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Universidade de Lisboa
Faculdade de Ciências
Departamento de Biologia Vegetal
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
Tiago Maria de Carvalho da Costa Amado
Mestrado em Biologia Molecular e Genética
2008
Universidade de Lisboa
Faculdade de Ciências
Departamento de Biologia Vegetal
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
Tiago Maria de Carvalho da Costa Amado
Mestrado em Biologia Molecular e Genética
Dissertação orientada por:
Dr. Paulo Emanuel Marujo (IBET/ITQB)
Prof. Mário Almeida Santos (FCUL)
2008
i
Agradecimentos
Gostaria de agradecer em primeiro lugar à Doutora Fátima, por me ter recebido
prontamente, ter dado a oportunidade de realizar este trabalho no seu laboratório e me ter
orientado ao longo deste ano, apesar de o seu nome não constar na primeira página; ao
Doutor Paulo por ter aceitado ser meu orientador externo e ter sempre "a porta aberta" para
as minhas questões e a ambos um sincero obrigado por tudo o que me ensinaram. Aos
meus colegas de laboratórios, à Neuza e Teresa por alegrarem os dias, à Tânia, Martas,
Renata, Daniela e Frederic pelos concelhos, favores e ajudas e a todos em geral pela vossa
simpatia e por me terem mostrado os "cantos à casa".
Agradeço ao Prof. Doutor Mário Santos por ter sido o meu orientador interno e ter feito a
revisão da minha tese.
Agradeço também ao ITBQ e IBET por me terem proporcionado as condições de trabalho.
Por último gostaria de agradecer aos meus amigos, porque sim, e às pessoas para mim
mais importantes e que enchem a minha vida de cor: os meus pais Ana e Zé, a minha irmã
Marta e a minha mais-que-tudo Rita. Um obrigado sentido e carinhoso para vocês.
ii
Sumário
A expressão génica pode ser regulada a diferentes níveis. Nos últimos anos têm surgido
imensos exemplos de regulação pós-transcricional quer a nível do processamento, quer da
degradação (estabilidade) do RNA, a qual permite uma adaptação rápida a alterações no
meio extracelular.
No processo de invasão do hospedeiro, as bactérias patogénicas atravessam uma série de
condições físico-químicas muito distintas a que têm de fazer frente e se adaptar. Neste
contexto, na adaptação a condições de stress, estão envolvidos diversos mecanismos de
regulação pós-transcricional. No entanto, em enterococos, bactérias Gram-positivas
presentes em diversos ambientes e que tem emergido nos últimos anos como causadores
de infecções nosocomiais graves, não foi ainda estudada a função deste tipo de regulação
em geral e qual a sua relação com a patogenicidade. Assim, este trabalho teve como
objectivos a construção de mutantes em ribonucleases, enzimas cruciais na regulação
pós-transcricional, nomeadamente, em duas exoribonucleases, PNPase e RNase R, e em
duas endoribonucleases, RNase III e RNase J1.
O trabalho efectuado, devido à diversidade das dificuldades encontradas com cada um dos
mutantes, abrangeu uma grande gama de técnicas de biologia molecular e de genética, quer
em Escherichia coli, quer em Enterococcus faecalis.
Assim, o 'mutante' da RNase III encontra-se na última etapa do protocolo, enquanto os
'mutantes' das outras RNases se encontram na fase de confirmação das construções a
utilizar para integração em enterococos (PNPase e RNase R) ou ainda na primeira
clonagem (RNase J1). Os resultados obtidos até este momento, parecem indicar que a
RNase III é essencial em enterococos, tal como acontece em Bacillus subtilis; no entanto,
estudos adicionais serão necessários para confirmação deste resultado.
Palavras-chave: Enterococcus, ribonucleases, mutantes, OE-PCR
iii
Abstract
Gene expression can be regulated at different levels. In the past few years several examples
of post-transcriptional regulation have arise regarding the processing and degradation
(stability) of RNA molecules, which allows a rapid adaptation to changing environments.
When invading the host, pathogenic bacteria have to go through several and very distinct
extracellular conditions to which they have to adapt in order to survive. In this adaptation to
foreign stress causing factors are involved various mechanisms of post-transcriptional
regulation. However in enterococci, Gram-positive cocci present in a large variety of habitats
and that have become one of the leading cause of nosocomial infections, the function of this
kind of regulation and its relation with pathogenicity has not been studied. Thus the goal of
this work was the creation of bacteria mutants on ribonucleases namely on the
exoribonucleases PNPase and RNase R genes and on the endoribonucleases RNase III and
RNase J1. These RNases are enzymes of vital importance on the post-transcriptional
regulation processes.
Due to the diverse difficulties encountered during this work, it came to involve a great variety
of molecular and genetic techniques in both Escherichia coli and Enterococcus faecalis.
At the moment the RNase III 'mutant' is at the final stage of the protocol while the other
RNases 'mutants' are still at the construction confirmation stage before transforming
enterococci (PNPase and RNase R) or still at the first cloning step (RNase J1). The results
obtain so far seem to point RNase III as essencial, similarly to what is described in
Bacillus subtilis. Nevertheless further studies will be necessary to prove this hypothesis.
Keywords: Enterococcus, ribonucleases, mutants, OE-PCR
iv
Lista de abreviaturas
Amp - Amp
B. subtilis -
icilina
DNA - 'deoxyribonucleic acid'
Bacillus subtilis
dNTPs - 'deoxyribonucleotide triphosphate'
dsRNA - 'double-stranded ribonucleic acid'
E. - Enterococcus
E. coli - Escherichia
Ery -
coli
Eri
FCUL - Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa
tromicina
IBET - Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica
ITQB - Instituto de Tecnologia Química e Biológica
kb - kilo pares de base
LA - Luria-Bertani agar
LB - Luria-Bertani broth
M - marcador de massa molecular
MCS - 'multiple cloning site'
MIC - 'minimum inhibitory concentration'
mRNA - 'messenger ribonucleic acid'
ncRNA - 'non-coding ribonucleic acid'
nt - nucleótidos
OE-PCR - 'overlap extension by polymerase chain reaction'
ORF - 'open reading frame'
pb - pares de base
PCR - 'polymerase chain reaction'
pGh 9 - pGh
PNPase - 'polynucleotide phosphoryl
ost 9
ase
pSK+ - pBluescript
'
RNA - 'ribonucleic acid'
SK+
RNase - ribonucle
rRNA - 'ribosomal ribonucleic acid'
ase
S. - Staphylococcus
Ta - Temperatura de 'annealing'
tRNA - 'transfer ribonucleic acid'
V583 - Enterococcus faecalis
V583 ∆ABC - Enterococcus faecalis
V583
V583 ∆ABC
v
Índice Geral
1. Introdução 1
2. Contextualização e Objectivos 6
3. Materiais 7
4. Metodologia e Discussão 9
5. Perspectivas futuras 24
6. Bibliografia 25
7. Anexos 29
vi
Índice de figuras Figura 1 | Ribonucleases identificadas em B. subtilis e E. coli. 4
Figura 2 | Representação esquemática do protocolo para a 11 obtenção de mutantes em Enterococcus faecalis utilizando o pGhost 9.
Figura 3 | Conceito de 'Overlap Entension by Polymerase 12 Chain Reaction' (OE-PCR).
Figura 4 |. Quantificação dos fragmentos resultantes dos 15 PCRs I e II em gel de agarose.
