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Construcción y evaluación de andamios modificados con polipirrol
por plasma para el crecimiento de células de cartílago
Proyecto Terminal
Ingeniería Biomédica
Lizeth Ávila Gutiérrez
Agradecimientos
Esta tesis está dedicada a mi madre Concepción Gutiérrez Vargas, a quien agradezco de todo
corazón su amor, cariño, apoyo, compañerismo y comprensión. Con quien he cosechado y
compartido triunfos a cada momento de mi vida.
Agradezco a cada uno de mis familiares quienes me han inculcado lo importante que es luchar
por los ideales. Y a quien fielmente compartió noches de desvelo a mi lado a lo largo de los
últimos años. A todos ellos les digo gracias…
Pero sobre todo este trabajo se realizó gracias al apoyo y combinación de recursos de:
Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa, el Hospital Infantil de México
(Federico Gómez) y el Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares. Dedicando ambos su
tiempo y parte de su estructura para el desarrollo de este trabajo.
De la UAM agradezco al Dr. Roberto Olayo, quien me dio la oportunidad de integrarme a su
equipo, por el tiempo dedicado a la dirección de este trabajo, por ayudarme a crecer como
profesional y persona. Pero sobre todo por ayudarme a encontrar mi verdadera vocación. Al Dr.
Juan Morales por su colaboración en el desarrollo de este trabajo. A mis compañeros Javier,
Bersain, Mario, Rafael, Juan que han hecho que mi estancia en la UAM, una buena experiencia.
Al Dr. Salvador Carrasco y la Dra. Ma. Teresa García por su apoyo incondicional a lo largo de mi
carrera. A todas las personas que contribuyeron de una manera u otra para que estos años
fueran divertidos: Elena, Salomón, Cristino…. A todos gracias….
A la Dra. Atlántida Raya del Hospital Infantil de México (Federico Gómez) por permitirme
colaborar junto con grupo de trabajo. A la Biol. Raquel Valdez por su tiempo y dedicación para el
desarrollo de este trabajo, quien también es parte de este proyecto. Y del ININ a quienes
dedicaron parte de su tiempo y de su infraestructura al desarrollo de esta investigación en los
análisis de SEM y SEM-EDS.
A todos les digo……
¡¡¡¡Gracias por creer en mí!!!!
INDICE
1. Introducción
2. Objetivos
3. Revisión de la literatura
3.1 Fisiología del cartílago
3.2 Ingeniería tisular y aplicaciones en cartílago
3.3 Tipos de Biomateriales
3.3.1 Polímeros
3.4 Síntesis del Ácido Poliláctico (PLA)
3.5 Síntesis de Poli-caprolactona (PCL)
3.6 Técnica de electrohilado
3.7 Polimerización por plasma
3.8 Síntesis y caracterización del polipirrol
3.9 Tipos de cultivos celulares
4. Procedimiento experimental
4.1 Electrohilado (preparación de soluciones, condiciones generales, recolectores y
tratamientos pos-hilado)
4.2 Polimerizado por plasma
4.3 Caracterización de fibras
4.4 Obtención de células y cultivo de condrocitos
4.5 Pruebas celulares
4.6 Prueba de viabilidad (MTT)
4.7 Deshidratación y punto crítico de muestras biológicas para observación en
Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
5. Resultados
5.1 Influencia de la temperatura del electrohilado
5.2 Influencia de los recolectores
5.3 Influencia de la concentración del polímero
5.4 Andamios de PLA,PCL y combinados
5.5 Porosidad de los andamios
5.6 Tratamiento pos-hilado
5.7 Polimerización por plasma
5.8 Pruebas in-vitro con membranas de PLA/PCL: viabilidad y Microscopía Electrónica
de Barrido (SEM)
5.9 Implantación de membranas en pruebas in -vivo
5.10Explante de membranas.
6. Conclusiones
7. Bibliografía
Construcción y evaluación de andamios modificados con polipirrol por plasma para el crecimiento de
células de cartílago
1. Introducción Las lesiones de cartílago causadas por defectos degenerativos de las articulaciones o lesiones
traumáticas, son un problema de salud, debido a la pobre capacidad de regeneración del
cartílago, por lo que una vez destruido es difícil de reparar. Estas lesiones ocasionan dolor,
trastornos funcionales y discapacidad con poca posibilidad de recuperación aún con
tratamiento. Este es un problema abierto, en el que se han visto avances con la participación de
ingeniería de tejidos, particularmente con el desarrollo de nuevos andamios para el sembrado
celular, siendo un campo actual que promete cubrir las necesidades.
La ingeniería tisular es una ciencia que aplica los principios de la ingeniería y las ciencias de la
vida para desarrollar sustitutos biológicos que reparen o mejoren la función biológica de un
tejido u órgano. Basándose en tres elementos fundamentales: las células, las biomoléculas y los
andamios poliméricos.
El presente proyecto continuó con la línea de investigación iniciada entre la UAM-I y el Hospital
Infantil Federico Gómez, donde se han probado esponjas biodegradables cubiertas de pirrol con
resultados alentadores. En este proyecto se generaron andamios por electrohilado, de
polímeros sintéticos como: ácido poliláctico (PLA), poli-caprolactona (PCL) y la combinación de
ambos adquiriendo una gran variedad de formas y fueron recubiertos por polimerización en
plasma (pirrol/yodo) para el crecimiento de células de cartílago (Garcia, 2008). Los andamios
recubiertos se evaluaron con Microscopía Óptica, Microscopía Electrónica de Barrido (SEM),
Espectroscopia de Rayos X por dispersión de energía (SEM-EDS), sus características de
composición, tamaño y distribución de poro y diámetro de fibras. La viabilidad y proliferación
celular de condrocitos, tanto in-vitro como in-vivo también fue estudiada
2. Objetivos Generación de un andamio por electrohilado, modificado superficialmente para el
crecimiento de células de cartílago.
Obtener andamios modificados por electrohilado partiendo de un solo polímeros y
combinación de varios; buscando diferentes porosidades y tiempos de degradación.
Modificar superficialmente los andamios con polimerización por plasma de
polipirrol/yodo.
3. Revisión de la literatura
3.1 Fisiología del cartílago
El tejido esquelético está conformado por el tejido conectivo denso, el cartílago y el tejido óseo.
El cartílago es una forma especializada de tejido conectivo, donde los condrocitos están aislados
en pequeños espacios de la matriz extracelular compuesta de fibras, en donde a diferencia de
otro tipo de tejidos este no tiene terminaciones nerviosas ni vasos. Nutriéndose por difusión a
través de un gel coloide rico en agua.
El cartílago está rodeado de una capa de tejido conectivo de colágeno denso llamado
membrana del cartílago o pericondrio. Este se puede clasificar en tres tipos de cartílago
(hialino, elástico y fibroso) dependiendo de la región en la cual se localiza: (Geneser, 2003)
Cartílago hialino; este tiene un aspecto vidrioso azulado y se localiza principalmente en los
cartílagos costales como parte del esqueleto nasal, la laringe, en la tráquea, en los bronquios y
en las superficies articulares. (fig. 1)
3.2 Ingeniería tisular y aplicación en cartílago
La ingeniería tisular es una tecnología de reciente aparición. Donde su metodología es ayudar y
acelerar la regeneración y la reparación de los tejidos defectuosos, proporcionando a las células
un entorno local que les permita regular su proliferación y diferenciación. Modificando
genéticamente las células para su manipulación tanto en investigación de células y terapia,
mediante la creación de entornos por medio de biomateriales, contribuyendo al desarrollo de
células de alta calidad para la terapia de trasplantes de células. (Yusihiko, 2008)
Fig.1 Cartílago hialino corte histológico
Gran parte del dolor de las articulaciones es debido a la degeneración del cartílago, sido un
problema que afecta a personas de todas las edades. Actualmente son empleadas técnicas
quirúrgicas, para tratar lesiones de cartílago en donde ninguna ha dado resultados satisfactorios
a largo plazo. Recientes avances de la biología y la ciencia de los materiales han traído nuevas
técnicas de reparación del tejido. A través de la combinación de células, andamios,
biorreactores, estimulaciones mecánicas y factores de crecimiento, ofreciendo nuevas
posibilidades en la regeneración de cartílago y tejido. (Dobrila Nesic, 2006)
Siendo elemental conocer la anatomía del cartílago articular, los tipos de lesiones y métodos de
reparación. Con el fin de entender las necesidades de los biomateriales que se utilizan
normalmente en la actualidad para el tejido de cartílago dentro de la de ingeniería, para
construirse adecuadamente la interface célula- biomaterial. (Temenoff J., 2000)
El cartílago no tiene la capacidad de regenerarse por lo que se requieren ambientes que permita
él crecimiento de este, a partir de biomateriales y factores de señalización que influyen en el
comportamiento celular (condrocitos) y la formación de cartílago. Con él único fin de promover
el crecimiento de tejido cartilaginoso que pueda imitar las mismas propiedades del tejido
natural. (Chung Cindy, 2008)
La regeneración de huesos y del cartílago puede ser acelerada por ciertos factores de
crecimiento, los cuales son impregnados en algunos sitios como lesiones, con el fin de estimular
los procesos de cicatrización de los tejidos. Existiendo hoy en día factores de crecimiento
implicados en la reparación y regeneración de hueso y cartílago. Existiendo compañías
preocupadas en la generación de andamios conformados de distintos polímeros de tipo
sintético o naturales, generando andamios porosos o a partir de micropartículas e hidrogeles.
