteómica ha contribuido a revelar los cambios que ocurren en el
metabolismo de los frutos a medida que estos maduran, sin embargo y debido a las
características peculiares de cada una de las especies se necesitan más datos sobre el
trascurso de este proceso natural, de manera que se puedan controlar algunos de los
aspectos de la fisiología de los mismos y finalmente ofrecérselos a los consumidores en
el mejor momento de su ciclo de vida. Una vez que se han descrito las principales
categorías funcionales de las proteínas que se expresan en cada uno de los estadios
madurativos, es posible avanzar en el estudio de las más importantes proteínas
específicas, así como en los genes que las codifican y, de esta manera, describir su papel
característico en la fisiología de los frutos (Palma et al., 2011b).
Capítulo 1
63
T
Capítulo 1
64
1.1 Patrón polipeptídico de frutos de pimiento
Mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes
(EGPA-SDS) y posterior tinción de los mismos con azul-Coomassie se estudió el
patrón polipeptídico de extractos crudos de fruto de pimiento verde y rojo. La
maduración de los frutos modifica claramente el patrón polipeptídico con la aparición
de nuevas bandas en los pimientos rojos. Concretamente, se detectan tres bandas
polipeptídicas exclusivas de frutos rojos de un tamaño aproximado de 97, 50 y 32
kDa, mientras que en frutos verdes una banda de un tamaño aproximado de 34 kDa es
más abundante que en frutos rojos (Figura 1.2).
Figura 1.2: Patrón polipeptídico de extractos crudos de
pimiento verde y rojo. Tras ser desnaturalizados a 95ºC
durante 5 min. los extractos (20 g) fueron sometidos a
electroforesis en geles discontinuos de poliacrilamida (10%).
Los valores que se muestran a la izquierda corresponden a los
patrones de peso molecular (SDS-PAGE standards Bio-Rad
low range), mientras que a la derecha de indican las bandas
diferenciales entre ambos tipos de fruto.
1.2 Análisis del proteoma de frutos de pimiento mediante electroforesis
bidimensional (2-D)
Mediante electroforesis bidimensional (2-D), se ha estudiado el patrón de las proteínas
de fruto de pimiento verde y rojo (Figuras 2-6). Previo al análisis proteómico y con la
finalidad de partir de la cantidad óptima de proteínas para la electroforesis 2-D, las
muestras se concentraron con acetona al 70% (v/v, volumen final). Los geles fueron
teñidos con el compuesto fluorescente Sypro-Ruby (Figura 1.3) y el análisis de los spots
Capítulo 1
65
se realizó mediante el programa bioinformático PDQuest. Debido a la envergadura del
trabajo los geles fueron sometidos a dos picados consecutivos, con el fin de no superar
el número máximo de spots a analizar aconsejado por el programa. Es por ésto que en el
caso del fruto de pimiento verde el análisis de los geles se dividió en dos partes: una de
102 spots, correspondiente a la zona superior del gel y otra de 103, correspondiente a la
inferior (Figura 1.4). En el caso del pimiento rojo, en la zona superior del gel se picaron
88 spots, mientras que en la inferior fueron 84 los puntos analizados (Figura 1.6). A
continuación cada uno de los spots fue extraído de los geles para ser sometidos a una
digestión con tripsina e identificación por MALDI-TOF/TOF.
Figura 1.3: Análisis comparativo por electroforesis bi-dimensional (2-D) entre frutos de pimiento
verde (A) y rojo (B) (Capsicum annuum L.). Se cargaron 60 μg de proteína por cada tipo de fruto.
Posteriormente los geles se tiñeron con el agente fluorescente Sypro Ruby ( Bio-Rad). A la izquierda
de cada gel se indican los marcadores de peso molecular y en la parte superior el pH correspondiente
a la primera dimensión. IEE: isoelectroenfoque.
En las Figuras 1.5 y 1.7 aparecen indicados los polipéptidos que se identificaron en los
frutos verdes y rojos, respectivamente, una vez aplicado el análisis por MALDI-
TOF/TOF y que se enfrentaran los resultados a las bases de datos. En dichos geles se
destacan en negro los polipéptidos que se detectaron exclusivamente en los frutos
verdes (Figura 1.5) y en los frutos rojos (Figura 1.7). En azul se muestran los
Capítulo 1
66
polipéptidos que eran coincidentes en frutos verdes y rojos cuando se analizó de manera
independiente el proteoma de frutos verdes (Figura 1.5) o el proteoma de frutos rojos
(Figura 1.7). Se podrá comprobar que los polipéptidos coincidentes en ambos tipos de
frutos tienen numeración diferente en las Figuras 1.5 y 1.7, al haberse asignado dicha
numeración de manera automática por el programa, dependiendo de si el proteoma
mostrado corresponde al pimiento verde o al rojo. No obstante, la identificación final en
ambos casos corresponde a la misma proteína. Así por ejemplo, el spot 3 del proteoma
del fruto verde corresponde en movilidad con el spot 6 del proteoma de fruto rojo, y en
ambos frutos se corresponde la transcetolasa (ver más adelante). Esta misma regla se
empleó para el resto de polipéptidos compartidos por los dos tipos de frutos.
Figura 1.4: Imagen correspondiente al gel 2-D de proteoma de fruto de pimiento verde con todos los
spots que se han picado. En la parte superior del gel se analizaron 102 polipéptidos y 103 en la parte
inferior.
Capítulo 1
67
Figura 1.5: Spots identificados en el proteoma de fruto de pimiento verde. En negro se muestran los
polipéptidos específicos de fruto de pimiento verde y en azul aquellos que coinciden con los del fruto
rojo.
Figura 1.6: Imagen correspondiente al gel 2-D de proteoma de fruto de pimiento rojo con todos los spots
que se han picado. En la parte superior del gel se analizaron 88 polipéptidos y 84 en la parte inferior.
Capítulo 1
68
Figura 1.7: Spots identificados en proteoma de fruto de pimiento rojo. En negro los específicos de fruto
de pimiento rojo y en azul aquellos que coinciden con los del verde.
1.3 Identificación de proteínas y análisis mediante MALDI-TOF/TOF
Las proteínas identificadas fueron analizadas por espectrometría de masas (MALDI-
TOF) tras su digestión con tripsina. MASCOT fue el motor de búsqueda elegido para
identificar las proteínas desde secuencias primarias lanzadas en bases de datos. Un valor
mayor de 99% en el intervalo de confianza de la puntuación asignada por MASCOT
(protein score C.I %) indica una elevada probabilidad de que la proteína haya sido
identificada correctamente. En la Tabla 1.2 aparecen las proteínas que han presentado
un protein score 99% presentes de forma exclusiva bien en frutos verdes o en rojos y
que ya habían sido descritas con anterioridad en Capsicum annuum u otras especies.
Capítulo 1
69
Tabla 1.2: Proteínas descritas e identificadas de forma exclusiva en frutos de pimiento (Capsicum
annuum L.) verdes o rojos y su número de identificación en la base de datos Uniprot (número de acceso).
Se indica también el spot con el que se corresponde en los respectivos geles (Figura 4 para pimientos
verdes y 6 para rojos), los tamaños moleculares (MW) y puntos isoeléctricos (PI), así como las especies
donde se han descrito anteriormente.
Proteína
identificada
Tipo
de
fruto
Spot
(Figs.
4 y 6)
Nº acceso MW/PI Especie
Subtilisina Verde 4 E9LUF1 86563.7/6.41 Phaseolus
vulgaris
Proteína de choque
térmico (Heat
Shock Protein,
HSP)
Verde 15 Q08276 73317.1/ 6.37 Solanum
tuberosum
59 Q67BD0 71341.2/ 5.14 Nicotiana
tabacum
80 B9RBP6 65385.7/ 5.6 Ricinus communis
Dihidroxiácido
deshidratasa
Verde 23 Q9LIR4 65555.9/5.85 Arabidopsis
thaliana
Calreticulina Verde 27 G7I9H2 48595.4 /4.41 Medicago
truncatula
Inositol-3-fosfato
sintasa
Verde 28 Q9SSV4 56520.9/ 5.44 Nicotiana
paniculata
Leucina
aminopeptidasa 2
Verde 32 Q42876 60081.9/ 8.18 Solanum
lycopersicum
Adenosil-
homocisteinasa
Verde 33 P35007 53769.2 /5.6 Catharanthus
roseus
Xylosa isomerasa Verde 43 K4CBD6 44750.3/ 5.53 Solanum
lycopersicum
Anexina Verde 45 B9N394 35865.3 /8.75 Populus
trichocarpa
S-
adenosilmetionina
sintasa 1
Verde 47 Q9M7K8 43144.6 /5.66 Nicotiana
tabacum
49 B5LAW6 43055.6 /5.66 Capsicum
annuum
Delta ácido
aminolevulínico
deshidratasa
Verde 50 K4CMC3 47261.9 /6.36 Solanum
lycopersicum
Anquirina Verde 61 D2Y4N3 37572.5 /4.47 Nicotiana
tabacum
Succinil-CoA
ligasa, subunidad
beta
Verde 66 Q2PYW7 45624.8 /5.69 Solanum
tuberosum
Piruvato
deshidrogenasa E1,
subunidad alfa
Verde 71 B5LAW2 48025 /6.29 Capsicum
annuum
Alfa-galactosidasa Verde 88 Q5DUH7 41545.2 /5.65 Coffea canephora
Capítulo 1
70
Succinil-CoA
sintetasa
Verde 97 K4FZR6 34581.9/ 8.99 Capsicum
annuum
Enoil-acil reductasa Verde 14 B5LAU4 41955.7/ 8.85 Capsicum
annuum
Coatómero,
subunidad gamma
Verde 24 K4B3G7 98962/ 5.05 Solanum
lycopersicum
Harpina Verde 54 E0X584 98962/ 5.05 Solanum
lycopersicum
Proteína de
biosíntesis de
arginina ArgJ
Verde 71 K4CR69 49638.2 /5.79 Solanum
lycopersicum
Glutatión-S-
transferasa
Verde 77 Q5DUH0 23840.3/ 6.38 Capsicum
chinense
Taumatina Verde 85 Q5DJS5 25562.7/ 5.39 Nicotiana
tabacum
Proteína 4b
relacionada con
patogénesis
Verde 90 Q75QH1 22507.6/ 7.91 Capsicum
chinense
Proteína de
respuesta al etileno
Verde 101 Q4LAW5 19850.8/ 5.53 Capsicum
chinense
Proteína del lumen
tilacoidal
Verde 103 B9SL97 26292.3/ 6.53 Ricinus communis
RNA polimerasa,
subunidad beta
Rojo 5 J7K6T9 234051.1/10.09 Trebouxiophyceae
sp.
Alfa manosidasa
lisosomal
Rojo 11 G7J3A3 115123.2/6.48 Medicago
truncatula
Proteína asociada a
la BON1
Rojo 19 Q941L2 22149.2/9.42 Arabidopsis
thaliana
Cetol-ácido
reductoisomerasa
Rojo 25 B5LAT1 63652.3/6.49 Capsicum
annuum
Leucina
aminopeptidasa
Rojo 28 B3TL99 32084.7/5.4 Solanum nigrum
Adenosil-
homocisteinasa
Rojo 32 B9S9Y6 53905.2/5.81 Ricinus communis
Glutatión reductasa Rojo 39 B8PWQ9 60499.9/7.62 Solanum
lycopersicum
Retrotransposón
subclase Ty3 gypsy
Rojo 35 Q2QMY4 198390.2/8.81 Oryza sativa
subsp. japonica
Progesterona 5 beta
reductasa
Rojo 50 D9ILU8 44125/5.53 Nierembergia
aristata
Factor de
transcripción
homebox
Rojo 51 D6PAP4 15383.2/9.3 Jatropha curcas
Succinil-CoA
ligasa, subunidad
beta
Rojo 63 Q84LB6 45153.6/5.86 Solanum
lycopersicum
Fenilalanina Rojo 66 Q9XGR3 72456/6.21 Vigna
Capítulo 1
71
amonio liasa unguiculata
Proteína SlUPTG1:
UDP glucosa
transglucosilasa
Rojo 69 Q6IV07 41735.8/5.85 Solanum
lycopersicum
Proteína de
cloroplasto RF2
Rojo 70 G0YD10 269728.3/8.49 Ixerba brexioides
Nucleasa de
inducción por alta
luminosidad
Rojo 75 A8HN65 29594.8/9.03 Chlamydomonas
reinhardtii
1,4-glucano sintasa Rojo 76 G7JWW6 41683.8/5.71 Medicago
truncatula
Proteína
poligalacturonasa
de inhibición
Rojo 2 D7RJV7 38246.8/8.99 Capsicum
annuum
Fructosa bisfosfato
aldolasa
Rojo 5 K4D3E4 38829/8.33 Solanum
lycopersicum
Gliceraldehído 3-
fosfato
deshidrogenasa
Rojo 27 F1AF05 12404.5/8.16 Rosa chinensis
var. spontanea
Glucano endo 1,3-
beta glucosidasa
Rojo 30 P15797 40541.4/7.1 Nicotiana
tabacum
Proteína de
biosíntesis de
piridoxina,
isoforma A
Rojo 36 Q6QND3 33353.1/5.93 Nicotiana
tabacum
Osmotina Rojo 68
70
Q9ARG0
Q84U69
27253.6/7.84
18627.6/8.3
Capsicum
annuum
Solanum
tuberosum
Lipocalina Rojo 78 Q5J0W3 21432.8/6.62 Capsicum
annuum
83 Q38JB9 21392.9/6.33 Populus
tremuloides
En la Tabla 1.3 se muestran las proteínas compartidas entre los dos tipos de frutos,
donde vienen anotados para cada una de ellas los spots identificados a partir de los
frutos verdes (Figura 1.5) o de los rojos (Figura 1.7).
Capítulo 1
72
Tabla 1.3: Proteínas coincidentes entre los dos tipos de fruto de pimiento (Capsicum annuum L.). Se
indica también el spot con el que se corresponde en los respectivos geles (Figura 4 para pimientos verdes
y 6 para rojos), los tamaños moleculares (MW) y puntos isoeléctricos (PI), así como las especies donde se
han descrito anteriormente.
Proteína identificada Tipo
de
fruto
Spot
(Figs. 4
y 6)
Nº acceso MW/PI Especie
Transcetolasa 1 Verde 3 O78327 80397.7/
6.16
Capsicum
annuum Rojo 6
Alfa manosidasa Verde 6 E7BYE5 117029.1/
6.28
Capsicum
annuum Rojo 30
Beta hexosaminidasa Verde 7 E7BYE4 64319.6/
5.47
Capsicum
annuum Rojo 8
Poligalacturonasa Verde 14 Q2XTD7 52412.2/
5.66
Solanum
tuberosum Rojo 12
Adenilosuccinato
sintetasa 1
Verde 46 A9XLE1 56188.9
/8.35
Capsicum
frutescens Rojo 46
Citocromo c oxidasa,
subunidad II PS17
Verde 55 P84733 1707 /9.63 Pinus strobus
Rojo 32
3 isopropilmalato
deshidrogenasa
Verde 70 B5LAV1 43683.4/ 5.9 Capsicum
annuum
Rojo 64
Fosforribuloquinasa Verde 84 K4CMY9 44792.6
/5.96
Solanum
lycopersicum Rojo 78
N carbamoíl-
putrescina amidasa
Verde 9 Q3HVN1 33555/ 5.87 Solanum
tuberosum Rojo 11
Ferredoxina NADP+
oxidorreductasa
Verde 17 Q9M4D2 40666.7
/8.54
Capsicum
annuum Rojo 54
Ascorbato peroxidasa Verde 55 Q84UH3 27754.9
/5.43
Capsicum
annuum Rojo 42
Deshidroascorbato
reductasa
Verde 81 Q84UH4 23817.5/ 7.7 Nicotiana
tabacum Rojo 63
Metionina sulfóxido
reductasa A4
Verde 91 G3K2M4 29252.5
/8.65
Solanum
lycopersicum Rojo 79
Peptidil prolil cis-
trans isomerasa
Verde 102 K4ATJ4 26689.6 /9.2 Solanum
lycopersicum
Rojo 84 B9RMA5 27656.2/9.58 Ricinus
communis
Enolasa Verde 36 P26300 48053.5/
5.68
Solanum
lycopersicum
Rojo 37 Q6WB92 47872.7/6.16 Gossypium
barbadense
Glutamato
deshidrogenasa
Verde 57 B9I5Y2 44699/ 6.28 Populus
trichocarpa
Rojo 59 G3G8J6 44944.1/6.23 Vitis vinifera
Capítulo 1
73
Fructosa bifosfato
aldolasa
Verde 78 G9MA91 37689.5/
5.97
Linum
grandiflorum
Verde 81 K4CQV5 39109.1
/7.51
Solanum
lycopersicum Rojo 3
Malato
deshidrogenasa
Verde 87 Q2PYY8 35805.4/
5.74
Solanum
tuberosum
Verde 91 K4DCV3 35860 /8.9 Solanum
lycopersicum Rojo 83
Rojo 82 Q8L5C8 36429.1/8.48 Solanum
tuberosum
Subunidad alfa
proteasomal
Verde 59 K4D245 27443.9/
6.11
Solanum
lycopersicum Rojo 45
Verde 31 K4B407 27196.2/
6.98
Solanum
lycopersicum
Verde 68 K4BA40 27368.7/
5.63
Solanum
lycopersicum
Rojo 48 K4BVD8 32648.3/5.67 Solanum
lycopersicum
Subunidad beta
proteasomal
Verde 69 K4C2U0 29566.7
/6.66
Solanum
lycopersicum
Verde 78 K4BB06 24930.3/
5.93
Solanum
lycopersicum
Verde 88 K4CCD7 25382.7
/5.51
Solanum
lycopersicum Rojo 66
Rojo 56 K4DA71 27637.9/7.02 Solanum
lycopersicum
Triosofosfato
isomerasa
Verde 72 K4FXE7 27305.2/
5.72
Capsicum
annuum Rojo 51
Verde 75 K4B3X5 35042.7/
6.45
Solanum
lycopersicum Rojo 52
Catalasa Verde 29 Q9M5L6 56957.4/
7.31
Capsicum
annuum
Rojo 43
Rojo 55 A8QID6 56960.4/7.05 Capsicum
annuum
Cisteína sintasa Verde 15 Q3LAG5 34331.1/
5.71
Nicotiana
tabacum
Verde 13 K4CVI4 34335.1/
5.93
Solanum
lycopersicum
Rojo 87 P31300 40465.9/5.22 Capsicum
annuum
Superóxido dismutasa Verde 92 C0JPM8 14732.4/
5.36
Solanum
nigrum Rojo 72
Verde 93 Q7YK44 27893/ 6.6 Solanum
lycopersicum Rojo 73
Capítulo 1
74
Capítulo 1
75
En los últimos años ha aumentado la información disponible sobre el proceso de
maduración de los frutos, principalmente de aquellas especies que están destinadas al
consumo humano. Por consiguiente, la investigación en producción de frutos, desde un
punto de vista nutricional, fisiológico y genético ha adquirido una especial atención,
para de esta forma poder satisfacer las demandas de los diferentes sectores como la
agricultura, la economía e incluso la política.
El pimiento es una especie agrícola dominante a nivel mundial, puesto que se consume
prácticamente en todos los países y de distintas maneras. A día de hoy existe poca
información sobre algunos de los aspectos del cultivo de este fruto, tales como mejores
prácticas para el sembrado y germinación de semillas, patologías, control de
maduración y estrategias post-cosecha y, por último, calidad de frutos como valor
añadido, entre otros. La maduración de los frutos es un proceso complejo en el
desarrollo de los mismos que conlleva una gran cantidad de cambios tanto a nivel
fisiológico como bioquímico (Palma et al., 2011b). En este estudio se ha comparado el
proteoma general de frutos de pimiento verdes y rojos y se han identificado las
proteínas diferenciales de cada tipo de fruto, así como las coincidentes entre ellos para
así intentar descubrir los eventos que subyacen a este importante proceso del desarrollo
en esta especie.
En la Tabla 1.4 se distribuyen las proteínas identificadas de acuerdo al grupo funcional
en el que se encuadran. Como se puede apreciar, muchas proteínas tienen un cierto
papel en los mecanismos de defensa, fundamentalmente relacionados con el
metabolismo antioxidante. Por otro lado, son de destacar también por su número las
proteínas relacionadas con el propio metabolismo proteico, tanto proteinasas como
aquellas implicadas en la síntesis de aminoácidos. Asimismos, se dará una visión
general de aquellas proteínas, de acuerdo a sus implicaciones nutricionales o de cierta
singularidad, habida cuenta de que hasta el momento se desconoce buena parte del
metabolismo de frutos de pimiento y, sobre todo, de cómo evoluciona éste durante la
maduración.