Figura 5 | Obtenção dos fragmentos híbridos. 15
Figura 6 | Combinações das hibridações no passo de 'Overlap Entension'. 16
Figura 7 | PCR I+II com baixo rendimento. 17
Figura 8 | PCR I+II com o rendimento melhorado. 17
Figura 9 | Obtenção do fragmento híbrido correspondente à RNase III. 18
Figura 10 | Variabilidade nos tamanhos dos fragmentos da 18 PNPase e RNase R clonados em pSK+.
Figura 11 | Digestão dupla do pSAVE 6. 20
Figura 12 | Obtenção de transformantes de E. coli com o pSAVE 8. 20
Figura 13 | Obtenção de transformantes de E. faecalis com o pSAVE 8. 20
Figura 14 | Representação esquemática dos acontecimentos 22 de integração e excisão.
Figura 15 | Obtenção de um só tipo de integração do 23 pSAVE 8 no cromossoma de E. faecalis.
Figura 16 | Clones em que ocorreu excisão. 23
Figura Suplementar 1 | Marcadores de massa molecular. 32
vii
Índice de tabelas
Tabela Suplementar 1 | Estirpes e plasmídios utilizados neste trabalho. 29
Tabela Suplementar 2 | 'Primers' utilizados neste trabalho. 30
Tabela Suplementar 3 | Dimensões dos fragmentos esperadas ao longo 31 do protocolo.
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
1
1. Introdução
O termo francês “entérocoque” foi utilizado pela primeira vez numa publicação científica em
1899 por Thiercelin para descrever uma nova bactéria Gram-positiva de origem intestinal
capaz de formar pares e pequenas cadeias (1). Em 1906, Andrewes e Horna introduziram
este microorganismo no género Streptococcus com o nome de Streptococcus faecalis (2).
Um segundo microorganismo de origem fecal com características semelhantes a S. faecalis
foi isolado e denominado S. faecium por Orla-Jensen no ano de 1919 (3). Em 1933,
Lancefield cria um sistema de classificação serológica de Streptococcus com base na
composição dos antigénios bacterianos, onde os enterococos são inseridos no grupo D.
Posteriormente Sherman, em 1937, salienta o facto do termo enterococos ser utilizado com
diferentes significados, desde qualquer estreptococos de origem fecal até organismos
idênticos a S. faecalis (4). Cria então um novo sistema para a classificação dos
estreptococos que os divide em quatro grupos: piogénicos, lácticos, 'viridans' (ou orais) e
enterococos. Em 1970 Kalina propõe que os enterococos deveriam ser transferidos para um
novo género: Enterococcus (5). No entanto, isso só vem a acontecer em 1984 após um
estudo realizado por Schleifer e Kilpper-Balz em que a hibridação de DNA-DNA e DNA-
rRNA confirmam uma maior distância dos enterococos em relação aos estreptococos,
fixando assim a sua localização taxonómica em: Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales;
Enterococcaceae; Enterococcus (6). Nessa altura apenas faziam parte do novo género
E. faecalis e E. faecium mas desde então o número de espécies pertencendo ao género tem
vindo a aumentar. Actualmente pertencem ao género Enterococcus quarenta espécies
(taxonomicamente validadas) sendo E. faecalis a espécie tipo
(http://www.dsmz.de/microorganisms/bacterial_nomenclature_info.php?genus=Enterococcus
&show_all_details=1 acedido a 07/09/2008).
Os enterococos caracterizam-se por serem: bactérias Gram-positivas em forma de cocos,
podendo aparecer individualmente, aos pares ou sob a forma de pequenas cadeias, não
formarem esporos e terem um conteúdo baixo em G+C no genoma (entre os 37 e 45 mol%).
Metabolicamente são: anaeróbios facultativos, catalase e oxidase negativos, realizam
fermentação ácido láctica, possuem resistência intrínseca a vários antibióticos
(e.g. β-lactâmicos, cefaloesporinas, sulfonamidas) e são capazes de tolerar uma vasta gama
de condições de crescimento, nomeadamente a presença de 40% de sais biliares, 6,5% de
NaCl, pH entre 4,6 e 9,6 e temperaturas entre os 10 e os 45 ºC, sendo ainda capazes de
sobreviver a 60 ºC durante 30 minutos (7, 8). Estas bactérias são parte natural da microbiota
intestinal de humanos e animais mas são também frequentemente encontradas em plantas,
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
2
alimentos, solo e águas superficiais, provavelmente devido à contaminação fecal e à
tolerância intrínseca a condições ambientais adversas (9).
Este grupo de bactérias ácido lácticas é importante não só na microbiologia ambiental como
também na microbiologia clínica e alimentar. Os enterococos têm um papel benéfico
importante, considerado por muitos essencial, na produção de muitos queijos tradicionais,
inclusive queijos portugueses, o que se deve provavelmente à sua capacidade proteolítica,
lipolítica e de metabolizar o citrato (7). Estão igualmente envolvidos na fermentação de
vários outros produtos tradicionais, especialmente de origem mediterrânea, como salsichas
e azeitonas (10). Em alguns países estas bactérias são ainda utilizadas na constituição de
probióticos aplicados em produtos alimentares, como iogurtes e leites, e em produtos
farmacêuticos (10). A importância do uso de estirpes bacterianas como probióticos deve-se
às suas diversas acções benéficas, nomeadamente, a inibição de microrganismos
patogénicos, o reforço das barreiras mucosas, a estimulação do sistema imunitário e a
diminuição dos níveis de colesterol (8). Apesar destes seus papéis benéficos, os
enterococos estão também associados ao deterioramento de alimentos, em especial carnes,
e mais preocupantemente, a uma enorme variedade de infecções tanto em animais como no
ser humano (8). Estes patogénios oportunistas são capazes de provocar infecções ao nível
da corrente sanguínea, endocárdio, sistema urinário, sistema nervoso central, abdómen,
feridas e queimaduras, entre outros (11). O número de enterococos resistentes a
antibióticos, com particular destaque para a vancomicina, tem vindo a aumentar de uma
forma preocupante, o que se deve à eficiente capacidade dos enterococos para transferirem
e incorporarem material genético e também à incorrecta utilização dos antibióticos (12).
Existem várias características envolvidas na patogenicidade dos enterococos (7, 11):
− Síntese de citolisina (Cyl; proteína com actividade simultaneamente hemolítica e
bacteriocida);
− Síntese de substância de agregação (Agg; envolvida na conjugação bacteriana e
induzida por feromonas);
− Síntese de uma proteína de superfície extracelular (Esp; envolvida na adesão e
evasão à resposta imune do hospedeiro);
− Síntese de uma endoprotease (GelE; envolvida na degradação de várias proteínas
bioactivas);
− Síntese de outras enzimas hidrolíticas (e.g. hialuronidase e desoxirribonuclease);
− Formação de biofilmes;
− Presença de vários mecanismos de resistência a antibióticos, quer intrínseca
(e.g. β-lactâmicos, cefaloesporinas, sulfonamidas) quer adquirida (e.g. ampicilina,
vancomicina, eritromicina).
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
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Estas características contribuíram para que, nos últimos anos, os enterococos se tornassem
numa das principais causas de infecção nosocomial em todo o mundo. Estas infecções são
provocadas em cerca de 80% dos casos pela espécie E. faecalis, sendo a maioria dos
restantes 20% causados pela espécie E. faecium (13).