(Soo-Hong Lee, 2007)
Recientes avances en el desarrollo de biomateriales y terapia celular han ofrecido la posibilidad
de explorar nuevas estrategias, tanto en biomateriales naturales como sintéticos, diseñando
entornos adecuados. Permitiendo la generación de andamios biomiméticos, siendo materiales
que pueden realizan la misma función que el tejido biológico, pero que se construyen a partir
de un andamio sintético (polímero biodegradable, poroso y con forma de tubo) sobre el cual se
aplican células en este caso condrocitos del propio paciente que proliferan y se diferencian. (Vial
Ximena, 2009)
El electrohilado se ha utilizado en el auto-ensamblaje de péptidos y la biominerización las cuales
han sido empleadas para la fabricación de andamios nano-estructurados que imitan mejor el
medio extracelular, que se encuentra dentro de los tejidos vivos. Reincorporación péptidos que
tienen como finalidad el reconocimiento celular y el uso de la tecnología de ADN recombinante,
permitiendo la creación de andamios con nuevos niveles de disfuncionalidad, creando entornos
altamente adaptados para la regeneración celular. (Bonzani Lan, 2006) Así que el éxito de la
regeneración o sustitución de cartílago dañado o enfermo dependerá de los futuros avances, de
la comprensión de la biología del cartílago y del desarrollo tecnológico en la ingeniería. (Kuo
Wen Hung, 2005)
Actualmente se ha venido implementando una técnica en la cual se deposita una fibra
conformada a partir de poly (ethylene glicol) – terephthalate-poly (butylene terephthalate)
(PEGT/PBT) formando una red de interconexión con forma de poros. Esta técnica ha permitido
el diseño de un andamio con características de capa por capa, permitiendo tener un mayor
control sobre cómo se depositan las fibras. Así que al variar la composición de PEGT/PBT se
modificó la porosidad y la geometría de los poros alterándose sus propiedades mecánicas como
son el equilibrio y la rigidez dinámica las cuales fueron muy similares a las del cartílago articular
que son de (.27 y 4.10 MPa. respectivamente), mientras que las obtenidas a partir de estos
experimentos fueron entre el rango de 0.05-2.5 y de 0.16 -4.33 MPa. Además, los resultados
generaron también una distribución homogénea de las células después de 5 días de la siembra,
obteniéndose un modelo útil para el desarrollo de andamios y la arquitectura de poros que a su
vez permiten la formación de cartílago articular. (Woodfield T.B.F, 2004)
Se han continuado haciendo investigaciones incorporándose biomateriales al tejido circundante
con el fin de que se presente una funcionalidad inmediata y con resultados a largo plazo,
utilizado sulfato de condroitina (CS) que es uno de los principales componentes de la matriz
extracelular del cartílago formándose un bioadhesivo que es fácil de aplicar, analizándose la
estabilidad mecánica de la utilización de sulfato de condroitina para biomateriales. (Wang Dong-
An, 2007)
Actualmente se han usado andamios poliméricos para mejorar su rehabilitación. Estos pueden
modificar el tamaño de los poros, la porosidad del mismo, la biocompatibilidad, la especificidad
de la forma, la integración con el tejido propio, la degradación en función con la tasa de
formación del neo-cartílago y la rentabilidad. (Raghunath J. Rollo J., 2007). Concluyéndose que
el tamaño del poro, afecta la cantidad y la composición del tejido cartilaginoso. (Bhardwaj
Tajinder, 2001).
3.3 Tipos de Biomateriales
Biomaterial, se define como cualquier material que pueda reemplazar y /o restaurar tejidos u
órganos vivos de manera temporal o permanente, entendiendo las relaciones existentes entre
las propiedades, funciones y estructuras de los materiales biológicos, materiales de implante y
la interacción existente entre ellos.
Observando la clasificación esta se divide en 4 grupos, dada sus estructuras y propiedades:
3.3.1 Polímeros
Los polímeros, son compuestos de tipo químico, natural o sintético que se forma a partir de
reacciones químicas entre dos o más moléculas que se combinan de la misma especie, para
formar otro compuesto más complejo. Estos son macromoléculas formadas por la unión de
moléculas más pequeñas llamadas monómeros. (Piña, 2009)
Los materiales poliméricos tienen una gran variedad de aplicaciones dadas sus propiedades,
físicas, químicas y mecánicas. Existen dos tipos de polímeros de acuerdo a su origen: natural y
sintéticos.
Entre los polímeros de origen natural encontramos las proteínas y los polisacáridos que forma
parte del tejido vivo, dentro de los polímeros sintéticos que actualmente son utilizados en el
campo biomédico tenemos el polimetil-metacrilato (PMMA), el polietileno (PE) y poco a poco
con el paso de los años se han venido introduciendo nuevos polímeros biodegradables siendo
utilizados en varios aspectos como la cirugía ortopédica, fijación de fracturas, remplazo óseo,
cartílago y meniscos. Estos materiales han sido usados en su mayoría en forma de tornillos,
clavos y placas para cirugías tanto ortopédicas como cráneo-faciales.
Alguna de las características que deben de tener los materiales biodegradables para poder ser
utilizados dentro del organismo humano es que no deben ser mutagénicos, carcinógenos ni
tóxicos, si no al contrario deben de ser totalmente compatibles con el tejido receptor y no
generar reacciones patológicas. Como ejemplos de estos polímeros biodegradables tenemos:
Polímeros Metálicos
Materiales
Compuestos
Cerámicos
Fig.2 Clasificación de los materiales
Fig. 3 Ejemplos de Polímeros Biodegradables
Siendo los más comunes los obtenidos a partir del ácido poli-glicólico (PGA) y el ácido poliláctico
(PLA) utilizados en suturas biodegradables, también hay otros materiales como la polidioxanona
y copolímeros de poli (-caprolactona), los cuales han sido aceptados como materiales de uso
biomédico.
3.4 Síntesis del Ácido Poliláctico (PLA)
El ácido poliláctico (PLA), tiene como características ser un material termoplásticos, amorfo,
semi-cristalino con un alto valor de fuerza mecánica y plasticidad térmica. Siendo posible la
síntesis del ácido láctico, en ácido poliláctico, teniendo un mayor peso molecular, trasformado
primero el ácido en un diester cíclico conocido como polilactide. La polimerización es llevada a
cabo por la apertura del anillo del diester cíclico, utilizándose diferentes iniciadores metálicos e
inorgánicos como el Zn y estaño; siendo él más utilizado el octanato estañoso (fig. 4).