Capítulo 1
76
Tabla 1.4: Proteínas identificadas de frutos de pimiento y agrupadas por grupos funcionales.
Proteína Tipo de
pimiento
Grupo funcional
Catalasa Verde y rojo Metabolismo oxidativo
Superóxido dismutasa (SOD) Verde y rojo Metabolismo oxidativo
Ascorbato peroxidasa (APX) Verde y rojo Metabolismo oxidativo
Deshidroascorbato reductasa (DAR) Verde y rojo Metabolismo oxidativo
Glutatión reductasa (GR) Rojo Metabolismo oxidativo
Glutatión S-transferasa (GST) Verde Metabolismo oxidativo
Metionina sulfóxido reductasa A4
(MSR)
Verde y rojo Metabolismo oxidativo
Malato deshidrogenasa (MDH) Verde y rojo Metabolismo del malato
Ferredoxina NADP+ oxidorreductasa Verde y rojo Fotosíntesis
Fosforribuloquinasa Verde y rojo Fotosíntesis
Taumatina Verde Defensa frente a patógenos
Proteína 4b relacionada con
patogénesis
Verde Defensa frente a patógenos
Proteínas de choque térmico Verde Defensa
Harpina Verde Defensa
Proteína asociada BON1 Rojo Defensa
Osmotina Verde y rojo Defensa
Subtilisina Verde Enzimas proteolíticas
Leucina aminopeptidasa Verde y rojo Enzimas proteolíticas
Subunidad alfa proteasomal Verde y rojo Enzimas proteolíticas
Subunidad beta proteasomal Verde y rojo Enzimas proteolíticas
S-adenosilmetionina sintasa Verde Biosíntesis de Aminoácidos
Adenosil-homocisteinasa Verde Biosíntesis de Aminoácidos
Cisteína sintasa Verde y rojo Biosíntesis de Aminoácidos
Proteína de biosíntesis de arginina Verde Biosíntesis de aminoácidos
Anexina Verde Metabolismo secundario
Fenilalanina amonio liasa Rojo Metabolismo secundario
Progesterona 5 beta reductasa Rojo Metabolismo secundario
Proteína Ycf2 Rojo Síntesis de ATP
Citocromo C oxidasa subunidad II Verde y rojo Respiración mitocondrial
Calreticulina Verde Síntesis de proteínas
Anquirina Verde Transporte intracelular
Coatómero subunidad γ Verde Transporte intracelular
Lipocalina Rojo Transporte intracelular
Alfa manosidasa lisosomal Rojo Metabolismo de carbohidratos
Triosofosfato isomerasa Verde y rojo Metabolismo de carbohidratos
Factor de transcripción homeobox Rojo Transcripción de ADN
Proteína de biosíntesis de piridoxina Rojo Biosíntesis de vitaminas
La catalasa (EC 1.11.1.6) es una de las principales proteínas peroxisomales
relacionadas con la eliminación del peróxido de hidrógeno en células eucarióticas bajo
situaciones celulares normales y que además actúa como antioxidante en situaciones en
que se produce un estrés oxidativo (Palma et al., 2013). En estudios realizados en
nuestro laboratorio sobre el perfil de la catalasa en peroxisomas aislados tanto de frutos
Capítulo 1
77
de pimiento verde como rojo, se observó una actividad inferior en frutos maduros
(Mateos et al., 2003). Sin embargo, a nivel global la catalasa es una enzima que se
expresa tanto en condiciones de inmadurez de fruto como en éste ya maduro indicando
que en situaciones de estrés es también una defensa antioxidante primordial.
Las superóxido dismutasas (SODs; EC 1.15.1.1) son las enzimas encargadas
de eliminar el radical superóxido (O2.-) y se les considera las primera barrera de defensa
antioxidante (Halliwell and Gutteridge, 2007). Existen tres tipos distintos de SODs en
función del metal pesado que posean en el centro activo de la proteína (CuZn-SOD, Fe-
SOD y Mn-SOD) (Rodríguez-Serrano et al., 2007). El número y tipo de isoformas de
SOD varía en función de la especie de planta, del órgano, del estadio de desarrollo y de
las condiciones medioambientales. La sobreexpresión de las SODs está relacionada
normalmente con la defensa de plantas frente a estrés oxidativo generado tanto por
estrés biótico como abiótico, y juega un papel crucial en la supervivencia de la célula
bajo esas condiciones (Gill and Tuteja, 2010). En plantas, las SODs han sido
localizadas en distintos compartimentos subcelulares. Las CuZn-SOD se localizan a
nivel de cloroplastos citosol, peroxisomas y apoplasto. Las MnSOD a nivel de
mitocondrias y de peroxisomas. Y por último las Fe-SOD se localizan a nivel de
cloroplastos aunque también se han descrito en peroxisomas (Palma; Del Rio et al.,
1983; Salin, 1988; Ogawa, 1995; Corpas et al., 1998; Corpas et al., 2006b). Debido a
que las SODs tienen diferentes átomos presentes en el sitio activo, han sido
ampliamente estudiadas en la investigación frente a estrés en plantas causado por
metales pesados. En cultivares de pimiento con diferente sensibilidad al cadmio (Cd2+
),
se observó cómo este metal a concentraciones de 0,5 mM provocaba una leve
disminución de la actividad SOD. El crecimiento de las plantas de pimiento con 0,5 mM
de cadmio inhibió la actividad CuZn-SOD en todos los cultivares, a diferencia de la Fe-
SOD y de la Mn-SOD que aumentaron (León et al., 2002). A nivel subcelular también
se han estudiado los efectos del exceso de cobre (Cu2+
)usando cloroplastos y
peroxisomas aislados de plantas de guisante de dos cultivares con diferente sensibilidad
a este metal. En estos análisis se observó una elevada actividad Mn-SOD en
peroxisomas del cultivar tolerante, mientras que en el caso de las CuZn-SOD de los
cloroplastos de los dos cultivares no hubo diferencias (Palma et al., 1987).
Capítulo 1
78
La ascorbato peroxidasa (APX; EC 1.11.1.11 ), junto con la
deshidroascorbato reductasa (DAR; EC 1.8.5.1), la glutatión reductasa (GR; EC
1.8.1.7) y la monodeshidroascorbato reductasa (MDAR; EC 1.6.5.4) – no detectada en
este estudio – forman una unidad funcional denominada ciclo ascorbato-glutatión,
también llamado ciclo Foyer-Halliwell-Asada, en el que están implicadas las moléculas
citadas anteriormente que son de gran importancia en el metabolismo celular: ascorbato,
glutatión y NADPH. Así, este ciclo está encargado de la eliminación de peróxido de
hidrógeno con consumo de ascorbato y siendo estrictamente dependiente, como ciclo,
del aporte contínuo de NADPH (Asada, 2006).
La APX es una peroxidasa hemínica que lleva a cabo la primera reacción del
ciclo ascorbato-glutatión, al reducir el H2O2 a H2O empleando para ello, el ascorbato
como sustrato reductor, el cual se oxida a monodeshidroascorbato (MDA). Su
localización subcelular en plantas superiores es a nivel de citosol, cloroplastos,
mitocondrias y peroxisomas (Shigeoka et al., 2002). La DAR es otra enzima que, al
igual que las demás, ayuda a defender a la planta frente a los efectos nocivos de las
especies de oxígeno reactivo (ROS). La deshidroascorbato reductasa cataliza la
reducción del deshidroascorbato (DHA) a ascorbato (ASC), empleando para ello el
glutatión reducido (GSH) (Trumper et al., 1994). La (GR) es una flavoproteína que
cataliza la reducción del glutatión oxidado (GSSG) a glutatión reducido (GSH),
utilizando el NADPH como donador de electrones. Forma parte del ciclo ascorbato-
glutatión y por lo tanto es muy importante en la defensa de la planta frente al estrés
oxidativo. La GR se ha identificado en numerosas especies y tejidos vegetales, siendo
las más estudiadas las de guisante. A nivel de orgánulos se localizan en cloroplastos,
mitocondrias, citosol y peroxisomas (Romero-Puertas et al., 2006). En pimiento se ha
comprobado que, en general, tanto la catalasa, las superóxido dismutasas, así como las
enzimas del ciclo ascorbato-glutatión están implicadas en la respuesta de las plantas
frente a estrés por Cd (León et al., 2002) y por bajas temperaturas (Airaki et al., 2012)
en la germinación y etapas post-germinativas (Airaki et al., 2015), en la maduración de
los frutos (Jiménez et al., 2003; Mateos et al., 2003; Martí et al., 2009) y en la
respuesta de éstos frente a estrés por bajas temperaturas (Mateos et al., 2013).
Las glutation S-transferasas (GST; EC 2.5.1.13) son enzimas que ayudan a la
destoxificación celular ya que tienen actividad peroxidasa y se localizan principalmente
Capítulo 1
79
a nivel de citosol. Se ha sugerido que las GST actúan formando complejo con el
glutatión existente en el citosol para transformarlo en tiolato (GS-). Este tipo de enzimas
han sido bien caracterizadas en mamíferos (Sheehan et al., 2001). En plantas de
pimiento, la GST está implicada en la respuesta de la planta al herbicida 2,4-D (Mateos,
2006) y en la especie Amelanchier alnifolia (fresa de junio o sascatun) participa en la
maduración de los frutos (Rogiers et al., 1998).
Los residuos de metionina (Met) son especialmente sensibles a la oxidación por las
ROS, lo que produce sulfóxido de metionina (MetSO). Las metionina sulfóxido
reductasas (MSR) reparan los residuos oxidados de metionina y protegen a la planta
frente al estrés oxidativo (Liu and Wang, 2013). La modificación de las metioninas
origina cambios en la función y estructura de las proteínas. Por eso es tan importante la
existencia de estas proteínas que se expresan en casi todos los organismos y se han
relacionado con el retraso del envejecimiento celular y la progresión de enfermedades
neurodegenerativas (Kim and Gladyshev, 2007). Resultados en experimentos
realizados en arroz transfectado con el gen de pimiento CaMSRB2 indicaron que dicho
gen debía jugar un importante papel en los cloroplastos pues conferían tolerancia frente
a estrés por sequía (Kim et al., 2014). Recientemente, mediante análisis de
secuenciación masiva de plantas de Arabidopsis expuestas a GSH o S-nitrosoglutatión
(GSNO), se ha observado que la mayoría de los genes de MSR de hoja se inducían por
GSH, a excepción de MSRB7 (At4g21830) que se inducía por GSNO pero por GSH
(Begara et al., 2014), sugiriendo una clara relación entre metabolismo oxidativo y
nitrosativo de esta proteína.
La malato deshidrogenasa cataliza la reacción de oxidación del (S)-malato a
oxaloacetato utilizando NAD+ como aceptor de electrones. Esta enzima juega un papel
esencial en el transporte malato/aspartato a través de la membrana mitocondrial y en el
ciclo de los ácidos tricarboxílicos dentro de la matriz mitocondrial. Además aparece en
muchos compartimentos celulares y posee varias isoformas en función de su
localización (Minarik et al., 2002). Esta enzima al igual que la 3 cetoacil coA thiolasa
es procesada proteolíticamente antes de entrar en los peroxisomas por su extremo C-
terminal (Corpas et al., 1993b).
Capítulo 1
80
La ferredoxina NADP+ oxidorreductasa (FNR; EC 1.18.1.2) es una enzima
perteneciente a las flavoproteínas que emplea FAD como cofactor y está codificada por
una pequeña familia de genes nucleares de plantas superiores. Las isoformas
cloroplastídicas de FNR son las responsables del último paso del transporte de
electrones desde la ferredoxina al NADP+ para generar NADPH, el distribuidor del
poder reductor. Las FNRs se han encontrado en tres compartimentos dentro del
cloroplasto, en la membrana tilacoidal, en el estroma y en la pared interna
cloroplastídica (Mulo, 2011). La presencia de la FNR en frutos rojos de pimiento
sugiere que, esta enzima podría tener otra función adicional a la propia transferencia de
electrones provenientes del PSI, aunque tampoco se podría descartar la posibilidad de
que esta proteína fuera parte de los remanentes que quedan en la célula sin degradar (o
de degradación lenta), una vez que se desmantelan los cloroplastos.
Las proteínas relacionadas con la patogénesis (PRs) están relacionadas con una
gran cantidad de alérgenos y se inducen de manera específica en respuesta a infecciones
causadas por patógenos o por situaciones medioambientales desfavorables. Las PRs no
constituyen una superfamilia de proteínas sino que representan un grupo de familias de
proteínas no relacionasdas entre sí que funcionan como parte del sistema de defensa de
las plantas. Debido a la homología en las secuencias de una de las familias de PRs con
la taumatina, se ha denominado al conjunto de estas proteínas tipo taumatina o TLPs
(thaumatin-like proteins). Las TLPs pueden producirse como respuesta al ataque de
patógenos, en respuesta a estrés osmótico (en este caso se llaman osmotinas), o un
tercer grupo que son las TLPs antifúngicas que están presentes en semillas de cereales.
Las TLPs son resistentes a las proteasas, pH o calor y esto se debe a que poseen 16
cisteínas conservadas en su estructura que formas 8 puentes disulfuro (Breiteneder,
2004). Además, la taumatina es la proteína considerada como el edulcorante natural más
potente conocido. Es denominado en la legislación alimenticia con el código de
identificación E 957 (Kant, 2005). La taumatina en pimiento picante donde actúa como
alérgeno (Lee et al., 2009). También se ha propuesto que el gen PepTLP que codifica
una proteína de tipo taumatina en pimiento se puede usar como marcador molecular en
la resistencia a enfermedades, de maduración y en los casos de acumulación de azúcares
en los frutos (Kim et al., 2002).
Capítulo 1
81
Las proteínas de choque térmico o HSP (Heat shock proteins), son un conjunto
de proteínas que producen tanto los organismos unicelulares como los pluricelulares
cuando se encuentran en un medio ambiente que le provoca cualquier tipo de estrés.
Hay un tipo de HSPs conocidas como chaperonas, y dentro de estas últimas las
chaperoninas, que son vitales en procesos tales como síntesis de proteínas, unión de
complejos multiproteicos, transporte de proteínas a compartimentos celulares,
señalización celular, y reacción frente a estrés. Además, las HSPs pueden desencadenar
la respuesta inmune. Las HSP se clasifican en función de su peso molecular (hsp10,
hsp40, hsp60, hsp70, hsp90, etc.) (Li and Srivastava, 2004). La distribución subcelular
de estas proteínas en plantas superiores es amplia, citosol, cloroplastos, mitocondria,
retículo endoplasmatico, peroxisomas y núcleo (Haslbeck and Vierling, 2015). Se ha
descrito que el tratamiento de pimientos dulces con ácido jasmónico induce la síntesis
de HSPs, así como de otras proteínas PR o la oxidasa alternativa, lo que conlleva a una
mayor tolerancia a las bajas temperaturas (Wang et al., 2005).
La subtilisina es una endopeptidasa del tipo serín-proteinasa que está
relacionada con una gran variedad de procesos fisiológicos en plantas, como
senescencia, muerte celular programada, diferenciación de tejidos, germinación, etc
(Palma et al., 2002). En plantas, al igual que en animales, la muerte celular
programada (PCD) se produce en una gran variedad de situaciones incluidos el
desarrollo, así como la respuestas de defensa frente a estrés. En el reino animal son las
caspasas las que tienen un papel muy importante en la PCD, y en plantas se ha
establecido un paralelismo con las subtilisinas, ya que a pesar de que estructuralmente
no están relacionadas unas con las otras sí comparten la misma especificidad y función.
Se han descubierto alrededor de 50 genes que codifican subtilisinas en Arabidopsis
thaliana así como unos 60 en Oryza sativa (Vartapetian et al., 2011).
Las aminopeptidasas son un tipo de peptidasas que degradan el extremo amino
de las proteínas (exopeptidasas), liberando el aminoácido terminal. Las enzimas
proteolíticas juegan un papel esencial en procesos de maduración intracelular y reciclaje
de proteínas y, a nivel subcelular, se localizan en distintos compartimentos (Matsui et
al., 2006). Este tipo de enzimas se han descrito en peroxisomas de guisante (Corpas et
al., 1993b).
Capítulo 1
82
Las subunidades alfa y beta proteasomales forman parte del proteasoma que
es un complejo proteico de gran tamaño ubicado en el citosol que se encarga de realizar
la degradación de proteínas no necesarias o ya dañadas. Las proteínas que van a ser
degradadas por este complejo son marcadas por una pequeña proteína
llamada ubiquitina. Una vez que una de estas moléculas de ubiquitina se han unido a la
proteína a eliminar, se empiezan a agregar más proteínas de ubiquitina dando como
resultado la formación de una cadena poliubiquitínica (poliubiquitinación) que le
permite al proteasoma identificar y degradar la proteína. Hay tres tipos de proteosomas
funcionales: el proteosoma 26S, el proteosoma 30S, y el inmunoproteosoma. La forma
más común de proteasoma es el 26S que está compuesto por un núcleo de 20S y dos
subunidades reguladoras 19S. El complejo 20S está formado por 4 anillos, 2 alfa y 2
beta. El complejo 20S está formado por 4 anillos, 2 alfa y 2 beta, que dejan tres espacios
o cámaras internas entre ellos (precámara, cámara de reacción y postcámara). Los
anillos alfa y beta están, a su vez, formados por 7 subunidades cada uno de ellos. En la
cámara de reacción, cada subunidad beta deja su extremo amino con una treonina muy
reactiva hacia el interior de la cámara, que es el residuo que lleva a cabo la degradación
de proteínas (Palma et al., 2002). La actividad 26S y la 20S del proteasoma se regulan
para controlar el desarrollo de la planta y las respuestas a estrés (Kurepa et al., 2009;
Jung et al., 2013).
A nivel proteómico se han identificado estas enzimas tanto en extractos de fruto
verde como de fruto rojo puesto que la degradación de las proteínas oxidadas forma
parte de la protección del normal funcionamiento celular. Pero además, el hecho de que
este grupo de proteínas con actividad proteolítica (subtilisina, leucina
aminopeptidasasea y proteasoma) sea de los más abundantes en los frutos de pimiento
indica el gran dinamismo metabólico que se desarrolla durante la maduración.
La S-adenosilmetionina sintasa (también llamada ATP:L-metionina S-
adenosil-transferasa, y metionina adenosiltransferasa, entre otros términos)
cataliza la formación de S-adenosilmetionina desde la metionina y ATP y es el principal
donador de grupos metilo (Murray et al., 2014). En base a la importante función que
tienen estas proteínas (reacciones de transmetilación) se puede esperar que jueguen un
papel clave en la tolerancia de las plantas a estrés (Gong et al., 2014). A nivel
Capítulo 1
83
subcelular se han descrito en citoplasma y núcleo en células de epidermis de cebolla
(Quan et al., 2014).
La S-adenosilhomocisteinasa (SAHH) es la enzima que cataliza el catabolismo
de S-adenosilhomocisteína (SAH) a adenosina y L-homocisteína. Juega un importante
papel en la regulación de las reacciones de metilación en las células (la SAH se forma
por una reacción de transmetilación de la S-adenosil metionina y por lo tanto en la
concentración de adenosilhomocisteína intracelular (Chaki et al., 2009a). Se ha
encontrado actividad SAHH en mamíferos, aves, plantas y levaduras (Mull et al.,
2006). Las reacciones de transmetilación son esenciales para el desarrollo normal de las
plantas. A nivel subcelular se ha descrito en citoplasma y núcleo de Arabidopsis
thaliana (Lee et al., 2012). A la luz de nuestros resultados sobre la S-adenosilmetionina
sintasa y la SAHH, se podría afirmar que, posiblemente, la reacciones de
transmetilación y los procesos asociados tienen mayor repercusión en las etapas previas
a la maduración de los frutos.
La cisteína sintasa es la enzima encargada de generar cisteína a partir de serina.
La cisteína no sólo es un aminoácido proteinogénico, sino también un metabolito
regulador esencial en plantas. La asimilación de nutrientes es fundamental para el
crecimiento y el desarrollo vegetal, y también determina la respuesta de la planta a las
señales ambientales. La cisteína juega un importante papel en el metabolismo de las
plantas debido a que es una molécula que dona azufre reducido, lo que sirve para la
síntesis de biomoléculas esenciales y elementos de defensa. Además la cisteína es
esencial en el estado del mantenimiento redox celular. El azufre es un macronutriente
esencial para el crecimiento y el desarrollo de las plantas y la forma más abundante en
que éste se presenta en la naturaleza es en forma de sulfatos, el cual es tomado por las
plantas y asimilado en forma de cisteína. Además el grupo tiol de la cisteína es
susceptible de oxidación por lo que puede afectar a la estructura de las proteínas y como
consecuencia a su función (Romero et al., 2014). En plantas, las enzimas implicadas en
la síntesis de cisteína están presentes en el citosol, los plastidios y las mitocondrias
(Romero et al., 2014) habiéndose descrito también en los plastidios de fruto de
pimiento (Romer et al., 1992).