Devido ao forte impacto dos enterococos na saúde humana, tem-se vindo a discutir com
alguma preocupação a segurança da utilização dos enterococos na fermentação e em
produtos probióticos (8). Determinar se há um risco geral ou se o risco se aplica apenas a
determinadas espécies ou estirpes e elaborar novas estratégias para combater as infecções
são alguns dos objectivos que se tem procurado alcançar. Os enterococos assumem assim
uma posição paradoxal pois são benéficos na fermentação de diversos alimentos e na
acção como probióticos, mas acarretam uma potencial patogenicidade (14).
Uma das primeiras estirpes de enterococos resistentes à vancomicina foi isolada em 1989
de uma amostra clínica e denominada E. faecalis V583 e conta com o seu cromossoma e
plasmídios sequenciados desde 2003 (15, 16). Esta estirpe tem sido alvo de vários estudos
e descobertas, nomeadamente a caracterização de uma ilha de patogenicidade (que contém
alguns dos factores de virulência acima mencionados), análise do transcriptoma e a
descrição de sistemas de dois componentes envolvidos em vários mecanismos celulares
(17-20). Foram identificados e estudados até à data dezoito sistemas de dois componentes
no genoma de Enterococcus faecalis, alguns dos quais representam potenciais alvos
terapêuticos (18, 21, 22). Entre estes encontram-se um sistema envolvido na resistência à
vancomicina (VanSB-VanRB) e um sistema envolvido na formação de biofilmes e produção
de factores de virulência (FsrC-FsrA) (23-25). Os sistemas de dois componentes são um
mecanismo muito utilizado pelos organismos procariotas como forma de responder a sinais
ou condições exteriores. Levam tipicamente à regulação da expressão génica, por exemplo,
de genes relacionados com o metabolismo ou a virulência. Apesar de nos últimos anos se
terem vindo a descobrir muitos genes envolvidos na virulência de enterococos, poucos
estudos foram ainda feitos para explicar a sua expressão diferencial e muito pouco se sabe
acerca dos mecanismos envolvidos na regulação da sua expressão (26-31).
A expressão de um gene até ao produto final, atravessa vários estádios, em que cada um
deles oferece uma oportunidade de regulação. Embora durante muito tempo se tenha
pensado que a iniciação da transcrição seria a etapa mais importante no controlo da
expressão génica, têm surgido nos últimos anos diversos exemplos importantes de
regulação ao nível pós-transcricional (32-34). São estes últimos, por vezes bastante
complexos, que comandam o destino e a funcionalidade de uma molécula de RNA através
do controlo da sua maturação, estrutura e degradação (estabilidade). Neste tipo de
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
4
regulação estão envolvidas diversas proteínas bem como outras moléculas de RNA
denominados RNAs reguladores ou não codificantes (ncRNAs). Entre as várias proteínas
envolvidas na regulação pós-transcricional estão as ribonucleases (RNases) e as
'chaperones' de RNA (e.g. Hfq e stpA).
As ribonucleases são enzimas capazes de processar e degradar moléculas de RNA, sendo
um dos principais e mais importantes intervenientes na regulação pós-transcricional. As
RNases exibem diferentes estruturas e modos de acção e podem ser agrupadas em duas
classes consoante o forma como clivam o RNA: Endoribonucleases e Exoribonucleases. As
primeiras clivam o RNA internamente (e.g. RNase III, RNase P, RNase J1) enquanto que as
segundas clivam o RNA a partir de uma das extremidades, nucleótido a nucleótido (e.g.
PNPase, RNase R, RNase J1) (35, 36). Em Escherichia coli e em Bacillus subtilis, bactérias
modelo nos estudos de degradação e processamento de RNA, estão identificadas vinte e
sete ribonucleases (36, 37) (Figura 1).
Figura 1 | Ribonucleases identificadas em Bacillus subtilis e em Escherichia coli. Algumas das
exoribonucleases (em cima) e endoribonucleases (em baixo) são partilhadas por B. subtilis e E. coli
(centro), enquanto as restantes foram apenas identificadas numa das espécies (esquerda ou direita
respectivamente). A vermelho estão representadas as ribonucleases essenciais.
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
5
O papel fundamental das RNases para o correcto funcionamento da célula advém do facto
de, para além de todo o RNA ter de ser, mais tarde ou mais cedo, degradado a nucleótidos
para permitir a reciclagem dos mesmos, estas proteínas actuarem ao nível dos vários tipos
de RNA: tRNA, rRNA, mRNAs e ncRNAs.
Assim as RNases acabam por estar directa ou indirectamente envolvidas em todos os
processos de que estes RNAs fazem parte, nomeadamente na formação das subunidades
ribossomais (rRNA), na tradução (tRNA e mRNAs) e nos variados processos a que estão
associados os ncRNAs (38-42). A identificação de novas moléculas pertencentes a este
último grupo, ncRNAs, e a determinação das estruturas dos RNAs, tem sido feita a um ritmo
alucinante nos últimos anos. Embora a função de muitos destes ncRNAs seja ainda
desconhecida, alguns deles comportam-se como reguladores chave em respostas
adaptativas face a condições e sinais do meio exterior, como é o caso do stress imposto por
iões, produção de luminiscência, resistência a antibióticos e controlo da virulência (25, 43,
44). Como exemplos de RNAs reguladores envolvidos no controlo da virulência bacteriana
encontram-se o RNAIII em Staphylococcus aureus, o RsmB' em Erwinia carotovora e o
RNAα em Vibrio anguillarum, entre muitos outros (32, 43). Assim, tendo em conta o referido
anteriormente é natural que as ribonucleases estejam também envolvidas no controlo da
virulência. Na realidade têm sido publicados diversos artigos que relatam o envolvimento
das RNases na virulência bacteriana. São exemplos disso a RNase R, necessária para a
expressão da virulência em Shigella flexneri, Escherichia coli e Aeromonas hydrophila; a
PNPase, que regula a virulência e persistência de Salmonella enterica e a RNAse III
envolvida na regulação da virulência em Staphylococcus aureus (45-49).
Um profundo conhecimento dos mecanismos e do modo como controlam a expressão de
factores de virulência poderá abrir novas perspectivas na quimioterapia antibacteriana.
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
6
2. Contextualização e objectivos
O laboratório onde este trabalho foi realizado, dedica-se ao estudo dos mecanismos de
resposta a diferentes stresses (biocidas, iões metálicos e antibióticos), da resistência a
antibióticos em enterococos e, de uma forma mais global, ao estudo da virulência e
patogenicidade destas bactérias (50-54).
Dado não existir, até à data, nenhum estudo sobre a regulação pós-transcricional, bem
como a função das RNases na virulência de enterococos, decidiu-se levar a cabo a
construção de mutantes em ribonucleases. Estes mutantes constituirão ferramentas
essenciais para estudar os efeitos dessas enzimas ao nível do metabolismo global da célula
e, em particular, de factores de virulência específicos, da patogenicidade e da capacidade
de resistência a antibióticos (11, 32, 55). Neste contexto, o objectivo deste trabalho foi a
construção de mutantes em RNases, bem como a familiarização com técnicas de biologia
molecular e de genética associadas à construção de mutantes em Enterococcus faecalis.
Para este trabalho foram escolhidas quatro RNases: PNPase, RNase R, RNase III e RNase
J1.
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
7
3. Materiais
Estirpes e plasmídios
- As estirpes bacterianas e os plasmídios utilizados neste trabalho
estão listados na Tabela 1.
Conservação de estirpes
- E. coli (-80 ºC): 1 ml de cultura bacteriana + 0,2 ml de glicerol
80%. E. faecalis (-20 ºC): 0,8 ml de cultura bacteriana + 0,2 ml de glicerol 80%. E. faecalis
(-80 ºC): 0,5 ml de cultura bacteriana + 0,5 ml de glicerol 40%.