Polímeros Biodegradables
Naturales
Protéicos
Albúmina Colágeno
Polisacáridos
Quitosano Quitina
Carboxicelulosa Glucosaminoglucanos
Sintéticos
Polieortoésteres Policianoacrilatos
Polianhidridos Poli-ala-aminoácidos
Polifosfacenos Policarbonatos
Poliésteres Alifáticos
Polidioxanona Poliecaprolactona
Ploli-alfa-hidroácidos
Poliglicólico Poliláctico
Fig.4 Síntesis del láctico a poliláctico
3.5 Síntesis de la Policaprolactona (PCL)
La policaprolactona es sintetizada mediante la polimerización por apertura del anillo -
caprolactona usando como catalizador el octanato de estaño (fig. 5), este polímero es semi-
cristalino, además de presentar un punto de fusión a los 59⁰C-64⁰C y una Tg -60⁰C, este
material tiene un intervalo de degradación de aproximadamente 2 años .
Fig. 5 Síntesis de -caprolactona a policaprolactona
3.6 Técnica de electrohilado
La reconstrucción de tejidos a partir de un cultivo controlado de células sobre un soporte es una
de las aplicaciones más importantes de los polímeros. Esta técnica consiste en la generación de
fibras a partir de inyección de una solución polimérica en un campo electrostático del orden del
kilo-volts (kV), obteniendo un entrelazado de nano y micro fibras poliméricas por medio de un
colector. La figura 6 presenta un esquema del equipo.
En esta técnica es importante el control de las variables físicas involucradas en el proceso de
fabricación de fibras como son: el campo eléctrico (voltaje y distancia entre cargas),
temperatura, humedad, distancia entre inyector/colector y flujo de la solución .El control de
estas variables tiene como fin determinar la estabilidad del proceso y la calidad del material
fabricado.
Estas variables se manipulan de acuerdo a la pareja polímero/solvente buscando tener un flujo
estable, que la muestra pierda el solvente en el trayecto al colector y se logre una fibra del
grosor esperado. Mientras que, las propiedades mecánicas de las fibras (elasticidad y
resistencia) dependerán de la clase de polímero y las características del solvente. (W. Gamboa,
2007)
X. M. Mo y colaboradores electrohilaron copolímeros de PLLA-PCL disolviéndolos con acetona
o alcohol, a baño maría a 45⁰C variando la solución entre un 3- 9% colocando una jeringa de
plástico de 20 ml, variando el diámetro de la aguja entre 0.4-1.2 mm. Observando los efectos
de los diferentes parámetros como son calibre de la aguja, volumen inyectado, voltaje de
aplicación, tipo de colector, distancia de colector, dando diferentes resultados e hilados. (X.M.
Mo, 2004)
Finalmente las características físicas de un andamio polimérico, pueden ser manipuladas por la
técnica de electrohilado, pero esto no siempre es suficiente. En ocasiones se requiere modificar
superficialmente el andamio para conseguir una mejor adhesión celular, esto se puede lograr
por medio de un recubrimiento por plasma en este caso con polipirrol dopado con yodo (PPy).
Llevándose a cabo reacciones químicas que permiten la modificación superficial del material.
3.7 Polimerización por plasma
El plasma es un gas ionizado considerado el cuarto estado de la materia, presentando
características propias como conducción de la electricidad, campo eléctrico efectivo y oscilación
del plasma.
La polimerización por plasma es un método, que tiene como finalidad generar un deposito
polimérico partiendo de reacciones en el estado gaseoso. En este caso el recubrimiento con
polipirrol puede estimular el crecimiento celular, con la finalidad de generar andamios efectivos
para ingeniería tisular.
Fig. 6 Equipo utilizado en la técnica de electrospinning.
3.8 Síntesis y caracterización del polipirrol
Una de las propiedades de los polímeros sintéticos es que pueden actuar como aislante
eléctrico. El polipirrol (PPy) es considerado como un polímero semiconductor debido a su buena
conductividad eléctrica y a su estabilidad térmica. Esta conductividad puede ser influida por la
presencia de otros elementos y/o compuestos ya sea como dopantes químicos, por
implantación de iones o por complejos químicos metálicos. Así que las propiedades eléctricas
del polipirrol están dadas en función de la polimerización y de la humedad ambiental.
En los últimos años la técnica de polimerización por plasma ha sido utilizada para sintetizar
películas delgadas de polímeros, en donde la ventaja de esta técnica radica en que la película se
obtiene a partir de reacciones en la fase gaseosa y se propaga en la superficie más cercana. El
monómero, reacciona para producir el polímero sin introducir ningún compuesto químico
oxidante. En este caso la oxidación es promovida por el impacto de los electrones libres que
viajan a lo largo del campo eléctrico las cuales colisionan con las moléculas del monómero. (G.
Cruz, 1999) Este tipo de recubrimientos se ha utilizado en andamios para crecimiento celular
con éxito. (R. Olayo, 2008)
De las descripciones anteriores, podemos decir que las características tanto físicas como
químicas del andamio dependerán de las condiciones de síntesis, geometría del reactor, los
elementos implantados, la utilización de algunos disolventes, grosor de la fibra, tamaño del
poro, voltaje aplicado entre otros . Siendo factores que propiciaran una adecuada proliferación
y adhesión celular; además de propiedades mecánicas adecuadas.
3.9 Tipos de cultivos celulares
Se define como cultivo celular al resultado del crecimiento in-vitro de células obtenidas a partir
de organismos multicelulares, se pueden clasificar de acuerdo a su capacidad de adherencia,
esto es, pueden ser en suspensión o adheridos. En general los cultivos en suspensión no
pueden ser muy grandes, mientras que los de adherencia pueden ser en monocapas o de forma
tridimensional utilizando los andamios adecuados.
Cuando el cultivo proviene de células que han sido disgregadas de un tejido original tomado de
un órgano de un animal recién sacrificado, reciben el nombre de Cultivo Primario; cuando éste
cultivo primario es sometido a procesos de transformación que le confiere capacidad ilimitada
de multiplicación, reciben el nombre de Líneas Celulares.
4. Procedimiento experimental
Uno de los objetivos el proyecto fue el desarrollo de un andamio polimérico poroso formado
por microfibras biodegradables y biocompatibles (PLA y PCL) a través de la técnica de
electrohilado, recubiertas con una película de pirrol con yodo utilizando la técnica de
polimerización por plasma, estudiando posteriormente los efectos de la degradación y
biocompatibilidad in vitro con células de cartílago elástico de conejo.
4.1 Electrohilado (Preparación de soluciones, condiciones generales,
recolectores, tratamientos pos-hilados)
Para la construcción del andamio de ácido poliláctico (PLA), se comenzó buscando la
concentración ideal para obtener fibras con la técnica de electrohilado según reportes previos
sobre la técnica su aplicación en crecimiento celular de cartílago estas debían presentar el
aspecto físico mostrado en la figura 7.
Preparación de soluciones
Material : Reactivos:
Balanza analítica Cloroformo (CH-Cl3)
Frasco de cristal Etanol
Agujas distinto cálibre Ácido poli-láctico (PLA)
Jeringas 20 ml. Poli-caprolactona (PCL)
Parafilm
Existiendo 5 factores como: % de la concentración del material, tipos de recolector, tipo de
solvente, temperatura ambiente y calibre de la aguja. Que influyen en su geometría, porosidad
b
Fig.7 a) Fibras obtenidas mediante técnica de electrospinning PLA, voltaje de 25 kV , velocidad de inyección de 0.1 mL/h y a una distancia del colector de 15 cm. (Yin Gui-Bo, 2009) b) Fibras de PLA en dimetofomamide obtenidas mediante la técnica de electrospinning, voltaje de 15 kV, velocidad de inyección de 10µL/min a una distancia del colector de 10 cm. (Chunhui Xiang)
y diámetro de la fibra, siendo importantes para la proliferación y diferenciación celular de
condrocitos, comparando estos, para analizar los beneficios y desventajas que presentan:
Preparación de muestras con cloroformo/cloroformo+etanol:
1. Se preparo una solución de concentración a peso 12% de PLA en cloroformo teniendo 10ml.
de solución, obteniendo una mezcla homogénea y cerrando los frascos con parafilm con el fin
de evitar la evaporación. .