Capítulo 1
84
Las anexinas son proteínas multifuncionales de unión a lípidos dependientes de
Ca2+.
En plantas se expresan durante todo el ciclo de vida así como bajo control
medioambiental. Dentro de las funciones de estas proteínas se incluyen, la exocitosis,
unión a actina, actividad peroxidasa, regulación de la síntesis de calosa y transporte de
iones. Al ser proteínas capaces de unirse a Ca2+
actúan en el desarrollo y como
respuesta a condiciones bióticas y abióticas regulando el estado redox celular. Ha
habido estudios en los que se ha relacionado a la anexina con la maduración de frutos de
pimiento. El pimiento al ser un fruto no climatérico presenta un comportamiento
especial en respuesta a factores hormonales durante la maduración, en el que las
anexinas podrían jugar un papel clave (Proust et al., 1996; Delmer and Potikha, 1997;
Laohavisit and Davies, 2011). De hecho, se ha aislado y caracterizado la anexina p35 a
partir de frutos verdes de pimiento (Hoshino et al., 1995). Nuestro estudio corrobora
estos datos ya que sólo pudimos detectar esta proteína en los frutos verdes.
Posiblemente los procesos asociados al calcio sean más proclives en los frutos
inmaduros, pero es un tema que conviene estudiar con más profundidad. A nivel
subcelular se ha descrito en membrana plasmática de Gossypium hirsutum L. y de
Arabidopsis thaliana (Zhang et al., 2015).
La fenilalanina amonio liasa (PAL) es la principal enzima implicada en la
biosíntesis de compuestos fenólicos tales como los flavonoides. La PAL se encuentra
ampliamente distribuida en plantas, así como algunas levaduras y hongos. La actividad
de esta proteína se induce como respuesta ante las distintas situaciones de estrés
soportadas por la planta. La PAL está implicada en 5 vías metabólicas: metabolismo de
la tirosina, el metabolismo de la fenilalanina, el metabolismo del nitrógeno, la
biosíntesis de fenilpropanoides y biosíntesis de alcaloides. A nivel subcelular se ha
localizado en pared celular en uvas (Chen et al., 2006). La PAL se ha estudiado
recientemente para posibles beneficios terapéuticos en los seres humanos que sufren de
fenilcetonuria y además se ha utilizado en la generación de la L-fenilalanina en forma
de precursor del edulcorante aspartamo (Strisciuglio and Concolino, 2014; Valcárcel
et al., 2015). Dado que la capsicina, compuesto exclusivo que se encuentra en
determinadas variedades de pimientos picantes, es un derivado fenilpropanoide, es
lógico pensar que la PAL desempeñe un papel importante en las rutas metabólicas
ligadas a esta molécula. De hecho, se ha comprobado que la PAL, además de participar
Capítulo 1
85
en la biosíntesis de capsicina en condiciones normales (Pandhair and Sharma, 2008;
Phimchan et al., 2014), lo hace en situaciones de estrés por sequía (Phimchan et al.,
2014). En nuestro caso, la PAL sólo fue detectada en frutos rojos. Al ser una variedad
dulce, hay que descartar la implicación de esta enzima en metabolismo de
capsaicinoides.
Existen dos grandes genes en el genoma del cloroplasto ycf1 y ycf2 (Proteína
hipotética del cloroplasto RF2) de los cuales se desconoce su función, aunque hasta el
momento se han sugerido la síntesis de ATP, proteínas chaperonas, actividad en la
división celular, función estructural, detoxificación y respuesta a estrés (Wicke et al.,
2011). Es interesante destacar que esta proteína está fundamentalmente al cloroplasto,
pero, en nuestro caso, fue detectada en los frutos rojos y no en los verdes. Convendría
estudiar más profundamente este aspecto.
La cadena de transporte de electrones mitocondrial utiliza electrones desde un
donador ya sea NADH o FADH2 y los pasa a un aceptor de electrones final, como el O2,
mediante una serie de reacciones redox. Estas reacciones están acopladas a la creación
de un gradiente de protones generado por los complejos I, III y IV ubicados en la
membrana interna de la mitocondria. Dicho gradiente es utilizado para generar ATP
mediante la ATP sintasa, que se localiza en las proximidades de los complejos redox (I-
IV). El complejo IV o de la citocromo c oxidasa (CCO; EC 1.9.3.1) capta 4 electrones
de las cuatro moléculas de citocromo c y las transfiere al O2 para producir dos
moléculas de agua sin intermediarios reactivos de oxígeno (Dudkina et al., 2010). La
subunidad II de la CCO se detectó tanto en frutos verdes como rojos, lo que denota la
funcionalidad de la respiración mitocondrial, un hecho que está asociado a la evolución
de los frutos durante la maduración.
La calreticulina juega un importante papel en procesos celulares como
señalización por Ca2+
y plegamiento de proteínas. Estas proteínas se expresan en
situaciones de crecimiento de la planta y desarrollo así como en respuesta a estreses
tanto bióticos como bióticos. A nivel subcelular se localizan principalmente en retículo
endoplasmático (Jia et al., 2009). En pimiento se ha descrito una calreticulin peroxidasa
que tiene una regulación positiva por el factor de transcripción SREBP (Sterol
Regulatory Element-Binding Proteins) (Hwang et al., 2004).
Capítulo 1
86
Las anquirinas son una familia de proteínas adaptadoras (en realidad una
secuencia polipeptídica repetitiva de unos 30-34 aminoácidos) que median la unión
de las proteínas integrales de membrana al citoesqueleto, en un proceso dependiente de
Ca2+
y que, en algunos casos está directamente implicada en el desarrollo del cáncer y
otras enfermedades (Li et al., 2006). A nivel subcelular se localizan en membrana
plasmática y citoplasma (Ueki et al., 2010). Se ha demostrado que 3-4 repeticiones de
la anquirina están presentes en el extremo amino terminal del receptor de la capsaicina
TRP. Los TRPs (transient receptor potential) son una subfamilia de receptores de la
capsaicina que poseen seis dominios transmembrana, con un canal para iones, de 3-4
anquirinas y un dominio TRP propiamente dicho formado por 25 aminoácidos en el
extremo carboxílico (Nakagawa and Hiura, 2006). La presencia de esta proteína en los
frutos verdes de pimiento es un fenómeno extraño, ya que sería el primer caso descrito
sobre la existencia de este polipéptido en plantas.
El coatómero, γ, pertenece a un grupo de proteínas denominadas
“coatómero” que es un complejo citosólico formado por 7 proteínas “coat” (α-COP, β-
COP, β′-COP ,γ-COP, δ-COP ε-COP, and δ-COP). Su función está relacionada con el
transporte de proteínas desde el retículo endoplasmático hasta el aparato de Golgi
(Kimata et al., 2000). Al igual que como ocurría con la anquirina, la presencia de la
subunidad γ del coatómero en frutos de pimiento sería algo excepciona ya que, aunque
este polipéptido se ha descrito en determinadas situaciones y tejidos en plantas
(Langhans et al., 2008; Ostertag et al., 2013) no es un evento común, y su descripción
en frutos es, hasta ahora, inexistente.
La harpina es una proteína rica en glicina estable frente a calor secretada por
bacterias patógenas de plantas. Muchos estudios han descrito cómo estas proteínas se
dirigen al espacio extracellular de los tejidos de las plantas a diferencia de las proteínas
efectoras de bacterias que van al interior de las células desencadenando la respuesta
hipersesitiva. Cuando las harpinas se han aplicado a las plantas directamente o se han
expresado en células vegetales han aportado muchas respuestas beneficiosas de defensa
frente a determinados patógenos, así como estimulado el crecimiento de la planta (Choi
et al., 2013). En pimiento se ha comprobado que el tratamiento con harpina aumenta la
vida media de los frutos afectados por Botrytis cinérea (Akbudak et al., 2009; Tezcan
et al., 2013b) o Verticillium dahliae (Tezcan et al., 2013a) o Phytophthora capsicii
Capítulo 1
87
(Roberts et al., 2010) entre otros. En algunos casos se ha empleado el gen de una
proteína tipo ferredoxina vegetal (PFLP, plant ferredoxin-like protein), característica de
pimiento dulce para mimetizar los efectos de la harpina en plantas transfectadas con
dicho gen e inoculadas con diversos patógenos (Lin et al., 2010; Tripathi et al., 2013;
Ger et al., 2014).
La α-manosidasa lisosomal es una proteína encargada de las síntesis de la
manosa que en humanos es la responsable de una enfermedad autosómica dominante
que causa deficiencia en el almacenamiento en los lisosomas cuando existe una
deficiencia en la misma. La enzima de frutos de pimiento fue la primera que se purificó
y se caracterizó a partir de estos órganos vegetales (Sethu and Prabha, 1997). En
pimiento se ha descrito que esta enzima muestra baja actividad durante la maduración
(Tan et al., 2012) aunque también se ha comprobado que esta enzima incrementa la
vida media de los frutos (Ghosh et al., 2011).
Los cardenólidos son un tipo de esteroides (alcaloides indol monoterpernoides,
entre ellos) que poseen las plantas y que a menudo actúan como toxinas. La
progesterona-5.- reductasa (PR) es una familia de proteínas que forman parte de la
ruta biosintética de estos compuestos y que podría actuar en el metabolismo secundario
de la planta (Gartner et al., 1990). Recientemente se ha detectado también esta proteína
en fibra de algodón mediante análisis proteómico, y se le ha atribuido una función
relacionada con la pigmentación de dicha fibra (Li et al., 2013b). No hay datos sobre
esta enzima en pimiento, pero el hecho de que la capsicina sea un alcaloide hace pensar
que la PR pueda ser un elemento fundamental en el metabolismo de esta especie, sobre
todo en las variedades picantes.
88
ÍT 2: T T F T
F T .
89
T
Capítulo 2
90
OBJETIVO: Estudio de las modificaciones post-traduccionales de las proteínas
mediante nitroproteómica en extractos de fruto de pimiento verde y rojo, así como el
estudio del efecto del NO sobre la maduración de los frutos.
El óxido nítrico (NO) es un gas radical a partir del cual se forman algunas
moléculas derivadas como el S-nitrosoglutatión (GSNO) y el peroxinitrito (ONOO-),
dióxido de nitrógeno (NO2) entre otras. Todas ellas son las denominadas especies de
nitrógeno reactivo (RNS). El metabolismo de las RNS y sus implicaciones fisiológicas
han sido estudiadas ampliamente en células animales. Sin embargo, poco se sabe sobre
su papel en la células de las plantas. Se ha descrito cómo el NO produce modificaciones
post-traduccionales (PTMs) en las proteínas. La importancia de este fenómeno radica en
que dichas modificaciones intervienen en diferentes procesos fisiológicos a través de
mecanismos de señalización celular (Radi, 2004; Ischiropoulos and Gow, 2005;
Corpas et al., 2007; Corpas et al., 2009b; Corpas and Barroso, 2014). Dentro de las
PTMs mediadas por las RNS se incluyen procesos de nitración de tirosinas,
nitrosilación de grupos tioles y nitrosilación metálica de proteínas (Gow et al., 2004).
Nitración de proteínas
La nitración de proteínas es el proceso por el cual se añade un grupo NO2 a uno de los
dos carbonos en posición orto de un residuo de tirosina. Esto convierte a la tirosina en
una nitrotirosina hidrofílica cargada negativamente lo que causa un cambio pronunciado
en el pKa local del grupo hidroxilo variando de 10.07 en la tirosina a 7.50 en la
nitrotirosina (Turko and Murad, 2002). Esta modificación post-traduccional de las
proteínas es considerada un proceso selectivo, puesto que depende de diversos factores
como la estructura de la proteína, y además afecta a un número reducido de proteínas,
así como a unas pocas tirosinas dentro de cada proteína (Corpas et al., 2009b).
La nitración se ha usado tradicionalmente como un marcador de enfermedad y
estrés oxidativo en células animales (Ischiropoulos, 2003), mientras que en plantas se
ha estudiado bajo condiciones de estrés biótico (Chaki et al., 2009a) y abiótico, tal
como salinidad (Valderrama et al., 2007; Corpas et al., 2009c; Tanou et al., 2012),
temperatura (Chaki et al., 2011; Airaki et al., 2012), y concentraciones controladas de
Capítulo 2
91
arsénico (Leterrier et al., 2012). Sin embargo, a día de hoy existe poca información
disponible sobre la nitración de las proteínas durante los procesos de desarrollo y
senescencia en plantas superiores (Begara-Morales et al., 2013).
Óxido nítrico y desarrollo en plantas
En mamíferos, el NO juega un papel fundamental en gran cantidad de procesos
fisiológicos (Hirst and Robson, 2011). Sin embargo, el papel de esta molécula en
procesos de desarrollo no es tan conocido. Experimentos llevados a cabo mediante la
eliminación de los genes NOS no han provocado graves alteraciones en el desarrollo en
tejidos animales de diverso origen (Huang et al., 1993; Lee et al., 2000). No obstante,
se ha descubierto el papel del NO en el desarrollo del corazón en el que una deficiencia
de la eNOS causa defectos congénitos como hipertrofia cardíaca y fallos cardíacos post-
natales. Asimismo, se sabe que la eNOS es crucial en las principales arterias coronarias
y en el desarrollo de los capilares del miocardio (Liu and Feng, 2012; Yu et al., 2014).
En plantas se está considerando el papel del NO en los últimos años, como
regulador del crecimiento, del desarrollo, de la inmunidad y de las interacciones
medioambientales de las plantas (Yu et al., 2014). El NO interviene en los procesos de
desarrollo de las plantas tales como germinación (Beligni et al., 2002), desarrollo de las
flores (Lee et al., 2008; Kwon et al., 2012), momento de floración (He et al., 2004;
Kwon et al., 2012), crecimiento de raíces y su desarrollo, etc. (Corpas et al., 2006a;
Fernández-Marcos et al., 2011; Kwon et al., 2012; Yu et al., 2014).
El desarrollo de la planta consta de diferentes fases que son: crecimiento
vegetativo, fase reproductiva y senescencia.
Durante la senescencia se produce un incremento de las ROS que desbordan los
sistemas antioxidantes de la planta causando un desequilibrio en el estado redox celular
lo que provoca un daño oxidativo que deviene, por tanto, en muerte celular (Thompson
et al., 1987; Procházková, 2007).
Por el contrario, los cambios que se producen en la senescencia en los niveles
de NO y en las RNS son menos conocidos (Procházková and Wilhelmova, 2011). El
NO afecta a la biosíntesis de etileno, que es un factor promotor de la senescencia, y por
tanto se ha descrito que ambos gases actúan de modo antagónico (Procházková and
Wilhelmova, 2011). En investigaciones llevadas a cabo sobre el efecto del NO en el
Capítulo 2
92
metabolismo de las plantas se ha observado que un aporte de NO exógeno puede
retrasar la senescencia de flores y de vegetales así como la maduración de los frutos
(Leshem and Pinchasov, 2000), a diferencia de lo que ocurría con la producción de
etileno. De hecho, Leshem and Haramaty (1996) mostraron cómo la aplicación de un
donante de NO sobre hojas senescentes de guisante (Pisum sativum) reducían la
producción de etileno (Leshem and Haramaty, 1996). En hojas de arroz (Oryza sativa),
la aplicación de NO exógeno contrarresta la senescencia inducida por ácido abcísico
(Hung and Kao, 2003) y puede retrasar la muerte celular programada en las capas de
aleurona de cebada (Hordeum vulgare) (Beligni et al., 2002). Sin embargo, elevados
niveles de NO exógeno son tóxicos. Selçukcam y Cevahir describieron que el efecto del
NO sobre la senescencia de las hojas de girasol (Helianthus annuus L.) es dependiente
de concentración. Así, el SNP (nitroprusiato sódico) a una concentración del 0,1 M
retrasa la senescencia mientras que a 400 M la induce (Selçukcan and Cevahir,
2008).
Recientemente se ha descrito cómo el uso de una mezcla sólida formada por
dietilentriamina-óxido nítrico (DETANO), que libera NO, aumenta la vida post-cosecha
de determinadas hortalizas (Wills et al., 2007).
A día de hoy existe un consenso sobre cómo el NO interviene en gran cantidad
de funciones biológicas durante el crecimiento, desarrollo, respuesta a señales
medioambientales e incluso en la respuesta inmune en plantas (Delledonne et al., 2001;
Neill et al., 2008a; Airaki et al., 2012; Begara-Morales et al., 2013). Los cambios
locales en el estado redox celular o subcelular afectan a varios aspectos de la fisiología
de las plantas, al igual que ocurre en mamíferos. A pesar de que en los últimos 15 años
se han llevado a cabo numerosos e importantes descubrimientos en la biología del NO,
aún quedan importantes cuestiones referentes a dicha molécula. No sólo el
descubrimiento del gen que codifica la NOS en plantas superiores, sino cuáles son las
rutas de señalización completas en las que esta molécula y sus derivados intervienen y
por tanto, cual es su papel global durante el desarrollo de las plantas (Yu et al., 2014).
Capítulo 2
93
RESULTADOS
Capítulo 2
94
2.1.- Detección de proteínas nitradas en extractos crudos de pimiento
Mediante western blotting se ha estudiado el patrón de las proteínas nitradas en
extractos crudos de pimiento verde y rojo, observándose un total de 10 bandas
immunoreactivas predominantes, con un tamaño molecular aparente comprendido entre
89 y 25 kDa. Dicho análisis mostró cómo la intensidad de las bandas polipeptídicas de
tamaño 79, 63, 44 y 25 kDa aumentaba en los frutos rojos con respecto a los verdes.
Además las bandas de tamaño 89, 50, 32 y 28 Kda eran exclusivas de frutos rojos,
mientras que las bandas corespondientes a los tamaños 70, 72 y > 90 kDa aparecen sólo
en los frutos verdes (Figura 2.1).
Figura 2. 1: Patrón de proteínas nitradas en extractos
crudos de pimiento verde y rojo. Se cargaron 30 g de
proteínas que fueron sometidas a EGPA-SDS en geles
preparados al 12% de poliacrilamida. A continuación las
proteínas nitradas fueron detectadas mediante western
blotting, en membrana de PVDF, usando un anticuerpo
policlonal frente a la 3-nitrotirosina de conejo en
dilución 1:8.000. Se usó BSA nitrada (NO2-BSA) como
control positivo. Los valores que se muestran a la
derecha corresponden a los tamaños estimados de las
principales bandas inmunoreactivas detectadas. PV:
pimiento verde, PR: pimiento rojo.
2.2.- Análisis de las proteínas nitradas mediante electroforesis bidimensional (2-D)
e inmunoblot
Mediante electroforesis bidimensional (2-D), se ha estudiado el patrón de las proteínas
nitradas en extractos de fruto de pimiento verde y rojo en muestras previamente
concentradas con acetona al 70% (v/v, volumen final), usando un anticuerpo frente a la
3-nitrotirosina. Para ello se realizaron dos réplicas de cada muestra. El primer gel fue
teñido con el compuesto fluorescente Sypro Ruby y analizado posteriormente con el
programa bioinformático PDQuest, mientras que el segundo gel fue transferido a una
membrana de nitrocelulosa e incubado con el anticuerpo anteriormente indicado. Los
resultados de ambos geles se compararon y los puntos coincidentes entre uno y otro
fueron los seleccionados para estudios proteómicos posteriores. En fruto de pimiento
Capítulo 2
95
verde fueron reconocidos 15 polipéptidos por el anticuerpo frente a la nitrotirosina y
en fruto de pimiento rojo fueron reconocidos 14 polipéptidos (Figuras 2.2, 2.3 y 2.4).
Figura 2.2: Imagen representativa de electroforesis 2-D correspondiente al extracto crudo de fruto de
pimiento verde. 60 g de proteínas fueron sometidas a electroforesis bidimensional y a continuación el
gel fue teñido con el compuesto fluorescente Sypro Ruby (BioRad). A la izquierda se indican los
marcadores de peso molecular y en la parte superior el pH correspondiente a la primera dimensión. Sobre
el gel se indican los polipéptidos que reconocían el anticuerpo frente a la 3-nitrotirosina (ver Figura 4)
Capítulo 2
96
Figura 2.3: Imagen representativa de electroforesis 2-D correspondiente al extracto de fruto de pimiento
rojo. 60 g de proteínas fueron sometidas a electroforesis bidimensional y a continuación el gel fue teñido
con el compuesto fluorescente Sypro Ruby (BioRad). A la izquierda se indican los marcadores de peso
molecular y en la parte superior el pH correspondiente a la primera dimensión. Sobre el gel se indican los
polipéptidos que reconocían el anticuerpo frente a la 3-nitrotirosina (ver Figura 4)
Capítulo 2
97
Figura 2.4: Inmunoblot representativo correspondiente a proteínas nitradas de frutos de pimiento verde y
rojo. 60 g de proteínas fueron sometidas a electroforesis bidimensional y posteriormente transferidas a
una membrana de nitrocelulosa, la cual fue incubada con un anticuerpo frente a la 3-nitrotirosina diluido
1:8.000. A) Fruto de pimiento verde; B) Fruto de pimiento rojo.