Condições de crescimento
- Para o crescimento de E. coli foram utilizados os meios
Luria-Bertani broth (LB) e Luria-Bertani agar (LA) suplementados, quando apropriado, com
antibiótico: [ampicilina] = 100 µg/ml; [eritromicina] = 150 µg/ml. Em alguns casos, em que
estava presente o gene repórter lacZ, o meio foi também suplementado com X-GAL (80
µg/ml) e IPTG (0,5 mM), adquiridos à Apollo Scientific e à Promega, respectivamente.
Células de E. faecalis foram crescidas em M17 (56) suplementado com glucose (0,5%) e,
quando apropriado, com antibiótico: [eritromicina] = 30 µg/ml. A incubação das bactérias foi
feita a 27, 37 ou 42 ºC consoante as características das estirpes e o protocolo.
Enzimas, reagentes e materiais de biologia molecular
- As enzimas de restrição (PstI, SalI,
SmaI, SacI) e a 'T4 DNA ligase' utilizadas foram adquiridas à New England Biolabs, sendo
as restrições e ligações feitas de acordo com as instruções do fabricante. Para as reacções
de PCR a partir de colónias foi utilizada a MasterMix adquirida à 5Prime (62,5 U/ml 'Taq
DNA Polymerase'; 125 mM KCl, ®-CA360 0,5%; 500 µM de cada dNTP; 75 mM Tris-HCl pH
8,3; 3,75 mM Mg(OAc)2 ; 0,25% Igepal e estabilizadores). Para as restantes reacções de
PCR foi utilizada a 'VentR DNA polymerase' e respectivo tampão, adquiridos à New England
Biolabs, e os dNTPs (dATP, dTTP, dCTP e dGTP) adquiridos individualmente à Promega.
Todos os 'primers' utilizados (Tabela Suplementar 2) foram desenhados neste estudo tendo
por base o genoma de Enterococcus faecalis V583 publicado (GenBank, número de acesso
AE016830) e as sequências dos vectores utilizados: pBluescript SK+ (Stratagene) e
pGhost 9 (UBLO, Jouy-en-Jousas). Os 'primers' foram encomendados à MWG. A água
utilizada foi sempre ultra-pura. As reacções de PCR foram realizadas no aparelho 'T3000
Thermocycler' da Biometra. Os serviços de sequenciação foram realizados pela BaseClear.
O software utilizado para a análise das sequências foi o Vector NTI da Invitrogen. Os
marcadores de massa molecular utilizados na migração do DNA em géis de agarose foram
o 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) e o GeneRule Express (Fermentas) (Figura
Suplementar 1).
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
8
Extracção e purificação de DNA
- A extracção de DNA plasmídico, a purificação de produtos
de PCR e de digestões e a extracção e purificação de DNA a partir de géis de agarose foi
efectuada recorrendo a 'kits' da Qiagen e da Macherey-Nigel e de acordo com as instruções
do fabricante.
Células electrocompetentes e electroporação
- A preparação de células electrocompetentes
de E. coli e de E. faecalis foi feita segundo os protocolos de Dower et al. (1988) e de
Dunny et al. (1991), respectivamente. A electroporação, quer de E. coli quer de E. faecalis,
foi realizada no 'Gene Pulser Xcell' da Bio-Rad seguindo as instruções do fabricante e
utilizando o programa pré-definido 'Bacterial; 2. E. coli; Exponential decay; 25 µF; 200 ohm;
2,5 kV; 0,2 cm cuvette; 20-40 µl cell vol'.
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
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4. Metodologia e Discussão
A estirpe em que se pretendeu criar mutações foi a E. faecalis V583 ∆ABC. ∆ABC significa
que esta estirpe não possui os três plasmídios que são característicos da estirpe V583
original (pTEF1, pTEF2, pTEF3), isolada em 1989 de uma amostra clínica e descrita como
um dos primeiros isolados de enterococos resistentes à vancomicina (15).
A estirpe V583 ∆ABC é sensível à eritromicina, uma vez que os genes responsáveis pela
resistência à eritromicina em V583 se localizam no plasmídio pTEF1. Esta característica é
importante na medida em que a marca de selecção do vector utilizado, o pGhost 9, na
transformação desta estirpe é o gene ermC que confere resistência à eritromicina.
A escolha desta estirpe deveu-se ao facto de ser a única pertencente ao género com o
genoma totalmente sequenciado na altura do início do trabalho, o que permitiu, através da
comparação com o genoma de B. subtilis, identificar os genes de ribonucleases presentes
no seu genoma (16). Foram escolhidos três genes para se criarem mutantes de delecção: o
gene pnpA (EF3064), o gene vacB (EF2617) e o gene rnc (EF3097), que codificam para a
PNPase, RNase R e RNase III, respectivamente. Foi também escolhido o gene da RNase J1
(EF2924) mas para se inserir um codão de terminação prematuro através de uma mutação
pontual. Escolheram-se estas RNases por abrangerem mecanismos de degradação
distintos.
A PNPase, 'polynucleotide phosphorylase', é uma exoribonuclease que remove os
nucleótidos de uma molécula de RNA de um modo processivo e no sentido 3' → 5'. A
reacção é fosforolítica e dependente de fosfato, uma vez que para haver a quebra de uma
ligação fosfodiester e se libertar um nucleótido 5' - difosfato é necessário a presença de uma
molécula de fosfato inorgânico (Pi). A PNPase é uma 'cold shock protein' sendo portanto
importante para a célula fazer face a temperaturas baixas. A inactivação do seu gene
provoca um fenótipo sensível a baixas temperaturas, nomeadamente com paragem do
crescimento por volta dos 16 ºC, aumento do tempo de meia-vida (ou semi-vida) do mRNA
total, aumento da susceptibilidade à tetraciclina e algumas alterações da morfologia celular
(57-59). Em B. subtilis, a PNPase é tida como uma das principais ribonucleases 3' → 5'
envolvidas na degradação do RNA, embora a RNase R também tenha um papel muito
importante, especialmente no que diz respeito à degradação de RNAs com estruturas
secundárias mais estáveis, como as presentes nos tRNAs e rRNAs, as quais a PNPase tem
dificuldades em ultrapassar. A RNAse R é, à semelhança da PNPase, uma exoribonuclease
3' → 5' e uma 'cold shock protein'. A degradação do RNA é hidrolítica, feita de um modo
processivo e cujo produto final são pequenos oligonucleótidos (58, 60).
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
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Estas duas ribonucleases foram seleccionadas devido ao importante papel que assumem na
degradação e maturação de RNA em B. subtilis (organismo modelo no estudo de
degradação de RNA em bactérias Gram-positivas) e por, como já referido na introdução,
ambas já terem sido implicadas na regulação da virulência bacteriana (45-48).
A RNAse III é uma endoribonuclease que reconhece e cliva RNA em cadeia dupla (dsRNA)
de uma forma hidrolítica. A família das RNases III é composta por três classes. A RNAse III
bacteriana é a mais estudada e melhor caracterizada até à data e pertence à classe 1 (61).
Foi escolhida devido ao facto de ter sido descrita como essencial em B. subtilis e de,
juntamente com o RNAIII, regular a virulência em Staphylococcus aureus, cujo sistema de
virulência, agr, apresenta grande semelhança com o sistema fsr em Enterococcus faecalis
(49, 62, 63).