2. Se coloco la solución (CH-Cl3 + PLA) en una jeringa, en el inyector
3. Se prepararon muestras al 7%, 12% y 15% de PLA y con los mismos porcentajes de PLA pero
utilizando como solvente une mezcla 2:1 cloroformo + etanol
Tipos de recolector
Se diseñaron distintos tipos de recolectores, buscaron mejorar la eficiencia de la obtención de
fibra y morfología:
Recolector tambor rotatorio/desplazamiento:
Se trabajo con un tambor rotatorio, con superficie continua el cual nos permitiría cambiar la
superficie y acumular la fibra en capas conforme rota dependiendo el grueso de las capas de la
velocidad de rotación que es ajustable en el equipo. Su cableado tiene un aislamiento reforzado
para evitar la desviación del jet hacia distintos puntos del electrodo objetivo (tambor).
% de la concentración del material (soluto)
•7 % de PLA
• 10 % de PLA
•12% de PLA
•15% de PLA
Tipo de recolector
•Tambor
•Tambor cubierto de teflón
•Tambor con pipetas
•Tambor con elásticos
•Arco
•Dos orejas
Tipo de solvente
•Cloroformo
•Cloroformo / etanol
Temperatura del ambiente
•Sin calentar previamente cámara a 30⁰C
•Calentar el ambiente previamente a 30⁰C
•Aplicar calor durante el experimento
Calibre de la aguja
•22G
•23G
•25G
•30G
CONDICIONES GENERALES
Recolector tambor rotatorio/desplazamiento con pipetas:
Se le realizaron modificaciones al tambor rotatorio con el que contaba el equipo colocándose
alrededor de este una serie de pipetas a una distancia aproximada de 2 cm entre ellas, con el fin
de reducir el contacto entre la fibra y la superficie dando un mayor tiempo de secado a la fibra.
Recolector de dos orejas con desplazamiento:
Utilizando un bloque de madera (5 cm x 5 cm) y alambre de cobre de bajo calibre, se construyó
un recolector que tuviera el aspecto de dos orejas que sirvieran para atrapar sobre estas las
fibras que se fueran formando, colocándose justo al centro del recolector una tierra lineal (fig.
8). La velocidad de desplazamiento lateral (derecha/izquierda) era variable.
Recolector jaula de tambor rotatorio/desplazamiento:
Con el fin de obtener andamios de un tamaño considerable y homogéneos, se retomó la idea
del tambor rotatorio pero ahora en forma de una jaula, con una tierra lineal en el eje del
tambor y aumentando su velocidad. Obteniéndose mejores resultados que posteriormente
serán discutidos.
Tratamiento pos-hilado previo a la polimerización
El material es colocado en el horno a vacio a 42⁰C durante 7 días. Realizando SEM-EDS de
manera comparativa (previo al tratamiento y posterior), midiendo la cantidad de cloro.
4.2 Polimerización por plasma
Material: Reactivos:
Tubo de vidrio pirex Pirrol
Electrodos internos/externos (acero inoxidable)
Yodo
Fig. 8 Recolectores con líneas específicas de recolección, dos orejas con desplazamiento
a b
Bomba de vacío Fuente de radio-frecuencia Medidor de presión Nitrógeno líquido
Procedimiento:
1. Lavar y secar dentro de la estufa el material (tubo vidrio pirex, electrodos
(internos/externos), durante 15 min a 70 ⁰C.
2. Acoplar el reactor de plasma (tubo pirex) en sus 4 puntos de acceso: bomba de vacío,
medidor de presión, el dopante (yodo) y el monómero (pirrol). Midiendo los cambios en
la presión interna del reactor con un sensor pirani en un rango de 10 a 1x10-3 mbar.
3. Iniciar la descarga de iones, prendiendo la fuente de radio-frecuencia cuando la presión
llega a 133.33x10-3 mbar. controlando la potencia a 15 watts. Bajo el principio de que a
menor presión, podemos usar menor potencia y de esta manera conservar la integridad
del monómero y el andamio
4. Aplicando de manera continúa durante 1 hr. pirrol y de manera intermitente en intervalos
de 6 min. yodo sobre los andamios (fig.9).
4.3Caracterización de fibras
La caracterización de las fibras se da buscando su mejor desempeño como andamios para
Ingeniería de Tejidos. Las variables relevantes para esta función son: la porosidad de la muestra
generada por la distribución de las fibras y sus diámetros, su biodegradación e interacción
celular. Los equipos utilizados para la primera evaluación son:
Fig.9 a) Inicio de la polimerización sobre el andamio por plasma b) Aplicación de pirrol/yodo en intervalos de 6min. sobre los
andamios.
Microscopía óptica
Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
Espectroscopía de Rayos X por Dispersión de Energía (SEM-EDS)
Microscopia Óptica
El análisis de Microscopia Óptica se realizó con un Microscopio marca: Leica, modelo: DMLP,
con aumentos 50X y 100X para fines de comparación entre los materiales, a partir de una fuente
de luz visible con distintos filtros de longitud de onda. El microscopio cuenta con un dispositivo
para obtener la imagen electrónicamente para eso se utilizó una cámara digital:
Microscopia Electrónica de Barrido
Para preparar las muestras se utilizó la técnica de sputtering, recubriendo con oro los
materiales y generando una diferencia de potencial. A partir de una pulverización catódica a
alto vacio e intercambiando partículas de oxígeno por argón. Realizando un recubrimiento de
aproximadamente 10 nm. sobre el material, debido a que estos no eran conductores.
El análisis de Microscopia Electrónica de Barrido (SEM) se realizó utilizando un microscopio
marca Philips® XL30 sobre las fibras, explorando la superficie y tomando las imágenes
representativas de la muestra.
Espectroscopia de Rayos X por Dispersión de Energía (SEM-EDS)
El SEM-EDS se realizó utilizando un microscopio Philips® XL30 por retro dispersión de electrones
(reflejo de los átomos), a partir de la interacción entre el haz y los átomos, generando una
emisión de rayos X que tiene las características del elemento primario, permitiendo un análisis
elemental de la energía dispersiva de rayos X o espectroscopia EDS, generando un análisis
cuantitativo de la composición elemental presente en la superficie de la muestra. La técnica se
utilizó para establecer la presencia de solvente residual.
4.4 Obtención de las células y cultivo de condrocitos
Para la obtención de células de cartílago elástico auricular y cultivo de condrocitos se utilizaron
los siguientes reactivos y procedimientos:
Reactivos:
PBS (Phosphate Buffer Saline) con Antibiótico-Antimicótico
Tripsina 0.05% - EDTA (0.53 mM) en solución Hank's
Colagenasa Tipo II 2mg/ml en medio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) con
0.37% NaHCO3, suplementado con Antibiótico-Antimicótico
Medio de cultivo D-MEM con 0.37% NaHCO3, Suero Fetal Bovino al 10% y suplementado
con Antibiótico-Antimicótico.
Procedimiento:
Biopsia de cartílago elástico auricular:
1. Se retiro una biopsia de cartílago elástico auricular utilizando un conejo con las
siguientes características:
Especie: Conejo New Zealand blanco. Sexo: Macho Edad: 2 meses de vida extrauterina Peso: 2.200 Kg
2. El conejo fue tranquilizado con una inyección intramuscular de Acepromacina (5 mg/Kg)
y Ketamina (20 mg/Kg), anestesiando posteriormente con una inyección intravenosa de
Pentobarbital Sódico (40 mg/ml) (fig 10.a y 10.b).
3. Se tomo la biopsia bajo condiciones asépticas de la oreja derecha del conejo realizando
una incisión en la zona dorsal y separando la piel del cartílago. (fig. 10.c)
4. Obteniendo una muestra de aproximadamente 1 cm2, la cual fue transportada al
laboratorio en un tubo falcon con PBS c/ Antibiótico-Antimicótico para ser procesada.