2.3. Identificación de proteínas nitradas y análisis mediante MALDI-TOF/TOF
Mediante análisis por espectrometría de masas a partir de los polipéptidos seleccionados
se identificaron un total de 9 proteínas nitradas entre los frutos de pimiento verde y rojo,
aunque cuatro de ellas se corresponden con variantes de catalasa. En la Tabla 2.1 se
indican algunas características moleculares de dichas proteínas, además del número de
acceso de cada una de ellas en la base de datos Uniprot y su integración en grupos
funcionales.
Capítulo 2
98
Tabla 2.1: Los extractos de proteínas concentradas de fruto de pimiento verde y rojo (Capsicum annuum
L.) fueron sometidos a electroforesis bidimensional y posterior inmunoblot con anticuerpo frente a la 3-
nitrotirosina. Las proteínas identificadas fueron analizadas por espectrometría de masas (MALDI-TOF)
tras su digestión con tripsina. MASCOT fue el motor de búsqueda elegido para identificar las proteínas
desde secuencias primarias lanzadas en bases de datos. Un valor mayor del 99% en el intervalo de
confianza de la puntuación asignada por MASCOT (protein score C.I %) indica una elevada probabilidad
de que la proteína haya sido correctamente identificada. Pep.count: número de péptidos identificados;
MW: peso molecular; pI: punto isoeléctrico. Acc.no/Uniprot: identificación de la proteína en la base de
datos Uniprot.
Proteína
identificada
Tipo de
fruto
Acc.no/
Uniprot
Protein Score
CI%/pep.count
MW/pI Grupo
funcional
Gliceraldehido 3-
fosfato
deshidrogenasa
dependiente de
NADP (putativa)
Verde D7U1A1 100/7 53824,7/6,76 Metabolismo
redox
Transcetolasa 1 Verde O78327
100/18 80397,7/6,16 Metabolismo
de
carbohidratos
Subunidad tipo alfa
proteasomal
Verde Q8H1Y2
100/8 30142,9/5,07 Metabolismo
de proteínas
Catalasa, isoenzima
1
Verde P49319
100/14 57301,4/6,6 Metabolismo
redox
Catalasa, isoenzima
2
Verde P49316
100/9 57317,6/6,75 Metabolismo
redox
Catalasa Verde y
rojo
Q9M5L6
100/8 56957,4/7,31 Metabolismo
redox
Catalasa Rojo P55311
100/26 57097,5/6,86 Metabolismo
redox
Glutamato sintasa 1
dependiente de
ferredoxina
(putativa)
Rojo B5LAU8
99.9/17 179205,1/6,1
1 Biosíntesis de
glutamato
Proteína portadora
en la enfermedad de
Graves (putativa)
Rojo B9RQR8
99.9/11 37639,8/9,84 Transporte a
través de
membrana
(metabolismo
oxidativo)
Capítulo 2
99
2.4. Nitración de catalasa
Teniendo en cuenta que la catalasa y algunas de sus variantes aparecen como la
principal proteína nitrada tanto en frutos verdes como en rojos, se llevó a cabo un
análisis in vitro del efecto de la nitración de esta proteína mediante el empleo de SIN-1
(3-morpholinosydnonimine). El efecto de este compuesto sobre la actividad enzimática
de la catalasa se muestra en la figura 2.5. El tratamiento con SIN-1, a una concentración
2 mM, produjo un descenso pronunciado de la actividad enzimática, tanto en frutos
verdes como en rojos. Los resultados presentados en esta figura coinciden, por otro
lado, con los obtenidos anteriormente que mostraban que la actividad catalasa es mayor
en frutos verdes que en rojos (Mateos et al., 2003). Esto se correspondía, además, con
nuestros datos de inmunoblot que revelaban un mayor reconocimiento en los
peroxisomas verdes con el anticuerpo policlonal frente a catalasa (Figura 2.5).
Figura 2.5: Efecto del SIN-1 en la actividad catalasa de frutos de pimiento. Los extractos crudos de
frutos verdes y rojos se incubaron en ausencia y en presencia de SIN-1 2 mM, determinándose
posteriormente la actividad catalasa (gráfico). Se llevaron también a cabo ensayos de inmunoblotting en
frutos verdes y rojos, usando un anticuerpo frente a una secuencia consenso interna de la catalasa de
pimiento (foto superior).
Capítulo 2
100
DISCUSIÓN
Capítulo 2
101
El NO es un gas radical que se genera de manera natural en las células. El óxido nítrico
no sólo actúa como importante molécula señal en animales sino que en plantas
interviene en ciertos momentos del crecimiento y del desarrollo, e incluso en respuestas
a estrés (Beligni et al., 2002; Zafra et al., 2010). Así, se ha descrito que el NO es
considerado como una molécula señal clave relacionada con las respuestas de defensa
frente a estrés tanto biótico como abiótico (Delledonne et al., 2001; Neill et al., 2008a;
Corpas et al., 2011; Airaki et al., 2012) y por su papel como regulador del crecimiento,
del desarrollo, la inmunidad y de las interacciones con el medioambiente (Yu et al.,
2014). El NO participa en procesos tales como la germinación de semillas (Beligni et
al., 2002) y desarrollo de las flores (He et al., 2004; Lee et al., 2008; Kwon et al.,
2012), crecimiento y desarrollo de raíces (Corpas et al., 2007; Fernández-Marcos et
al., 2011; Kwon et al., 2012; Yu et al., 2014) y senescencia (Corpas et al., 2004;
Corpas et al., 2006a; Procházková and Wilhelmova, 2011; Begara-Morales et al.,
2013; Khan, 2014). En este trabajo se ha descrito el efecto que tiene el NO sobre la
maduración de los frutos de pimiento para así ampliar el conocimiento y utilizarlo como
estrategia de cultivo y/o post-cosecha en el futuro. De hecho, en trabajos realizados
recientemente en nuestro laboratorio se ha demostrado que el NO retrasa la maduración
de los frutos de pimiento y se ha propuesto un modelo sobre cómo están relacionados
ambos eventos (Chaki et al., 2015).
Se sabe cómo el NO afecta a la biosíntesis de etileno y se ha descrito el papel
antagónico de ambos gases (Procházková and Wilhelmova, 2011). De hecho, el NO
afecta la producción de etileno en Arabidopsis thaliana como consecuencia de la S-
nitrosilación de la metionina adenosíltransferasa, una enzima implicada en la síntesis de
la S-adenosílmetionina, precursos del etileno (Lindermayr et al., 2006). Algunos
trabajos pioneros en este campo revelaron que la adición exógena de NO en forma
líquida (como SNP, NONOato o como nitrosoglutation, GSNO), y no como gas,
producían un retraso en la senescencia de flores y hojas, así como en maduración de
frutos de plátano (Leshem and Pinchasov, 2000). La maduración de los frutos es un
proceso controlado genéticamente, que está asociado a la senescencia de las plantas en
el que normalmente se produce un aumento en la generación de especies de oxígeno
reactivo (ROS). De hecho, los pimientos maduros presentan una tasa de peroxidación
lipídica superior al de pimientos verdes (Martí et al., 2011). Sin embargo, en esta
Capítulo 2
102
Memoria Doctoral se demuestra la correlación existente entre la maduración de frutos
de pimiento con un aumento en el número de proteínas nitradas.
La nitración de las tirosinas de las proteínas es una modificación post-traduccional
mediada por el NO que puede causar alteraciones en las funciones de las mismas
(Corpas et al., 2013c). Tradicionalmente se ha usado la nitración como marcador de
estrés nitrosativo en células animales y de plantas (Ischiropoulos, 2003; Chaki et al.,
2009b; Corpas et al., 2009c; Airaki et al., 2012). Teniendo en cuenta que la
maduración de los frutos es un complejo proceso en el desarrollo de los mismos que
conlleva una gran cantidad de cambios tanto a nivel fisiológico como bioquímico
(Palma et al., 2011b), se ha pretendido establecer la relación existente entre dicho
proceso y el posible nivel de estrés al que quedan sometidas las células durante la
maduración, usando para ello como parámetro la nitración de las proteínas. Mediante un
anticuerpo frente a la nitrotirosina se detectaron las proteínas nitradas en extractos de
frutos de pimiento verde y rojo. El estudio mostró cómo aparece un mayor número de
proteínas nitradas en pimiento rojo (maduro) que en pimiento verde. Las proteínas
nitradas se identificaron mediante análisis proteómicos y se vio que la mayoría de ellas
estaban relacionadas con el metabolismo oxidativo y, en menor medida, con el
metabolismo de carbohidratos y del glutamato. La poca información disponible sobre el
genoma del pimiento dulce y las limitaciones en la ejecución de los análisis es lo que
hace que el número de proteínas identificadas sea considerablemente bajo.
En muestras de fruto verde se identificó la gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa dependiente de NADP (EC 1.2.1.9), que es una enzima perteneciente
a la familia de las aldehído deshidrogenasas, las cuales poseen una importante función
generadoras de NADPH en las rutas biosintéticas
(http://www.uniprot.org/uniprot/Q1WIQ6 y referencias incluidas en este portal). En el
caso de frutos de pimiento esta enzima debe jugar un papel crucial, ya que se ha
demostrado que el NADPH y otras deshidrogenasas están relacionadas con procesos de
maduración (Mateos et al., 2009). Se ha descrito también cómo esta enzima es
susceptible de nitración en plántulas de Arabidopsis thaliana (Lozano-Juste et al.,
2011).
La transcetolasa (EC 2.2.1.1) cataliza dos reacciones opuestas, en el ciclo de
Calvin, y en el de las pentosas fosfato, pero además produce 4fosfo-eritrosa que es el
Capítulo 2
103
precursor de la ruta del siquimato lo que inicia el metabolismo de los fenilpropanoides
(Flechner et al., 1996; Henkes et al., 2001). Los fenilpropanoides son una importante
clase de metabolitos secundarios que participan en la estructura celular de las plantas,
defensa y mecanismos de señalización (Dixon and Paiva, 1995). Estos compuestos
derivan de aminoácidos aromáticos que son sintetizados mediante la ruta del siquimato
en los plastidios (Henkes et al., 2001). Teniendo en cuenta el papel de la transcetolasa
en la fotosíntesis, nuestros resultados indican que ésta podría ser un punto de regulación
en la transición de cloroplastos a cromoplastos que acompañe a la pérdida del aparato
fotosintético durante la maduración de los frutos. También se ha descrito cómo la
transcetolasa es potencialmente nitrada en plántulas de Arabidopsis thaliana (Lozano-
Juste et al., 2011).
Recientemente, se ha demostrado que la oxidación de las proteínas es una
consecuencia de la maduración de los frutos de pimiento (Martí et al., 2011). La
glutamato sintasa 1 dependiente de ferredoxina, (EC 1.4.7.1; también denominada
Fd-GOGAT; http://www.uniprot.org/uniprot/Q9ZNZ7), que se encontró en frutos de
pimiento rojo, es una enzima cloroplastídica responsable de la biosíntesis del glutamato
en hojas y que se necesita para la reasimilación del ión amonio generado durante la
fotorrespiración, así como para la asimilación del nitrógeno primario (Coschigano et
al., 1998; Jamai et al., 2009; Potel et al., 2009). La fotorrespiración ocurre en tres
orgánulos distintos, cloroplastos, peroxisomas y mitocondrias. A pesar de que la
fotorrespiración está asociada a los tejidos verdes en plantas, esta ruta metabólica
funciona también en frutos de pimiento rojos como ya se demostró en estudios de las
enzimas fotorrespiratorias glicolato oxidasa e hidroxipiruvato reductasa realizados en
peroxisomas purificados a partir de frutos de pimiento (Mateos et al., 2003). Por tanto,
los resultados mostrados en este trabajo aportan evidencias sobre la modulación de la
provisión de metabolitos desde la fotorrespiración en frutos de pimiento rojo maduro a
nivel de la Fd-GOGAT.
La proteína transportadora de la enfermedad de Graves es una proteína que
se localiza a nivel de la membrana mitocondrial interna y que pertenece a la familia de
proteínas transportadoras de metabolitos (incluidos traslocadores de ADP/ATP, un
transportador fosfato y una proteína desacopladora del ión hidrógeno) y que se
requieren para la acumulación del coenzima A en la matriz mitocondrial (Prohl et al.,
Capítulo 2
104
2001). Esta proteína es reconocida por la IgG en pacientes que padecen la enfermedad
de Graves, que es una trastorno autoinmune en humanos y que su homología en plantas
no se había descrito hasta ahora.
La catalasa aparece como la proteína nitrada más abundante. En estudios
pioneros sobre el perfil de la catalasa en peroxisomas aislados tanto de frutos de
pimiento verde como rojo, se observó una actividad de esta enzima que era inferior en
los frutos maduros (Mateos et al., 2003). Los resultados aquí aportados evidencian que
esta reducción no sólo se debe a un contenido menor en catalasa en frutos de pimiento
rojo, sino a la nitración potencial que ocurre durante el proceso de maduración en estas
especies. La disminución de catalasa en frutos rojos implica una menor capacidad para
eliminar H2O2, lo que conlleva el aumento de peroxidación lipídica ya descrito en frutos
de pimiento maduros (Martí et al., 2011).
Otro polipéptido cuya nitración se ha detectado en frutos verdes es la subunidad
alfa del proteasoma 20S. La nitración de la esta subuindad proteasomal que ocurre en
frutos de pimiento verde indica el papel de este sistema en la maduración de los frutos
de pimiento, como ya se discutió en el capítulo anterior.
Por tanto, los resultados presentados en esta memoria constituye un hito importante en
el metabolismo de las RNS en frutos de plantas superiores durante el proceso de
maduración. Sin embargo, serían necesarios estudios complementarios para profundizar
el cómo el metabolismo del NO influye en el conjunto de procesos que transforman de
verde a rojo los frutos, en plantas de pimiento.
105
ÍT 3: F
X
F T T (Capsicum
annuum .): X
T F ÁT .
Capítulo 3
106
T
Capítulo 3
107
OBJETIVO: Estudio de la implicación del metabolismo de los peroxisomas en la
maduración del fruto de pimiento mediante aproximaciones novedosas, concretamente
proteómica y bioinformática.
Uno de los principales acontecimientos que tuvo lugar durante la evolución fue la
subdivisión de las células eucarióticas en compartimentos subcelulares limitados por
membranas para optimizar las funciones fisiológicas. Cada compartimento celular
desempeña unas funciones propias y, por lo tanto, las células deben ser capaces de
dirigir cada proteína a su orgánulo correspondiente (Gould et al., 1988). Para
comprender la compartimentalizacion de las rutas metabólicas y de transducción de
señales, los proteomas de los orgánulos celulares deben ser definidos en toda su
complejidad (Lingner et al., 2012). De manera general los estudios de proteómica no
solo generan listas completas de proteínas sino que también manifiestan la abundancia
de éstas y su actividad. Nuevos avances en bioquímica, en espectrometría de masas y
sobre todo en bioinformática han aumentado considerablemente el número de proteínas
identificadas, sus modificaciones post-traduccionales y su ubicación dentro de la célula.
En este capítulo nos centraremos en el impacto que ha tenido el progreso en estas
técnicas sobre la composición proteica subcelular y más concretamente a nivel de los
peroxisomas (Saleem et al., 2006).
Hace años se acordó el concepto de “atlas proteico” en particular para la
descripción del proteoma humano (http://www.proteinatlas.org/). Este concepto
relaciona la creación de listas de proteínas para cada órgano y localización subcelular,
además proporciona información adicional sobre las modificaciones post-
traduccionales, empalme alternativo de proteínas (alternarive splicing), etc.
Actualmente dichas listas se están ampliando para generar el proteoma de las distintas
especies de plantas en las que exista información sobre los diferentes órganos y
estructuras subcelulares (van Wijk and Baginsky, 2011).
Proteoma de orgánulos subcelulares
Los plastidios son los orgánulos de la célula vegetal que llevan a cabo las funciones
más esenciales en el metabolismo de la planta. Dentro de estas se incluyen la
Capítulo 3
108
fotosíntesis, la biosíntesis de aminoácidos y ácidos grasos, así como la síntesis de
numerosos metabolitos secundarios (van Wijk and Baginsky, 2011). Es por ello que el
proteoma de los plastidios y en particular de los cloroplastos ha sido objeto de atención
en los últimos años y de hecho son los orgánulos celulares mejor caracterizados a nivel
proteico. Se calcula que el tamaño del proteoma de los plastidios oscila entre las 2.000 y
3.500 proteínas en Arabidopsis. Sin embargo, sólo se han descrito como proteínas
plastidiales alrededor de 1.200. Las razones por las que se ha subestimado este número
es: a) que se trate de proteínas poco abundantes o que su detección se vea “ocultada”
por otras proteínas fotosintéticas; b) que se expresen de manera diferencial en algunos
tipos de plastidios y no en cloroplastos; c) que sólo se expresen bajo determinadas
condiciones; o d) que sean altamente ionizables, es decir, que se dividan en sus péptidos
con facilidad. Existen distintas bases de datos tales como AtProteome (http://gator.
mascproteomics.org/), PPDB (http://ppdb.tc.cornell.edu), AT_CHLORO (http://www.
grenoble.prabi.fr/at_chloro/), etc. que aportan información sobre proteínas plastidiales
de Arabidopsis y de otras especies de plantas, además de información peptídica y
modificaciones post-traduccionales entre otras (Armbruster et al., 2011; van Wijk and
Baginsky, 2011).
El núcleo es el centro de regulación de las células eucarióticas. Es un sistema
dinámico que actúa como almacén de varias macromoléculas y que sirve como
modulador de señales de vital importancia para la célula. Las proteínas nucleares
constituyen del 10 al 20% del total de las proteínas celulares y forman una red compleja
que juega un importante papel durante el desarrollo y otros procesos fisiológicos. En
plantas, poco se sabe sobre la naturaleza de los componentes moleculares y sobre los
mecanismos implicados en la coordinación de la síntesis de proteínas nucleares así
como sobre su acción y función; por lo tanto los estudios de proteómica son necesarios
para ayudarnos a comprender las bases moleculares de la función nuclear (Narula et al.,
2013). Hasta la fecha el número de proteínas del núcleo descritas varía en función de las
especies (Tabla 3.1), y hay que destacar que la descripción del proteoma nuclear de
animales está bastante avanzado con respecto al de levaduras y plantas.
Capítulo 3
109
Tabla 3.1: Comparación de los distintos proteomas nucleares.
Especie Proteínas descritas Referencias
Hombre 1.868 (Salzano et al., 2006; Henrich et al., 2007)
Ratón 1.548 (Buhr et al., 2008)
Drosophila 282 (Varma and Mishra, 2011)
Levaduras 328 (Gauci et al., 2009)
En plantas se ha abordado el estudio del proteoma nuclear en Arabidopsis (Bae
et al., 2003), Medicago (Repetto et al., 2008; Repetto et al., 2012), soja (Cooper et al.,
2011), garbanzo (Pandey et al., 2006; Pandey et al., 2008), Xerophyta viscosa
(Abdalla and Rafudeen, 2012), y pimiento (Lee et al., 2006a) (Fig. 3.1). Dentro de las
monocotiledóneas el arroz es la especie con un mayor número de proteínas nucleares
descritas (Choudhary et al., 2009).
Figura 3.1: Número de proteínas identificadas en distintas especies de plantas mediante la
comparación de sus proteomas nucleares.
Las mitocondrias son los orgánulos responsables de procesos bioquímicos
esenciales para las células de plantas como son la fosforilación oxidativa y la
fotorrespiración. Tradicionalmente su principal papel fue la oxidación de ácidos
orgánicos mediante el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y la síntesis de ATP unida a la
transferencia de electrones al O2 que se produce en la membrana, proceso denominado
respiración. Más recientemente se ha descrito su papel en la síntesis de muchos
metabolitos como aminoácidos, lípidos y vitaminas. Además contienen un gran número
de transportadores por lo que pueden intercambiar metabolitos con el citosol y con otros
orgánulos. Asimismo las mitocondrias poseen un genoma propio que de manera activa
Capítulo 3
110
transcribe y traduce proteínas que están coordinadas con las proteínas codificadas en el
núcleo para producir grandes enzimas funcionales en el orgánulo. Para poder descifrar
los distintos tipos de metabolismo en los que están implicadas las mitocondrias, se ha
empleado mucho esfuerzo en describir el perfil proteico de las mismas tanto de plantas
de cultivo como de plantas modelo. Para poder obtener unos resultados satisfactorios
sobre el proteoma de las mitocondrias, es necesario partir de muestras de orgánulos
aislados de alta calidad, además de contar con técnicas de proteómica de alta resolución
para así poder identificar, cuantificar y diferenciar el grado de contaminación con otros
orgánulos y compartimentos celulares (Huang et al., 2014). Hasta la fecha menos del
30% del total de proteínas existentes que se suponen como mitocondriales han sido
verificadas experimentalmente mediante proteómica y/o estudios de localización con
proteínas de fusión que portan GFP (green fluorescent protein) (Lee et al., 2013).