A RNase J1 foi seleccionada por ser uma RNase sem paralelo pois é simultaneamente uma
endoribonuclease e uma exoribonuclease. Foi descoberta em B. subtilis onde está envolvida
na maturação do rRNA; juntamente com a RNase J2 tem um impacto profundo na
expressão génica e apresenta-se como essencial para a viabilidade celular. Proteínas
ortólogas têm sido identificadas em diversos grupos procariotas (e.g. cianobactérias,
alfa-proteobactérias e alguns grupos de arqueobactérias). A sua actividade endonucleolítica
é comparada à da RNase E de E. coli e a sua actividade exonucleolítica de 5' → 3', única,
pois até à data pensava-se que as bactérias apenas eram capazes de degradar
exonucleoliticamente RNAs no sentido 3' → 5', faz com que a degradação de moléculas de
RNA possa acontecer a partir de ambas as extremidades, quer 5' quer 3', à semelhança do
que acontece nos eucariotas (36, 64-69).
A Figura 2 representa esquematicamente o protocolo seguido para a obtenção dos
mutantes.
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
11
Figura 2 | Representação esquemática do protocolo para a obtenção de mutantes em
Enterococcus faecalis utilizando o pGhost 9. Adaptado de Heckman e Pease (2007).
PCR
Sequenciação
E. faecalis
E. coli
E. faecalis com pGhost 9 : fragmento mutado
integrado no genoma (integrantes)
Passagens sucessivas em meio
sem antibiótico
E. faecalis com
gene selvagem
E. faecalis com gene mutado
Identificação colónias
sensíveis ao antibiótico
pGh 9
pGh 9
pSK+
E. coli
*
* E. faecalis com pGhost 9 : fragmento mutado
livre no citoplasma (transformantes)
'Choque térmico'
27 ºC 2h
42 ºC 2h
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
12
O primeiro passo é a construção de um fragmento de DNA recombinante composto pela
junção das duas zonas adjacentes ao gene de interesse. O objectivo final é a substituição
da zona homóloga no cromossoma, contendo o gene selvagem, pela construção por nós
criada, onde parte do gene não se encontra presente, obtendo-se assim um mutante de
delecção. Para a construção deste fragmento recorreu-se à técnica de 'overlap extension by
polymerase chain reaction' (OE-PCR). Esta técnica inovadora foi descrita pela primeira vez
por Horton e colaboradores em 1989 e veio revolucionar a engenharia genética, dado que
permite a fusão de duas ou mais moléculas de DNA numa só de um modo preciso,
independente da sua sequência nucleotídica e sem o uso de enzimas de restrição ou de
ligação (70-73). O fundamento da fusão de duas moléculas de DNA numa só ('splicing')
utilizando o OE-PCR está esquematizado na Figura 3.
Figura 3 | Conceito de 'Overlap Entension by Polymerase Chain Reaction' (OE-PCR). Os 'primers' a e
c são complementares à cadeia 3' → 5' e os 'primers' b e d são complementares à cadeia 5' → 3'. Os
'primers' a e d são denomidados de 'externos'. Os 'primers' b e c são complementares e
denominados de 'internos'. A vermelho está representada a porção de DNA que se pretende eliminar.
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
13
Os dois fragmentos a serem unidos são produzidos separadamente numa reacção de PCR
(PCR I e PCR II). São utilizados 'primers' internos complementares, c e d, de modo a que os
fragmentos produzidos contenham nas extremidades sequências complementares.
Seguidamente os produtos destes dois PCRs são misturados e utilizados num novo PCR
(PCR I+II). No passo de 'annealing', as cadeias com a sequência complementar na sua
extremidade 3' podem emparelhar e servir de 'primer' uma à outra, permitindo a extensão
das cadeias levada a cabo pela DNA polimerase (Figura 3). A este passo dá-se o nome de
'overlap extension'. A molécula de DNA produzida desta forma pode ser seguidamente
amplificada do modo exponencial característico do PCR, através dos 'primers' externos a e
d. Estes 'primers' podem conter locais de restrição de modo a permitir a clonagem do
fragmento obtido. Assim, o produto final deste PCR será uma molécula de DNA em que as
duas sequências originais estão agora concatenadas.
No caso esquematizado na Figura 3, o OE-PCR é utilizado para fundir as duas regiões
adjacentes, assinaladas a verde e a azul, a uma região de interesse, assinalada a vermelho,
de modo a se obter um fragmento idêntico ao inicial mas sem a região de interesse. Foi com
este intuito, o de criar uma delecção sítio-específica, que esta técnica foi utilizada,
nomeadamente para a eliminação quase na totalidade da sequência do gene alvo (excepto
para o caso da RNAse J onde se recorreu à criação de uma mutação pontual).
No entanto esta técnica, mantendo sempre o mesmo fundamento, permite a obtenção de
diferentes construções no que diz respeito à zona da fusão. Nesta região de justaposição
das duas moléculas é possível realizar vários tipos de mutações sítio-específicas: inserções,
substituições ou delecções de um ou vários nucleótidos. Esta técnica pode ser ainda
utilizada para a remoção de intrões e para a criação de genes híbridos que vão permitir a
criação de proteínas de fusão de interesse, por exemplo na área da imunologia e da biologia
molecular e celular (70-72, 74, 75). É na escolha da sequência dos 'primers' internos (b e c)
que se define qual das possibilidades referidas nos parágrafos anteriores é aplicada.
É importante que estes PCRs sejam realizados utilizando uma DNA polimerase de alta
fidelidade, i.e. com baixa taxa de erro, de modo a minimizar-se a probabilidade de
introdução de mutações não pretendidas. A DNA polimerase utilizada deverá também ter a
característica de não adicionar adeninas no final da polimerização (3'), de modo a que no
passo de 'overlap extension' no PCR I+II não haja a introdução destas adeninas na
sequência do fragmento final.
Neste trabalho recorreu-se à técnica de OE-PCR para se proceder à eliminação quase
completa dos genes da PNPase (pnpA), RNase R (vacB) e RNase III (rnc) e à inserção de
um codão de terminação prematuro no gene da RNase J1 (EF2924). Ao escolher a região a
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
14
eliminar, definida pela sequência dos 'primers' internos b e c, teve-se em conta a presença
de outras ORFs e tentou-se ao máximo que as alterações introduzidas não interferissem
com a sua expressão. No caso do gene pnpA a delecção feita deixou presentes os tripletos
codificantes para os últimos 21 aminoácidos da extremidade carboxilo da proteína devido ao
facto de na cadeia complementar e ainda dentro da zona codificante para a PNPase, existir
um codão de terminação correspondente a uma outra ORF (EF3063). Na delecção do gene
vacB mantiveram-se os nucleótidos correspondentes aos 27 aminoácidos da extremidade
carboxilo, devido à sobreposição do seu codão de terminação com a sequência promotora
da ORF EF2616, e aos 13 aminoácidos da extremidade amina, devido à sobreposição
parcial do codão de iniciação com o codão de terminação da ORF EF2618. No que diz
respeito ao gene rnc, e à semelhança do gene vacB, foram mantidos os nucleótidos
equivalentes aos 16 aminoácidos da extremidade carboxilo devido a uma sobreposição do
codão de terminação com a sequência promotora da ORF EF3096. No gene da RNase J1
foi introduzido um codão de terminação prematuro deixando os tripletos codificantes para os
primeiros 57 aminoácidos devido à sobreposição com a região 3' da ORF EF2923.