(fig. 10.d y 11.a)
Obtención de cultivo primario de Condrocitos
1. En una campana de flujo laminar y bajo condiciones estériles el cartílago se lavó con PBS
para retirar el exceso de sangre y se coloco en un disco de 100mm x 20mm para
a b
c d
Fig. 10 Biopsia de cartílago elástico auricular a) Preparación del conejo. b) Aplicación de anestesia intravenosa c) Toma de
biopsia en la región dorsal de la oreja derecha. D) Obtención de la muestra de aproximadamente 1 cm2.
disgregarlo mecánicamente en trozos de aproximadamente 2 mm los cuales se
colocaron en 10 ml de la solución disgregadora (Tripsina 0.05% - EDTA (0.53 mM) -
solución Hank's) durante 30 minutos en agitación continua a 37°C, una atmósfera al 5%
de CO2 y humedad saturada. (fig. 11 a y 11.b)
2. Posteriormente se dejo sedimentar el tejido y se decanto el sobrenadante, se agregaron
10 ml de la solución de Colagenasa tipo II y se mantuvo durante 3 horas en agitación
continua a 37°C, una atmósfera al 5% de CO2 y humedad saturada. (fig. 11.c)
3. Ya disgregado el tejido se coloco en un tubo falcon y se centrifugo durante 10 minutos a
2000 rpm, se retiro el sobrenadante y el botón celular se re-suspendió en medio de
cultivo D-MEM con 0.37% NaHCO3, SFB al 10% suplementado con Antibiótico-
Antimicótico, se centrifugo a 2000 rpm x 10 minutos.
4. El botón celular se re-suspendió en 2 ml de medio de cultivo para realizar el conteo
celular en una cámara Neubauer con el colorante vital azul tripano,(fig. 11.d y 11.e) de
esta manera se obtuvieron aproximadamente 4x106celulas, las cuales fueron cultivadas
en discos de 150 mm x 25 mm a una densidad de 50,000 cel/ml en medio de cultivo D-
MEM con 0.37% NaHCO3, SFB al 10% suplementado con Antibiótico-Antimicótico para
lograr su proliferación.(fig. 11.f)
a b c
d e f
Fig. 11 Obtención de cultivo primario de condrocitos. a) Transportación de muestra al laboratorio en tubo falcon. b) Disgregación
mecánica de la muestra. c) Proceso de decantación y agitación continua a una temperatura de 37⁰C. d) Botón celular marcado con
azul de tripano. e) Cámara Neubauer f) Discos de cultivo con células para expansión celular de condrocitos.
4.5 Pruebas celulares
Se dejo para expansión y proliferación celular el cultivo durante 3 semanas para obtener una
población celular confluente lo cual permitió tener suficiente muestra para realizar los
experimentos.
In vitro:
Procedimiento:
1. Se re suspendieron las células y cultivaron a una temperatura de 37⁰C, con 5% de CO2 y
humedad saturada. Para expansión celular sobre las membranas.
2. Cambiando el medio celular cada tercer día durante 30 días. Evaluando sobre las
membranas la proliferación celular el día 3, 7, 10 y 30 de cultivo; con Microscopia
Electrónica de Barrido y Pruebas de Viabilidad, usando la reducción metabólica del
Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT), realizada por la enzima
mitocondrial succinato-deshidrogenasa.
In vivo:
Procedimiento:
1. Se re suspendieron las células y cultivaron a una temperatura de 37⁰C, con 5% de CO2 y
humedad saturada. Para expansión celular sobre las membranas, cambiando el medio
celular cada tercer día durante 7 días.
2. Procediendo al explante después de 30 días, evaluando con Microscopia Electrónica de
Barrido y Pruebas de Viabilidad (MTT); la proliferación celular en las membranas.
4.6 Pruebas de viabilidad (MTT)
Para evaluar la proliferación celular sobre los membranas, se siguió el siguiente procedimiento:
1. Adicionar 10% de MTT (100 ml.) del total de medio de cultivo durante 4 hrs. protegido
de la luz, a 37⁰C.
2. Retirar el medio MTT, lavar con PBS, una vez y solubilizar con 250 ml. de alcohol ácido,
10.4 ml. de HCl (Ácido Clorhídrico), en 100 ml. de isopropanol.
3. Colocar en tubos Eppendorf y cargar 30 ml. para leer la absorbancia entre 540 a 600 µm.
es un espectrofotómetro, con agitación de 120 rev/min.
4.7 Deshidratación y Punto Crítico de muestras biológicas para observación en
Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
Previo a la observación de muestras biológicas en Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) es
necesario preparar la muestra.
Procedimiento:
1. Lavar las muestras con PBS c/Antibiótico-Antimicótico y fijar las muestras con
Glutaldehido al 2.5% para SEM durante 30 min.
2. Retirar el fijador y lavar nuevamente dos veces con PBS c/Antibiótico-Antimicótico
3. Iniciar proceso de deshidratación con alcoholes graduales, adicionando alcohol al 50% y
dejar reposar durante 5 min. y posteriormente retirar.
4. Repetir el proceso anterior pero ahora con alcohol al 60%, 70%, 80%, 90% y alcohol
absoluto, todos estos con intervalos de 5 min.
5. Colocar las muestras en el equipo de punto crítico (fig. 12) en una celda y bajar la
temperatura a -15⁰C, inyectando CO2 (Dióxido de Carbono) a la muestra y sacando este
posteriormente, repitiendo este proceso 3 veces para desecar la muestra.
6. Y finalmente calentar la celda 42⁰C, retirando la muestra.
5. Resultados
Dada la dependencia de los diferentes factores como la temperatura, el tipo de recolector y la
concentración de la solución. Se evaluaron los resultados cuando se varían estos en nuestro
equipo para diferentes sistemas polímero-solvente. Además se discute los resultados de las
pruebas celulares.
Fig. 12 Equipo de punto crítico
Calentando el ambiente previamente
• PLA 10%
• Recolector tambor
Sin calentar el ambiente previamente
• PLA 10%
• Recolector tambor
5. 1 Influencia de la temperatura en el electrohilado
Para analizar el impacto de la temperatura se realizó un primer experimento, preparando las
muestras a una concentración de 10% de PLA en cloroformo, utilizando el recolector tambor.
Comparando el aspecto de las membranas obtenidas, a 21⁰C (temperatura ambiente) y
precalentando el ambiente dentro de la cámara de electrohilado a una temperatura de 30⁰C.
La membrana obtenida a temperatura ambiente (fig. 13.a) presenta un aspecto plastificado,
debido a la cantidad de solvente presente cuando las fibras caían sobre el tambor, al no ser
evaporado el solvente en su totalidad durante la trayectoria parabólica del inyector al tambor.
Esto se puede ver en una revisión a simple vista (fig. 13.c) y con Microscopía Óptica, donde se
observa una nula porosidad de las membranas debido a que las fibras se fusionaron, al entrar
en contacto con el recolector.
Cuando se establece una temperatura de 30⁰C, dentro de la cámara de electrohilado, la
membrana obtenida presenta una mayor porosidad a simple vista (fig. 13.b) y con Microscopia
Óptica debido a que se da una mayor evaporación del solvente durante la trayectoria del
inyector al tambor (fig. 13.d). Esto se debe principalmente a que el punto de ebullición del
cloroformo es de 61⁰C, por lo que el incremento de la temperatura dentro de la cámara
favorece la evaporación del solvente al igual que, la extracción de vapores liberados dentro de
la cámara, por medio de una manguera conectada a un extractor de aire.
Este experimento nos permitió observar que el control de la temperatura es un factor de suma
importancia en la evaporación del solvente, además la geometría del recolector afecta la
morfología de la fibra por lo que se analizó la influencia que tendrían los distintos tipos de
recolectores sobre los andamios.
Fig. 13 Microscopía óptica (5X) a) Muestra de PLA 10% sin calentar el ambiente, se observa aspecto plastificado y nula porosidad b) PLA 10%, calentando previamente el ambiente de la cámara de electrohilado. Imagen macroscópica de PLA 10% c) Sin calentar el ambiente. d) Calentando el ambiente a 30⁰C.