Arabidopsis thaliana se convirtió en el primer sistema modelo de plantas una
vez que su genoma fue completamente secuenciado en 2000 (The Arabidopsis Genome
Initiative, 2000). En los últimos años se ha avanzado tremendamente mediante el uso de
aproximaciones experimentales y bioinformáticas en la descripción del proteoma total
de esta planta modelo. Una gran parte de las proteínas mitocondriales descritas se han
basado en estudios con secuencias diana en el extremo N-terminal de las mismas. A
continuación se muestra un esquema de las 726 proteínas mitocondriales identificadas
hasta el momento clasificadas en las distintas categorías funcionales en Arabidopsis
(Lee et al., 2013).
Figura 3.2: Proteínas mitocondriales de Arabidopsis clasificadas en las distintas categorías funcionales.
Capítulo 3
111
Proteoma de peroxisomas
Desde que se descubrieron los peroxisomas hace más de 50 años, numerosos estudios
han reflejado la implicación de estos orgánulos en distintas rutas metabólicas. Los
peroxisomas están involucrados en diferentes reacciones oxidativas estrictamente
controladas, de manera que la célula pueda adaptarse a las condiciones cambiantes del
medio en el que se encuentra y, como respuesta a distintas señales, pueden variar de
manera drástica en número, forma, tamaño y metabolismo (Smith and Aitchison,
2013). La mayor parte de la información disponible a día de hoy sobre las enzimas
peroxisomales ha sido obtenida mediante aproximaciones tradicionales, como ensayos
de cinética y uso de anticuerpos específicos, los cuales se llevaban a cabo en
peroxisomas purificados o en fracciones enriquecidas en peroxisomas (Palma et al.,
2009b). Dichas aproximaciones tradicionales han permitido aclarar las principales rutas
metabólicas y las funciones celulares en las que los peroxisomas se encuentran
implicados; sin embargo existen limitaciones en estos estudios y por lo tanto son
necesarias otras técnicas que las complementen, técnicas proteómicas por ejemplo, que
permitan la identificación del total de proteínas de los peroxisomas, así como para la
caracterización de las modificaciones post-traduccionales de las mismas (Saleem et al.,
2006; Palma et al., 2009b).
En plantas existe mucha menos información proteómica disponible comparada
con la de animales y levaduras, esto se debe, principalmente, a las dificultades que
existen a la hora de purificar los peroxisomas a partir del material vegetal. En plantas el
número de peroxisomas por células es considerablemente menor que en animales, y
además se produce una elevada contaminación por otras estructuras celulares como
cloroplastos, mitocondrias y vacuolas en los protocolos de purificación de los
orgánulos. Todo ello, por tanto, hace que el número total de peroxisomas purificados
disminuya considerablemente por los métodos tradicionales de biología celular (Palma
et al., 2009b).
La proteómica experimental se enfrenta a obstáculos a la hora de detectar
proteínas peroxisomales que aparecen solamente de manera transitoria en estos
orgánulos, y para ello es necesario complementar dichas aproximaciones con los
estudios bioinformáticos de predicción de proteínas, basados en la aparición de los PTS
Capítulo 3
112
(peroxisomal targeting signals) que a su vez serán complementados con estudios de
localizacion subcelular (Kaur and Hu, 2011). Todas estas herramientas son esenciales
para definir el proteoma de los orgánulos y comprender así los sistemas metabólicos y
reguladores que rigen los mismos (Nair and Rost, 2008; Xu et al., 2009; Chowdhary
et al., 2012). La proteómica experimental además, nos permite investigar los cambios
que ocurren en las células durante el desarrollo, durante la diferenciación celular o
durante las condiciones desfavorables del medio, entre otros (Palma et al., 2009b).
Teniendo en cuenta la importancia médica y biológica de los peroxisomas, la
bioinformática ha asumido el importante reto de identificar proteínas peroxisomales a
partir de la secuencia aminoacídicas en una estrategia de tipo in silico (Emanuelsson et
al., 2003).
Como los peroxisomas no poseen un sistema propio de síntesis de proteínas,
éstas son importadas desde el citoplasma, desde donde son dirigidas mediante señales
peptídicas (PTSs; peroxisomal targerting signals) que determinan su liberación en los
peroxisomas (Lazarow and Fujiki, 1985; Hayashi et al., 1997; Reumann, 2004). Las
PTSs, así como las rutas de señalización, se mantienen conservadas en gran medida en
los eucariotas, de manera que los estudios bioinformáticos pueden ayudar a describir las
PTSs de tipo 1 y 2 mediante comparación con los ya descritos en otras especies. No se
conoce ninguna proteína que a la vez contenga PTS1 en una especie y un PTS2 en otra;
sin embargo, si una determinada proteína es dirigida al peroxisoma por una PTS1 (o
PTS2), todos los ortólogos de esa proteína poseerán también una PTS1 (o PTS2)
(Reumann, 2004).
En plantas, la determinación de la secuencia de las PTS1 se empezó a elucidar
en los años 90 (Banjoko and Trelease, 1995) por ejemplo el grupo de Dr. Nishimura
estableció que dicha secuencia en las proteínas peroxisomales de la matriz estaba en el
extremo C-terminal y correspondía a un tripéptido de la forma SACPKRLMI, lo
que generaba 24 posibles tripéptidos para las PTS1 en plantas superiores (Hayashi et
al., 1997). Basado en estos trabajos previos Reumann y colaboradores (Reumann,
2004), mediante estudios bioinformáticos, elaboraron un algoritmo para definir la
secuencia consenso responsable de dirigir las proteínas a los peroxisomas (Figura 3.3).
En primer lugar, obtuvieron de las bases de datos 391 secuencias con PTS1 conocidos
en las distintas especies de plantas. De todas ellas estudiaron cuáles se correspondían
Capítulo 3
113
con las secuencias establecidas por Hayashi et al., 1998, a las que denominaron con el
término general de “tripéptidos PTS1 canónicos” y en función de eso, las caracterizaron
como: PTS1 mayoritarios (SRL, SRM, SRI, SKL, SKM, ARL, ARM,
AKL, PRL) que eran aquellos que estaban presentes en al menos 10 secuencias y en
3 grupos ortólogos distintos y PTS1 minoritarios (SKI, PRM, PKL, CRL, CKL)
que eran los que aparecían con una frecuencia menor a 10 secuencias y 3 grupos
ortólogos. Además existían tripéptidos que sólo aparecían en una secuencia (AKI,
CRM, CRI) y otros que no se detectaban (AKM, ARI, PKM, PRI, PKI,
CKM, CKI) y, por lo tanto, no indicaban señalización a peroxisomas. De todos estos,
Reumann estableció que la secuencia de los PTS1 mayoritarios SARKLM (sin
AKM, pero con SRI y PRL) representaban las secuencias de localización
peroxisomal más fiables y se correspondían con el 84% de los PTS1 existentes. Además
existen otras secuencias de “tripéptidos PTS1 no canónicos” que no estaban incluidos
en las secuencias de Hayashi et al., 1998 y que se definían como minoritarios en
función a su frecuencia (SRV, SNL, SNM, ANL, SML, SSM) (Reumann,
2004).
Figura 3.3: Definición de los tripéptidos PTS1 mayoritarios y minoritarios de proteínas
peroxisomales de plantas superiores (Reumann, 2004).
Capítulo 3
114
Por otro lado, alrededor de un tercio del total de proteínas peroxisomales
contienen un PTS2 en el extremo N-terminal que se corresponden con el tipo
RKLVI-x5-HQLA y se trata de un nonapéptido que es degradado
proteolíticamente una vez que entra en el orgánulo (Brown and Baker, 2003;
Reumann et al., 2007; Palma et al., 2009b). Al igual que para los PTS1, en primer
lugar se procedió a la recuperación de secuencias de PTS2 conocidos de plantas en las
bases de datos y, como con los PTS1 y en función a su frecuencia se clasificaron en
mayoritarios (RLx5HL y RIx5HL) y minoritarios (RQx5HL, RTx5HL, RMx5HL,
RAx5HL, RVx5HL, RLx5HI, RIx5HI, RAx5HI, RLx5HF) e incluso un único
nonapéptido (RLx5HV) (Figura 3.4).
Figura 3.4: Definición de los nonapéptidos PTS2 mayoritarios y minoritarios de proteínas
peroxisomales de plantas superiores (Reumann, 2004).
A partir del conocimiento de las secuencias generales de los PTS1 y PTS2 se
pueden investigar los ortólogos de cualquier especie de planta, identificando para ello el
máximo número de cDNAs homólogos, o el máximo número de secuencia EST
(expressed sequence tag) que contengan el extremo C- o N- terminal, y de ahí analizar
la existencia de las secuencias peptídicas de direccionamiento peroxisomal.
Sin embargo, cabe destacar que existe otro grupo de proteínas peroxisomales
que han sido menos estudiadas que no poseen ni PTS1 ni PTS2 y que son las proteínas
Capítulo 3
115
integrales de la membrana de peroxisomas, de las cuales la información disponible es
muy escasa (Mullen et al., 1999; Hu et al., 2012).
Como conclusión se puede decir que el uso de la proteómica, además de otras
herramientas como la bioinformática, permitirán en un futuro próximo caracterizar a los
peroxisomas, últimos orgánulos descubiertos en biología celular, como elementos
dinámicos, funcionales y polivalentes en las células (Palma et al., 2009b).
Capítulo 3
116
RESULTADOS
Capítulo 3
117
3.1 Purificación de peroxisomas de frutos de pimiento verde y rojo tipo California
Los peroxisomas fueron purificados a partir de frutos de pimiento verde y rojo,
mediante centrifugaciones diferenciales y en gradientes de densidad de sacarosa (Figura
3.5)
Figura 3.5: Método de aislamiento y purificación de peroxisomas de frutos de pimiento mediante
centrifugaciones diferenciales y en gradientes de densidad de sacarosa. Las matrices peroxisomales
fueron separadas de las membranas (PMP) por choque osmótico y se concentraron por ultrafiltración.
3.2 Análisis del proteoma de peroxisomas de frutos de pimiento mediante
electroforesis bidimensional (2-D)
Mediante electroforesis bidimensional (2-D) se ha estudiado el patrón de proteínas de
los peroxisomas de fruto de pimiento verde y rojo (Figura 3.2). Los geles fueron teñidos
con el compuesto fluorescente Sypro-Ruby y el análisis de los spots se realizó con el
programa bioinformático PDQuest. Mediante este sistema se marcaron los spots
diferenciales de cada tipo de fruto así como la diferencia de intensidad de los
coincidentes (Figura 3.6).
Capítulo 3
118
Figura 3.6: Imagen de geles correspondientes a matrices concentradas de peroxisomas de fruto de
pimiento verde (A) y rojo (B). Las proteínas (100 g) se separaron por electroforesis bidimensional y,
posteriormente, los geles fueron teñidos con el compuesto fluorescente Sypro Ruby (BioRad). A la
izquierda se indican los marcadores de peso molecular y en la parte superior el pH correspondiente a la
primera dimensión. IEE muestra la dirección del isoelectroenfoque.
Capítulo 3
119
Figura 3.7: Imagen de gel correspondiente a la superposición de los dos anteriores en el que se han
señalado las proteínas que presentaron diferencias de intensidad en peroxisomas de fruto de pimiento
verde y rojo.
3.3 Identificación de proteínas y análisis mediante MALDI-TOF/TOF
Las proteínas seleccionadas fueron analizadas por espectrometría de masas (MALDI-
TOF) tras su digestión con tripsina. MASCOT fue el motor de búsqueda elegido para
identificar las proteínas desde secuencias primarias lanzadas en bases de datos. Un valor
mayor de 99% en el intervalo de confianza de la puntuación asignada por MASCOT
(protein score C.I %) indica una elevada probabilidad de que la proteína haya sido
identificada correctamente (Tabla 3.2). Además, las proteínas se han clasificado en
función de los grupos funcionales a los que pertenecen y se han señalado otras posibles
localizaciones subcelulares, según consta en la literatura (Tabla 3.3).
Capítulo 3
120
Tabla 3.2: Proteínas identificadas en peroxisomas de fruto de pimiento verde y rojo. Los peroxisomas de
fruto de pimiento verde y rojo (Capsicum annuum L.) fueron sometidos a electroforesis bidimensional.
Las proteínas fueron analizadas por espectrometría de masas (MALDI-TOF) tras su digestión con
tripsina. MASCOT fue el motor de búsqueda elegido para identificar las proteínas desde secuencias
primarias lanzadas en bases de datos. Un valor mayor del 99% en el intervalo de confianza de la
puntuación asignada por MASCOT (protein score C.I %) indica una elevada probabilidad de que la
proteína haya sido correctamente identificada. Pep.ident., número de péptidos identificados; PM, peso
molecular; pI, punto isoeléctrico. Nº acceso/Uniprot: identificación de la proteína en la base de datos
Uniprot.
Proteína Identificada Nº
acceso/Uniprot
Protein Score
CI%/pep.ident.
PM/pI
Malato
deshidrogenasa
O81279
100/6 27545,4/5,56
Superóxido dismutasa
(Fe)
Q6X1D0
100/4 27919/6,53
Superóxido dismutasa
(Fe)
Q7YK44
100/6 27893/6,6
Superóxido dismutasa
(Mn)
O49066
100/8 25610,2/8,39
Catalasa Q9M5L6
100/25 56957,4/7,31
Fosfoglicerato quinasa O81394
99.994/9 50594/7.68
Aminometiltransferasa O23936
99.916/11 44655,9/8,87
Formato
deshidrogenasa
Q07511
100/16 42094,6/6,64
Aconitasa Q84TR4
99.993/14 98635/6,07
Proteína de tipo
quinesina de cadena
pesada
Q9FKP4
99.986/19 140880,3/5,91
Esterasa/lipasa
tioesterasa
Q2HUX9
99.723/10 42088,5/9,18
Aldehído
deshidrogenasa
Q8LST4
100/9 59520.9/6.65
3-cetoacil-CoA
tiolasa1
Q8LF48
99.483/5 49067,2/8,78
6-4 fotoliasa Q52Z99
99.899/13 67551,4/9,51
Aspartato
aminotransferasa
Q2XTE6
99.512/11 50998,1/8,64
Capítulo 3
121
Tabla 3.3: Clasificación de las proteínas identificadas en los peroxisomas de fruto de pimiento verde y
rojo en función del grupo funcional al que pertenecen. Además se indican otras posibles localizaciones
subcelulares de las mismas.
Proteína identificada Otras
localizaciones
subcelulares
posibles
Grupo funcional
Malato deshidrogenasa Mitocondria Metabolismo de carbohidratos y malato
Ciclo de los ácidos tricarboxílicos
Superóxido dismutasa (Fe) Cloroplasto Metabolismo oxidativo
Superóxido dismutasa (Mn) Mitocondria Metabolismo oxidativo
Catalasa - Metabolismo oxidativo
Fosfoglicerato kinasa Citoplasma Glicólisis
Aminometiltransferasa Mitocondria Catabolismo de glicina
Formato deshidrogenasa Mitocondria Metabolismo redox
Aconitasa - Ciclo del glioxilato y
del ácido cítrico
Proteína de tipo quinesina
de cadena pesada
Microtúbulos
Citosol
Acumulación en
cloroplastos
Esterasa/lipasa
tioesterasa
- Metabolismo lipídico
Aldehído deshidrogenasa Mitocondria Metabolismo lipídico
3-cetoacil-CoA tiolasa 1 - Biosíntesis y metabolismo de ácidos
grasos
Metabolismo lipídico
Síntesis de lípidos
Biosíntesis de oxilipinas
6-4 fotoliasa - Reparación de ADN
Aspartato aminotransferasa - Procesos de biosíntesis
Metabolismo de aminoácidos
3.4 Análisis in silico del proteoma de peroxisomas
Este trabajo se realizó durante una estancia en el laboratorio de la Dra. Sigrun Reumann
de la Univesidad de Stavanger, Noruega. Para este estudio se tuvieron en cuenta 100
proteínas de Arabidopsis que portaban el tripéptido PTS1 (peroxisomal targeting signal
de tipo 1). En base a ello se estableció la existencia de posibles ortólogos de dichas
proteínas en Capsicum annuum con sus PTS1 correspondientes, basándonos en dos
algoritmos distintos (PWM, pulse-width modulation, y RIR, room impulse response).
De todas las proteínas analizadas, seleccionamos las más interesantes, bien porque se
tenía poca información sobre su función e integración dentro del metabolismo
peroxisomal o porque eran inducidas por estrés, para posteriormente desarrollar el
análisis experimental. Las proteínas seleccionadas, junto con su PTS1 respectivo fueron
las siguientes:
Capítulo 3
122
Proteínas Tripéptido C-terminal
Arabidopsis thaliana
Tripéptido C-terminal
Capsicum annum
AT1G61680 SLM> SML>
AT2G38760 SKI> AKV>
AT3G14660 HKL> RKL>
AT3G46170 SSL> SSL>
Las principales características de estas proteínas en Arabidopsis se detallan a
continuación en la Tabla 3.4.
Tabla 3.4: Funciones principales y localización subcelular descrita hasta el momento de las proteínas
seleccionadas AT1G61680, AT2G38760, AT3G46170 y AT3G14660.
Para cada proteína candidata, y haciendo uso del programa BLAST del NCBI
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), se realizaron dos aproximaciones
bioinformáticas para corroborar el resultado de las analogías:
1. Usando la proteína de Arabidopsis thaliana, como secuencia problema se hizo
un alineamiento frente proteínas de Capsicum annuum para determinar posibles
ortólogos.
2. A continuación se realizó un alineamiento entre la secuencia EST (expressed
sequence tag) traducida (cortada en el extremo C-terminal) de Capsicum
annuum, frente a proteínas de pimiento en general, para así poder confirmar las
proteínas candidatas.
Proteína Proceso biológico Función molecular Localización subcelular
AT1G61680 Procesos metabólicos
Biosíntesis de mono-
terpenos y
terpenoides
- Actividad S-linalool sintasa
- Unión de iones de magnesio
- Actividad terpeno sintasa
Citosol, mitocondrias,
plastidios
AT2G38760
Respuesta al frío, al
calor, al estrés salino
y a sequía
Unión de iones calcio y de
fosfolípidos dependientes de
calcio
Citosol, mitocondrias,
núcleo
AT3G46170
Respuesta a cadmio Actividad oxidorreductasa Citosol, plastidios, núcleo,
peroxisomas, mitocondrias,
membrana plasmática
AT3G14660
Procesos de
oxidación-reducción
Unión de oxígeno Citosol. retículo
endoplasmático, aparato de
Golgi, plastidios,
mitocondrias, membrana
plasmática
Capítulo 3
123
Haciendo un rastreo por las bases de datos, NCBI, TAIR-The Arabidopsis Information
Resource (https://www.arabidopsis.org) y el programa de localización subcelular
SUBA3 (http://suba3.plantenergy.uwa.edu.au/), podemos establecer la siguientes
consideraciones generales de las proteínas seleccionadas.
3.4.1. At1g61680 (Terpeno sintasa 14, TPS14 o S-lynalool sintasa). Es una proteína de
Arabidopsis thaliana, con una secuencia de 569 aminoácidos. Esta proteína está
relacionada con procesos de biosíntesis de terpenoides, que son algunos de los
compuestos volátiles que emiten las flores en los casos en los que los insectos son los
vectores para la polinización (aunque las flores de Arabidopsis poseen en la mayor parte
de los casos fecundación autógama). No existen evidencias de la localización de esta
proteína en peroxisomas, pero sí en citosol, mitocondrias y en plastidios.
3.4.2. At2g38760 (ANN3, ANNAT3, ATANN3 o anexina 3). Es una proteína que en
Arabidopsis thaliana tiene una secuencia de 321 aminoácidos. Las anexinas son
proteínas que se unen al calcio citosólico y que actúan en respuesta a distintos tipos de
estrés medioambiental, frío, calor, salinidad y sequía. A nivel subcelular se localizan a
nivel de citosol, mitocondria y núcleo.
3.4.3. At3g14660 (Citocromo P450, familia 72, subfamilia A, polipéptido 13,
CYP72A13 o citocromo P450 putativo). Es una proteína de Arabidopsis thaliana, con
una secuencia de 512 aminoácidos. Esta proteína está relacionada con procesos de
oxidación-reducción y tiene varias localizaciones subcelulares a nivel de citosol,
retículo endoplasmático, aparato de Golgi, plastidios, mitocondria y membrana
plasmática.