Na escolha da posição dos 'primers' externos a e d teve-se em consideração a sua
sequência e, principalmente, a distância ao 'primer' interno correspondente, b e d,
respectivamente. Esta distância deve ser aproximadamente 1000 pares de base de modo a
permitir a recombinação com a sequência homóloga do cromossoma (Figura 2). A estes
'primers' foi adicionado um local de restrição compatível com ambos os vectores utilizados.
Na Tabela Suplementar 3 estão representados os tamanhos esperados dos fragmentos de
DNA nas várias etapas do protocolo. Para facilitar a referência foi atribuída uma letra a cada
RNase: A para a PNPase, B para a RNase R, C para a RNase III e D para a RNase J1.
Nos primeiros PCRs, PCR I e PCR II (Figura 3), não foram encontradas dificuldades em
obter os fragmentos pretendidos. O DNA molde para cada um destes PCRs foi um
fragmento amplificado por PCR a partir do DNA genómico de E. faecalis V583 ∆ABC e
utilizando os 'primers' externos (a e d) respectivos a cada RNase (Tabela Suplementar 3). As
moléculas obtidas nestes PCRs serviram de DNA molde para o PCR seguinte, o PCR I+II.
No entanto aquando da realização deste último PCR, não se verificou a amplificação de
nenhum fragmento com o tamanho esperado. Na tentativa de resolver o problema fizeram-
se variar algumas das condições que normalmente estão associadas à optimização da
reacção de PCR:, nomeadamente a quantidade inicial de DNA molde, a temperatura de
'annealing' (Ta), o tempo das várias etapas da reacção: desnaturação, emparelhamento e
extensão, o número de ciclos e a quantidade de DNA polimerase. Esta estratégia revelou-se
infrutífera quaisquer que fossem as alterações feitas. A segunda abordagem ao problema
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
15
consistiu em seguir rigorosamente um protocolo da revista Nature Protocols intitulado: 'Gene
splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension' (75). A quantificação do DNA
para o cumprimento deste protocolo foi feita através de leituras no espectrofotómetro e em
gel de agarose, utilizando o marcador quantitativo GeneRuler Express (Figura 4 e Figura
Suplementar 1). Apesar de muito bem estruturado e parecer bastante promissor, este
protocolo não conduziu à formação do fragmento híbrido desejado. Numa nova tentativa
propôs-se a realização do PCR I+II em duas etapas distintas. A primeira com o objectivo de
promover o passo de 'overlap extension', i.e. a formação do fragmento híbrido, através de
alguns ciclos de PCR na ausência dos 'primers' exteriores. Na segunda etapa os 'primers'
seriam adicionados com o objectivo de levar à amplificação exponencial da molécula híbrida
formada anteriormente. Este ensaio, à semelhança dos anteriores, não teve os resultados
pretendidos. Como tal, e dado a obtenção destes fragmentos híbridos de DNA ser
absolutamente fundamental para a construção dos mutantes, tentou-se novamente uma
estratégia diferente. Esta consistiu na utilização do método descrito por Warrens et al. em
1997, o que finalmente permitiu a formação da molécula híbrida pretendida (Figura 5) (74).
Figura 4 | Quantificação dos fragmentos
resultantes dos PCRs I e II em gel de agarose
recorrendo ao marcador quantitativo (MQ)
GeneRuler Express. A seta indica a banda de
1 kb dos marcadores de massa molecular.
Figura 5 | Obtenção dos fragmentos híbridos.
Fragmentos após purificação por kit: PNPase /
RNase III / RNase R / RNase R / Marcador
(M). A seta indica a banda de 2 kb do
marcador de massa molecular.
Como ilustrado na figura Figura 6, na fase de 'annealing' do PCR I+II são possíveis quatro
combinações distintas. Apenas uma delas, (3), pode servir de molde à DNA polimerase de
modo a que se gere o fragmento híbrido completo, e esta combinação é uma das duas
menos favorecidas, (3) e (4). Como forma de favorecer esta combinação (3), em relação às
A C B B M A1 A2 B1 B2 C1 C2 M MQ
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
16
outras três, (1),(2),(4), as cadeias nela envolvidas foram produzidas em maior quantidade
que as suas complementares nos PCRs I e II. Para tal foi introduzido mais um PCR no
protocolo que tem a particularidade de ser assimétrico, isto é, um dos 'primers' está presente
numa maior concentração do que o outro, consequentemente originando um produto em
que uma das cadeias existe em maior quantidade do que a outra.
Figura 6 | Combinações das hibridações no passo de 'Overlap Entension'. Apenas uma das quatro
combinações (3) permite obter o fragmento híbrido de interesse, sendo esta combinação uma das
duas menos favorecidas - necessidade de utilização de PCR assimétrico. Adaptado de Warrens et al.
(1997).
Assim, foram feitos PCRs I e II assimétricos tendo como DNA molde o resultado dos PCRs I
e II não assimétricos, e onde os 'primers' a e d estavam 20x mais concentrados que os b e c
respectivamente. Os produtos de amplificação destes PCRs assimétricos vão servir de DNA
molde para o PCR I+II. Como se observa na Figura 7, a reacção tem um baixo rendimento e
a presença de outras bandas para além da com o tamanho pretendido implica a purificação
por gel de agarose do fragmento de interesse. Procurou-se amplificar com os 'primers' a e d
o resultado deste PCR mas sempre sem sucesso. A maneira encontrada para aumentar a
quantidade de fragmento e poupar tempo foi a de fazer os PCR assimétricos I e II
directamente a partir dos fragmentos iniciais ou do DNA genómico, reduzir a diferença da
quantidade dos 'primers' de 20x para 8x e aumentar o número de ciclos. O resultado destas
alterações pode ser visto na Figura 8. Assim deixa de haver a necessidade de fazer os
PCRs I e II não assimétricos e a obtenção de maiores quantidades de DNA facilita os
passos subsequentes de restrição e ligação para clonagem.
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
17
Aparentemente a maior ou menor dificuldade associada à obtenção destas moléculas
híbridas parece depender não só do tamanho dos fragmentos e do desenho dos 'primers'
mas também da natureza das próprias moléculas. Nos casos em que existe maior
dificuldade na obtenção do fragmento híbrido, como neste trabalho, este método revelou ter
uma grande eficácia e robustez.
Figura 7 | PCR I+II com baixo rendimento. A
seta indica a banda de 2 kb do marcador de
massa molecular.
Figura 8 | PCR I+II com o rendimento
melhorado. A seta indica a banda de 2 kb do
marcador de massa molecular.
Uma vez obtido e purificado o fragmento, este foi digerido com as respectivas enzimas de
restrição, clonado no vector pBluescript SK+ (pSK+) e inserido em E. coli JM101TR por
electroporação (Tabela Suplementar 1). Foi escolhido este vector porque possui o gene lacZ,
o que possibilita a indicação branco/azul (distinção das moléculas recombinantes das não
recombinantes, respectivamente) e por ser um vector com elevado número de cópias, o que
permite obter grandes quantidades de inserto necessárias para a posterior sequenciação.
As colónias resultantes da transformação que apresentavam cor branca foram repicadas
para novo meio de cultura sólido e, a partir destas, foram efectuados PCRs de colónia com
os 'primers' #92 e #93 (Tabela Suplementar 2), desenhados de modo a amplificar a região do
multiple cloning site (MCS) do vector pSK+. Todos os plasmídios com fragmentos com
tamanho próximo do esperado foram sequenciados de modo a verificar se a sequência do
inserto é a desejada. Os 'primers' para a sequenciação foram desenhados de modo que
houvessem sempre zonas de sobreposição entre as várias sequenciações parciais. Para
A M C A A M A
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
18
garantir que a sequência obtida era a correcta e estava isenta de mutações, ambas as
cadeias de DNA foram sequenciadas.