5.2 Influencia de los Recolectores
Para evaluar el uso de distintos tipos de recolectores y como favorecen en la formación de
fibras , se estableció como experimento, el trabajar bajo las siguientes condiciones : precalentar
el ambiente a una temperatura de 30⁰C , a concentración de 15% de PLA con
cloroformo/etanol cambiando la geometría del recolector
La membrana obtenida con el recolector de tambor rotatorio/desplazamiento con pipetas,
presentó un aún un aspecto con poca porosidad en las zonas de contacto con las pipetas esto
nuevamente por la cantidad de solvente presente cuando las fibras caían sobre las pipetas, al
no ser evaporado el solvente en su totalidad durante la trayectoria del inyector al
tambor/pipetas. Mientras que en los espacios generados entre las pipetas se la presencia de
Recolector de tambor rotatorio/ desplazamiento con pipetas
• PLA 15%
• Precalentando el ambiente (30⁰C)
Recolector orejas con desplazamiento
• PLA 15%
• Precalentando el ambiente (30⁰C)
c d
fibras bien formadas y además la porosidad, debido que el material tenía un mayor tiempo de
secado al no entrar en contacto con la superficie del tambor (fig. 14.a).
De lo que concluimos que es mejor tener generar recolectores con líneas especificas de
recolección para la captación de fibras. Esto se aplico en el recolector de orejas con
desplazamiento, donde es posible observar con Microscopía óptica (fig. 14.b) la presencia de
fibras y porosidad de las membranas. Al evitar la fusión de las fibras cuando entran en
contacto con una superficie plana, permitiendo una mejor distribución y secado de las fibras.
5.3 Influencia de la concentración del polímero
Para analizar los efectos de la concentración y el aspecto morfológico de las fibras, se estableció
como experimento; precalentar el ambiente de la cámara de electrohilado a 30⁰C, utilizando el
recolector dos orejas con desplazamiento y como solvente del sistema cloroformo/etanol.
La concentración del polímero se modificó en un intervalo de 7-15% de PLA, se utilizó la mezcla
cloroformo/etanol para bajar la calidad del solvente y buscar que la muestra secara en un tiempo
más corto.
En la concentración de 7%, el andamio generado presentaba pequeños grumos sobre las fibras,
estos como consecuencia del solvente remanente cuando se formo la fibra, por lo que se decidió
aumentar la concentración para disminuir la cantidad de solvente.
La concentración se aumento a 15%, incrementando la viscosidad de la solución. Si se considera la
ecuación de Poiseuille que nos da el cambio de presión necesaria para obtener un gasto podemos
ver que esta depende de la geometría de la aguja y la viscosidad. La relación es la siguiente:
Fig. 14 Microscopia óptica 5X. a) Muestra generada con el recolector pipetas con desplazamiento, el lado derecho de la
imagen corresponde al espacio generado entre las dos pipetas se observa la presencia de fibras, mientras que el lado
izquierdo corresponde a la región sobre la pipeta. b) Fibras obtenidas con el recolector orejas con desplazamiento.
Concentración de PLA 7%
• Recolector dos orejas con desplazamiento
• Precalentando el ambiente (30⁰C)
Concentración de PLA 12%
• Recolector dos orejas con desplazamiento
• Precalentando el ambiente (30⁰C)
Concetracion de PLA 15%
• Recolector dos orejas con desplazamiento
• Precalentando el ambiente (30⁰C)
Donde:
Q= Caudal volumétrico
µ= Viscosidad
L= Longitud del tubo
R=Radio del tubo
El aumento de la viscosidad a una concentración al 15%, provocó que se necesitara una presión
mayor que la que el equipo podía manejar. Por lo tanto fue necesario aumentar el radio de la
aguja lo que dio como resultado que el diámetro de la fibra también aumentara y se formaran
nuevamente grumos y colapsaran las fibras en algunos puntos.
Con la concentración al 12%, la viscosidad disminuyo y fue posible utilizar la misma aguja que
con el 7%, la fibra seco más rápidamente y se obtuvo limpia y sin grumos
5. 4 Andamios de PLA, PCL y combinados
Una vez optimizadas las variables para obtener fibras sin grumos se utilizaron las condiciones
para generar andamios de PLA, PCL y combinado. Las condiciones fueron: concentraciones de
12% del polímero, precalentando ambiente de la cámara a 30⁰C, utilizando como solvente
cloroformo/etanol, y el recolector jaula de tambor rotatorio/desplazamiento.
En la figura 15 muestra las imágenes de SEM obtenidas de los tres tipos de fibras. En la figura
15.a es posible ver como las fibras de PLA presentan un diámetro no muy homogéneo que
fluctúan entre 2.5 y 15 micrones. En el caso del PCL (fig. 15.b) las fibras presentan un diámetro
menor, con una distribución uniforme, formando un material poroso, con poros de mayor área
en comparación con el PLA por esta razón se decido que al combinar ambos materiales se
generaría un material con fibras combinadas y con una porosidad similar a la del PLA. Puesto
que los tiempos de biodegradación son similares al ser el PCL de diámetro menor esta se
degradara primero y en general nos dará un tiempo de biodegradación diferente en el material
combinado (fig. 15.c).
5.5. Porosidad de los andamios
Con Microscopía Electrónica de Barrido se identifico la porosidad de los distintos materiales,
estableciendo umbrales de intensidad para cada uno, con el fin de observar el área de los
poros, formados por las fibras de los distintos materiales.
Se segmentaron las imágenes en: características de interés que corresponde a la porosidad del
material (rojo) y a las fibras en color gris. Se obtuvo este umbral, en un punto en el cual fuera
posible identificar tanto fibras como poros. En la figura 16.a, el 19.53% corresponde a la
porosidad de la muestra y el 80.47% a la distribución y orientación de las fibras de PLA.
Fig.15 SEM (200X) a) Red tridimensional de PLA 12%, generada por técnica de electrospinning. b) PCL 12%. c) Andamio
polimérico generado a partir de PLA 12% y PCL 12% en una relación 70:30
Fig. 16 La imagen de la izquierda corresponde a la segmentación de la imagen de SEM, de color rojo se identifica la porosida d y
en gris las fibras de PLA al 12%. Mientras que del lado derecho se observa el umbral de la segmentación realizada
La figura 17.a corresponde al histograma de la Poli-caprolactona (PCL) identificando una
porosidad del 44.10% y el 55.85% restante a las fibras. En este caso al combinar ambos
materiales PCL/PLA, tenemos que el 90.24% de lo observado en el histograma corresponde a las
fibras, formando una mayor cantidad de poros con una menor área, a consecuencia de la
distribución de las fibras gruesas y delgadas de los materiales al hilarlo. (fig. 17.b)
Para determinar la porosidad, se efectuó una conversión binaria de las imágenes, por medio del
programa ImageJ, estableciendo un umbral que permitió convertir la imagen, en objetos y
fondo. Se realizó de manera automática a través de un umbral de prueba y calculando el
promedio de los pixeles por debajo de este umbral y por encima. Calculando el promedio de
ambos puntos, este promedio se compara con el valor del umbral y si no son iguales se
incrementa el umbral nuevamente, repitiendo el proceso. Este incremento se detiene cuando
se cumple la condición:
Estableciendo la porosidad de color negro (256) y como fondo las fibras en blanco (0). Se utilizó
el comando de analizador de partículas, el cual identifica y da las medidas de objetos, realizando
un escaneo de toda la imagen, detectando los bordes de los poros, mediante un cambio de
umbral de 0 a 256 o inversamente. Delimitando la forma y tamaño de estos.
Al analizar la imagen de PLA, se observa cómo están delimitados los poros, mientras que un
contador identifica el total de poros así como la ubicación, los resultados son desplegados en
una lista, indicando el número de poro y área. Con un total de 1626 poros, con áreas en un
intervalo de 0.824 µm2. a 2028.611µm2. y un área promedio de poro de 26.43 µm2. (Fig. 18).
Fig. 17 Umbral de segmentación a) PCL 12%. b) Combinado de PLA 12% y PCL 12%
a b
Fig. 18 PLA 12%. a) Conversión binaria de imagen de SEM (200X). b) Lista de resultados del analizador de partículas, identificando
ubicación y área de los poros del PLA.