3.4.4. At3g46170. Es una proteína de Arabidopsis thaliana, con una secuencia de 512
aminoácidos. Esta proteína actúa en respuesta a iones de cadmio y tiene actividad
óxido-reductasa. A nivel subcelular se localiza en citosol, plastidios, núcleo,
peroxisomas, mitocondrias y membrana plasmática.
Capítulo 3
124
En el anexo I se incluye una explicación detallada de las distintas aproximaciones
bioinformáticas, para cada proteína. En base al análisis de los algoritmos
bioinformáticos, que en todos los casos generaban resultados similares siguiendo las dos
aproximaciones empleadas, se obtuvieron las siguientes conclusiones:
1. Para la proteína AT1G61680, se corrobora que existe una proteína ortóloga en
Capsicum annuum que probablemente tendrá una localización peroxisomal
determinada por un PTS1 del tipo SML>, y que se correspondería con una
epiaristoloqueno sintasa o una sesquiterpeno ciclasa.
2. Asimismo, en Capsicum annuum existe una proteína ortóloga a la proteína
AT2G38760 que es muy probable que tenga una localización peroxisomal
determinada por un PTS1 del tipo AKV> y que se corresponda con una anexina.
3. Para la proteína AT3G14660, efectivamente existe una proteína ortóloga en
Capsicum annuum que con alta probabilidad tendrá una localización
peroxisomal determinada por un PTS1 del tipo RKL> y que posiblemente sea
del tipo citocromo P450 y, en menor medida, una p-cumarato hidroxilasa.
4. Por último, para la proteína AT3G46170, existe igualmente una proteína
ortóloga en Capsicum annuum que probablemente tenga una localización
peroxisomal determinada por un PTS1 del tipo RKL>., pudiendo atribuirse a
una proteína portadora de acilo 3-oxoacil reductasa.
Capítulo 3
125
Capítulo 3
126
Los frutos son exclusivos de las plantas fanerógamas y juegan un papel central en la
maduración de las semillas y en su dispersión. El estudio exhaustivo del proceso de
maduración ha despertado gran interés debido, sobre todo, a la importancia que tienen
los frutos en nuestra dieta (Wang et al., 2014). Para ampliar el conocimiento sobre los
mecanismos reguladores que subyacen al proceso de maduración, se ha llevado a cabo
la identificación del proteoma total de los peroxisomas de los frutos de pimiento, para,
de esta forma, comprender las funciones fisiológicas de estos orgánulos subcelulares.
La comparación entre el proteoma de peroxisomas de frutos de pimiento verdes
y rojos no demostró diferencias significativas, lo que indica que las mismas rutas
metabólicas operarían en los dos momentos del proceso de maduración. Por tanto a
continuación, se hará una discusión sobre las proteínas identificadas de forma común
en estos orgánulos y que pudieran ejercer una función en los peroxisomas.
La malato deshidrogenasa es una enzima propia de los peroxisomas (Reumann,
2002), cuya presencia en los frutos de pimiento quedó manifiesta en el análisis del
proteoma completo de los mismos que se mostró en el capítulo 1. La catalasa es el
marcador enzimático por excelencia de los peroxisomas (del Río, 2013) y ha sido
efectivamente identificado por MALDI-TOF/TOF en los orgánulos aislados de
pimiento verde y rojo, lo que confirma el importante papel de esta proteína en el
metabolismo celular a lo largo del proceso de maduración, como ya había sido
propuesto anteriormente (Mateos et al., 2003).
Con respecto a las superóxido dismutasas, en peroxisomas se ha identificado
la presencia de la Mn-SOD tanto en frutos verdes y rojos mediante nuestro análisis
proteómico, lo cual coincide con estudios anteriores de actividad de la enzima y de
transferencia de western en peroxisomas purificados a partir de los frutos (Mateos et
al., 2003). Recientemente mediante técnicas bioquímicas, se ha descrito también la
presencia de una Mn-SOD en los cromoplastos en una variedad de pimiento cuyos
frutos maduros viran a amarillo (Martí et al., 2009). Este evento, aunque también se ha
corroborado por estudios proteómicos (Barsan et al., 2012; Wang et al., 2013a) no es
un hecho común en estos orgánulos. Mateos y colaboradores (2003) no encontraron
actividad Fe-SOD en peroxisomas de fruto de pimiento, lo que contrasta con nuestros
resultados sobre el proteoma de los peroxisomas en ambos tipos de frutos. La Fe-SOD
generalmente se localiza en cloroplastos aunque la presencia de esta isoenzima en
Capítulo 3
127
peroxisomas ya había sido descrita en pétalos de clavel (Droillard and Paulin, 1990).
No obstante, esta es la única referencia hasta la fecha que haya asignado también una
localización de una Fe-SOD en peroxisomas vegetales. Estos datos, junto con los que
apuntan a la presencia de la CuZn-SOD en peroxisomas de plantas (Bueno et al., 1995;
del Río et al., 2003b; Sandalio et al., 2013) refuerzan la plasticidad metabólica del
metabolismo peroxisomal en plantas que es capaz de albergar todos los tipos de SODs
eucarióticas tanto en la matriz o bien ligada a la membrana peroxisomal, a diferencia de
lo observado en el resto de orgánulos celulares vegetales o en peroxisomas animales o
de levaduras. Como se muestra en el capítulo 1 (tabla 1.2) tanto la catalasa como la
SOD ya habían sido detectadas en el proteoma global de los frutos, lo que nos da una
idea de la abundancia relativa de estas enzimas.
La fosfoglicerato quinasa (PGK; EC 2.7.2.3) cataliza la primera reacción de
fosforilación a nivel de sustrato de la glucólisis, sintetizando ATP a partir del 1,3
bifosfoglicertato y ADP. Además también está implicada en el último paso de la
fijación de CO2 en plantas (Joao and Williams, 1993; Bowler, 2013). En plantas, se
han identificado diversas isoformas de PGK que se han localizado en el citosol y el
cloroplastos (Bayer et al., 2011; Troncoso-Ponce et al., 2013). No se puede descartar,
por tanto, la posible contaminación por plastos en las muestras de peroxisomas, aunque
la identificación de esta proteína en estos orgánulos, tanto en frutos verdes como en
rojos, que muestran un perfil plastídico tan diferente, podría ser un elemento de valor a
tener en cuenta a la hora de asignar la localización de la PGK. Por otro lado, se ha
descrito la presencia de una PGK en glicosomas de Trypanosoma brucei (Peterson et
al., 1997; Blattner et al., 1998), un orgánulo enmarcado comúnmente en el grupo de
los microcuerpos, donde también se encuadra a los peroxisomas (Parsons et al., 2001).
La enzima aminometiltransferasa o subunidad T (EC 2.1.2.10) es una de las
cuatro proteínas que forman parte del complejo glicina descarboxilasa (GDC). Las otras
proteínas constituyentes de este complejo son: la proteína L (dihidrolipoamida
deshidrogenasa), la proteína P (glicina deshidrogenasa) y la proteína H que es la
responsable de la interacción de las otras 3 proteínas. Este sistema es esencial en células
animales para la degradación de glicina, ya que se activa cuando las concentraciones de
este aminoácido son elevadas (Okamura-Ikeda et al., 2010). En plantas, la GDC es un
componente indispensable en la ruta de la fotorrespiración encargada de la
Capítulo 3
128
transformación de glicina en serina (Reumann, 2002). En la fotorrespiración toman
parte los cloroplastos, los peroxisomas y la mitocondrias en una serie de etapas
enzimáticas que comparten metabolitos de una forma muy activa, ya que van
transfiriéndose de unos orgánulos a otros (Reumann and Weber, 2006) (Heldt et al.,
1998; Hagemann et al., 2013). La GDC se localiza en mitocondrias, usando la glicina
que se genera en los peroxisomas con producción de serina vuelve al peroxisoma para
continuar el ciclo de la fotorrespiración. La unión funcional de peroxisomas y
mitocondrias en la fotorrespiración podría ser la responsable de esta falsa identificación
poisitiva.
La aconitasa (EC 4.2.1.3) es una enzima que cataliza la isomerización del
citrato a isocitrato, como parte de metabolismo de la célula implicado en el ciclo de
Krebs. Se ha descrito cómo la inhibición de la actividad de la aconitasa mitocondrial, en
un momento temprano del desarrollo de los frutos, conlleva un aumento de la acidez
mientras que un aumento de la actividad de la aconitasa citosólica provoca una
disminución de la misma (Degu et al., 2011). La acidez de la fruta es un índice de
maduración de la misma que aumenta con el proceso de desarrollo y que comienza a
disminuir una vez que el fruto ha madurado y comienza a envejecer (Etienne et al.,
2013). La aconitasa ha sido identificada en mitocondrias de fruto de pimiento rojo
(Camejo et al., 2015). No obstante, en plántulas se Arabidopsis se ha comprobado que
la isoforma ACO3 está más asociada al catabolismo del citrato a través del ciclo del
glioxilato peroxisomal que al catabolismo mitocondrial de este ácido (Hooks et al.,
2014). De alguna forma, esta unión funcional podría ser también la responsable la
presencia de la aconitasa en nuestras muestras de peroxisomas.
Las quinesinas (EC 3.6.4.4) son una familia de proteínas motoras que median el
transporte intracelular sobre los microtúbulos, que son componentes del citoesqueleto
(Ganguly and Dixit, 2013). Además juegan un importante papel durante la mitosis,
morfogénesis y transducción de señales. Este tipo de proteínas se encuentra distribuidas
en todas las organismos eucarióticos (Li et al., 2012). Las quinesinas han sido descritas
en peroxisomas (Hamada et al., 2013) donde podrían participar en los movimientos de
estos orgánulos (Kural et al., 2005; Rodríguez-Serrano et al., 2014)
Las aldehído deshidrogenasas (ALDH; EC 1.2.1.3) son un grupo de enzimas
que catalizan la oxidación de los aldehídos a ácidos carboxílicos usando NAD/NADH
Capítulo 3
129
como coenzimas. Estas proteínas modulan varias funciones celulares, tales como la
proliferación y la diferenciación celular o respuestas frente a estrés oxidativo, entre
otras. Existen muchas isoformas de las aldehído deshidrogenasas en prácticamente
todos los organismos y su localización subcelular es variada (Muzio et al., 2012). Se ha
identificado distintas isoformas a nivel de peroxisomas en Arabidopsis thaliana
(Missihoun et al., 2011) así como en cebada (Fujiwara et al., 2008).
Una esterasa es una enzima hidrolasa que rompe los enlaces éster en los
correspondientes alcoholes y ácidos por medio de una hidrólisis. También hay que tener
en cuenta que algunas enzimas que catalizan la hidrólisis de ésteres pueden catalizar
reacciones de transesterificación. Tras la hidrolización de ésteres, los ácidos grasos
comienzan a degradarse. Debido a la relación existente entre ácidos grasos y procesos
de desarrollo y senescencia celular, se han identificado alrededor de 60 lipasas que
aumentan con la senescencia (Troncoso-Ponce et al., 2013). La asociación de las
lipasas con los peroxisomas es un evento común dado que en tejidos que presentan
cuerpos lipídicos se necesita la acción de una lipasa que genere los ácidos grasos que
son procesados por la -oxidación peroxisomal. Recientemente se ha demostrado la
localización de una triacilglicerol lipasa (SPD1) en las membranas de peroxisomas de
plántulas jóvenes de A. thaliana (Thazar-Poulot et al., 2015).
Capítulo 3
130
Figura 3.8: Enzimas de las fotorrespiración de la b-oxidación de ácidos grasos y del ciclo del glioxilato
identificadas en peroxisomas mediante análisis proteómico. En color azul se indican las enzimas que se
han detectado y son propias del peroxisoma y en rojo, las que, aún habiéndose descrito en otros
orgánulos, nuestros resultados indican que también se podrían localizar en estos orgánulos. Previo a la b-
oxidación, la lipasa (LIP), localizada en los cuerpos lipídicos libera los ácidos grasos contenidos que se
activan por una acil-CoA sintetasa ubicada en la membrana de este orgánulo de almacén. Posteriormente
el acil-CoA entra en la espiral de la b-oxidación donde actúa la tiolasa (TIO) generando acetil-CoA, que
se incorporará al ciclo del glioxilato. El ciclo del glioxilato implica la conversión de citrato en isocitrato
por la acción de una aconitasa (ACO), si bien la localización de esta enzima sólo se ha descrito
fehacientemente en el citosol y en mitocondrias. El glicolato producido en el cloroplasto como
consecuencia de la actividad oxigenasa de la RuBisCo inicia la ruta fotorrespiratoria viajando al
peroxisoma, donde es oxidado a glioxilato y H2O2 por la glicolato oxidasa. El glioxilato se convierte en
glicina y la glicina, en la mitocondria, y ésta se transforma en serina, por acción del complejo glicina
descarboxilasa (GDC). La serina, a su vez, entra en el peroxisoma donde sufre las transformaciones
necesarias para integrarse de nuevo en el ciclo de la fotorrespiración. El H2O2 producido en los
peroxisomas por acción de diversas oxidasas es degradado por la catalasa (CAT). Por otro lado, el radical
superóxido, que es un metabolito común de los peroxisomas, es dismutado hasta H2O2 por la superóxido
dismutasa (SOD).
La β-oxidación es un proceso metabólico esencial en las células eucarióticas.
Tradicionalmente, esta ruta catabólica ha sido considerada en plantas como la vía
principal de degradación de ácidos grasos en las células. Sin embargo, en los últimos
años, la β-oxidación de plantas está siendo objeto de un gran interés científico por su
implicación en funciones relacionadas con el desarrollo y la defensa. En plantas, la β-
oxidación ocurre específicamente en peroxisomas a diferencia de los animales en los
que se desarrolla en mitocondrias. La familia de las 3-cetoacil-CoA tiolasas (EC 2. 3.
1. 16) son las enzimas que actúan en el paso final de la β-oxidación liberando el acetil-
Capítulo 3
131
CoA como producto final de la ruta. Dicho acetil-CoA es metabolizado a través del
ciclo del glioxilato y de la gluconeogénesis para dar lugar a sacarosa que proporciona la
energía ncesaria para el crecimiento de la planta y su desarrollo (Baker et al., 2006).
Esta enzima se ha comprobado que posee un PTS2 en el extremo N-terminal para su
entrada en peroxisomas (Johnson and Olsen, 2003). Mediante la técnica de
transferencia de western, empleando un anticuerpo frente a la tiolas, se detectó en
nuestro laboratorio la presencia de esta enzima en peroxisomas purificados a partir de
frutos de pimiento verdes y rojos (Mateos et al., 2003).
La biosíntesis de aspartato está propiciada por la aspartato aminotransferasa
(AST; EC 2.6.1.1) que cataliza la transaminación reversible entre el glutamato y el
oxalacetato para generar aspartato y 2-oxoglutarato, principalmente en el proceso de
fotorrespiración de plantas C4. La importancia del aspartato radica en que actúa como
precursor de otros aminoácidos esenciales como lisina, treonina, metionina e isoleucina
en plantas superiores (de la Torre et al., 2014). Se ha descrito que esta enzima está
localizada tanto en el citosol como en la mitocondria (Offermann et al., 2011). Las
aminotransferasas fotorrespiratorias que se han descrito en peroxisomas son del tipo
glioxilato aminotransferasa (Liepman and Olsen, 2001).
Las formato deshidrogenasas (FDH; EC 1.2.1.2/1.2.2.1) son un conjunto de
enzimas que llevan a cabo la oxidación de formato hasta CO2, empleando NAD (EC
1.2.1.2) o citocromo c3+
como aceptores de electrones. Esta enzima se ha detectado en
cloroplastos y mitocondrias de hojas de A. Thaliana (Herman et al., 2002), y en
pimiento se ha caracterizado la isoforma FDH 1 en las mitocondrias. Dicha enzima está
implicada en la regulación de la muerte celular y la respuesta de defensa frente a
patógenos bacterianos (Choi du et al., 2014). La detección de esta enzima en los
peroxisomas es anómalo, aunque es un hecho nada extraño en levaduras donde existen
una asociación entre el metabolismo del formato y estos orgánulos (Yurimoto et al.,
2004; van Zutphen et al., 2010).
Como se ha podido comprobar, la mayoría de las proteínas detectadas en los
peroxisomas de frutos de pimiento son o tienen vinculación funcional con estos
orgánulos, según se desprende de los datos bibliográficos. Sin embargo, nuestros datos
aportan discrepancias sobre la localización descrita hasta el momento para algunas
enzimas. Está claro que durante el proceso de purificación de los orgánulos se pueden
Capítulo 3
132
arrastrar algunas contaminaciones, aunque está descrito que en el procedimiento llevado
a cabo en este trabajo tiene contaminaciones cruzadas con otros orgánulos muy bajas
(Mateos et al., 2003). Por tanto, es recomendable confirmar la presencia de dichas
proteínas en los peroxisomas mediante diversas estrategias como la inmunolocación con
oro coloidal y el empleo de anticuerpos específicos, o técnicas de microscopía de
fluorescencia usando proteínas recombinantes, entre otras alternativas.
Como se ha podido comprobar, la mayoría de las proteínas detectadas en los
peroxisomas de frutos de pimiento son o tienen vinculación funcional con estos
orgánulos, según se desprende de los datos bibliográficos. Sin embargo, nuestros datos
aportan discrepancias sobre la localización descrita hasta el momento para algunas
enzimas. En la Figura 3.8 se muestra un esquema con algunas de las proteínas que se
han detectado tras el análisis proteómico de los peroxisomas, pero que anteriormente
habían sido descritas en otros orgánulos. Está claro que durante el proceso de
purificación de los orgánulos se pueden arrastrar algunas contaminaciones, aunque está
descrito que el procedimiento llevado a cabo en este trabajo tiene contaminaciones
cruzadas con otros orgánulos muy bajas (Mateos et al., 2003). Por tanto, es
recomendable confirmar la presencia de dichas proteínas en los peroxisomas mediante
diversas estrategias como la inmunolocación con oro coloidal y el empleo de
anticuerpos específicos, o técnicas de microscopía de fluorescencia usando proteínas
recombinantes, entre otras alternativas. En última instancia, es reseñable destacar que
las proteínas que anteriormente no habían sido descritas en peroxisomas y sí en otros
orgánulos llevan a cabo una función en rutas metabólicas en las que participan los
peroxisomas: así ocurre con la LIP de los cuerpos proteicos, la GDC de la
fotorrespiración y la ACO que transforma el citrato en isocitrato.
Validación de modelos de predicción
Para estudiar las funciones de los peroxisomas en el proceso de maduración, como
momento de “crisis celular” debido al aumentos de ROS y RNS, se hizo un estudio
previo de las posibles proteínas que portaban una PTS1 y que, además, contaran con
funciones descritas relacionadas con la defensa de plantas frente a patógenos y a otro
tipo de estreses.
Capítulo 3
133
La bioinformática es una disciplina cuyos objetivos son la comprensión de los
procesos biológicos y el análisis de grupos complejos de datos y de bases de datos
usadas en biología molecular, manejando archivos que proceden de distintas áreas en
las que están almacenados de modo eficaz y uniforme y que son de uso público para la
comunidad científica.
En esta Tesis y mediante dos algoritmos distintos (PMW y RI) se identificaron
varias proteínas peroxisomales de fruto de pimiento que portaban un tripéptido PTS1
en el extremo carboxílico. Además dichos modelos de predicción tienen en cuenta a
proteínas poco abundantes de manera que el número de posibles candidatas aumenta.
Nuestras proteínas seleccionadas, AT1G61680, AT2G38760, AT3G14660 Y
AT3G46170, eran ortólogas de aquellas de Arabidopsis ya descritas. A pesar de que
aparentemente las secuencias proteicas contienen la secuencia correspondiente a un
PTS1 en el extremo C-terminal, el siguiente paso en su estudio sería la localización
subcelular de las mismas en las células de la planta y para ello sería necesaria la
clonación de los genes en vectores con extremos fluorescentes y la transformación
posterior en células de epidermis de cebolla. Con ello, se comprobaría si efectivamente
las proteínas selecionadas poseen localización peroxisomal, determinada por la
presencia en su secuencia de un PTS1. Estos modelos de predicción han sido ya
corroborados con resultados positivos por el (Lingner et al., 2012)grupo de la Profesora
Sigrun Reumann (Reumann, 2011a; Reumann et al., 2012), en cuyo laboratorio se
desarrolló esta parte de esta Tesis Doctoral.