Esta etapa não apresentou qualquer dificuldade para o fragmento da RNAse III, pois à
primeira tentativa foi possível obter clones com o fragmento do tamanho esperado e que a
sequenciação viria a demonstrar ser o correcto e não ter nenhuma mutação adicional
(Figura 9).
Figura 9 | Obtenção do fragmento híbrido correspondente à RNase III. A seta indica a banda de 2 kb
do marcador de massa molecular.
No entanto, para os restantes fragmentos, da PNPase, RNase R e RNase J1, a situação foi
substancialmente diferente. Para além do facto de a coloração branca das colónias não ser
uma indicação muito fidedigna de que existiria de facto um fragmento inserido no vector a
interromper o gene da β-galactosidase, foi obtida uma elevada e inesperada variabilidade no
que diz respeito à dimensão dos fragmentos inseridos no vector (Figura 10). Não se
conseguiu determinar a causa desta diversidade de massas moleculares.
Figura 10 | Variabilidade nos tamanhos dos fragmentos da PNPase e RNase R clonados em pSK+.
M C C
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
19
Devido ao facto de a indicação branco/azul, principal vantagem pela qual se optou pela
utilização do pSK+, não se ter mostrado tão útil quanto esperado e ter obrigado à realização
de dezenas de reacções de PCR de colónia, propõe-se a obliteração desta etapa do
protocolo, procedendo-se à clonagem directamente no vector pGhost 9. Assim, a procura
pelos transformantes será feita da mesma forma, recorrendo ao PCR de colónia, e deixa de
ser necessário remover o fragmento de interesse do pSK+ para o transferir para o pGhost 9.
O problema do pGhost 9 não ser um plasmídio com múltiplas cópias é facilmente
contornado através da extracção do plasmídio a partir de volumes superiores de cultura e
utilizando kits comerciais próprios para estes casos. Como já foi referido, os fragmentos da
RNase III que foram sequenciados não apresentavam qualquer erro, ao contrário dos muitos
fragmentos das restantes RNAses que apresentavam sequências muito diferentes das
pretendidas e cuja origem não se conseguiu determinar. Foram necessárias numerosas
tentativas de transformação para se conseguirem obter os fragmentos correctos
correspondentes à PNPase e à RNase R clonados em pSK+. Ainda não foi possível clonar o
fragmento da RNase J1, possivelmente devido às suas elevadas dimensões, muito
superiores às dos outros fragmentos. Para solucionar este problema vão ser desenhados
novos 'primers' de modo a reduzir as dimensões do fragmento.
Uma vez tendo o fragmento sem erros no pSK+, procedeu-se à restrição com as mesmas
enzimas utilizadas anteriormente (Tabela Suplementar 3 e Figura 11) e clonou-se o fragmento
em pGhost 9. O vector foi depois introduzido em E. coli VE 14188 por electroporação
(Tabela Suplementar 1). É neste passo que se encontram os fragmentos correspondentes à
PNPase e à RNase R. A estirpe de E. coli transformada com o pGhost 9 tem de codificar no
seu genoma a proteína RepA selvagem (genótipo repA+), proteína responsável pela
replicação do plasmídio, de modo a permitir a replicação do pGhost 9 a 37 ºC, temperatura
óptima de crescimento de E. coli. Este plasmídio é capaz de se replicar a 27 ºC mas é
incapaz de o fazer a 37 ou 42 ºC. Esta incapacidade de replicação a estas temperaturas
mais altas (37 e 42 ºC) deve-se ao facto de a proteína RepA codificada pelo plasmídio
pGhost 9 ser termosensível, não se encontrando funcional a tais temperaturas.
A transformação de E. coli com o pGhost 9 contendo o fragmento de interesse permite obter
esta construção em quantidade suficiente para permitir a transformação de E. faecalis
V583 ∆ABC por electroporação (para a qual é necessária maior quantidade de plasmídio do
que relativamente à transformação de E. coli). Os transformantes foram verificados através
de PCR de colónia com os 'primers' #112 e #113 (Tabela Suplementar 2) desenhados de
modo a amplificar a região do 'multiple cloning site' (MCS) do vector pGhost 9 (Figura 12).
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
20
Figura 11| Digestão dupla do pSAVE 6. A seta
indica a banda de 2 kb do marcador de massa
molecular.
Figura 12 | Obtenção de transformantes de
E. coli com o pSAVE 8. A banda inferior é
resultado de uma amplificação inespecífica
com o cromossoma da estirpe VE 14188. A
seta indica a banda de 2 kb do marcador de
massa molecular.
O plasmídio pGhost 9 com o fragmento de interesse clonado foi extraído de E. coli e inserido
em E. faecalis. A identificação de transformantes foi efectuada da mesma forma do que para
E. coli, realizando PCRs de colónia com os 'primers' #112 e #113 (Tabela Suplementar 2 e
Figura 13).
Figura 13| Obtenção de transformantes de E. faecalis com o pSAVE 8. A seta indica a banda de 2 kb
do marcador de massa molecular.
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
21
Uma vez em E. faecalis o objectivo é a integração do plasmídio no genoma através de
recombinação homóloga entre o fragmento de interesse presente no plasmídio e uma das
duas regiões de homologia presentes no cromossoma. Para seleccionar os clones onde a
integração ocorreu as bactérias foram incubadas durante 2 horas a 27 ºC sem antibiótico
(pGhost 9 é capaz de replicar) e posteriormente 2 horas a 42 ºC (pGhost 9 é incapaz de
replicar). Após esta variação de temperatura, a cultura foi plaqueada em meio com
antibiótico e incubada a 42 ºC. Deste modo as bactérias que conseguirem resistir ao
antibiótico fazem-no porque integraram o plasmídio no seu genoma, dado este não ser
capaz de se replicar a 42 ºC. Os integrantes foram confirmados através de um PCR de
colónia com os 'primers' #70 e #112 (Tabela Suplementar 2). No caso do mutante da RNase
III (o único a chegar até este ponto do protocolo) só foi obtido um tipo de integração, a do
tipo I relativamente à Figura 14 (Figura 15).
Depois de o fragmento, juntamente com o vector, estar integrado no cromossoma de
E. faecalis V583 ∆ABC, procurou-se promover a excisão, por recombinação homóloga, da
sequência do vector em conjunto com a sequência a eliminar ladeada pelas duas regiões de
homologia de modo a que fique no cromossoma o fragmento com o gene mutado em
substituição do gene selvagem. Para tal realizaram-se várias passagens crescendo os
enterococos a 27 ºC sem antibiótico. No final plaquearam-se as bactérias em meio com e
sem antibiótico e incubaram-se a 42 ºC. Comparando a mesma diluição, o número de
colónias na placa sem antibiótico deveria ser consideravelmente superior ao número de
colónias na placa com antibiótico. A existência de um razoável número de colónias sensíveis
ao antibiótico constitui um bom indicador da ocorrência da excisão do pGhost 9 (o qual
confere resistência à eritromicina) do cromossoma e posterior perda do pGhost 9, devido à
sua incapacidade de replicação a 42 ºC. Infelizmente o verificado para o caso da RNase III,
nos ensaios repetidos várias vezes e para diferentes integrantes, foi um número muito
semelhante o que indica uma fraca probabilidade de encontrar o mutante de delecção. Para
se identificar um clone onde tenha ocorrido excisão, as colónias das placas sem antibiótico
foram repicadas simultaneamente para placas com e sem antibiótico, utilizando uma grelha
para identificação. Aqueles que cresceram no meio sem antibiótico e não no meio com
antibiótico foram repicados novamente para placas com e sem antibiótico e foi realizado um
PCR de colónia com dois dos 'primers' utilizados na sequenciação, no caso da RNase III,
#94 e #95, respectivamente (Tabela Suplementar 2 e Figura 14). Após várias tentativas e
dezenas de colónias testadas ainda não foi possível encontrar um clone com o gene
mutado, somente clones em que a excisão deixou no cromossoma o gene selvagem (Figura
16). A eficácia desta etapa do protocolo pode variar bastante e por vezes ser muito baixa
mas, dado o número de tentativas, somos levados a considerar a
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
22
hipótese de que talvez, à semelhança do que acontece em B. subtilis, o gene da RNase III
seja essencial em E. faecalis, não sendo possível obter mutantes de delecção para este
gene.