En la figura 19.a la Poli-caprolactona (PCL), reporta un promedio de área de 120.300 µm2. y el
intervalo va de 0.824 µm2. a 10137.359 µm2., en este caso al ser más delgada la fibra, el área
promedio del poro se incrementa. Por lo tanto en la muestra donde son combinados PLA/PCL
se obtiene fibras gruesas y delgadas, aumentando la cantidad de poros y disminuyendo el área
promedio a 17.655 µm2. (fig.19.b)
La distribución de los poros, se analizó en histogramas, en el eje vertical se representaron las
frecuencias y en el eje horizontal los valores de área. Estableciendo el rango y longitud de clase
del área de los poros, con las siguientes relaciones (ver tabla 1):
a
b
a b
Fig. 19 Lista de resultados del analizador de partículas a) PCL 12%. b) Combinación de PLA y PCL
Los histogramas están normalizados por medio de la siguiente expresión y la tabla 2 reporta los
valores normalizados.
Material PLA PCL Combinado
Intervalo Frecuencia Normalización Frecuencia Normalización Frecuencia Normalización
0.824 646 0.040639968 623 0.07402921 1001 0.059965679
3.324 174 0.010946369 97 0.01152622 240 0.014377386
5.825 115 0.007234669 52 0.006179 154 0.009225489
8.325 96 0.006039376 31 0.00368364 99 0.005930672
10.825 78 0.004906993 25 0.00297067 73 0.004373121
13.326 56 0.003522969 27 0.00320833 54 0.003234912
15.826 33 0.002076035 18 0.00213889 44 0.002635854
18.327 21 0.001321113 16 0.00190123 37 0.002216514
20.827 31 0.001950215 9 0.00106944 37 0.002216514
23.327 29 0.001824395 11 0.0013071 28 0.001677362
25.828 31 0.001950215 7 0.00083179 27 0.001617456
28.328 18 0.001132383 19 0.00225771 21 0.001258021
30.829 21 0.001321113 15 0.0017824 20 0.001198115
33.329 19 0.001195293 4 0.00047531 15 0.000898587
35.829 15 0.000943652 7 0.00083179 11 0.000658964
38.33 15 0.000943652 11 0.0013071 11 0.000658964
40.83 7 0.000440371 12 0.00142592 10 0.000599058
43.33 15 0.000943652 8 0.00095062 10 0.000599058
45.831 6 0.000377461 6 0.00071296 13 0.000778775
48.331 8 0.000503281 3 0.00035648 7 0.00041934
50.832 6 0.000377461 8 0.00095062 13 0.000778775
53.332 13 0.000817832 5 0.00059413 4 0.000239623
55.832 6 0.000377461 4 0.00047531 6 0.000359435
Material Ácido Poli-láctico Poli-caprolactona Combinado
Dato Mayor
Dato Menor
Rango
Longitud de clase
Tabla 2. Frecuencia de los materiales y normalización
Tabla 1. Longitud y clase del PLA, PCL y PLA/PCL
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.82
43.
324
5.82
58.
325
10.8
2513
.326
15.8
2618
.327
20.8
2723
.327
25.8
2828
.328
30.8
2933
.329
35.8
2938
.33
40.8
343
.33
45.8
3148
.331
50.8
3253
.332
55.8
3258
.333
60.8
3363
.333
65.8
3468
.334
70.8
3573
.335
µm2
Normalización de área de los poros
PLA
PCL
Combinado
58.333 8 0.000503281 5 0.00059413 9 0.000539152
60.833 5 0.000314551 4 0.00047531 12 0.000718869
63.333 7 0.000440371 3 0.00035648 4 0.000239623
65.834 8 0.000503281 0 0 5 0.000299529
68.334 7 0.000440371 1 0.00011883 3 0.000179717
70.835 7 0.000440371 3 0.00035648 7 0.00041934
73.335 2 0.00012582 3 0.00035648 4 0.000239623
La grafica 1 muestra la distribución normalizada de cada uno de los materiales, en la Poli-
caprolactona (PCL) la porosidad del material es generada a partir de espacios muy grandes y
zonas de muchas fibras que nos dan espacios pequeños. Al contrario del Ácido Poli-láctico (PLA)
donde hay una distribución más homogénea, con una menor cantidad de espacios pequeños
como se observa en la gráfica. Finalmente al combinar ambos materiales aumenta el número
Grafica 1. Normalización PLA (rojo), PCL (verde) y combinado PLA/PCL (morado)
de espacios pequeños y se da una distribución intermedia de los poros entre ambos polímeros
(combinado).
5.6 Tratamiento pos-hilado
Sobre las membranas se evaluó la cantidad de solvente remanente con Espectroscopia de Rayos
X por Dispersión de Energía (SEM-EDS), identificando los elementos y el porcentaje de estos
presentes en las membranas (ver tabla 3):
De la tabla se puede destacar que la muestra contiene cloro (0.116208%), esto es consecuencia
de que solvente no se evaporo totalmente durante su trayectoria al recolector. Dado que el
cloro puede ser tóxico para las células, se le dio un tratamiento a la muestra que consistió en
dejar durante 7 días las muestras a vacio en un horno a 42⁰C.
En la tabla 3 se puede observar el análisis elemental de SEM-EDS para la muestra después de
este tratamiento. Como se puede ver no se vieron cantidades significativas de silicio (Si) y cloro
(Cl) el nitrógeno no está presente porque no se le había dado el tratamiento con plasma.
La figura 22 muestra las graficas SEM-EDS de las muestras con tratamiento y sin tratamiento.
Elemento Línea Espectro % Elemental % Atómico
Carbono (C) K ED 70.6688 75.81108
Nitrógeno (N) 8.683216 7.98766
Oxígeno (O) K ED 19.5015 15.70577
Silicio (Si) K ED 0.826747 0.379286
Cloro (Cl) K ED 0.319745 0.116208
Elemento Línea Espectro % Elemental % Atómico
Carbono (C) K ED 79.12671 83.46962
Oxígeno (O) K ED 20.87329 16.53038
Tabla 3. SEM-EDS. Porcentaje de los elemento previo al tratamiento pos-hilado de PLA/PCL al 12%
Tabla 4. SEM-EDS. Porcentaje de los elementos posterior al tratamiento pos-hilado de PLA/PCL al 12%
5. 7 Polimerización por plasma
La figura 21 obtenida por SEM-EDS se identifico la presencia del elemento Yodo (I) debido al
recubrimiento de pirrol/yodo sobre las membranas con la técnica de polimerización por plasma.
Fig.20 Graficas de SEM-EDS. La gráfica de la izquierda muestra la presencia de los elementos como el Si, N y Cl previo al
tratamiento pos-hilado. Mientras que a la derecha se observan los resultados del calentar el ambiente a 42⁰C durante 7 días.
Fig. 21 Grafica de SEM-EDS . Muestra la presencia de yodo (I) a consecuencia de la polimerización de polipirrol
Para la polimerización por plasma se utilizó una potencia a 15 watts con una fuente de radio-
frecuencia, aplicando de manera continúa durante 1 hr. pirrol y de forma intermitente yodo (I)
en intervalos de 6 min. Observando sobre los materiales lo siguiente:
El PCL, mostró cambio en su forma durante la polimerización al comprimirse. (fig. 22.b)
El PLA, era frágil y quebradizo. Sin generar cambios en su forma (fig. 22.a).
Así que la combinación de ambos polímeros, nos permitió mejorar las características de
resistencia, maleabilidad y ductilidad del material fig. 22.c).
Todos los materiales presentaron cambios de coloración en la superficie, por el pirrol
aplicado durante la polimerización (fig.22).
5.8 Pruebas in vitro con membranas PLA/PCL: Viabilidad y Microscopia Electrónica
de Barrido
A partir de una biopsia de cartílago elástico auricular, se obtuvo el cultivo primario, iniciando la
expansión con 4x106 células, cultivadas en discos de 150 mm x 25 mm a una densidad de 50,000
cel/ml en medio de cultivo DMEM con 0.37% NaHCO3, SFB al 10% suplementado con
Antibiótico-Antimicótico durante 3 semanas.