134
DISCUSIÓN GENERAL
Discusión general
135
El objetivo principal del trabajo que se presenta en esta Memoria Doctoral se ha
centrado en el estudio de la maduración de los frutos de pimiento (Capsicum
annuum L.), así como en los procesos biológicos que están implicados en el control de
esta compleja fase de su ciclo de vida y, por consiguiente, de la calidad de los frutos
maduros que llegan a los mercados. Todo ello deriva de la importancia que este fruto
posee tanto a nivel económico, como a nivel nutricional. Dicho objetivo general se ha
abordado mediante una aproximación proteómica, con el propósito de conocer las
proteínas y, por tanto, los genes que se expresan de manera diferencial durante el
proceso de maduración. Se han empleado diversos abordajes proteómicos, lo que
confiere a este trabajo una riqueza, una singularidad y un carácter innovador apenas
aplicados en la fruticultura actual. Además del proteoma global de los frutos, se han
estudiado las proteínas modificadas post-traduccionalmente mediante proteómica
funcional, en concreto nitro-proteómica, para así desvelar las rutas metabólicas que
tienen una regulación positiva y/o negativa mediada por especies de nitrógeno reactivo
(RNS) durante el proceso de maduración. Existen otras formas de analizar el proteoma
funcional de muestras biológicas como puede ser el estudio de las proteínas oxidadas
(oxi-proteoma), proteínas fosforiladas (fosfo-proteoma) o proteínas glicosiladas (glico-
proteoma). En nuestro caso, como ya se ha indicado, y por cuestiones meramente
logísticas sólo hemos podido acometer la investigación del nitro-proteoma de los frutos.
El óxido nítrico es un gas radical que se produce de manera endógena en las células de
las plantas, con efectos diversos sobre los procesos fisiológicos de las mismas, incluida
la germinación, la respuesta frente a patógenos y a estrés abiótico, entre otros. La
adición de donantes externos de NO permite valorar el comportamiento de las proteínas
frente a este agente, así como su interacción con el metabolismo de las especies de
oxígeno reactivo (ROS, reactive oxygen species).
Para llevar a cabo este proyecto se han analizado no sólo los frutos enteros, sino
fracciones celulares de los mismos, en este caso, peroxisomas, por ser estos orgánulos
fuentes importantes de antioxidantes implicados en la respuesta frente al estrés
oxidativo y nitrosativo. La investigación del sub-proteoma de los peroxisomas es un
complemento más que nos permite profundizar en más detalle en los cambios
metabólicos que se suceden en la maduración. En conexión con nuestro objetivo se ha
Discusión general
136
desarrollado en paralelo el perfil del proteoma de las mitocondrias durante la
maduración de los frutos de pimiento. Se ha abordado proteoma completo de la
mitocondria (Álvarez de Morales et al., 2011) así como el oxi-proteoma de dichos
orgánulos durante la maduración de los frutos (Camejo et al., 2015). Todo ello deriva
de la necesidad fundamental de conocer las características nutricionales y beneficiosas
que esta materia prima puede aportar a la dieta humana, para, de esta forma, poder
desarrollar herramientas biotecnológicas que permitan su mejora, y además poder
ofrecérselos a los consumidores en el momento más saludable delciclo de vida del
producto.
En la Figura 10 se muestran algunas de las estrategias más importantes para el
análisis del proteoma en muestras vegetales. En la investigación realizada en esta Tesis
Doctoral se han analizado los frutos completos, así como los peroxisomas purificados a
partir de los mismos mediante la combinación de electroforesis bi-dimensional y
MALDI/TOF. En el caso del nitro-proteoma se siguió la estrategia de combinar la
electroforesis 2-D con la técnica de detección de proteínas específicas (nitradas) con
anticuerpos frente a la nitro-tirosina (transferencia de western) y el análisis por MALDI-
TOF de las proteínas inmunoreactivas. En esta Tesis, además, se ha desarrollado una
aproximación bio-informática que permite predecir la localización de algunas proteínas
en los peroxisomas de los frutos, basándonos en otras que portan un PTS1 depositadas
en las bases de datos.
Discusión general
137
Figura 10: Estrategias para el estudio del proteoma en muestras vegetales (basado en (Palma et al.,
2009b)).
Como se observa en la Figura 11, que representa la clasificación de las proteínas
identificadas en frutos verdes y rojos de pimiento, en base a la clasificación de Bevan
(Bevan et al., 1998). A nivel de fruto completo podemos destacar cómo el mayor
número de proteínas identificadas (alrededor del 25%) tanto en fruto verde como en
fruto rojo están ralacionadas con el metabolismo oxidativo de las células., Esto nos
indica que la maduración está asociada a importantes cambios redox en los que
participan enzimas antioxidantes fundamentalmente para contrarrestar las alteraciones
metabólicas que ocurren durante este proceso. Otros grupos importantes de proteínas
que se afectan son aquellas relacionadas con el metabolismo de las proteínas, sobre todo
las que poseen actividad proteolítica. En realidad durante la maduración de los frutos, el
recambio proteico es muy considerable ya que se produce el desmantelamiento de
estructuras pre-existentes y síntesis de nuevas (Palma et al., 2011b). Por tanto, es
lógico pensar que el metabolismo de las proteínas tendrá un marcado papel en la
maduración. En el caso de los frutos verdes también destaca el grupo de proteínas
Discusión general
138
implicadas en el metabolismo de aminoácidos. Éste es un aspecto relevante para el fruto
y, por consiguiente, para la nutrición, por el papel que desempeñan éstos, no sólo como
elementos constituyentes de nuevas proteínas que se van a sintetizar, sino también como
fuente para otros metabolismos como es la síntesis de glutatión u otros péptidos
pequeños que puedan tener funciones importantes en la estabilidad de los frutos, etc.
Discusión general
139
Figura 11: Histograma de los grupos funcionales, según clasificación de Bevan (Bevan et al., 1998) en
los que se encuadran las proteínas identificadas por 2-D y MALDI/TOF-TOF de frutos verdes (A) y rojos
(B) de pimiento.
Esta estrategia de estudiar el proteoma de los frutos para avanzar en el
conocimiento de la maduración de los mismos ha sido empleada en los últimos años en
un buen número de especies, entre las que se incluyen la vid, el tomate, kiwi, mango,
naranja, melocotón, etc. (Palma et al., 2011b)y referencias incluidas; (Kambiranda et
al., 2014; Pan et al., 2014; Wu et al., 2014; Fraige et al., 2015; Jiang et al., 2015).
El estudio del nitro-proteoma se ha acometido por la relevancia que tiene el NO
y las especies derivadas (RNS) en la transducción de señales que regulan la mayoría de
los procesos metabólicos (Corpas et al., 2008a; Corpas and Barroso, 2014). Según
nuestros resultados la nitración de proteínas es un evento relevante en la maduración de
los frutos de pimiento, pero sería también de interés acometer las MPT originadas por
S-nitrosilación, una modificación de las proteínas que es reversible y en la que participa
el S-nitrosoglutatión (Corpas et al., 2013a). El análisis in vitro del efecto que tanto la
nitración como la S-nitrosilación ejercen sobre algunas proteínas permite conocer
exactamente las modificaciones estructurales que sufren y que son las responsables, en
última instancia, de la mayor o menor actividad enzimática que muestran en cada
situación (Begara-Morales et al., 2014). Igualmente sería de gran interés estudiar el
oxi-proteoma completo, ya que nos proporcionaría una imagen más global de los
eventos que se suceden durante la maduración. Como ya es reconocido, las proteínas
oxidadas son destruidas normalmente por sistemas proteolíticos. El relevante papel que
juegan las proteasas durante la maduración, como se indicó anteriormente, hace que esta
ruta sea un objetivo a tener en cuenta en los próximos estudios.
Aplicado a la biología celular, el análisis de los proteomas de los orgánulos
proporciona un conocimiento profundo de la dinámica del metabolismo celular,
incluyéndose las interacciones entre orgánulos, el tránsito de moléculas, los procesos de
señalización intracelulares, etc. Permite, además, amplificar los datos obtenidos en el
proteoma global de las muestras y que, por cuestiones de concentración o de abundancia
relativa de las proteínas, podría hacer indetectables a algunas de ellas. A nivel de
plastidios, la conversión de cloroplastos en cromoplastos está asociada al
desmantelamiento de las rutas fotosintéticas y la aparición de rutas implicadas en el
Discusión general
140
metabolismo de carotenoides. La investigación del proteoma plastídico se ha
documentado ampliamente en los último años, así como su evolución durante los
cambios en distintas etapas del desarrollo y maduración de los frutos (Egea et al., 2011;
Barsan et al., 2012; Nogueira et al., 2012; Wang et al., 2013b; Renato et al., 2014).
En este contexto hay que destacar los studios realizados sobre el proteoma de
cromoplastos de frutos de pimiento (Ytterberg et al., 2006; Wang et al., 2013a).
Por el contrario, los proteomas de mitocondrias y peroxisomas están menos
estudiados. En esta Tesis se documenta por primera vez el proteoma de los peroxisomas
de frutos de pimiento durante la maduración. Se siguió desde una estrategia estándar de
separación de proteínas por electroforesis 2-D seguida de análisis de espectrometría de
masa, a una nueva fórmula que detecta proteínas candidatas en base a análisis de
secuencia in silico, pero que ha de corroborarse con ensayos in vitro con proteínas
recombinantes o métodos alternativos. En cualquier caso, nuestros resultados aportan
evidencias de la presencia en los peroxisomas de proteínas hasta ahora no asociadas a
estos orgánulos. Por tanto, estas aproximaciones resultan ser de gran calado ya que nos
proporciona nuevos elementos a tener en cuenta en la biología celular y en la fisiología
molecular de la maduración.
141
Conclusiones
142
- En esta Tesis Doctoral se constata que los estudios proteómicos son una gran
herramienta para analizar los cambios metabólicos que se producen durante la
maduración de los frutos de variedades comerciales de pimiento dulce. Así, los datos de
proteómica obtenidos son consistentes, e indican que, en base a la abundancia relativa
de las proteínas, en la maduración de los frutos intervienen de manera fundamental el
metabolismo oxidativo y el relacionado, sobre todo, con la degradación proteica,
fenómenos que son fundamentales, si tenemos en cuenta las grandes transformaciones
metabólicas que sufre el fruto de pimiento.
2.- Los datos obtenidos en el análisis del proteoma de los peroxisomas complementan y
afinan aún más los observados en el estudio del proteoma global de los frutos. Así, se
corrobora la función preeminente que desarrollan la catalasa y las superóxido
dismutasas, enzimas propias del metabolismo del orgánulo, pero además nuestros datos
enfatizan la relevancia de las rutas metabólicas del peroxisoma durante la maduración,
habida cuenta de que parecen coexistir la fotorrespiración, la β-oxidación de ácidos
grasos y el ciclo del glioxilato a largo de todo el proceso, algo que no se había
observado hasta la fecha en otros órganos vegetales.
3.- Por otro lado, la detección de ciertas proteínas en el proteoma de los peroxisomas,
que hasta la fecha estaban asimiladas a otros orgánulos, abre de nuevo el debate sobre la
verdadera localización subcelular de algunas proteínas, sobre todo aquéllas que
participan en rutas metabólicas compartidas entre varios compartimentos celulares.
4.- El análisis del nitro-proteoma, que permite detectar las proteínas que han sufrido la
nitración de algunas de sus tirosinas, revela que esta modificación post-traduccional,
propiciada probablemente por el peroxinitrito, es un evento consustancial a la
maduración de los frutos de pimiento, donde la catalasa parece jugar un papel central.
143
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Anexo I.1
179
ANEXO I.1
Análisis bioinformático para la proteína de Arabdopsis thaliana At1g61680
El número de acceso en la base de datos UNIPROT para A. thaliana corresponde a
Q84UV0. A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos de esta proteína y su
PTS1 marcado en rojo, obtenido del NCBI.
1 MALIATKISS RSCFVSAYPN NSPTFLISKF PNTVDSLSPA NTAKRSILRN VHASVSNPSK
61 QFHNKTSLEY LHELNIKKIK NILSANVDVP SENLEMIDVI QSLGIDLHFR QEIEQTLHMI
121 YKEGLQFNGD LHEIALRFRL LRQEGHYVQE IIFKNILDKK GGFKDVVKND VKGLTELFEA
181 SELRVEGEET LDGAREFTYS RLNELCSGRE SHQKQEIMKS LAQPRHKTVR GLTSKRFTSM
241 IKIAGQEDPE WLQSLLRVAE IDSIRLKSLT QGEMSQTFKW WTELGLEKDV EKARSQPLKW
301 HTWSMKILQD PTLTEQRLDL TKPISLVYVI DDIFDVYGEL EELTIFTRVV ERWDHKGLKT
361 LPKYMRVCFE ALDMITTEIS MKIYKSHGWN PTYALRQSWA SLCKAFLVEA KWFNSGYLPT
421 TEEYMKNGVV SSGVHLVMLH AYILLGEELT KEKVELIESN PGIVSSAATI LRLWDDLGSA
481 KDENQDGTDG SYVECYLNEY KGSTVDEART HVAQKISRAW KRLNRECLNP CPFSRSFSKA
541 CLNIARTVPL MYSYDDDQRL PDEYLKSLM //
Los algoritmos aportan una posible candidata en Capsicum annuum (gb|GD135281.1),
cuyos últimos 14 aminoácidos en el extremo C-terminal son los siguientes:
QSLPVLQEYIKSML.
Con el número de acceso GD135281.1 en el NCBI, nos aparece la siguiente secuencia
EST (KS26061G10 ) de C. annuum de 593 bp.
GCACGAGGGCAGTCTTAGTTCACTTGTTCTATCTCTTAGGTCTTGGTGTAAGCTCTATAAGTTTGGAGGA
TATATCAGCCATATCTGCTTCTGCGGCTATGATTCTACGCCTTTGGGATGATCTTGGAACTGCAAAGGAT
GAAAATCAAGAAGGAACTGATGGTTCATACATAGAATGTTACATCAAGGAAAACAAAGATGCTTCTCTTG
AATTGGCAAGAGAACATGTGATCAAGCTAATAGAAGATGAATGGAAGCAACTCAACAAAGAACATCTTCG
TCTGATGAGTCGATCTTCAAGATCATTTTCAAAAGCTTCGCTTAATTTTGCAAGGATGGTTCCTCTTATG
TACAATTACGATGATAATCAGTCCCTCCCTGTCCTCCAAGAATACATTAAGTCTATGTTGTAAGCGGAGG
CAGGTAGAATTGAGGAGTCCATTCA
AGCTTCCTTTGATAGAAAGTTACACTATTTATACATAGTTGAAAT
TAATTTTTATTTATATAGTAGCTATTGAACCTCCTACGACTTCTTTGTATGTTTACTTATTTATATTTTG
AAATCCTTAGTGAATATCTTGGCTCTGCCAATT
La traducción de esta secuencia de nucleótidos, en aminoácidos corresponde con el
marco de lectura (+3) siguiente:
5’3’f 3 T R A V L V H L F Y L L G L G V S S I S L E D I S A I S A S A A M I L
R L W D D L G T A K D E N Q E G T D G S Y I E C Y I K E N K D A S L E
L A R E H V I K L I E D E W K Q L N K E H L R L M S R S S R S F S K A
S L N F A R M V P L M Y N Y D D N Q S L P V L Q E Y I K S M L Stop A E
A G R I E E S I Q A S F D R K L H Y L Y I V E I N F Y L Y S S Y Stop T
S Y D F F V C L L I Y I L K S L V N I L A L P I
Anexo I.1
180
En azul se indica la correlación de la secuencia con los 14 aminoácidos del extremo C-
terminal indicado por el algoritmo.
1) Para llevar a cabo nuestro análisis, en primer lugar se hace un alineamiento entre la
secuencia de la proteína de Arabidopsis y las posibles proteínas ortólogas de C. annuum
(blastp) y se obtienen los siguientes resultados:
Figura I.1: Resultados de blastp de la proteína de Arabidopsis frente proteínas de Capsicum annuum.
Las “barras rojas” del alineamiento se corresponden con las secuencias cuya similitud
con la secuencia problema es mayor. Dichas “barras rojas”, a su vez, se corresponden
con las proteínas de Capsicum annuum indicadas en la siguiente tabla.
Tabla I.1: Secuencias que tienen alineamientos significativos. El parámetro “e-value” es el valor de
corte que nos permite definir qué alineamientos queremos obtener de acuerdo a su significación
estadística. Cuanto menor sea el “e-value”, más significativo es un alineamient. “Query cover” indica el
porcentaje de homología de nuestra secuencia problema.
Proteína Número de acceso e-value Query cover
5-epiaristoloqueno sintasa,
secuencia completa
O65323.1 1e-80 86%
5-epiaristoloqueno sintasa CAA06614.1 6e-80 86%
sesquiterpeno ciclasa AAK15641.1 3e-73 81%
UV-induced sesquiterpeno cyclasa
inducida por UV
AAF21053.1 4e-71 81%
sesquiterpeno cyclasa AAK15642.1 4e-58 81%
Con estos resultados se construye el siguiente árbol de distancia entre secuencias,
referidas al molde de A. thaliana At1g61680.
Anexo I.1
181
Figura I.2: Árbol de distancia entre las secuencias, teniendo como referencia la proteína At1g61680 de
A. thaliana.
2) En segundo lugar se hace un alineamiento entre la secuencia EST traducida (cortada
en en C-terminal) frente a proteínas de Capsicum annuum.
T R A V L V H L F Y L L G L G V S S I S L E D I S A I S A S A A M I L
R L W D D L G T A K D E N Q E G T D G S Y I E C Y I K E N K D A S L E
L A R E H V I K L I E D E W K Q L N K E H L R L M S R S S R S F S K A
S L N F A R M V P L M Y N Y D D N Q S L P V L Q E Y I K S M L
Y ello nos proporciona las siguientes correspondencias
Tabla I.2: Secuencias que tienen alineamientos significativos. El parámetro “e-value” es el valor de
corte que nos permite definir qué alineamientos queremos obtener de acuerdo a su significación
estadística. Cuanto menor sea el “e-value”, más significativo es un alineamiento. “Query cover” indica el
porcentaje de homología de nuestra secuencia problema.
Proteína Número de acceso e-value Query cover
sesquiterpeno ciclasa AAK15641.1 3e-08 89%
sesquiterpeno cyclasa inducida por
UV
AAF21053.1 2e-06 80%
epiaristoloqueno sintasa, secuencia O65323.1 6e-06 80%
Anexo I.1
182
completa
5-epiaristoloqueno sintasa CAA06614.1 6e-06 80%
Observamos que por ambas aproximaciones bioinformáticas, los resultados coinciden,
lo que significa que, efectivamente, existe una proteína ortóloga en Capsicum annuum
que probablemente tendrá una localización peroxisomal determinada por un PTS1 del
tipo SML>.
Anexo I.2
183
ANEXO I.2
Análisis bioinformático para la proteína de Arabdopsis thaliana At2g38760
El número de acceso en la base de datos UNIPROT para A. thaliana corresponde a
AAP21228. A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos de esta proteína y
su PTS1 marcado en rojo, obtenido del NCBI.
1 MATIRVPNEV PSPAQDSETL KQAIRGWGTD EKAIIRVLGQ RDQSQRRKIR ESFREIYGKD
61 LIDVLSSELS GDFMKAVVSW TYDPAERDAR LVNKILNKEK KKKSLENLKV IVEISCTTSP
121 NHLIAVRKAY CSLFDSSLEE HIASSLPFPL AKLLVTLAST FRYDKDRTDA EVATIEAAML
181 REAIEKKQLD HDHVLYILGT RSIYQLRETF VAYKKNYGVT IDKDVDGCPG DADLRSLLKV
241 AIFCIDTPEK HFAKVVRDSI EGFGTDEDSL TRAIVTRAEI DLMKVRGEYF NMYNTSMDNA
301 ITGDISGDYK DFIITLLGSK I //
Los algoritmos aportan una posible candidata en Capsicum annuum (gb|GD107205.1),
cuyos últimos 14 aa en el extremo C-terminal son los siguientes:
DYRKFLMTLLGAKV.
Con el número de acceso GD107205.1en el NCBI, nos aparece la siguiente secuencia
EST (KS22024A04 ) de C. annuum de 442 bp.