Figura 14 | Representação esquemática dos acontecimentos de integração e excisão que podem ocorrer durante o protocolo.
Integração
I
#112
pGh 9 #70 #70
I II
pGh 9
Excisão
#97
#94
IV Gene Mutado
#112
pGh 9 #70 #70
II
#97
#94
III Gene Selvagem
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
23
Figura 15 | Obtenção de um só tipo de
integração do pSAVE 8 no cromossoma de
E. faecalis. A seta indica a banda de 2 kb do
marcador de massa molecular.
Figura 16 | Clones em que ocorreu excisão.
Na pista 2 e 3 estão clones nos quais ocorreu
a excisão e onde o gene selvagem ficou no
cromossoma, na pista 4 está o V583 ∆ABC, na
pista 5 está o controlo sem colónia e nas
pistas 1 e 6 está o marcador. A seta indica a
banda de 2 kb do marcador de massa
molecular.
Apesar deste processo de construção de mutantes envolver várias etapas (um primeiro
'crossing-over' para integração do plasmídio, seguido de um segundo para excisão do
mesmo de forma a substituir o gene selvagem pelo mutante) (Figura 14), esta abordagem foi
seleccionada uma vez que é do nosso interesse obter um mutante exclusivamente neste
gene deixando o restante genoma inalterado. Por esta razão não se optou por exemplo pela
disrupção do gene por inserção de uma cassete de resistência a antibiótico.
1 2 3 4 5 6
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
24
5. Perspectivas futuras
Estabelecer se o gene rnc, que codifica para a RNase III, é essencial em
Enterococcus faecalis V583 ∆ABC, à semelhança do que acontece em Bacillus subtilis. Para
isso ir-se-á clonar o gene rnc selvagem num plasmídio com um promotor indutível, com
replicação não sensível à temperatura, com origem de replicação em E. faecalis e E. coli e
com uma marca de selecção apropriada. Este plasmídio será depois introduzido numa das
estirpes de Enterococcus que já possuem o pGhost 9 com o fragmento mutado integrado no
genoma (integrantes) e os transformantes serão submetidos às etapas finais do protocolo de
elaboração dos mutantes, nomeadamente as passagens a 27 ºC sem a presença de
eritromicina, de modo a promover a excisão do cromossoma do pGhost 9 juntamente com a
forma selvagem do gene rnc. Naquelas bactérias em que a excisão pretendida se verificar, e
se o gene for essencial, só sobreviverão os clones que possuam o plasmídio não
termosensível com o gene rnc selvagem a ser expresso sob a acção do promotor indutível.
Posteriormente, estudos poderão ser feitos para observar as consequências da variação na
expressão deste gene.
Após a obtenção dos mutantes na PNPase, na RNase R e na RNase J1 pretende-se
estudar o efeito destas mutações em vários processos, embora no caso da última exista
também a possibilidade de ser essencial dado que, à semelhança da RNase III, é essencial
em B. subtilis. Serão estudadas as alterações ao nível do crescimento celular, realizando
curvas de crescimento à temperatura óptima e a baixas temperaturas (uma vez que a
PNPase e a RNase R são 'cold shock proteins'); ao nível da resistência a vários antibióticos,
determinando as concentrações mínimas inibitórias (MIC) e ao nível da morfologia celular,
por observação ao microscópio. Em paralelo estes mutantes serão utilizados para a análise
do processamento e estabilidade das moléculas RNA em geral, e dos transcritos do operão
fsr em particular (sistema em estudo no laboratório). Pretende-se estudar também o
comportamento dos mutantes no que diz respeito à produção de factores de virulência
(e.g. teste da gelatinase) e à sua patogenecidade recorrendo a organismos modelos,
nomeadamente Galleria mellonella, macrófagos e Drosophila melanogaster.
Por último, será também interessante, recorrendo ao protocolo aqui apresentado, efectuar
os mesmos mutantes na estirpe E. faecalis V583 selvagem (que possui os três plasmídios:
pTEF1, pTEF2, pTEF3) ou noutras que se revelem de especial interesse.
Assim, com o trabalho desenvolvido nesta tese, pretendeu-se melhorar os protocolos para a
obtenção de mutantes em Enterococcus faecalis e abrir caminho para uma nova área,
criando ferramentas que irão permitir estudos futuros sobre as complexas relações entre
RNAses, RNAs e virulência em enterococos.
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
25
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Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
29
7. Anexos Tabela Suplementar 1| Estirpes e plasmídios utilizados neste trabalho.
Estirpe ou plasmídio Características relevantes Fonte
JM 101 TR E. coli repA-, Amps
IBPC, Paris
VE 14188 E. coli GM1674 repA+, Amps, Erys
UBLO, Jouy-en-Jousas
V583 ∆ABC E. faecalis V583 curado dos seus plasmídios, repA-, Erys
LME, Caen
pBluescript SK+ Vector de clonagem, indicação LacZ, Ampr, Ori1
Stratagene
pGhost 9
Vector de clonagem, replicação termosensível, Eryr, Ori1, Ori2
UBLO, Jouy-en-Jousas
pSAVE 6 pBluescript SK+ : rnc mutado
este estudo
pSAVE 11 pBluescript SK+ : pnpA mutado
este estudo
pSAVE 13 pBluescript SK+ : vanB mutado
este estudo
pSAVE 8 pGhost9 : rnc mutado
este estudo
Ori1 representa origem de replicação em E. coli e Ori2 representa origem de replicação em E. faecalis
Amp : ampicilina
Ery : eritromicina
s : sensível
r : resistente
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
30
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22
Tabela Suplementar 2 | 'Primers' utilizados neste estudo. O símbolo # representa o número de
identificação do 'primer' de modo a simplificar a sua referência e tornar a sua identificação mais
imediata. A dimensão dos 'primers' é dada em nucleótidos (nt).
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
31
Tabela Suplementar 3 | Dimensões dos fragmentos esperadas ao longo do protocolo. O símbolo #
representa o número de identificação do 'primer'.
Prim
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_217
3522
Ext
erno
17E
F292
4_5'
_Pst
I
C I+
C II
1009
A I
Prim
ers
D I
2445
B I+
B II
D II
1125
D I+
D II
1062
C II
2384
C I
B II
1183
835
2375
5910
4993
2250
5562
2027
5785
2084
2214
B I
A II
2259
5118
1067
A I+
A II
1117
6447
2036
4770
1861
3713
3538
Construção de mutantes em RNases em Enterococcus
32
Figura Suplementar 1 | Marcadores de massa molecular.
(A) - 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen)
(B) - GeneRuler Express (Fermentas)
(A) (B)