Las células se re-suspendieron y se cultivaron sobre las membranas, para evaluar su viabilidad
(MTT) y distribución celular (SEM) en un total de 30 días. Evaluando el día 3, 7, 10 y 30 después
a b c
Fig.22 Material polimerizado por plasma con pirrol/yodo. a) PLA 12%. b) PCL 12%. c) PLA/PCL 12%
de sembrar. Durante la prueba de MTT se compararon los resultados de viabilidad celular de las
membranas con dos controles:
Control 1 Alcohol ácido
Control 2 Membrana sin células
Muestras 1 y 2 Membranas con células (Combinado)
Día Control 1 Control 2 Muestra 1 Muestra 2 Promedio de muestras
Desviación Estándar
3º 0.281 0.322 0.450 0.411 0.4305 0.02757716
7º 0.240 0.300 0.498 0.549 0.5235 0.03606245
10ª 0.229 0.361 0.777 0.800 0.7585 0.01626346
30º 0.267 0.234 0.757 0.809 0.783 0.03676955
-0.05
0.05
0.15
0.25
0.35
0.45
0.55
0.65
0.75
0.85
3 8 10 30
Ab
sorb
anci
a
Dias de cultivo
Viabilidad de las membranas
Sin/células
Con/celulas
Tabla 5. Absorbancia de los controles y las membranas con células. Pruebas in-vitro
Grafica 2. Viabilidad de las membranas (MTT) pruebas in-vitro
a c b
La tabla 5 y la grafica 2 muestran los resultados de la proliferación celular. Se puede observar
un incremento en la viabilidad de las membranas, indicando que la combinación de ambos
materiales PLA y PCL propicia un ambiente para la proliferación celular.
La figura 23 muestra la imagen de SEM del control 2 (membranas sin células) y de las
membrana con células a los 7 y 30 días. Se observa la presencia de algunas células de aspecto
circular a los 7 días (fig. 23.b) y una confluencia importante sobre las membranas a los 30 días
de sembrado (fig. 23.c).
5.9 Implantación de membranas en pruebas in-vivo
Se cultivaron sobre las membranas células del cultivo primario, proliferando durante una
semana, para implantación en conejo bajo el siguiente procedimiento:
1. Se tranquilizó el mismo conejo, al cual se le había hecho la biopsia de cartílago elástico
auricular, con una inyección intramuscular de Acepromacina (5 mg/Kg) y Ketamina (20
mg/Kg), anestesiando posteriormente con una inyección intravenosa de Pentobarbital
Sódico (40 mg/ml).
2. Se realizó la implantación del material en la zona dorsal del conejo bajo condiciones
asépticas, realizando una incisión y separando la piel a nivel subcutáneo para la
implantación de los materiales.
3. Se colocaron 5 muestras de PLA/PCL (combinado) de aproximadamente 1 cm2, sobre las
cuales se había iniciado la proliferación celular del cultivo primario una semana antes.
Las membranas fueron cubiertas con una maya de vycril antes de implantarlas (fig. 24.a
y 24.b).
Fig. 23 Imágenes de SEM a) Membranas sin células (control 2) b) Membranas a los 7 días de cultivos. c) Membranas a 30 días de cultivo.
4. Suturando la incisión (fig. 24.c) y aplicando Bactrovel® aerosol sobre la herida, para
favorecer la cicatrización debido a su capacidad hemostática de alta adherencia y
antimicrobiana (fig. 24.d)
5.10 Explante de membranas
Se retiro el material del dorso del conejo, 30 días después de la implantación. Para esto se
tranquilizó el animal con una inyección intramuscular de Acepromacina (5 mg/Kg) y Ketamina
(20 mg/Kg), anestesiando posteriormente con una inyección intravenosa de Pentobarbital
Sódico (40 mg/ml).
c d
a b
Fig. 24 Implantación de material pruebas in-vivo a) Implantación de andamios en la región dorsal del conejo a nivel subcutáneo.
b) Muestras de PLA/PCL de aproximadamente 1 cm2 cubiertas de malla de vycril. c) Incisión suturada. D) Aplicación de
Batrovel® para favorecer la cicatrización de la herida.
Tabla 6. Absorbancia. Pruebas in-vivo
Separando la piel y retiraron las 5 membranas que fueron transportadas al laboratorio en un
tubo falcon con PBS c/Antibiótico-Antimicótico para ser procesada. (fig.25)
A partir del explante de las membranas del conejo se evaluó su viabilidad (MTT) y distribución
celular (SEM) a los 30 días del implante. Durante la prueba de MTT se reporto (ver. Tabla 6) la
viabilidad promedio de las muestras con células (1 y 2) y del control 2 (membranas sin células).
Se corroboro con la imagen n obtenida con SEM la presencia de células sobre las membranas.
Día Control 1 Control 2 Muestra 1 Muestra 2 Promedio de muestras
Desviación Estándar
30º 0.239 0.223 0.757 1.30 1.0285 0.38395898
Fig. 25 Explante de membranas pruebas in-vivo a) Incisión en la misma región dorsal, 30 días antes. b) Membranas con
irrigación y sin rechazo aparente. c) Crecimiento celular sobre las membranas. D) Membranas retiradas del conejo sin aparente
degradación del material.
a b
d c
6. Conclusiones Se diseño un sistema polímero-solvente que permitiera la obtención de andamios por
electrohilado de PLA, PCL y la combinación de los polímeros PLA/PCL. Se evaluaron los distintos
factores que propicia la formación de fibras por electrohilado, siendo las mejores condiciones:
el incremento de temperatura dentro de la cámara de electrohilado a 30⁰C, la concentración al
12 % del polímero, con combinación de solvente etanol/cloroformo y el recolector de tambor
jaula rotatorio/desplazamiento, con líneas específicas de recolección de fibras. Estos factores
favorecen la formación de andamios útiles para la Ingeniería de Tejido.
Se analizaron las características de porosidad de los materiales. Las imágenes de SEM
reportaron que la combinación de ambos materiales nos generó un material con fibras
combinadas y una porosidad homogénea. Como consecuencia de la distribución de la Poli-
caprolactona (PCL), donde la porosidad del material es generada a partir de espacios muy
grandes y zonas de muchas fibras que nos dan espacios pequeños. Al contrario del Ácido Poli-
láctico (PLA) donde hay una distribución más uniforme, con una menor cantidad de espacios
pequeños. Por lo tanto las pruebas se hicieron en el material combinado que tienen una
porosidad promedio de 18 µm2, la cual es adecuada para la Ingeniería de Tejidos.
El tratamiento pos-hilado se dio con el fin de retirar el solvente remanente en los andamios,
indicando la presencia del elemento Cloro con SEM-EDS. Esto es consecuencia de que el
solvente no se evaporaba en su totalidad durante su trayectoria al recolector, siendo el cloro
tóxico para las células. Se le dio un tratamiento pos-hilado a las membranas durante 7 días en
un horno a vacio a 42⁰C. Reportando los resultados después del tratamiento donde no se
encontró la presencia de cloro.
Fig. 26 Imagen SEM. Membrana a los 30 días de implantación en conejo
Se modificaron superficialmente los materiales por medio polimerizaron en un reactor por
plasma, recubriendo con una película delgada de pirrol/yodo su superficie. Con el fin de
favorecer la proliferación celular sobre los andamios. Observando que la combinado de ambos
materiales PLA/PCL nos da mejores características de resistencia y maleabilidad del material.
Se decidió realizar pruebas celulares en los andamios (PLA/PCL) a partir de un cultivo primario
con fin de evaluar la viabilidad y proliferación celular de los materiales. De manera in-vitro los
resultados de MTT reportaron un buen desempeño en la viabilidad de los andamios, indicando
que el andamio con la combinación de los dos polímeros (PLA/ PCL) y el tratamiento de plasma
propicia un ambiente para la proliferación celular. Las imágenes de SEM obtenidas a los 7 y 30
días de sembrado; destacan la presencia de algunas células de aspecto circular a los 7 días,
confluyendo a los 30 días.
Se realizaron pruebas in vivo del mismo animal donde se obtuvo el cultivo primario,
implantando un andamio sobre el cual ya se tenían 7 días de crecimiento celular, el andamio fue
retirado 30 días después de su implantación, realizando pruebas de MTT y SEM. Se reporta
viabilidad de los andamios y confluencia celular. No se observa biodegradación por parte del
material implantado, en comparación con estudios previos realizados en Acido poli-glicólico
(PGA) en pruebas in-vivo.
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