GCACGAGGAGCAACTTTTGAGTGCTACAAGCAAAATTACGGATTCTCCATTGACCAGGAC
ATTAAGAGCTGTGGAAAGGGTCTGCTGGAGTCTATTCTGAAGGTCGTTATCTGGTGCATT
GATTCGCCGGAGAAACATTTTGCTGAGGTTGTCAGAGCCTCTGTTGTCGGGTTAGGGACT
GATGAGGATTCACTAACTAGAGCCATTGTAACGCGAGCTGAAGTTGATATGATGAAAGTG
AGGGGAGAGTATTTCATCGCGAACAAGACTAGTCTTGATAATGCAGTTATTGATGACACA
TCAGGTGATTACAGAAAGTTCCTCATGACACTACTTGGTGCCAAAGTCTAGATCTTTGGA
CATGATACATTGTGTTGCGTAGTGTTTCAATAGTATAATTCTACTTTGTATGGTTTCATT
TAACGATGCTACATGATATGAG
La traducción de la secuencia de nucleótidos de EST en aminoácidos corresponde con el
marco de lectura (+1) siguiente:
5’3’f 3 A R G A T F E C Y K Q N Y G F S I D Q D I K S C G K G L L E S I L K V
V I W C I D S P E K H F A E V V R A S V V G L G T D E D S L T R A I V
T R A E V D M M K V R G E Y F I A N K T S L D N A V I D D T S G D Y R
K F L M T L L G A K V Stop I F G H D T L C C V V F Q Stop Y N S T L Y
G F I Stop R C Y Met I Stop
En azul se indica la correlación de la secuencia con los 14 aminoácidos del extremo C-
terminal indicado por el algoritmo.
Anexo I.2
184
1) Para llevar a cabo nuestro análisis, en primer lugar se hace un alineamiento entre la
secuencia de la proteína de Arabidopsis y las posibles proteínas ortólogas de Capsicum
annuum (blastp) y se obtienen los siguientes resultados:
Figura I.3: Resultados de blastp de la proteína de Arabidopsis frente proteínas de Capsicum annuum.
Las “barras rojas” del alineamiento se corresponden con las secuencias cuya similitud
con la secuencia problema es mayor. Dichas “barras rojas” a su vez se corresponden
con las proteínas de Capsicum annuum indicadas en la siguiente tabla.
Tabla I.3: Secuencias que tienen alineamientos significativos. El parámetro “e-value” es el valor de
corte que nos permite definir qué alineamientos queremos obtener de acuerdo a su significación
estadística. Cuanto menor sea el “e-value”, más significativo es un alineamient. “Query cover” indica el
porcentaje de homología de nuestra secuencia problema.
Proteína Número de acceso e-value Query cover
anexina P38 CAA10261.1 3e-84 99%
anexina CAA63710.1 3e-75 99%
Estructura cristalina de la anexina,
cadena 24
1DK5_A 4e-75 99%
annexina cap32 CAA10210.1 1e-74 99%
Con estos resultados se construye el siguiente árbol de distancia entre secuencias,
referidas al molde de A. thaliana At2g38760.
Anexo I.2
185
Figura I.4: Árbol de distancia entre las secuencias, teniendo como referencia la proteína At2g38760 de
A. thaliana.
2) En segundo lugar se hace un alineamiento entre la secuencia EST traducida (cortada
en en C-terminal) frente a proteínas de Capsicum annuum.
A R G A T F E C Y K Q N Y G F S I D Q D I K S C G K G L L E S I L K V
V I W C I D S P E K H F A E V V R A S V V G L G T D E D S L T R A I V
T R A E V D M M K V R G E Y F I A N K T S L D N A V I D D T S G D Y R
K F L M T L L G A K V
Y ello nos proporciona las siguientes correspondencias
Tabla I.4: Secuencias que tienen alineamientos significativos. El parámetro “e-value” es el valor de
corte que nos permite definir qué alineamientos queremos obtener de acuerdo a su significación
estadística. Cuanto menor sea el “e-value”, más significativo es un alineamient. “Query cover” indica el
porcentaje de homología de nuestra secuencia problema.
Proteína Número de acceso e-value Query cover
anexina P38 CAA10261.1 1e-27 96%
anexina cap32 CAA10210.1 9e-18 96%
anexina CAA63710.1 1e-17 96%
Anexo I.2
186
Observamos que por ambas aproximaciones bioinformáticas, los resultados coinciden,
lo que significa que, efectivamente, existe una proteína ortóloga en Capsicum annuum
que probablemente tendrá una localización peroxisomal determinada por un PTS1 del
tipo AKV>.
Anexo I.3
187
ANEXO I.3
Análisis bioinformático para la proteína de Arabdopsis thaliana At3g14660
El número de acceso en la base de datos UNIPROT para A. thaliana corresponde a
Q9LUC8. A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos de esta proteína y su
PTS1 marcado en rojo, obtenido del NCBI.
1 MEISVASVTV SVAVVVVSWW VWRTLQRVWL KPKMLESYLR RQGLAGTPYT PLVGDLKRNF
61 SMLAEARSKP INLTDDITPR IVPYPLQMLK THGRTFFTWF GPIPTITIMD PEQIKEVFNK
121 VYDFQKAHTF PLGRLIAAGL VSYDGDKWTK HRRIINPAFH LEKIKNMVPA FHQSCSEIVG
181 EWDKLVTDKQ SSCEVDIWPW LVSMTADVIS RTAFGSSYKE GQRIFELQAE LAQLIIQAFR
241 KAIIPGYRYF PTKGNRRMKA AAREIKFILR GIVNKRLRAR EAGEAPSDDL LGILLESNLG
301 QTKGNGMSTE ELMEECKLFY FAGQETTTVL LVWTMVLLSQ HQDWQARARE EVKQVFGDKE
361 PDAEGLNQLK VMTMILYEVL RLYPPVVQLT RAIHKEMQLG DLTLPGGVQI SLPILLIQRD
421 RELWGNDAGE FKPDRFKDGL SKATKNQVSF FPFAWGPRIC IGQNFALLEA KMAMTLILRK
481 FSFELSPSYV HAPYTVLTTH PQFGAPLILH KL //
Los algoritmos aportan una posible candidata en Capsicum annuum (gb|GD129978.1),
cuyos últimos 14 aa en el extremo C-terminal son los siguientes:
IHPQYGAPLLMRKL.
Con el número de acceso GD129978.1en el NCBI, nos aparece la siguiente secuencia
EST (KS26002F09 ) de C. annuum de 717 bp.
GCACGAGGAGAGGTTTTGCAGGTCTTTGGAAATGATAAACCCGATTTGGAAGGACTAGGT
CGCTTGAAAATTGTGAACATGATCTTGTACGAGACGCTAAGGTTATTCCCCCCATTACCA
ACATTTGGTAGAAGGAATAAACAAGAAGGGAAATTGGGGGAGCTAGATCTACCTGATGGA
GTGATACTCATTATACCCGCAATCTTGGTACATTATGATAAGGAAATATGGGGTGAAGAC
GCAAAGGAATTCAAACCAGAAAGATTTAGTGAAGGAGTGTCAAAGGCAACCAAAGGACAA
TTCTCATATATTCCATTTGGCGGGGGACCTCGAATTTGCATTGGACAAAACTTTGCAATG
ATGGAAGCAAAAATGGCAATGGCAATGATACTAAGAAAATTCTCCTTCGAACTCTCTCCA
TCTTATACACATGCTCCATTTGCAGTAGTGACTATTCATCCTCAGTATGGTGCTCCTCTG
CTTATGCGCAAACTTTAAAACGGAATATCCAGAAGAATACTTGTATTCATAGGTTTTCTC
AATTGAACTTCATATAGGATGCTTGGTCGAGAAAAAGATAAGTTTTGCACCATAGTATTA
ATGCATCTCTATATTCATTTTGGTTTGTCCATATACCGGGAATCAACCAAAACAACTACT
GCTATTTTTCTCAAGTGCTATGTACTTTCTTGTTTTCTTTGGCCTGTATATATTTCT
La traducción de la secuencia de nucleótidos de EST en aminoácidos corresponde con el
marco de lectura (+1) siguiente:
5’3’f 3 A R G E V L Q V F G N D K P D L E G L G R L K I V N M I L Y E T L R L
F P P L P T F G R R N K Q E G K L G E L D L P D G V I L I I P A I L V
H Y D K E I W G E D A K E F K P E R F S E G V S K A T K G Q F S Y I P
Anexo I.3
188
F G G G P R I C I G Q N F A M M E A K M A M A M I L R K F S F E L S P
S Y T H A P F A V V T I H P Q Y G A P L L M R K L Stop N G I S R R I L
V F I G F L N Stop T S Y R M L G R E K D K F C T I V L M H L Y I H F G
L S I Y R E S T K T T T A I F L K C Y V L S C F L W P V Y I S
En azul se indica la correlación de la secuencia con los 14 aminoácidos del extremo C-
terminal indicado por el algoritmo.
1) Para llevar a cabo nuestro análisis, en primer lugar se hace un alineamiento entre la
secuencia de la proteína de Arabidopsis y las posibles proteínas ortólogas de Capsicum
annuum (blastp) y se obtienen los siguientes resultados:
Figura I.5: Resultados de blastp de la proteína de Arabidopsis frente proteínas de Capsicum annuum.
Las “barras moradas” del alineamiento se corresponden con las secuencias cuya
similitud con la secuencia problema es mayor.
Dichas “barras moradas” a su vez se corresponden con las proteínas de Capsicum
annuum indicadas en la siguiente tabla.
Tabla I.5: Secuencias que tienen alineamientos significativos. El parámetro “e-value” es el valor de
corte que nos permite definir qué alineamientos queremos obtener de acuerdo a su significación
estadística. Cuanto menor sea el “e-value”, más significativo es un alineamient. “Query cover” indica el
porcentaje de homología de nuestra secuencia problema.
Proteína Número de acceso e-value Query cover
citoromo P450 A ADO24345.1 2e-27 78%
citocromo P450 AAF27282.1 4e-27 79%
citocromo P450 ACD10924.1 8e-24 75%
p-cumarato 3-hidroxilasa putativa ACF17644.1 5e-17 78%
Anexo I.3
189
Con estos resultados se construye el siguiente árbol de distancia entre secuencias,
referidas al molde de A. thaliana At3g14660.
Figura I.6: Árbol de distancia entre las secuencias, teniendo como referencia la proteína At3g14660 de
A. thaliana.
2) En segundo lugar se hace un alineamiento entre la secuencia EST traducida (cortada
en en C-terminal) frente a proteínas de Capsicum annuum.
A R G E V L Q V F G N D K P D L E G L G R L K I V N M I L Y E T L R L
F P P L P T F G R R N K Q E G K L G E L D L P D G V I L I I P A I L V
H Y D K E I W G E D A K E F K P E R F S E G V S K A T K G Q F S Y I P
F G G G P R I C I G Q N F A M M E A K M A M A M I L R K F S F E L S P
S Y T H A P F A V V T I H P Q Y G A P L L M R K L
Y ello nos proporciona las siguientes correspondencias
Tabla I.6: Secuencias que tienen alineamientos significativos. El parámetro “e-value” es el valor de
corte que nos permite definir qué alineamientos queremos obtener de acuerdo a su significación
Anexo I.3
190
estadística. Cuanto menor sea el “e-value”, más significativo es un alineamient. “Query cover” indica el
porcentaje de homología de nuestra secuencia problema.
Proteína Número de
acceso
e-value Query cover
citocromo P450 A ADO24345.1 2e-27 78%
citocromo P450 ACD10924.1 8e-24 75%
Observamos que por ambas aproximaciones bioinformáticas, los resultados coinciden,
lo que significa que, efectivamente, existe una proteína ortóloga en Capsicum annuum
que probablemente tendrá una localización peroxisomal determinada por un PTS1 del
tipo RKL>.
Anexo I.4
191
ANEXO I.4
Análisis bioinformático para la proteína de Arabdopsis thaliana At3g46170
El número de acceso en la base de datos UNIPROT para A. thaliana corresponde a
AEE78124. A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos de esta proteína y
su PTS1 marcado en rojo, obtenido del NCBI.
1 MSNHQTLTFV FGEKEVLKQL EPWCELKDKV VLVTGASSGI GREICLDLGK AGCKIIAVAR
61 RVDRLNSLCS EINSSSSTGI QAAALKLDVT SDAATIQKVV QGAWGIFGKI DALINNAGIR
121 GNVKSSLDLS KEEWDNVFKT NLTGPWLVSK YVCVLMRDAK LGGSVINISS IAGIRGILPG
181 ALAYACSKIG VDTMSKMMAV ELGVHKIRVN SIAPGIFKSE ITQGLMQKEW FKNVTERTVP
241 LKLQQTVDPG ITSLVRYLIH DSSQYISGNT YIVDSGATLP GVPIFSSL //
Los algoritmos aportan dos posibles candidatas en Capsicum annuum (GD126785.1 y
GD058877.1), cuyos últimos 14 aa en el extremo C-terminal son los siguientes:
GGGTLPGVPIFSSL en ambos casos.
Con el número de acceso GD126785.1 en el NCBI, nos aparece la siguiente secuencia
EST (KS25033E17 ) de C. annuum de 717 bp.
GCACGAGGGCCGATGGCGCTACTATTGAGGCTTCCGTACAAAGAGCTTGGGATGCCTTTG
GACGTATCGATGCCTTGATTAACAATGCTGGCGTTAGAGGTAGTATGAACTCTTCACTGG
AATTGTCAGAGGAGGAATGGGAAAATACTTATAAGACGAATCTAAGAGGGGCATGGTTGG
TTTCAAAATATGTTTGTAAACGTATGCGCGATGCTAAACAGGGCGGAGGATCTGTTATTA
ATATAACTTCGATAGCTGGTCTGAATCGAGTTATATTAGCAGGGTCTATTGCTTACGGTT
CTTCGAAGATGGCTCTTGACATGGTCACTAAGACAATGGCACTTGAATTGGGAGTTCACA
ACATCAGAGTGAACTCTATAGCACCAGGAATATTCAAATCCGAGATAACAGAGAGCCTTT
TTAAACAGAAATGGTTCCATGAATTTTTTTATAAAACCCTTCCTCAGAGATATCTTGGAG
CAACGGATCCGGCTTTAACATCAGTAGTTCGATATTTGATCCATGATTGTTCTGAATATG
TAACTGGCAATGTCTTCGTTGTTGATGGTGGAGGTACTTTACCCGGTGTTCCCATTTTCT
CATCGTTGTAGAAGATGGAGTGATAATTTAGTATTGTGCAACCTGCACTAATAATGCAAT
AGTTAATTAATATTGTTGCTTTTGTCTCATTGTATTAATCATATTGGTCAATTCGT
La traducción de la secuencia de nucleótidos de EST en aminoácidos corresponde con el
marco de lectura (+1) siguiente:
5’3’f 3 T R A D G A T I E A S V Q R A W D A F G R I D A L I N N A G V R G
S M N S S L E L S E E E W E N T Y K T N L R G A W L V S K Y V C K
Anexo I.4
192
R M R D A K Q G G G S V I N I T S I A G L N R V I L A G S I A Y G S S
K M A L D M V T K T M A L E L G V H N I R V N S I A P G I F K S E I T
E S L F K Q K W F H E F F Y K T L P Q R Y L G A T D P A L T S V V R Y
L I H D C S E Y V T G N V F V V D G G G T L P G V P I F S S
L Stop K M E Stop Stop F S I V Q P A L I M Q Stop L I N I V A F V S L
Y StopS Y W S I R
En azul se indica la correlación de la secuencia con los 14 aminoácidos del extremo C-
terminal indicado por el algoritmo.
Con el número de acceso GD058877.1en NCBI, nos aparece la siguiente secuencia EST
(KS14016A04 ) de C. annuum de 685 bp.
GCACGAGGCCTTGAGCTTGATGTCACTGCTGATGGTGCTACTATTGAGGCTGCTGTACAA
ATAGCTTGGGACGCCTTTGGACGTATTGATTCCTTGGTTAACAATGCTGGAGTTCGAGGT
AGTACAAGTTCTTCACTGAATTTGTCAGAGGAGGAGTGGGAACATACTTATAAGACGAAT
CTAAGAGGGGCATGGCTGGTCTCAAAATATGTTTGTAAACGTATGCGCGATGCTAAACAA
GGCGGAGGATCTGTTATTAATATAACCTCAATAGCTGCTCTGAATAGAGTACTAGTAGGA
GGGACTCTTGCTTACGCTTCTTCAAAGATGGCTCTCGACATGGTCACTAAGATAATGGCA
CTTGAATTAGGAGCAGACAATATTCGAGTGAACTCAATATCGCCAGGAATATTCAAATCT
GAGATAACAGAGAGCCTTCTTCAACAGGAATGGTTCCATAAGTTTCTTTATAAAACTCAT
CCTCAGAGATTTATTGGAAAGACAGATCCGGCTTTAACAACACTGCTCCGGTATTTGATC
CATGATTCTTCTGAATATGTAACAGGCAATATCTTCATTGTTGATGGTGGAGGTACCTTA
CCAGGCGTTCCCATTTTCTCATCGTTGTAGAAGATGGAGTAATAGTTTAGTACTGGTGAA
TGTTCAGATAGTCAGTCGACTGAAC
La traducción de la secuencia de nucleótidos de EST en aminoácidos corresponde con el
marco de lectura (+1) y es la siguiente:
5’3’f 3
A R G L E L D V T A D G A T I E A A V Q I A W D A F G R I D S L V N N
A G V R G S T S S S L N L S E E E W E H T Y K T N L R G A W L V S K Y
V C K R M R D A K Q G G G S V I N I T S I A A L N R V L V G G T L A Y
A S S K M A L D M V T K I M A L E L G A D N I R V N S I S P G I F K S
E I T E S L L Q Q E W F H K F L Y K T H P Q R F I G K T D P A L T T L
L R Y L I H D S S E Y V T G N I F I V D G G G T L P G V P I F S S
L Stop K M E Stop Stop F S T G E C S D S Q S T E
En azul se indica la correlación de la secuencia con los 14 aminoácidos del extremo C-
terminal indicado por el algoritmo.
Anexo I.4
193
1) Para llevar a cabo nuestro análisis, en primer lugar se hace un alineamiento entre la
secuencia de la proteína de Arabidopsis y las posibles proteínas ortólogas de Capsicum
annuum (blastp) y sólo se obtiene un resultado significativo:
Figura I.7: Resultados de blastp de la proteína de Arabidopsis frente proteínas de Capsicum annuum.
La “barra morada” del alineamiento se corresponden con las secuencias cuya similitud
con la secuencia problema es mayor.
Dichas “barra morada” , a su vez, se corresponden con las proteínas de Capsicum
annuum indicada en la siguiente tabla.
Tabla I.7: Secuencias que tienen alineamientos significativos. El parámetro “e-value” es el valor de
corte que nos permite definir qué alineamientos queremos obtener de acuerdo a su significación
estadística. Cuanto menor sea el “e-value”, más significativo es un alineamient. “Query cover” indica el
porcentaje de homología de nuestra secuencia problema.
Proteína Número de acceso e-value Query cover
proteína portadora de acilo 3-oxoacil-
reductasa putativa
ACF17653.1 6e-30 90%
En este caso al ser una única secuencia no se pudo hacer ningún árbol de distancias de
secuencias.
2) En segundo lugar se hace un alineamiento entre la secuencia EST traducida (cortada
en en C-terminal) frente a proteínas de Capsicum annuum, siendo para KS25033E17
T R A D G A T I E A S V Q R A W D A F G R I D A L I N N A G V R G
S M N S S L E L S E E E W E N T Y K T N L R G A W L V S K Y V C K
R M R D A K Q G G G S V I N I T S I A G L N R V I L A G S I A Y G S S
K M A L D M V T K T M A L E L G V H N I R V N S I A P G I F K S E I T
E S L F K Q K W F H E F F Y K T L P Q R Y L G A T D P A L T S V V R Y
L I H D C S E Y V T G N V F V V D G G G T L P G V P I F S S L
y para KS14016A04
Anexo I.4
194
A R G L E L D V T A D G A T I E A A V Q I A W D A F G R I D S L V N N
A G V R G S T S S S L N L S E E E W E H T Y K T N L R G A W L V S K Y
V C K R M R D A K Q G G G S V I N I T S I A A L N R V L V G G T L A Y
A S S K M A L D M V T K I M A L E L G A D N I R V N S I S P G I F K S
E I T E S L L Q Q E W F H K F L Y K T H P Q R F I G K T D P A L T T L
L R Y L I H D S S E Y V T G N I F I V D G G G T L P G V P I F S S L
La única secuencia que produce resultados signifcativos es:
Tabla I.8: : Secuencia que tiene un alineamiento significativo. El parámetro “e-value” es el valor de
corte que nos permite definir qué alineamientos queremos obtener de acuerdo a su significación
estadística. Cuanto menor sea el “e-value”, más significativo es un alineamient. “Query cover” indica el
porcentaje de homología de nuestra secuencia problema.
Proteína Número de
acceso
e-value Query cover
proteína portadora de acilo 3-oxoacil-
reductasa putativa
ACF17653.1 6e-30 90%
Observamos que por ambas aproximaciones bioinformáticas, los resultados coinciden,
lo que significa que, efectivamente, existe una proteína ortóloga en Capsicum annuum
que probablemente tendrá una localización peroxisomal determinada por un PTS1 del
tipo RKL>.